Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Flash NanoPrecipitation for indkapsling af hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58757
Automatic Translation
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Summary

Flash NanoPrecipitation (FNP) er en skalerbar tilgang til at producere polymere core-shell nanopartikler. Lab-skala formuleringer for indkapsling af hydrofobe eller hydrofile therapeutics er beskrevet.

Abstract

Formulering af et terapeutisk sammensatte til nanopartikler (NPs) kan give unikke egenskaber. For dårligt vandopløselige stoffer, kan NP formuleringer forbedre biotilgængelighed og ændre narkotika distribution i kroppen. For hydrofile stoffer som peptider eller proteiner giver indkapsling inden for NPs også beskyttelse mod naturlige clearance mekanismer. Der er nogle teknikker til produktion af polymert NPs, der er skalerbar. Flash NanoPrecipitation (FNP) er en proces, der bruger manipuleret blanding geometrier til at producere NPs med smalle størrelse distributioner og afstemmelige størrelser mellem 30 og 400 nm. Denne protokol indeholder instruktioner om laboratorium-skala produktion af kerne-shell polymere nanopartikler af target størrelse ved hjælp af FNP. Protokollen kan gennemføres for at indkapsle enten hydrofile eller hydrofobe forbindelser med kun mindre ændringer. Teknikken kan let ansat i laboratoriet på milligram skala til skærmen formuleringer. Bly hits kan direkte skaleres op til gram - og kilogram-skala. Som en kontinuerlig proces indebærer skala-up længere blanding køre procestid snarere end oversættelse til nye proces fartøjer. NPs produceret af FNP er højt læsset med terapeutiske, indslag en tætte stabiliserende polymer pensel, og har en størrelse reproducerbarhed ± 6%.

Introduction

Siden slutningen af 1990 ' erne, har der været en støt stigning i antallet af kliniske forsøg med nanomaterialer1,2. Den stigende interesse afspejler løfte om nanomaterialer at forbedre biotilgængelighed af hydrofobe narkotika og aktivere præferentielle målretning i kroppen3. Polymere nanopartikler (refereret til som nanopartikler eller NPs her) udgør en voksende del af denne klasse af materialer2. NPs har høstet interesse, fordi de har meget afstemmelige egenskaber som størrelse, sammensætning og overflade functionalization4. Når den anvendes til administration af tungtopløselige stoffer, har NPs ofte en kerne-shell struktur hvor den terapeutiske er indkapslet i den hydrofobe kernen og skallen består af en hydrofil polymer pensel. En enkel måde at generere denne struktur beskæftiger en amphiphilic diblock copolymer (BCP) bestående af en nedbrydeligt hydrofobe blok, der indgår i partikel-core, og en hydrofil poly(ethylene glycol) (PEG) blok, der udgør polymer pensel og formidler sterisk stabilisering4,5.

Nanoprecipitation er en fælles fabrikation teknik for polymere nanopartikler, fordi det er simpelt og ikke energi intensive6. I sin enkleste form indebærer nanoprecipitation tilsætning af pipette af NP komponenter i et organisk opløsningsmiddel som acetone til en overskydende mængde stirred vand. Ændringen i opløsningsmiddel til en fortyndet vandig opløsning medfører udfældning af uopløselige kernekomponent. Stabilisatoren samler på denne voksende partikel overflade, instrueret af adsorptionen af kollapsede hydrofobe blok7,8,9,10. En ensartet partikelstørrelsesfordeling opnås når opløsningsmiddel og vand hurtigt blandes til at danne en homogen opløsning. Blanding, er langsommere end Nukleering og samling af komponenter resulterer i en større, mere polydisperse partikel befolkning. Selvom let tilgængelige for en enkel test, stirred batch tilgang resultater i bred variation på grund af blande inkonsekvens og er ikke indstillet til opskalering6,11. Mikrofluidik er dukket op som en anden avenue til NP produktion, der kan køre kontinuerligt. Denne form for produktion har været for nylig gennemgået af Ding et al. 11 . En fælles tilgang bruger laminar flow med fokus for at reducere opløsningsmiddel længde skala til sub micron værdier. Blanding af antisolvent sker ved diffusion, så små flow dimensioner er afgørende for at sikre ensartede partikler11,12. Parallelization af flere mikrofluid kamre for skala-up er problematisk for store produktionsmængder.

De hurtige blanding forhold, der favoriserer ensartet nanoprecipitation i mikrofluidik kan skiftevis fremstilles i begrænset, turbulent strømme. Flash NanoPrecipitation (FNP) beskæftiger særlige blanding geometrier til at opnå disse betingelser højere volumetriske flowhastighed end muligt med mikrofluidik. Indløb streams Angiv et blandingskammer under turbulente forhold, der fører til generation af hvirvler, således at opløsningsmiddel/anti-solvent lamellae danner på længde omfanget af diffusion11,13. Dermed, ensartet blanding på en kortere end Nukleering og væksten i den terapeutiske tidsskala er opnået. Mixeren begrænset geometri tillader ikke stream omgåelse af regionen hvor turbulente energi varmeafledning opstår og hele systemet oplever den samme proces historie13. Nukleering sker ensartet i blandingskammeret og partikel vækst fortsætter indtil stoppet af forsamlingen af BCP på overfladen9,14. Den blandede stream indeholdende stabil partikler kan derefter fortyndes med yderligere antisolvent at undertrykke Ostwald modning af partikler15,16,17.

En begrænset aktiverende jet (CIJ) mixer er den enkleste mixer design for FNP og tillader blanding af to strømme i en skalerbar og kontinuerlig måde, som vist i figur 1A13. En multi inlet vortex mixer (MIVM) blev udviklet for at aktivere op til fire forskellige strøm indgange samtidig stadig opnå den hurtige micromixing kræves til ensartet partikel dannelse, som vist i figur 1B18. FNP muliggør enkel formulering screening, der kan let oversættes til kommerciel-skala produktion. På grund af processen kontinuerlig karakter kræver større parti størrelser ikke nye fartøjer, men snarere længere køre gange, muliggør enkel oversættelse til kilogram-skala produktion i samme udstyr toget.

Hydrofile forbindelser såsom peptider og proteiner ('biologics') kan også være indkapslet i en proces kaldet inverse Flash NanoPrecipitation (iFNP). Teknikken kræver en amphiphilic BCP hvor én blok er hydrofobe og den anden er en polyacid19. Det første skridt indebærer hurtig sammenblanding af en dimethyl sulfoxid (DMSO) stream indeholdende den biologiske og BCP mod en lipofile opløsningsmiddel som dichlormethan eller chloroform. Dette resulterer i dannelse af partikler stabiliseret med hydrofobe blok pensel. Sådan en arkitektur vil her, betegnes som en 'omvendt' NP. Kernen indeholder polyacid, som er så ionically crosslinked ved hjælp af en multivalente kationer. Det stabiliserer partikler til forarbejdning til et vandigt miljø i form af mikropartikler eller PIND-belagt nanopartikler af teknikker, der har været rapporteret i litteraturen19,20,21.

Denne protokol kan anvendes til lab-skala produktion af polymert core-shell nanopartikler indkapsling enten hydrofobe eller hydrofile forbindelser. Undersektioner af protokollen giver anvisninger på brugen af begge mixer klasser - CIJ og MIVM. Læseren bør kunne tilpasse protokollen for romanen kernekomponenter og reproducerbar generere nanopartikler af ønskede størrelse ved hjælp af passende mixeren for strøm indgange. Tre eksempel formuleringer ved hjælp af FNP og iFNP præsenteres nedenfor. To ansætte CIJ mixer og kræver en MIVM15,22. Den første formulering viser indkapsling af en model hydrofobe sammensatte af FNP. Den anden formulering viser indkapsling af en model hydrofile sammensatte af iFNP i en CIJ mixer. Den endelige formulering giver et eksempel på protein indkapsling af iFNP ved hjælp af en MIVM. Protokol for denne tredje formulering beskriver brugen af små, håndholdte MIVM betegnes 'μMIVM.' Mixer design er mindre at give mulighed for forenklede formulering screening, men funktionen skalering er velbeskrevet og mixeren er ikke en mikrofluid enhed22. I det sidste afsnit af protokollen indeholder nogle noter på skala-up af bly formuleringer identificeret i screening. Disse formuleringer er beregnet til at give adgangspunkter for den læringsproces og derfor bruge ikke-nedbrydelige poly (styren)-baserede polymerer. Alternative stabilisatorer er blevet beskrevet i litteraturen, med en række biokompatible kommercielle indstillinger tilgængelige14,23,24.

Protocol

1. indkapsling af hydrofobe forbindelser i polymere NPs ved hjælp af en CIJ Mixer

  1. Forberede og rense udstyr.
    1. Skaffe og validere en CIJ mixer.
      Bemærk: Se Supplerende Information sektion 1 byggeri vejledning. CAD-filer er tilgængelige som Supplerende oplysninger samt.
    2. Før hver brug, sikre, at alle fittings på CIJ mixer er lun og outlet slangen ikke er bøjet eller klemt.
    3. I et stinkskab, vedhæfte en 5 mL luer lock sprøjte indeholdende 2-3 mL opløsningsmiddel til hver inlet adapter. Vælg et opløsningsmiddel (fx, acetone), der vil rense enhver forbindelser for nylig brugt i mixeren.
      Bemærk: Typiske valg er acetone eller tetrahydrofuran (THF). Kun brug polypropylen sprøjter at undgå opløsningsmidler kompatibilitetsproblemer såsom udvaskning. Brug ikke sprøjter med gummi O-ring tætning udstikkere.
    4. Indstille CIJ forsamlingen over en spildbakken.
      Bemærk: En kolbe med en mindre end selve CIJ åbning fungerer godt som dette understøtter mixeren og giver mulighed for nem betjening af sprøjter.
    5. Støt trykkes sprøjte stemplerne for at tømme indholdet gennem blandingskammeret over et par sekunder. Fjerne sprøjter.
      Bemærk: Sprøjter kan opbevares og genbruges for flere runder af rengøring mellem FNP kører.
    6. Tør de CIJ mixer interne ved hjælp af en N2 stream. En mandlig luer adapter på slutningen af et N2 linje er effektiv.
      Bemærk: Hvis den Rengøring opløsningsmidler ikke er flygtige (fx DMSO), Gentag trinene 1.1.3-1.1.5 med acetone eller THF inden vi går videre til trin 1.1.6. Det er afgørende at fjerne resterende solvens til køre til at køre konsistens.
  2. Forberede solvent og antisolvent vandløb på target kompositioner.
    1. Opløse den hydrofobe sammensatte (dvs., E-vitamin) i unstabilized THF på 10 mg/mL i tilstrækkelig mængde til at fuldføre det ønskede antal FNP kører. Forberede sig lidt mere end nødvendigt pr. løb.
      Bemærk: Andre opløsningsmidler kan bruges i disse trin, gælder begrænsningerne i afsnittet diskussion. Hvis beskæftiger THF, anbefales stabilisator-fri opløsningsmiddel, fordi direktivet hydroxytoluene har lav vandig opløselighed. Forsigtig undgå peroxid oprustning (herunder peroxid test) og være opmærksom på, at lave niveauer af peroxider kan forstyrre visse NP programmer (fx, blegning af farvestoffer).
    2. Bland vitamin E løsning på en vortex-mixer indtil opløst.
      Bemærk: For nogle forbindelser, bad sonikering i 1-2 min. kan hjælpe til at generere en opløst løsning. Det er vigtigt, at alle NP komponenter molekylemæssigt opløst.
    3. Opløse blok copolymer stabilisator (dvs., poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS1.6 k-b-PIND5 k) i THF på 10 mg/mL på omtrent den samme mængde som i trin 1.2.1 at danne polymer løsning.
      Bemærk: Andre opløsningsmidler kan bruges, underlagt de begrænsninger, der er beskrevet i afsnittet diskussion.
    4. Bland polymer løsning med en vortex-mixer indtil opløst. Hvis det er nødvendigt, placere løsningen i et sonikering bad for 1-2 min til hjælp legemer opløsning.
      Bemærk: Polymeren kan ikke være i en micellar form. Dynamisk lysspredning (DLS) kan være et nyttigt redskab til at afgøre, om en ny stream sammensætning opfylder dette kriterium.
    5. Oprette opløsningsmiddel Inputstreamen indeholder 5 mg/mL af både E-vitamin og stabilisator (50% vitamin E ladning) af første pipettering 0,25 mL af opløsningen, E-vitamin i en 1,5 mL-centrifugerør. Derefter afpipetteres 0,25 mL af polymer løsning i det samme rør.
      Bemærk: Diskenheder større end 0,5 mL pr. run er muligt med forskellige sprøjte størrelser. Over 10 mL input volumen er det praktisk at bruge en sprøjten pumpe.
    6. Bland godt på en vortex mixer til 5-10 s. valgfrit, centrifugeres tube på 1000 x g for 5-10 s til at genoprette enhver væske, der holdt sig til fælles landbrugspolitik, som forbedrer reproducerbarhed mellem CIJ kører.
    7. Der afpipetteres 0.525 mL deioniseret vand i en anden 1,5 mL centrifugeglas som den antisolvent strøm.
      Bemærk: Det er bedre at have overskydende antisolvent, som sikrer, at de solvente stream aldrig træder blandekammeret uden antisolvent stede. I nogle tilfælde hvor salt Opløselighed i opløsningsmidlet/antisolvent blanding ikke begrænse, kan buffered vandige systemer bruges.
    8. Der afpipetteres 4 mL deioniseret vand i en 20 mL scintillation hætteglas eller anden egnet beholder som en dæmpningen bad. Placer en lille magnetiske rør bar i hætteglasset.
      Bemærk: Dæmpningen bad reducerer Ostwald modning ved at sænke den endelige opløsningsmiddel indhold til 10% af volumen15,17. Denne mængde kan justeres til adresse proces begrænsninger og kan skaleres direkte med Inputstreamen volumen.
  3. Producere NPs af FNP brug CIJ mixer.
    1. Position åben dæmpningen bad hætteglasset nedenfor den rensede CIJ mixer på en røre pladen i et stinkskab. En praktisk konfiguration bruger et 50 mL reagensglas rack blok til at støtte CIJ mixer med hætteglas nedenfor og outlet slange rettet ind i hætteglasset. Se figur 1A til orientering.
    2. Begynd omrøring dæmpningen bad via magnetiske rør bar på omkring 75% max hastighed.
    3. Ved hjælp af en 1 mL polypropylen sprøjten udstyret med en stump-tip nål, drage fuld volumen af det antisolvent rør.
      Bemærk: Brug ikke sprøjter, der indeholder en gummi O-ring tætning for at undgå kompatibilitet bekymringer. For større inlet mængder, brug en passende størrelse luer lock sprøjte. Sprøjte stikkontakten skal være centreret på sprøjten akse eller det bliver ustabilt under depression.
    4. Forsigtigt fjerne alle luftbobler fra sprøjten og fjerne stump spids nål, bortskaffelse i en skarpe container.
    5. Prime stemplet, således at strømmen kommer bare til sprøjten åbning. Vedhæfte sprøjten til en af CIJ fjorden fittings.
    6. Gentag trin 1.3.3-1.3.5 for de solvente løsning.
    7. Hurtigt, jævnt og ensartet trykkes sprøjter på samme tid ved at placere bolden i hånden, i håndfladen eller en tommelfinger på toppen af stemplerne afhængigt af personlige præferencer. Indsamle spildevand i dæmpningen bad hætteglas.
      Bemærk: En 0,5 mL input bør være deprimeret på mindre end 0,5 s.
    8. Der er afsat CIJ mixer med sprøjter stadig fastgjort. Fjern linjen rør og cap hætteglas, som indeholder nu NP dispersion med en core-shell partikel struktur (figur 1 c).
    9. Hold mixeren over en affald løsning container og fjern sprøjter. Hold up volumen (ca. 0,25 mL) vil derefter løbe ud. Bortskaf de brugte sprøjter og Gentag trinnet rengøring 1.1 før den næste FNP retssag.
      Bemærk: Tillad ikke hold up volumen at tømme ind i hætteglasset indeholdende de nationale parlamenter, som dette vil negativt påvirke prøve ensartethed.
  4. Udføre analyse og efterbehandling af NP dispersion.
    1. At karakterisere NP størrelse ved hjælp af DLS, Tilsæt 100 μl af NP spredning til en plast kuvette og tilføje 900 μl af dæmpningen bad opløsningsmiddel (f.eks. vand).
      Bemærk: Mindre mængder kan bruges til lav-volumen kuvetter. En 10-fold fortynding er normalt tilstrækkeligt.
    2. Bland godt af pipettering op og ned eller ved mild omrystning. Følg instruktionerne instrumentspecifikke analysere prøven.
      Bemærk: Alternative karakterisering teknikker såsom zeta potentielle analyse eller elektronmikroskopi kan udføres som kræves. NP spredning kan forarbejdes yderligere, da dikteres af ansøgningen og gennemgik i afsnittet diskussion.

2. indkapsling af hydrofile forbindelser i omvendt NPs ved hjælp af en CIJ Mixer

  1. Forberede opløsningsmiddel, antisolvent, og slukke løsninger i stinkskab.
    1. Komplet rengøring og klargøring fremgangsmåden i trin 1.1, bruge DMSO som rengøring opløsningsmidler og overholde Bemærk i trin 1.1.6 for at fuldføre en anden Skyl med THF.
    2. Opløse den hydrofile sammensatte (dvs., maltodextrin (MD) med dextrose tilsvarende (DE) med 4-7, gennemsnitlig molekylevægt = 3,275 g/mol, "3 k MD") i DMSO på 10 mg/mL i tilstrækkelig mængde til at fuldføre det ønskede antal FNP kører.
      Bemærk: Andre opløsningsmidler kan bruges, underlagt de begrænsninger, der er beskrevet i afsnittet diskussion.
    3. Bland maltodextrin løsning med en vortex-mixer indtil opløst. Hvis det er nødvendigt, placere løsningen i et sonikering bad for 1-2 min til hjælp legemer opløsning.
    4. Oprette en blok copolymer stabilisator (dvs., poly(styrene) -b- poly (akryl syre), PS5 k-b- PAA4.8 k) bestand løsning i THF på 11,1 mg/mL på omtrent den samme mængde som i trin 2.1.2 at danne polymer løsning .
      Bemærk: Andre opløsningsmidler og stabilisator koncentrationer kan bruges. DMSO kan umiddelbart kan bruges som et opløsningsmiddel i stedet for THF.
    5. Bland polymer løsning med en vortex-mixer indtil opløst. Hvis det er nødvendigt, placere løsningen i et sonikering bad for 1-2 min til hjælp legemer opløsning.
      Bemærk: Polymer Inputtet må ikke være i en micellar form. DLS kan bruges til at afgøre, om en ny stream sammensætning opfylder dette kriterium.
    6. Forberede opløsningsmiddel stream input (0,5 mL) ved at kombinere følgende rækkefølge i et 1,5 mL centrifugeglas: 0.250 mL af opløsningen 3 k MD, 0,225 mL af polymer løsning, og 0,025 mL deioniseret vand.
      Bemærk: Vandindholdet i denne strøm har en stærk effekt på NP størrelse og polydispersity. Generelt er det bedst at operere i 2,5-10 vol % interval20. Værdier i den høje ende af rækken kan hjælpe indkapsling af større molekylvægt forbindelser.
    7. Bland godt på en vortex mixer til 5-10 s.
    8. Valgfrit, centrifugeres tube på 1000 x g for 5-10 s til at genoprette enhver væske, der holdt sig til fælles landbrugspolitik, som forbedrer reproducerbarhed mellem CIJ kører.
    9. Forberede en crosslinker løsning af calciumchlorid (CaCl2) dihydrat i methanol på 25,0 mg/mL.
      Bemærk: Crosslinker vil blive tilføjet i forholdet 1:1 afgift til grupperne syre i PAA blok. Justere koncentrationen i overensstemmelse hermed, hvis en anden crosslinker er brugt, eller hvis en anden PAA blok størrelse eller polymer koncentration er brugt20,21.
    10. Forberede den antisolvent strøm af pipettering 0,5 mL chloroform og 0,05 mL af crosslinker (0,55 mL samlede) ind i et microcentrifuge rør.
      Bemærk: Andre acceptable antisolvents er dikteret af blok copolymer valg og omfatter typisk dichlormethan eller acetone. Crosslinker kan i stedet føjes til dæmpningen bad, med yderligere ældning af NP dispersion at tillade bitmapgenkendelse dannelse20.
    11. Bland godt på en vortex mixer til 5-10 s.
    12. Valgfrit, centrifugeres tube på 1000 x g for 5-10 s til at genoprette enhver væske, der holdt sig til fælles landbrugspolitik, som forbedrer reproducerbarhed mellem CIJ kører.
    13. Tilføje 4 mL af antisolvent (dvs., chloroform) til en 20 mL scintillation hætteglas til at danne dæmpningen bad. Placer en lille magnetiske rør bar i hætteglasset.
      Bemærk: Denne diskenhed kan justeres til adresse proces begrænsninger.
  2. Komplet protokol for NP dannelse, som beskrevet i trin 1.3.
  3. Udføre analyse og efterbehandling af NP dispersion.
    1. At karakterisere NP størrelse ved hjælp af DLS, Tilsæt 100 μl af NP spredning til et glas kuvette og tilføje 900 μl af opløsningsmidlet anvendes til dæmpning bad.
    2. Bland godt ved pipettering op og ned eller ved lys agitation af kuvette. Følg instruktionerne software til at analysere prøven.
      Bemærk: Crosslinking af de nationale parlamenter kan vurderes kvalitativt af DLS ved hjælp af en god solvens som DMSO eller dimethylformamid (DMF) som DLS fortyndingsmiddel20. Partikler, som er stabilt crosslinked vil udstille en autokorrelation funktion i opløsningsmiddel med minimal ændring i partikelstørrelse. Dårligt crosslinked partikler svulme og udstille en svag autokorrelation funktion og spredning styrke21.
    3. Du kan eventuelt tilføje en base, som ammoniak, at drive ionisk kompleks og styrke crosslinking i partikel-kerne.
      1. Eventuelt forberede en 3,48 mg/mL opløsning af ammoniak i methanol gravimetrisk bruger ammoniumhydroxid løsning (typisk 30 wt % ammoniak). Tilsæt 50 μL (dvs., 0,6 ækvivalenter for grupperne syre på polymeren) dråbevis under omrøring.
        Bemærk: Ækvivalenter kan justeres, hvis det ønskes af varierende enten koncentrationen eller mængden tilføjet25.
      2. Valgfrit, alder ikke mindre end 30 min med mild omrøring for crosslinking at forekomme.
    4. Processen NP dispersion til at producere enten mikropartikler eller overtrukne NPs som beskrevet i litteraturen19,20,21.

3. indkapsling af ægalbumin i omvendt NPs ved hjælp af en μMIVM

  1. Forberede solvent og antisolvent løsninger.
    1. Forberede en 50 mg/mL opløsning af ægalbumin i ionbyttet vand ("æg").
    2. Forbered 0,75 mL af opløsning A i et 1,5 mL centrifugeglas ved at fortynde 75 μl af æg løsning med 0.675 mL af DMSO til at generere en 5 mg/mL opløsning af æg i DMSO, som indeholder 10% vand ved volumen. Bland godt og centrifugeres kort som beskrevet tidligere.
      Bemærk: Se trin 2.1.6 vedrørende vand effekter. Som i foregående afsnit, kan løsning diskenheder skaleres op eller ned til fit materielle behov.
    3. Forberede løsning B ved at opløse blok copolymer stabilisator (dvs., poly(styrene) -b- poly (akryl syre), PS5 k-b- PAA4.8 k) i DMSO på 6 mg/mL. Bland godt og Læg instrumenterne i ultralydsbad til at opløse hvis nødvendigt. 0,75 mL pipetteres i et 1,5 mL centrifugeglas.
    4. Der afpipetteres 0,75 mL THF (løsning C) i en 1,5 mL-centrifugerør.
    5. 1.85 mL chloroform (løsning D) afpipetteres i et glas scintillation hætteglas.
    6. Forberede en 60,0 mg/mL calciumchlorid dihydrat crosslinker opløsning i methanol. Bland brug en vortex-mixer.
    7. Forberede en 4,17 mg/mL ammoniakopløsning i methanol som beskrevet i trin 2.3.4.
    8. Tilføj 5,25 mL chloroform til en 15 mL centrifugeglas som dæmpningen bad.
  2. Forberede mixer forsamling og stå.
    1. Samle nederst modtageren, blande geometri disk, den øverste disk, skruenøgle skruenøgle og en O-ring. Se figur 2 for skematisk af komponenter og mixer stå terminologi.
      Bemærk: Oplysninger om MIVM konstruktion kan findes i Supplerende oplysninger (afsnit 1) og i litteraturen22. CAD-filer er tilgængelige som Supplerende oplysninger samt.
    2. Sted O-ring ind i rillen, at sikre at det passer godt, og at der ingen tegn på slid eller skader.
      Bemærk: Normale drift vil føre til slidt eller opløsningsmiddel-hævede O-ringe. Hvis O-ring vises strakte eller deforme, lade det luft tørre natten over før brug. Hvis figuren ikke gendanner natten over, bortskaffe o-ringen. Holde et stort lager, da dette er en forbrugsmaterialer del.
    3. Omhyggeligt Juster blanding disk hullerne med pinde på den øverste disk og skubbe sammen. Sikre, at o-ringen ikke blive fordrevet ved at kontrollere de to stykker sidde flush.
    4. Vend de to stykker og sammensætte dem med den nederste modtageren. Sikre, at outlet rør montering har været løsnes, så at det ikke forstyrrer komplet stramning af disken.
      Bemærk: Hvis de threading fangster under montagen skal omhyggeligt demontere og anvender en mad - eller farmaceutiske-grade anti-gribe til gevindskæring for at forhindre irriterende.
    5. Efter manuel stramning, passe spanner wrench top disk pindene og stramt stramme forsamlingen. Stram derefter de outlet rør montering så at den sidder fast mod bunden ansigt af den blanding geometri. Sikre, at sprøjten fittings på den øverste disk er lun.
    6. Placer den forsamlede mixer på mixer standeren, så outlet slange udvider under støtte plade. Støtte de mobile plade, så det er suspenderet ude af vejen for arbejdsområdet.
    7. Valgfrit, sprøjter kontrollere mekanisk stop justering, første vedhæfte den tomme glas til mixer fjorde.
      Bemærk: Volumetriske flowhastighed varieres ved hjælp af sprøjter af forskellige tønde diametre, da sprøjter er deprimeret samtidigt på den samme lineære hastighed. De indledende og afsluttende lodret højder skal være den samme for alle sprøjter og kan justeres ved hjælp af sæt skruer tappet ind i stemplet skaft22. De mekaniske stoppesteder sikre, at urimelig skade glas sprøjter ikke forekommer.
      1. Eventuelt kommer lavere mobile pladen så thats til hvile på de mekaniske stopper. Sikre, at disse er justeret, så pladen også kommer til at hvile umiddelbart før du kontakter de tomme sprøjter (som det ses i figur 2).
      2. Valgfrit, løsne mekanisk stop og repositionere, hvis nødvendigt. Fjerne glas sprøjter og nulstille den mobile plade ud af vejen.
        Bemærk: For operation med plast sprøjter, de mekaniske stop er ikke påkrævet.
    8. Placer åben dæmpningen bad under outlet slange til at indsamle overløbet.
    9. Trække løsning en ind i en 1 mL gas-stramme sprøjte ved hjælp af en stump spids nål. Fjerne alle luftbobler og bortskaffelse af nålen. Prime løsning til slutningen af sprøjten luer montering. Gentag denne proces for løsninger B og C.
    10. Trække løsning D i en 2,5 mL gas-stramme sprøjte ved hjælp af en stump spids nål. Fjerne alle luftbobler og bortskaffelse af nålen. Prime løsning til slutningen af sprøjten luer montering.
      Bemærk: Disse diskenheder er blevet udvalgt, så at de indledende sprøjte stemplet højder er de samme. Hvis bind er ændret, skal de stadig opfylde dette højde krav.
    11. Saml de fire sprøjter på mixer i en urets i alfabetisk rækkefølge. Se figur 1B for endelige udseende og sprøjte orientering skematisk.
      Bemærk: Kontroller, at ingen sprøjte højde er væsentligt forskellige fra de andre og fejlfinding efter behov.
  3. Udfør mixer drift og rengøring.
    1. Greb forsynet med boliger på begge sider af den mobile plade. Anbring ikke fingrene i bunden ansigtet af boliger, fordi dette er en knivspids fare mod de mekaniske stopper. Langsomt sænke den mobile plade, så det hviler jævnt men knap nok røre sprøjter.
    2. Støt og gnidningsløst trykkes plade, satsning hen til hel operationen i omkring 0,5-1 s for disse stream bind22.
      1. Fjerne og cap dæmpningen bad tube, som indeholder nu NP dispersion.
    3. Tage mixeren med sprøjter stadig fastgjort og hold over en spildbakken. Fjerne sprøjter, så hold up volumen til at dræne i containeren. Hold mixer forsamlingen på hovedet og demontere mixer ved hjælp af en skruenøgle skruenøgle.
    4. Brug en sprayflaske, skyl outlet slangen med flere milliliter af opløsningsmiddel (fx acetone) og tør med luft eller kvælstof.
    5. Skyl den blanding geometri med en god solvens (fx, deioniseret vand eller DMSO) og skyl derefter med acetone ved hjælp af flere milliliter fra en sprayflaske. Tør med en luft eller kvælstof stream.
    6. Skyl O-ring i en strøm af deioniseret vand og dup tør.
    7. Skyl den øverste disk grundigt med flere milliliter af acetone ved hjælp af et opløsningsmiddel flasken indtil visuelt ren. Tør med en luft eller kvælstof stream både overfladen og sprøjte fittings.
    8. Skyl hver sprøjte med flere milliliter af en god solvens (fx, deioniseret vand eller acetone) fra en solvent flaske. Anvende en sidste skylning af flere milliliter af acetone og lufttørre før næste brug.
  4. Udføre efterbehandling og analyse.
    1. Tilsæt 50 μL af calcium chlorid dihydrat crosslinker løsningen dråbevis under omrøring til omkring 75% maksimal hastighed.
    2. Tilsæt 50 μL ammoniakopløsning dråbevis under omrøring med 75% maksimal hastighed. Alder i mindst 30 min.
    3. Karakterisere NP størrelse, som beskrevet i trin 2.3.1 og 2.3.2.
    4. Processen NP dispersion til at producere enten mikropartikler eller overtrukne NPs som beskrevet i litteraturen19,20,21.

4. ændringer til formulering skala-up

  1. Forberede de opløsningsmidler og antisolvent løsninger, som beskrevet i trin 1, 2 eller 3 på den ønskede komposition og tilstrækkeligt volumen til kræves formulering størrelse.
  2. Valgfrit, hvis det er nødvendigt, rense og sterilisere mixer på plads ved hjælp af en egnet protokol før NP dannelse.
    Bemærk: Sekventielle skylninger af CIP 100, vand (til neutral pH), CIP 200, vand (til neutral pH), og en egnet opløsningsmiddel har været ansat i fortiden. Derudover kan sterile filtre knyttes til indløb af mixer i tilfælde hvor endelige partikelstørrelse hinder sterilisation ved filtrering.
  3. Indlæse løsningerne i gastætte sprøjter af passende volumen og vedhæfte polytetrafluorethylen (PTFE) slanger med en luer adapter monteret på enden. Manuelt prime løsninger til enden af slangen.
    1. Indlæse sprøjter ind i en sprøjten pumpe og vedhæfte sprøjter til mixer indløb på enten CIJ eller MIVM, som kræves.
      Bemærk: Alternativt Strømningsregulatorer kan anvendes til lab eller pilotstørrelse for at tilvejebringe større volumen kapacitet end en sprøjten pumpe. Succesfuld handling kræver lind strøm og tilstrækkelig trykfald, hvilket betyder at trykisoleret fartøjer med flow måling på stikkontakten er den mest hensigtsmæssige valg for store skala produktion.
  4. Placer en collection fartøj indeholdende en dæmpningen bad af tilstrækkelig volumen, om nødvendigt under outlet slangen.
  5. Angiv de volumetriske strømningshastigheder til at matche de opnåede manuelt (f.eks., om 30-60 mL/min pr. stream).
    Bemærk: Hvis bruger CIJ, pumpe strømningshastigheder skal være identiske. Hvis bruger MIVM, kan forskellige fjorde have forskellige strømningshastigheder.
  6. Samtidig Begynd pumperne. Indsamle omkring 5-10 mL af spildevand som affald i en lille hætteglas (dette er en "start-up volumen") og derefter begynde at indsamle i dæmpningen bad.
  7. Karakterisere og behandle som beskrevet i den tilsvarende formulering afsnittet ovenfor.

Representative Results

Screening af NP formuleringer med FNP er hurtig og kræver små mængder materiale (størrelsesordenen 1-10 mg). FNP-protokollen til at indkapsle hydrofobe forbindelser, såsom vitamin E (trin 1) medfører en stabil, klart eller let opaliserende NP dispersion. Dynamisk lysspredning (DLS) giver en robust måde at karakterisere partikelstørrelse. Som vist i figur 3, giver processen NPs med et lavt polydispersity på en reproducerbar måde. Det typiske polydispersity indeks (PDI) er mindre end 0,20, der angiver en relativt monodisperse befolkning. PDI er fremstillet af funktionen autokorrelation og gennemføres ofte i instrument software. Det er et forhold på andet til det første øjeblik, hvor værdier af 0,1 fremstilles almindeligvis for monodisperse partikler26. For de fire E-vitamin/PS-b-PIND formulering replikater rapporteret, værdien 0,12 ± 0,02 og den gennemsnitlige diameter var 107 ± 7 nm. En typisk "fejltænding" på grund af enten ujævn depression af sprøjter eller langsommere depression hastighed er også rapporteret i figur 3. Polydispersity var upåvirket, men størrelsen var lidt større (135 nm). Herunder dette eksempel er de nye målinger for partikelstørrelse 113 ± 14 nm. En fejltænding resulterer i perioder hvor salen indeholder kun en enkelt stream type. Det er vigtigt, at hele streamen oplever den samme proces historie og relative mængder af økologiske og vandig streams i mixeren. Uden en stabilisator fremstilles en uigennemsigtig løsning med synlige aggregater. DLS autokorrelation funktion for denne prøve er ikke-monotone og henfalde ikke gnidningsløst, som det ses i figur 3 indsatser.

Partikel størrelse kontrol af FNP er vist i figur 4, hvor forskellige de relative mængder af kernemateriale – poly(styrene)1.8 k i denne sag – og PS -b-PIND stabilisator resulterede i partikler størrelser, der spænder fra 49-152 nm. Disse partikelstørrelser blev genereret med THF streams indeholdende en samlede massekoncentration af kerne og stabilisator af 20 mg/mL, hvor 25%, 50% eller 75% af massen blev poly(styrene) core materiale. Polydispersity af nanopartikler var altid mindre end 0,15. Omfattende diskussion af parameter effekter på partikelstørrelse produceret af FNP kan findes i litteraturen10. Lastning kan indstilles ved at holde opløsningsmiddel volumen konstant og varierende de relative mængder af stamopløsninger kerne og stabilisator. Ligeledes, den samlede massekoncentration kan varieres ved at forberede lager løsninger på andre værdier end 10 mg/mL. Visse betingelser er det muligt at observere en tom micelle befolkning af DLS27. Dette har ikke nogen skadelig virkning end udvide den målte partikelstørrelsesfordeling. Når størrelserne er ens, kan denne kommer til udtryk som en enkelt bred peak snarere end to separate toppe.

Den samme CIJ mixer kan også bruges til at indkapsle hydrofile forbindelser af iFNP, som eksemplificeret i trin 2 i protokollen. Partiklerne produceret i de rapporterede formulering er omkring 65 nm med en lav polydispersity af 0,08. Størrelse fordelingen kan ses i figur 5A (stiplet linje). Effekten af crosslinking PAA carboxylsyre rester på partikel stabilitet fremgår af DLS analyse i en stærk opløsningsmiddel som DMSO, som vist i figur 5B. Funktionen autokorrelation for godt-crosslinked partikler skal starte i nærheden af en værdi på 1 og drop skarpt til 0 på en karakteristisk tid, der er relateret til partikelstørrelse (solid line). Partikler, som svulme ekstensivt eller opløses ikke crosslinked og Vis minimal autokorrelation signal (stiplet linje). For iFNP manifestere mislykkede forsøg på samme måde som beskrevet for FNP ovenfor. Synlige aggregater kan ses eller dårlig DLS autokorrelation funktion figur kan observeres. MIVM kan anvendes til FNP eller iFNP, når mere end to indløb vandløb er påkrævet på grund af systemet begrænsninger såsom opløselighed eller kemiske uforenelighed. En mindre version af MIVM (μMIVM) med stoetteben mixer er vist i figur 2. Som med CIJ, kan denne mixer bruges til at indkapsle hydrofobe eller hydrofile forbindelser22. I trin 3, blev en protokol til indkapsling af en hydrofil protein, æg, af iFNP beskrevet. Partikelstørrelsesfordeling er vist i figur 5A (solid line). Størrelsen er ca 125 nm med en PDI af 0,16. En generel protokol for sprøjten pumpe operation i større målestok er fastsat i trin 4.

Figure 1
Figur 1: Mixer forsamling og intern flow mønster skemaer. (A) den snævre rammer jetfly (CIJ) mixer med vedlagte sprøjter er placeret over dæmpningen bad. Ikke afbilledet er et rør bar i dæmpningen bad hætteglas og en røre pladen. Den blanding geometri er afbildet i den udvidede visning viser to stream fjorde, at gribe ind i midten af salen. (B) en multi inlet vortex mixer (μMIVM) er vist med glas sprøjter og placeret i stå over et dæmpningen bad. Den mobile plade og de mekaniske stop har været beskåret fra billedet. Den udvidede visning viser vortex kammer og inlet kanaler skematisk. (C) en skematisk gengivelse af kerne-shell NPs produceret af FNP. Røde kugler repræsenterer den terapeutiske, hvilket kombineret med den blå kollapsede polymer blok, omfatter NP kerne. Den gule polymer blok udgør pensel lag bibringe sterisk stabilisering til NPs. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: μMIVM terminologi og komponenter til assemblyen. ΜMIVM kræver en mixer stå hen til muliggøre ensartede depression af de fire sprøjter. I dette tilfælde skal sprøjte stemplet højder alle være ensartet at sikre konsekvent blanding. Det kan alternativt betjenes ved hjælp af sprøjte pumper. Mixer stå med mærkede komponenter er vist til venstre på figuren. Til højre er den afmonterede mixer med o-ringen på plads på de blande geometri disk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Partikel størrelse distribution af polymert nanopartikler der indeholder en kerne af vitamin E og stabiliseret af PS -b-PLØK. Dynamisk lysspredning (DLS) giver intensitet-vægtede størrelse distributioner, der angiver NP diameter distribution. Kurver er gennemsnittet af tredobbelt analyser for hver retssag og har været reskaleres til at producere identiske maksimale tophøjder. De fire flergangsbestemmelser (streger) angiver metoden høj reproducerbarhed (standardafvigelse = 7 nm). Der er også inkluderet en repræsentativ fejltænding (stiplet linje), såsom langsommere sprøjte hastighed eller ujævn depression af de to sprøjter, hvilket resulterer i større partikel diameter. Standardafvigelsen af NP størrelse herunder fejltænding var 14 nm. (Indsat) Uden PS -b-PIND stabilisator, store micron-skala aggregater (eller dråber, i tilfælde af en olie som vitamin E) dannes. DLS autokorrelation funktion af en køre uden stabilisator (stiplet linje) er vist sammen med en repræsentant autokorrelation fra en nanopartikel replikat (solid line). Funktionen autokorrelation viser en række karakteristiske tidsskalaer for kontrolprøve, der angiver en polydisperse befolkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: partikel størrelse kontrol af FNP gennem varierende relative nøgletal af core materiale til stabilisator. Intensitet-vægtede størrelse distributioner af tre formuleringer med en poly(styrene) kerne stabiliseret af PS -b-PIND er afbildet. Den samlede massekoncentration i THF var 20 mg/mL og antisolvent vand. Formuleringer blev udarbejdet i en CIJ mixer. Massefraktion af den bestående af kernemateriale er opført i forklaringen. For eksempel 25% core prøven indeholdt 5 mg/mL poly(styrene) og 15 mg/mL PS -b-PLØK. De gennemsnitlige størrelser for 25% (solid line), 50% (stiplet linje) og 75% (blandet dash line) core belastninger var 49 nm, 96 nm, og 152 nm, henholdsvis. Alle PDI værdier var mindre end 0,15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: karakterisering af inverteret NPs lavet i en CIJ mixer eller μMIVM. (A) DLS kurver er gennemsnittet af tredobbelt analyser for hver formulering. Den stiplede linje angiver størrelse fordelingen af 3 k MD partikler gjort i CIJ mixer, mens den streg er den størrelse fordeling af æg partikler i μMIVM. (B) styrke af crosslinking kan vurderes af DLS bruge DMSO som fortyndingsvæsken. Funktionen DLS autokorrelation angiver styrken af crosslinking gennem den oprindelige autokorrelation værdi og observation af en ren overgang til en værdi på nul. Den stiplede linje afbilder autokorrelation funktion for en partikel med nogen crosslinker, viser en svag indledende signal og en bred henfald tid. Den faste linje skildrer autokorrelation efter tilsætning af en stærk crosslinker (i dette tilfælde, tetraethylenepentamine), som viser en stærk første signal og en defineret henfald tidsskala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Supersaturation, S, som en funktion af de relative blanding forhold mellem organiske opløsningsmidler til vand. (A) sammenligning af højeste opnåelige supersaturation for (○) boscalid, pesticider og (■) peptid B, en syv-rester model peptid. Den økologiske stream indeholder boscalid ved en koncentration på 230 mg/mL og peptid B på 200 mg/mL, deres mætning koncentrationer. Der er en maksimal supersaturation, der afhænger af hver aktive farmaceutiske ingredienser (API) / opløsningsmiddel system. (B) når koncentrationen af boscalid i den økologiske stream er faldet 20-fold, de betingelser, hvormed der opnås supersaturation og nanoprecipitation blive begrænset. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra Elsevier9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Indkapsling af hydrofobe forbindelser, såsom vitamin E, som i trin 1 i protokollen, har været udførligt beskrevet9,14,28. Relativt er monodisperse partikler produceret for tidshorisonten for blanding er kortere end tidshorisonten for sammenlægning og vækst af partikler. Specifikt bliver blandet opløsningsmiddel/antisolvent løsningen hurtigt homogen, som gør det muligt for Nukleering at forekomme ensartet. Montering af blokcopolymer partikel overflade derefter giver sterisk stabilisering, der stopper partikel vækst5. Da blande tid i salen (turbulens) er en funktion af strømningshastigheder indløb til CIJ eller MIVM, er der et indløb sats, som opstår efter overgangen til turbulent blanding, hvor partikelstørrelse er stort set konstant13. Dette giver yderligere robusthed over for processen som en batch til batch variation i inlet flowhastighed (dvs., sprøjte depression hastighed) kan tolereres uden betydning for den endelige NP størrelse, som det ses af figur 3. Langsommere eller ujævn inlet hastigheder kan resultere i større partikler eller mere polydisperse distributioner, som det ses f.eks fejltænding. Nummerportabilitet er også blevet udvidet for at indkapsle hydrofile forbindelser i nanopartikler af inverse Flash NanoPrecipitation. Disse inverteret nanopartikler kan derefter bruges til at oprette mikropartikler eller være beklædt med PIND til at skabe vand-spredbar nanopartikler25. De underliggende forsamling principper forblive den samme, selv om der er den ekstra kompleksitet af crosslinking partikel core. Dette er nødvendigt for stabilisering af partikel i et vandigt miljø. I almindelighed, er forholdet 1:1 beregning i forhold til polyacid blokken tilstrækkelig, selvom de Ioniske interaktioner kan fremmes ved justering af pH gennem tilsætning af en base19. I denne protokol, er blevet beskrevet kun den første proces skridt til form inverteret NPs.

Ud over hurtig blanding er vellykket formulering af FNP eller iFNP begrænset til tilfælde, hvor flere betingelser kan være mødte9,14. Første, alle strøm indgange skal være blandbar. Mens emulsioner har været brugt til at producere NPs, kræver FNP en ensartet løsning fase i mixeren. For det andet skal den kernekomponent næsten uopløselige i opløsningsmiddel betingelserne i mixer (for CIJ, en 50/50 blanding af volumen) at køre hurtig Nukleering. Ellers, en betydelig del forbliver unencapsulated eller vil bundfald efter yderligere fortynding med antisolvent. MIVM kan aktivere højere antisolvent indhold i blandekammeret adresse core materiale opløselighed begrænsninger. Det er ofte nyttigt at generere supersaturation kurver fra opløselighed data som en funktion af opløsningsmiddel sammensætning til at guide proces design9. Figur 6 viser repræsentative kurver for to forbindelser. Lav supersaturation på de blanding kammer betingelser fortjenester opererer på forskellige kompositioner, typisk ved hjælp af MIVM. Højere supersaturation favoriserer Nukleering af den kernekomponent over partikel vækst men en uoverensstemmelse i forsamlingen tid af kernemateriale og stabilisator kan resultere i store aggregater af den terapeutiske. D'Addio og Prud'homme har gennemgået anvendelsen af sådanne supersaturation kurver i detalje9. Endelig, BCP molekylemæssigt skal opløses i det opløsningsmiddel stream og antisolvent streamen skal være selektiv for én blok. BCP skal være tilstrækkelig amphiphilic til at give både en solvophobic drivkraft fra kollapsede blokken til at forankre stabilisator på partikel overflade og til solvated blok at give sterisk stabilitet til partikel. Opløsningsmidler ikke er beskrevet i protokollen kan anvendes, så længe de opfylder disse betingelser.

Praksis med manuel sprøjte operation kan forbedre succesraten under screening. Som nævnt ovenfor, betyder drift over overgangen til homogen, turbulent blanding betingelser at små variationer i strømningshastigheden er tolereret i processen28. Skala-up til pumpe-drevne, computer-kontrollerede strømme medfører endnu større gevinster i sammenhæng på grund af reproducerbare inlet strømningshastigheder. På ethvert tidspunkt under efterbehandling af partikler, kan visuel inspektion eller DLS analyse indikere tilstedeværelsen af store aggregater, der kan være på grund af hændelige støv eller partikel ustabilitet. Når det er nødvendigt, kan streamen filtreres med en passende filter porestørrelse. I mangel af aggregater, vi har konstateret, at mindre end 5% masse er typisk tabt, når filtrering PIND-belagt nanopartikler, hvis nominelle filter størrelse er større end partikelstørrelsesfordeling. Når filtrering aggregater, er eksperimentel bestemmelse af masse tabt under processen nødvendig. Kvantificering af massetabet kan foretages på to måder. Tørvægt i en given mængde kan bestemmes massen af thermogravimetric analyse før og efter filtrering til at identificere omfanget af forandringer (jf. Supplerende oplysninger afsnit 2). Alternativt, partikler kan være genvundet (f.eks.af ingot) og opløst i et godt opløsningsmiddel. Koncentrationen af kernemateriale kan derefter direkte måles ved en passende teknik såsom ultraviolet-synlige spektrofotometri eller kromatografi.

For FNP, skal de resterende 10 vol % organisk opløsningsmiddel (fxTHF) fjernes fra den vandig dispersion. Dette kan gøres ved fordampning destillation14,29, dialyse30eller tangential flow filtrering31,32. Praktiske overvejelser for hver behandlingstrin er beskrevet i henvisningerne forudsat. Dialyse er typisk membraner 3,5 kDa eller 6-8 kDa cutoffs, selvom der findes større muligheder. Denne molekylvægt cutoff er tilstrækkelig for solvent fjernelse når dialysebehandling i 24 timer ved hjælp af flere bad ændringer. Brugen af tangential flow filtrering indebærer nogle procesudvikling som skal sørges for at undgå inducerende aggregering på grund af koncentrationen polarisering på membranen overflade. Vi har fundet, at reducere de organiske opløsningsmidler sammensætning under et system-afhængige værdi, normalt 2-10 vol %, eliminerer aggregering på membranen overflade. Efter forarbejdning, bestemmes koncentrationen af nanopartikler let ved thermogravimetric analyse (jf. Supplerende oplysninger afsnit 2). Det er ofte ønskeligt at transportere eller opbevare partikler i en yderst stabil form. Vandige dispersioner kan simpelthen være frosset hurtigt ved hjælp af en tør is/acetone blanding og derefter opbevares ved-80 ° C. Alternativt, tørt pulver kan opnås ved ingot33,34 eller spray tørring24. Ofte, skal en kryoprotektant føjes til reducere nanopartikel sammenlægning under frysning eller tørring. Sukker (saccharose, trehalose, osv.), poly(ethylene glycol) eller cyclodextrins kan screenes for effektiviteten over en række koncentrationer af overvågning størrelse af DLS35,36,37, 38. Fælles NP stabilitetsproblemer under behandling er ofte relateret til opløselighed eller fase adskillelse i kernen resulterer i omlejring mod et lavere energi stat på betingelser, hvor mobilitet er øget. Brug af fælles kerne materialer, alternative stabilisatorer eller modificerede eksterne løsning sammensætning kan bidrage til at forbedre stabiliteten14,16,17,39,40, 41.

Som nævnt ovenfor, MIVM giver mulighed for højere antisolvent indhold i blandekammeret når kræves for at opnå høj supersaturation. Det kan også give mulighed for den fysiske adskillelse af arter i mere end to vandløb når reaktivitet eller opløselighed begrænsninger kræver det. Et eksempel er dannelsen af zein protein-stabiliseret nanopartikler af antibiotika clofazimine24. Den hydrofobe clofazimine er indført i en acetone stream; Trine er indført i en 60% ethanoliske vandig strøm; kasein, som komplekser med zein, er bragt ind med en vandig buffer stream, og den fjerde stream er ekstra buffer til at øge forholdet mellem vand til acetone og ethanol. To opløsningsmiddel vandløb er påkrævet, da clofazimine og zein ikke er opløselig i et fælles opløsningsmiddel. Denne proces kan ikke ske i en to-jet CIJ mixer. Dette protein-stabiliseret formulering viser også, at Nummerportabilitet ikke er begrænset til BCP stabilisatorer. Janus partikler er produceret uden stabilisator42 og et sortiment af lavprisselskaber stabilisatorer er blevet påvist til mundtlige ansøgninger24. Navnlig, kan copolymerer såsom hydroxypropyl methylcellulose bruges i stedet for blok copolymerer af24. Core materialer kan gøres mere hydrofobe ved en række teknikker. Hydrofobe ion parring er blevet anvendt til at indkapsle en bred vifte af forbindelser, der har mellemliggende opløselighed43,44,45. Ekstremt hydrofob prodrugs er blevet genereret og derefter indkapslet46. Nukleinsyrer har været indkapslet gennem kompleks med kationiske lipider47. Vigtigere, har disse undersøgelser vist, at Nummerportabilitet kan producere en række partikel overflade kemi. Yderligere, blandet stabilisatorer indeholdende en brøkdel af BCP, der er blevet ændret med en målretning ligand på kæde ende har været brugt. Dette giver præcis kontrol over ligand indhold på overfladen, da partiklen sammensætning afspejler Inputstreamen sammensætning23,48. Tilsvarende er det muligt at inkorporere flere kernekomponenter, herunder farvestoffer og uorganiske nanopartikler3,8.

Flash NanoPrecipitation er en skalerbar tilgang til polymere nanopartikler består af enten en hydrofobe eller en hydrofil kerne. Hvis de kriterier, der er opregnet ovenfor er opfyldt, er generelt over 95% af kernemateriale indkapslet på høj massefraktionen i partikel. De tre eksempler, her blev udført på bænken skala, der kræver et par milligram af materiale og ca. 0,5 mL i hver inlet stream. Dette giver mulighed for hurtig screening af partikel betingelser for formulering optimering. Opskalering af bly formuleringer til større parti størrelser er en sag af løb den oparbejde i længere tid, der kan let ske ved hjælp af sprøjte pumper eller Strømningsregulatorer. Derimod ansigter opskalering af bulk tilsætning nanoprecipitation veldokumenterede udfordringer i at opretholde tilstrækkelig micromixing på tilsætning og tegner sig for effekten af at ændre fartøj geometri49. Dette er en væsentlig hindring, da det er afgørende at fremstille partikler på en ensartet måde at møde FDA krav50. Mikrofluidik teknikker kan også producere ensartet, reproducerbare nanopartikler, men kun aktiverer produktionen i området milligram. For eksempel, rapporterede Karnik et al. produktion satser på 0,25 mg/min. for en drug udgivelse studere51. Yderligere skala-up indebærer typisk parallelization ved høj kapital koste12. Med FNP er det ligetil at producere 1 gram af nanopartikler 600 mg/min. med en sprøjten pumpe og et par beslag til at forbinde til mixeren fjorde. Derfor repræsenterer FNP både en tilgængelig lab-skala screeningsværktøj samt en skalerbar tilgang til NP produktion for Translationel arbejde.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), af Bill og Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) og den National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) tildeles K.D.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting - CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule - CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing - CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting - MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing - MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J., Corrie, S. R. Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research. 33 (10), 2373-2387 (2016).
  2. D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  3. Gindy, M. E., Prud'homme, R. K. Multifunctional nanoparticles for imaging, delivery and targeting in cancer therapy. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (8), 865-878 (2009).
  4. Chen, G., Roy, I., Yang, C., Prasad, P. N. Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy. Chemical Reviews. 116 (5), 2826-2885 (2016).
  5. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302-118302 (2003).
  6. Schubert, S., Delaney, J. J. T., Schubert, U. S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 7 (5), 1581-1588 (2011).
  7. Lebouille, J. G. J. L., Stepanyan, R., Slot, J. J. M., Cohen Stuart, M. A., Tuinier, R. Nanoprecipitation of polymers in a bad solvent. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 225-235 (2013).
  8. Akbulut, M., et al. Generic method of preparing multifunctional fluorescent nanoparticles using flash nanoPrecipitation. Advanced Functional Materials. 19 (5), 718-725 (2009).
  9. D'Addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (6), 417-426 (2011).
  10. Pagels, R. F., Edelstein, J., Tang, C., Prud'homme, R. K. Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano Letters. 18 (2), 1139-1144 (2018).
  11. Ding, S., Anton, N., Vandamme, T. F., Serra, C. A. Microfluidic nanoprecipitation systems for preparing pure drug or polymeric drug loaded nanoparticles: an overview. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (10), 1447-1460 (2016).
  12. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  13. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE Journal. 49 (9), 2264-2282 (2003).
  14. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  15. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  16. Kumar, V., Wang, L., Riebe, M., Tung, H. H., Prud'homme, R. K. Formulation and stability of itraconazole and odanacatib nanoparticles: Governing physical parameters. Molecular Pharmaceutics. 6 (4), 1118-1124 (2009).
  17. Liu, Y., Kathan, K., Saad, W., Prud'homme, R. K. Ostwald Ripening of β -Carotene Nanoparticles. Physical Review Letters. 98 (3), 036102-036102 (2007).
  18. Liu, Y., Cheng, C., Liu, Y., Prud'homme, R. K., Fox, R. O. Mixing in a multi-inlet vortex mixer (MIVM) for flash nano-precipitation. Chemical Engineering Science. 63, 2829-2842 (2008).
  19. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Polymeric nanoparticles and microparticles for the delivery of peptides, biologics, and soluble therapeutics. Journal of Controlled Release. 219, 519-535 (2015).
  20. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Ch. 11. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 249-274 (2017).
  21. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Ch. 12. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 275-296 (2017).
  22. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a Small-Scale Multi-Inlet Vortex Mixer for Scalable Nanoparticle Production and Application to the Encapsulation of Biologics by Inverse Flash NanoPrecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  23. Gindy, M. E., Ji, S., Hoye, T. R., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'Homme, R. K. Preparation of poly(ethylene glycol) protected nanoparticles with variable bioconjugate ligand density. Biomacromolecules. 9 (10), 2705-2711 (2008).
  24. Zhang, Y., et al. Design and Solidification of Fast-Releasing Clofazimine Nanoparticles for Treatment of Cryptosporidiosis. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3480-3488 (2017).
  25. Pagels, R. F. Polymeric Nanoparticles and Microparticles for the Delivery of Hydrophobic and Hydrophilic Therapeutics. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2018).
  26. Frisken, B. J. Revisiting the method of cumulants for the analysis of dynamic light-scattering data. Applied Optics. 40 (24), 4087-4091 (2001).
  27. Budijono, S. J., Russ, B., Saad, W., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Block copolymer surface coverage on nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 360 (1-3), 105-110 (2010).
  28. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation of Organic Actives and Block Copolymers using a Confined Impinging Jets Mixer. Australia Journal of Chemistry. 56, 1021-1024 (2003).
  29. Kumar, V., Prud'homme, R. K. Nanoparticle stability: Processing pathways for solvent removal. Chemical Engineering Science. 64 (6), 1358-1361 (2009).
  30. Shi, L., Shan, J., Ju, Y., Aikens, P., Prud'homme, R. K. Nanoparticles as delivery vehicles for sunscreen agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 122-129 (2012).
  31. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of Diafiltration and Tangential Flow Filtration for Purification of Nanoparticle Suspensions. Pharmaceutical Research. 22 (12), 2152-2162 (2005).
  32. Pansare, V. J., Tien, D., Thoniyot, P., Prud'homme, R. K. Ultrafiltration of nanoparticle colloids. Journal of Membrane Science. 538, 41-49 (2017).
  33. D'Addio, S. M., et al. Novel Method for Concentrating and Drying Polymeric Nanoparticles: Hydrogen Bonding Coacervate Precipitation. Molecular Pharmaceutics. 7 (2), 557-564 (2010).
  34. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1688-1713 (2006).
  35. Correa, S., et al. Highly Scalable, Closed-Loop Synthesis of Drug-Loaded, Layer-by-Layer Nanoparticles. Advanced Functional Materials. 26 (7), 991-1003 (2016).
  36. Figueroa, C. Engineering Nanoparticles for Pharmaceutical Applications: Formulation and Freeze-drying Techniques. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2014).
  37. Harada, A., Li, J., Kamachi, M. Preparation and properties of inclusion complexes of polyethylene glycol with alpha-cyclodextrin. Macromolecules. 26 (21), 5698-5703 (1993).
  38. Troiano, G., Song, Y. -H., Zale, S., Wright, J., Van Geen Hoven, C. Stable Formulations for Lyophilizing Therapeutic Particles. United States patent. , (2013).
  39. Kumar, V., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Fluorescent polymeric nanoparticles: Aggregation and phase behavior of pyrene and amphotericin B molecules in nanoparticle cores. Small. 6 (24), 2907-2914 (2010).
  40. Budijono, S. J., et al. Synthesis of stable block-copolymer-protected NaYF4:Yb3+, Er3+up-converting phosphor nanoparticles. Chemistry of Materials. 22 (2), 311-318 (2010).
  41. Chen, T., et al. Protected peptide nanoparticles: Experiments and brownian dynamics simulations of the energetics of assembly. Nano Letters. 9 (6), 2218-2222 (2009).
  42. Sosa, C., et al. Soft Multifaced and Patchy Colloids by Constrained Volume Self-Assembly. Macromolecules. 49 (9), 3580-3585 (2016).
  43. Pinkerton, N. M., et al. Formation of stable nanocarriers by in situ ion pairing during block-copolymer-directed rapid precipitation. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 319-328 (2013).
  44. Lu, H. D., Rummaneethorn, P., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Hydrophobic Ion Pairing of Peptide Antibiotics for Processing into Controlled Release Nanocarrier Formulations. Molecular Pharmaceutics. 15 (1), 216-225 (2018).
  45. Lu, H. D., et al. Encapsulation of OZ439 into Nanoparticles for Supersaturated Drug Release in Oral Malaria Therapy. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 970-979 (2018).
  46. Ansell, S. M., et al. Modulating the Therapeutic Activity of Nanoparticle Delivered Paclitaxel by Manipulating the Hydrophobicity of Prodrug Conjugates. Journal of Medicinal Chemistry. 51 (11), 3288-3296 (2008).
  47. Gindy, M. E., et al. Mechanism of macromolecular structure evolution in self-assembled lipid nanoparticles for siRNA delivery. Langmuir. 30 (16), 4613-4622 (2014).
  48. D'Addio, S. M., et al. Optimization of cell receptor-specific targeting through multivalent surface decoration of polymeric nanocarriers. Journal of Controlled Release. 168 (1), 41-49 (2013).
  49. Perry's Chemical Engineers' Handbook. , McGraw-Hill. 19-20 (2007).
  50. Torrice, M. Does nanomedicine have a delivery problem? ACS Central Science. 2 (7), 434-437 (2016).
  51. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 143 nanopartikel micromixing blokcopolymer medicinafgivelse peptid protein proces skala-up
Flash NanoPrecipitation for indkapsling af hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Markwalter, C. E., Pagels, R. F.,… More

Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter