Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Flash NanoPrecipitation for innkapsling av hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58757
Automatic Translation
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Summary

Flash NanoPrecipitation (FNP) er en skalerbar tilnærming til å produsere polymere core-shell nanopartikler. Lab-skala formuleringer for innkapsling av hydrofobe eller hydrofile therapeutics er beskrevet.

Abstract

Utformingen av en terapeutisk blanding i nanopartikler (NPs) kan gi unike egenskaper. For dårlig vannløselige stoffer, kan NP formuleringer forbedre biotilgjengelighet og endre distribusjon i kroppen. For hydrofile stoffer som peptider eller proteiner, kan innkapsling i NPs også gi beskyttelse mot naturlig klaring mekanismer. Det er noen teknikker for produksjon av polymere NPs som er skalerbare. Flash NanoPrecipitation (FNP) er en prosess som bruker utviklet blanding geometrier å produsere NPs med smale størrelse distribusjoner og tunable størrelser mellom 30 og 400 nm. Denne protokollen gir instruksjoner på laboratoriet skala produksjon av kjerne-shell polymere nanopartikler målet størrelse bruker FNP. Protokollen kan implementeres for å kapsle enten hydrofile eller hydrofobe forbindelser med kun mindre modifikasjoner. Teknikken kan lett brukes i laboratorier ved mg skala til skjermen formuleringer. Bly treff kan direkte skaleres til gram og kilo-skala. Som en kontinuerlig prosess innebærer skalere opp lenger miksing prosess kjører i stedet for oversettelse til nye prosessen fartøyer. NPs produsert av FNP er svært lastet med terapeutiske, har en tett stabiliserende polymer pensel, og har en størrelse reproduserbarhet ± 6%.

Introduction

Siden 1990, har det vært en jevn økning i antall kliniske studier ansette nanomaterialer1,2. Den stigende interessen gjenspeiler løfte om nanomaterialer å forbedre biotilgjengeligheten av hydrofobe narkotika og aktivere fortrinnsrett målretting i kroppen3. Polymere nanopartikler (referert til som nanopartikler eller NPs her) representerer en økende andel av denne klassen av materialer2. NPs har fått interesse fordi de har svært tunable egenskaper som størrelse, sammensetning og overflate functionalization4. Når påføres av dårlig vannløselige stoffer, har NPs ofte en kjerne-shell struktur der terapeutisk er innkapslet i hydrofobe kjernen og skallet består av en hydrofile polymer pensel. En enkel måte å generere denne strukturen har en amphiphilic diblock copolymer (BCP) som består av en nedbrytbar hydrofobe blokk, som er en del av partikkel kjernen, og en hydrofile poly(ethylene glycol) (PEG) blokkere, som danner polymer penselen og formidler steric stabilisering4,5.

Nanoprecipitation er en vanlig fabrikasjon teknikk for polymere nanopartikler fordi det er enkelt og ikke energi intensiv6. I sin enkleste form innebærer nanoprecipitation tillegg av Pipetter NP komponenter i en organisk løsemiddel som aceton til et overflødig volum rørt vann. Endringen i løsningsmiddel til en fortynnet vannoppløsning resulterer i nedbør av uløselig kjernen. Stabilisatoren samler på denne voksende partikkel overflaten, regissert av adsorpsjon av skjulte hydrofobe blokk7,8,9,10. En uniform partikkel størrelsesDistribusjon oppnås når løsemiddel og vann raskt bland til en homogen løsning. Blanding som er tregere enn nucleation og montering av komponenter resulterer i et større, mer polydisperse partikkel befolkningen. Om lett tilgjengelig for en enkel test, rørt satsvise tilnærmingen gir bred variasjon på grunn av miksing inkonsekvens og er ikke mottakelig for skala-up6,11. MicroFluidics har dukket opp som en annen avenue til NP produksjon som kan kjøres kontinuerlig. Denne produksjonsmidlene har nylig gjennomgått av Ding et al. 11 . En felles tilnærming bruker laminær strømning fokus for å redusere størrelsen løsemiddel lengde sub-mikron verdier. Blanding av antisolvent skjer ved diffusjon, så liten flyt er avgjørende for å sikre ensartet partikler11,12. Parallelization av flere microfluidic kamre for skala-up er problematisk for store produksjonsvolumer.

Rask blande betingelsene som favoriserer ensartet nanoprecipitation i microfluidics kan vekselvis produseres i trange, turbulente. Flash NanoPrecipitation (FNP) benytter spesielle blanding geometrier for å oppnå disse vilkårene høyere volumetriske flowrates enn mulig med microfluidics. Vik bekker angi en blanding kammer under turbulent forhold som fører til generasjon av virvlene, slik at løsemiddel/anti-solvent lamellae danner lengde størrelsesorden diffusjon11,13. Dermed oppnås uniform blande på en tidsskala som er kortere enn nucleation og vekst av terapeutisk. Begrenset geometrien av blandebatteri tillater ikke strømmen omgåelsen i regionen hvor turbulente energi ødsling oppstår og hele systemet opplever den samme prosess historie13. Nucleation oppstår jevnt i miksing kammeret og partikkel veksten fortsetter til stoppet av forsamlingen av BCP på overflaten9,14. Blandet strømmen som inneholder stabil partikler kan deretter fortynnes med flere antisolvent å undertrykke Ostwald modning partikler15,16,17.

En begrenset impinging jet (CIJ) blandebatteri er den enkleste mixer designen for FNP og tillater blanding av to bekker på en skalerbar og kontinuerlig måte, som vist i figur 1A13. En multi innløp vortex mikser (MIVM) ble utviklet for å muliggjøre opptil fire forskjellige strømmen innganger mens fortsatt oppnå rask micromixing kreves for uniform partikkel formasjon, som vist i figur 1B18. FNP kan enkelt formulering screening som kan lett oversettes til kommersiell skala produksjon. På grunn av kontinuerlig natur prosessen krever ikke større satsvise størrelser nye fartøyer men heller lenger kjøre ganger, muliggjør enkel oversettelse til kilo skala produksjon i samme utstyret toget.

Hydrofile forbindelser som peptider og proteiner ('biologiske') kan også være innkapslet i en prosess betegnes inverse Flash NanoPrecipitation (iFNP). Teknikken krever en amphiphilic BCP der en blokk er hydrofobe og den andre er en polyacid19. Det første trinnet innebærer rask blanding av en dimethyl sulfoxide (DMSO) stream inneholder den biologiske og BCP mot et lipofile løsemiddel som diklormetan eller kloroform. Dette resulterer i dannelsen av partikler stabilisert med hydrofobe blokk pensel. Her, skal slik en arkitektur kalles en "omvendt" NP. Kjernen inneholder polyacid, som er så ionically krysskoblet bruker en multivalent kation. Dette stabiliserer partikler for behandling i en vandig miljø i form av microparticles eller PEG-belagt nanopartikler av teknikker som er rapportert i litteraturen19,20,21.

Denne protokollen kan anvendes for lab-skala produksjon av polymere core-shell nanopartikler innkapsle hydrofobe eller hydrofile forbindelser. Underdeler av protokollen inneholder instruksjoner for bruk av begge blandebatteri klasser - CIJ og MIVM. Leseren skal kunne tilpasse protokollen for romanen kjernekomponenter og reproduserbar generere nanopartikler ønsket størrelse bruker riktig blandebatteri for strømmen innganger. Tre eksempel formuleringer FNP og iFNP presenteres nedenfor. To benytter CIJ blandebatteri og krever MIVM15,22. Den første formuleringen demonstrerer innkapsling av en modell hydrofobe sammensatt av FNP. Andre formulering demonstrerer innkapsling av en modell hydrofile sammensatt av iFNP i en CIJ blandebatteri. Siste utformingen gir et eksempel på protein innkapsling av iFNP med en MIVM. Protokoll for denne tredje formulering beskriver bruken av en småskala, håndholdte MIVM kalt "μMIVM." Blandebatteri er mindre å tillate forenklet formulering screening, men skalering virkemåten er godt forstått og blandebatteri er ikke en microfluidic enhet22. Den siste delen av protokollen inkluderer noen notater på skalaen opp av bly formuleringer i screening. Disse formuleringene er ment å gi tilgangspunkter for å lære prosessen og dermed bruke ikke-nedbrytbare poly (styren)-baserte polymerer. Alternative stabilisatorer har blitt beskrevet i litteraturen, med en rekke biokompatible kommersielle alternativer tilgjengelig14,23,24.

Protocol

1. innkapsling av hydrofobe forbindelser i polymere NPs bruker en CIJ mikser

  1. Forberede og rent utstyr.
    1. Skaffe og validere en CIJ mikser.
      Merk: Se Tilleggsinformasjon delen 1 for bygging veiledning. CAD-filer er også tilgjengelig som Tilleggsinformasjon .
    2. Før hver bruk, kontroller du at alle beslag på CIJ mikseren er tettsittende og utløp slangen ikke bøyd eller klemt.
    3. I avtrekksvifte, knytte en 5 mL luer lås sprøyte med 2-3 mL løsemiddel til hver vik adapter. Velg et løsemiddel (f.eks, aceton) som vil rense eventuelle forbindelser nylig brukt i mikseren.
      Merk: Typisk valg er aceton eller tetrahydrofuran (THF). Bare bruk polypropylen sprøyter å unngå løsemiddel kompatibilitetsproblemer som utvasking. Ikke bruk sprøyter med gummi O-ring segl stempler.
    4. Sett samlingen CIJ over en avfallsbeholderen.
      Merk: En flasken med en åpning mindre enn selve CIJ fungerer godt som dette støtter blandebatteri og tillater enkel betjening av sprøyter.
    5. Stadig trykke ned sprøyte stempler for å tømme innholdet gjennom miksing kammeret over et par sekunder. Fjerne sprøyter.
      Merk: Sprøyter kan beholdes og gjenbrukes for flere runder med rengjøring mellom FNP kjøres.
    6. Tørr CIJ blandebatteri internals bruker en N2 strøm. En mannlig luer adapter på slutten av en N2 linje er effektiv.
      Merk: Hvis rengjøring løsemiddelet ikke flyktig (f.eks DMSO) Gjenta trinn 1.1.3-1.1.5 med aceton eller THF før du fortsetter å gå 1.1.6. Det er viktig å fjerne gjenværende løsningsmiddel for kjøre å kjøre konsistens.
  2. Forberede løsemiddel og antisolvent bekker på målet komposisjoner.
    1. Oppløse den hydrofobe sammensatt (dvs., vitamin E) i unstabilized THF på 10 mg/mL i tilstrekkelig å fullføre ønsket antall FNP kjører. Forberede litt mer enn nødvendig per kjørt.
      Merk: Andre løsemidler kan brukes i disse trinnene, underlagt begrensningene under diskusjon. Hvis ansette THF, anbefales stabilisator uten løsemiddel fordi butylated hydroxytoluene har lav vandig oppløselighet. Vær forsiktig å unngå peroxide buildup (inkludert peroxide testing) og være klar over at lave nivåer av peroksider kan forstyrre enkelte NP programmer (f.eks bleking av fargestoffer).
    2. Bland vitamin E løsningen på en vortex mikser til oppløst.
      Merk: For noen forbindelser, bad sonication i 1-2 min kan hjelpe generere en oppløst løsning. Det er viktig at alle NP komponenter molecularly oppløst.
    3. Oppløse blokk copolymer stabilisator (dvs.poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS1.6 k-b-pinne5 k) i THF på 10 mg/mL på omtrent samme volum som i trinn 1.2.1 til polymer løsning.
      Merk: Andre løsemidler kan brukes, underlagt begrensningene beskrevet under diskusjon.
    4. Bland polymer løsningen med en vortex mikser til oppløst. Eventuelt plassere løsningen i et sonication bad for 1-2 min til hjelp i faste stoffer oppløsning.
      Merk: Polymer kan ikke være i et micellar skjema. Dynamisk lysspredning (DLS) kan være et nyttig verktøy for å avgjøre om en ny strøm sammensetning oppfyller dette vilkåret.
    5. Opprette løsemiddel input stream som inneholder 5 mg/mL av vitamin E og stabilisator (50% vitamin E lasting) ved første pipettering 0,25 mL av vitamin E løsningen i en 1,5 mL sentrifuge rør. Deretter Pipetter 0,25 mL av polymer løsning i samme rør.
      Merk: Volumer større enn 0,5 mL per kjørt er mulig med forskjellige sprøyte størrelser. Over 10 mL volumet er det praktisk å bruke en sprøytepumpe.
    6. Bland godt på en vortex mikser for 5-10 s. eventuelt, sentrifuge røret på 1000 x g for 5-10 s gjenopprette væske fast til luen, som forbedrer reproduserbarhet mellom CIJ kjøres.
    7. Pipetter 0.525 mL deionisert vann i en andre 1,5 mL sentrifuge rør som antisolvent.
      Merk: Det er bedre å ha overflødig antisolvent, som sikrer at løsemiddel strømmen aldri inn i blande kammer uten antisolvent tilstede. I noen tilfeller der salt oppløselighet i løsemiddel/antisolvent blandingen ikke begrenser benyttes bufrede vandig systemer.
    8. Pipetter 4 mL deionisert vann i 20 mL scintillation ampuller eller andre egnet beholder som quench badekar. Sett en liten magnetic røre bar i ampullen.
      Merk: Undertrykking av badekaret reduserer Ostwald modning ved å senke det endelige løsemiddel innholdet til 10% av volumet15,17. Dette volumet kan justeres til adresse prosessen begrensninger og kan skaleres direkte med Inndataflyten volum.
  3. Produsere NPs av FNP bruke CIJ mixer.
    1. Plasser åpne quench bad ampullen under renset CIJ mikseren på en røre plate i avtrekksvifte. En praktisk konfigurasjon bruker en 50 mL reagensglasset rack blokk for å støtte CIJ blandebatteri med ampullen nedenfor og utløp slangen rettet inn ampullen. Se figur 1A orientering.
    2. Start røring den quench bad via baren magnetic røre på rundt 75% maks hastighet.
    3. Bruker en 1 mL polypropylen sprøyte med en butt tupp nål, trekke hele volumet fra antisolvent røret.
      Merk: Ikke bruk sprøyter som inneholder en gummi O-ring sel for å unngå problemer. For større vik volumer, bruker du en passende stor luer lås sprøyten. Sprøyte stikkontakten må være sentrert på sprøyten aksen eller det vil være ustabilt under depresjonen.
    4. Nøye fjerne alle luftbobler i sprøyta og fjerne butt tupp nålen, kaste i en beholder.
    5. Prime stempelet slik at strømmen kommer bare til sprøyten åpningen. Knytt sprøyten til én CIJ vik er modulbasert.
    6. Gjenta trinn 1.3.3-1.3.5 løsemiddel løsning.
    7. Raskt, enkelt og jevnt nedtrykt sprøyter samtidig ved å plassere ballen på hånden, håndflaten av hånden eller ett tommelen på toppen av stemplene avhenger opp på personlig preferanse. Samle avløpsvann i quench bad ampullen.
      Merk: En 0,5 mL innspill bør være deprimert på mindre enn 0,5 s.
    8. Sette til side den CIJ mikser med sprøyter fortsatt festet. Fjern feltet rør og cap ampullen, som nå inneholder NP spredning med en kjerne-shell partikkel struktur (figur 1 c).
    9. Hold blandebatteri over en avfall løsning beholder og fjern sprøyter. Hold opp volumet (ca 0,25 mL) vil deretter renne. Kaste brukte sprøyter gjenta rengjøringsprosessen 1.1 før den neste FNP prøve.
      Merk: Tillat ikke holder opp volumet som tomt i ampullen inneholder NPs som dette vil negativt påvirke eksempel ensartethet.
  4. Utføre analyse og etterbehandling med NP spredning.
    1. Karakterisere NP størrelsen med DLS, Pipetter 100 μL NP spredning i plast søppel og legge til 900 μL quench bad løsemiddel (f.eks vann).
      Merk: Mindre volumer kan brukes for lavt volum cuvettes. En 10 ganger fortynning er vanligvis tilstrekkelig.
    2. Bland godt pipettering opp og ned eller mild risting. Instruksjonene Apparatspesifikke analysere prøven.
      Merk: Alternative karakterisering teknikker som zeta potensielle analyse eller elektronmikroskop kan gjennomføres som kreves. NP spredning kan behandles videre som diktert av programmet og vurdert under diskusjon.

2. innkapsling av hydrofile forbindelser i invertert NPs bruker en CIJ mikser

  1. Forberede løsemiddel, antisolvent, og slukke løsninger i avtrekksvifte.
    1. Fullføre rengjøring og preparering fremgangsmåtene i trinn 1.1 med DMSO som rengjøring løsemiddel og følge notatet i trinn 1.1.6 for å fullføre en andre skylling med THF.
    2. Oppløse hydrofile sammensatte (dvs., maltodekstrin (MD) med druesukker tilsvarende (DE) av 4-7, gjennomsnittlig molekylvekt = 3,275 g/mol, "3 k MD") i DMSO på 10 mg/mL i tilstrekkelig volum å fullføre ønsket antall FNP kjører.
      Merk: Andre løsemidler kan brukes, underlagt begrensningene beskrevet under diskusjon.
    3. Bland maltodekstrin løsningen med en vortex mikser til oppløst. Eventuelt plassere løsningen i et sonication bad for 1-2 min til hjelp i faste stoffer oppløsning.
    4. Opprette en blokk copolymer stabilisator (dvs., poly(styrene) -b- poly (akryl acid), PS5 k-b- PAA4.8 k) lagerløsning i THF på 11,1 mg/mL på omtrent samme volum som i trinn 2.1.2 å danne polymer løsning .
      Merk: Andre løsemidler og stabilisator konsentrasjoner kan brukes. DMSO kan lett bli brukt som et løsemiddel i stedet for THF.
    5. Bland polymer løsningen med en vortex mikser til oppløst. Eventuelt plassere løsningen i et sonication bad for 1-2 min til hjelp i faste stoffer oppløsning.
      Merk: Polymer inndata kan ikke være i et micellar skjema. Distribusjonslister kan brukes til å fastslå om ny strømmen sammensetning oppfyller dette vilkåret.
    6. Forberede løsemiddel strøm-inngang (0,5 mL) ved å kombinere følgende, i rekkefølge, i en 1,5 mL sentrifuge rør: 0.250 mL av 3 k MD løsningen, 0.225 mL av polymer løsning og 0.025 mL vaskebuffer vann.
      Merk: Vanninnholdet av denne strømmen har en sterk innvirkning på NP størrelse og polydispersity. Vanligvis er det best å operere i 2,5-10 vol % rekkevidde20. Verdiene på den høye enden av området kan hjelpe innkapsling av større molekylær vekt forbindelser.
    7. Bland godt på en vortex mikser for 5-10 s.
    8. Eventuelt sentrifuge røret på 1000 x g for 5-10 s gjenopprette væske fast til luen, som forbedrer reproduserbarhet mellom CIJ kjøres.
    9. Utarbeide en crosslinker løsning av veisalt (CaCl2) dihydrate i metanol på 25.0 mg/mL.
      Merk: Crosslinker legges i 1:1 gratis forholdet til syre grupper i PAA blokken. Justere konsentrasjonen tilsvarende hvis en annen crosslinker brukes, eller hvis en annen PAA blokk størrelse eller polymer konsentrasjon brukte20,21.
    10. Forberede antisolvent strømmen av pipettering 0,5 mL av kloroform og 0,05 mL crosslinker løsningen (0.55 mL totalt) inn i et microcentrifuge rør.
      Merk: Andre akseptable antisolvents dikteres av blokk copolymer valg og inneholder vanligvis diklormetan eller aceton. Crosslinker kan i stedet bli lagt til undertrykking av badekaret, med ekstra aldring av NP spredning å tillate krysskobling formasjon20.
    11. Bland godt på en vortex mikser for 5-10 s.
    12. Eventuelt sentrifuge røret på 1000 x g for 5-10 s gjenopprette væske fast til luen, som forbedrer reproduserbarhet mellom CIJ kjøres.
    13. Legge til 4 mL av antisolvent (dvs., kloroform) 20 mL scintillation ampuller å danne undertrykking av badekaret. Sett en liten magnetic røre bar i ampullen.
      Merk: Dette volumet kan justeres til adresse prosessen begrensninger.
  2. Komplett protokoll for NP formasjon som beskrevet i trinn 1.3.
  3. Utføre analyse og etterbehandling med NP spredning.
    1. Karakterisere NP størrelsen med DLS, Pipetter 100 μL NP spredning i glass søppel og legge til 900 μL løsemiddelet brukes for undertrykking av bad.
    2. Bland godt av pipettering opp og ned eller lys uro i cuvette. Instruksjonene programvare å analysere prøven.
      Merk: Crosslinking av NPs kan kvalitativt vurderes av DLS bruker et godt løsningsmiddel som DMSO eller vannistedenfor (DMF) som DLS fortynningsmiddel20. Partikler som er stabilt krysskoblet har en autokorrelasjon funksjon i løsemiddelet med minimal endring i partikkelstørrelse. Dårlig krysskoblet partikler svelle og viser en svak autokorrelasjon funksjon og spredning styrke21.
    3. Du kan også legge en base, som ammoniakk, å kjøre ioniske complexation og styrke crosslinking i partikkel kjernen.
      1. Alternativt kan du forberede en 3,48 mg/mL løsning av ammoniakk i metanol gravimetrically bruker ammonium hydroksid løsning (vanligvis 30 wt % ammoniakk). Tilsett 50 μL (dvs., 0,6 ekvivalenter forhold til syre gruppene i polymer) dropwise med omrøring.
        Merk: Ekvivalenter kan justeres ved varierende enten konsentrasjonen eller volumet lagt25.
      2. Eventuelt alder ikke mindre enn 30 min med mild omrøring for crosslinking oppstår.
    4. Prosessen NP spredning å produsere enten microparticles eller belagt NPs som beskrevet i litteraturen19,20,21.

3. innkapsling av Ovalbumin i invertert NPs ved hjelp av en μMIVM

  1. Forberede løsemiddel og antisolvent løsninger.
    1. Forberede en 50 mg/mL løsning av ovalbumin i deionisert vann ("OVA").
    2. Klargjør 0,75 mL løsning A i en 1,5 mL sentrifuge rør ved utvannende 75 μL av OVA løsningen med 0.675 mL DMSO generere en 5 mg/mL løsning av OVA i DMSO som inneholder 10% vann etter volum. Bland godt og sentrifuge kort som beskrevet tidligere.
      Merk: Se trinn 2.1.6 om vann effekter. Som i forrige avsnitt, kan løsning volumene skaleres opp eller ned passer materielle behov.
    3. Klargjør løsning B ved oppløsning blokk copolymer stabilisator (dvs., poly(styrene) -b- poly (akryl acid), PS5 k-b- PAA4.8 k) i DMSO på 6 mg/mL. Bland godt og sonicate for å oppløse hvis nødvendig. Pipetter 0,75 mL i en 1,5 mL sentrifuge rør.
    4. Pipetter 0,75 mL THF (løsning C) inn i et 1,5 mL sentrifuge rør.
    5. Pipetter 1,85 mL kloroform (løsning D) i et hetteglass for scintillation.
    6. Klargjør en 60.0 mg/mL veisalt dihydrate crosslinker løsning i metanol. Bland med en vortex blandebatteri.
    7. Forberede en 4.17 mg/mL ammoniakk løsning i metanol som beskrevet i trinn 2.3.4.
    8. Legge til 5,25 mL kloroform en 15 mL sentrifuge rør og undertrykking av badet.
  2. Forberede blandebatteri assembly og stå.
    1. Samle bunnen mottaker, blande geometri disk, topp disken, skiftenøkkel skiftenøkkel og en O-ring. Se figur 2 for skjematisk av komponenter og blandebatteri stå terminologi.
      Merk: Detaljer om MIVM bygging kan finnes i Tilleggsinformasjon (del 1) og litteratur22. CAD-filer er også tilgjengelig som Tilleggsinformasjon .
    2. Sted O-ring i sporet, slik at det passer godt og at det er ingen tegn på slitasje eller skade.
      Merk: Normal drift vil føre til slitt eller løsemiddel-hovne o-ringer. Hvis O-ring vises strukket eller deformert, tillate den å lufttørke natten før bruk. Hvis figuren ikke gjenopprettes over natten, kast O-ring. Holde et stort lager, som dette er en forbruksvare del.
    3. Nøye justere blande disk hullene med pinnene på toppen disken og trykk sammen. Kontroller at O-ring ikke bli fordrevet ved å merke de to stykker sitte flush.
    4. Inverterer de to stykker og manuelt settes sammen med nedre mottakeren. Kontroller at uttaket rør montering har vært løsnet slik at det ikke forstyrrer komplett innstramming av disken.
      Merk: Hvis tråder fangstene ved monteringen, nøye demontere og bruker en mat - eller farmasøytiske-grade anti-gripe til threading for å hindre galling.
    5. Etter manuell stramme, passer skiftenøkkel skiftenøkkelen til beste disk pinnene og tett stramme forsamlingen. Stram stikkontakt rør montering slik at det sitter fast mot bunnen mot blande geometrien. Kontroller at sprøyten beslag på topp disken er tettsittende.
    6. Plass montert blandebatteri oppå stativet blandebatteri slik at uttaket slangen går under støtteplaten. Støtte mobile platen slik at det er suspendert ut av veien for arbeidsområdet.
    7. Eventuelt sprøyter kontrollere Mekanisk stopp justering, festes tomme glass til mikser viker.
      Merk: Volumetriske flowrates er varierte bruker sprøyter annet diameter, siden sprøyter er deprimert samtidig på samme lineære hastighet. Innledende og avsluttende loddrette høyden må være den samme for alle sprøyter og kan justeres med festeskruene banket inn stempelet aksel22. Mekanisk stopper sikre at overdreven skade glass sprøyter ikke oppstår.
      1. Eventuelt kommer lavere mobile platen slik at til å hvile på den mekaniske stopper. Kontroller at dette er justert slik at platen kommer også til å hvile umiddelbart før du kontakter tom sprøyter (som vist i figur 2).
      2. Eventuelt løsne i mekanisk stopper og omplassere, hvis nødvendig. Fjerne glass sprøyter og tilbakestille mobile plate ut av veien.
        Merk: For operasjon med plast sprøyter, mekanisk stopper kreves ikke.
    8. Plass åpne undertrykking av badekaret under stikkontakt slangen å samle avløpsvann.
    9. Tegne løsning A 1 mL gass-tette sprøyter med en butt tupp nål til. Fjerne alle luftbobler og kast på nålen. Prime løsningen på slutten av sprøyte luer montering. Gjenta denne prosessen for løsninger B og C.
    10. Tegne løsning D 2,5 mL gass-tette sprøyter med en butt tupp nål til. Fjerne alle luftbobler og kast på nålen. Prime løsningen på slutten av sprøyte luer montering.
      Merk: Disse volumene er valgt slik at den første sprøyte stempelet høyden er de samme. Hvis volumer er endret, må de fortsatt oppfylle denne høyden kravet.
    11. Montere fire sprøyter på mikseren i klokkeretning alfabetisk. Se figur 1B endelige utseendet og sprøyte retningen skjematisk.
      Merk: Kontroller at ingen sprøyte høyde er signifikant forskjellig fra de andre og feilsøke etter behov.
  3. Utføre mikser bruk og rengjøring.
    1. Grep peiling bolig på begge sider av mobile plate. Ikke Legg fingrene på bunnen ansiktet til huset fordi dette er en klype fare mot mekanisk stopper. Sakte senke mobile platen slik at den hviler jevnt men knapt berøre sprøyter.
    2. Jevnt og smidig trykke ned platen, satsing å fullføre operasjonen i ca 0,5-1 s for disse streame volumer22.
      1. Fjerne og lue quench badekar som inneholder nå NP spredning.
    3. Ta blandebatteri med sprøyter fortsatt festet og holde over et avfallsbeholderen. Fjerne sprøyter, slik at hold opp volumet til renne til beholderen. Hold samlingen mikser opp og demontere mikseren ved hjelp av skiftenøkkel skiftenøkkelen.
    4. Bruker en sprayflaske, skyll stikkontakt slangen med flere ml løsemiddel (f.eks aceton) og tørk med luft eller nitrogen.
    5. Skyll blande geometrien med et godt løsningsmiddel (f.eks vaskebuffer vann eller DMSO) og deretter skylle med aceton bruker flere ml fra en sprayflaske. Tørr med en luft eller nitrogen strøm.
    6. Skyll O-ring i en strøm av deionisert vann og blot tørr.
    7. Skyll topp disken grundig med flere ml aceton bruker en løsemiddel flaske til visuelt rene. Tørr med en luft eller nitrogen strøm både overflaten og beslag på sprøyten.
    8. Skyll hver sprøyte med flere ml et godt løsningsmiddel (f.eks vaskebuffer vann eller aceton) fra en løsemiddel flaske. Bruk en siste skylling av flere ml aceton og lufttørke før neste bruk.
  4. Utføre etterbehandling og analyse.
    1. Tilsett 50 μL av veisalt dihydrate crosslinker løsningen dropwise under omrøring på ca 75% maksimal hastighet.
    2. Tilsett 50 μL av ammoniakk løsningen dropwise under omrøring med 75% maksimal hastighet. Alder i minst 30 min.
    3. Karakterisere NP størrelsen som beskrevet i trinn 2.3.1 og 2.3.2.
    4. Prosessen NP spredning å produsere enten microparticles eller belagt NPs som beskrevet i litteraturen19,20,21.

4. endringer i formulering skalere opp

  1. Forberede den løsemiddel og antisolvent løsninger som beskrevet i trinnene 1, 2 eller 3 ønskede sammensetningen og tilstrekkelig volum for nødvendige formulering størrelsen.
  2. Eventuelt om nødvendig rengjøres og steriliseres mikseren på plass med en egnet protokoll før NP-formasjonen.
    Merk: Sekvensiell skyller CIP 100, vann (til nøytral pH), CIP 200, vann (til nøytral pH) og en passende løsemiddel har vært ansatt i siste. I tillegg kan sterilt filtre knyttes til sundene på mikseren i tilfeller der siste partikkelstørrelse utelukker sterilisering ved filtrering.
  3. Laste inn løsningene i gass-tette sprøyter egnet volum og fest polytetrafluoroethylene (PTFE) rør med luer-adapter på slutten. Manuelt prime løsninger til slutten av slangen.
    1. Laste inn sprøyter i en sprøytepumpe og fest sprøyter til mikser viker på CIJ eller MIVM, som kreves.
      Merk: Alternativt Strømningsreguleringsutstyr kan brukes på lab eller pilot skala for å gi større volum evner enn en sprøytepumpe. Vellykket operasjon krever jevn flyt og tilstrekkelig trykkfall, som betyr at trykksatt fartøy med flyt måling på utløpet er det mest passende valget for storskala produksjon.
  4. Plass en samling fartøy med quench bad av tilstrekkelig volum, hvis nødvendig, under slangen uttaket.
  5. Angi volumetriske flyten prisene å matche de oppnådd manuelt (f.eks om 30-60 mL/min per stream).
    Merk: Hvis bruker CIJ, strømningshastigheter pumpen må være identiske. Hvis bruker MIVM, kan ulike innganger ha forskjellige strømningshastigheter.
  6. Samtidig Begynn pumpene. Samle ca 5-10 mL av avløpsvann som avfall i små ampuller (dette er en "oppstart volum"), og deretter begynne å samle inn i undertrykking av badekaret.
  7. Karakterisere og behandle som beskrevet i tilsvarende formulering avsnittet ovenfor.

Representative Results

Screening av NP formuleringer med FNP er rask og krever små mengder materiale (på 1-10 mg). FNP protokollen å kapsle hydrofobe forbindelser som vitamin E (trinn 1) gir en stabil, klar eller lett opaliserende NP spredning. Dynamisk lysspredning (DLS) gir en robust betyr å karakterisere partikkelstørrelse. Som vist i Figur 3, produserer prosessen NPs med en lav polydispersity på en reproduserbar måte. Typisk polydispersity indeksen (PDI) er mindre enn 0,20, som indikerer en relativt monodisperse befolkningen. PDI hentes fra funksjonen autokorrelasjon og ofte implementert i instrumentet programvare. Det er et forhold mellom andre til første øyeblikk, der verdiene i 0,1 hentes vanligvis for monodisperse partikler26. For fire vitamin E/PS-b-PEG formulering gjentak rapportert, verdien var 0,12 ± 0,02 og gjennomsnittlig diameter var 107 ± 7 nm. En typisk "ubeskyttede" på grunn av enten ujevne depresjon av sprøyter eller langsommere depresjon er også rapportert i Figur 3. Polydispersity var upåvirket, men størrelsen var litt større (135 nm). Inkludert dette eksemplet er de nye beregningene for partikkelstørrelse 113 ± 14 nm. En klikke resulterer i perioder hvor kammeret inneholder bare en enkelt strømmen. Det er viktig at hele strømmen opplever de samme historikk og relativ mengder organisk og vandig bekkene i mikseren. Uten en stabilisator produseres en ugjennomsiktig løsning med synlige aggregat. Funksjonen DLS autokorrelasjon for dette eksemplet er ikke-monotoniske og råtner ikke jevnt, som vist i Figur 3 rammemargen.

Partikkel størrelse-kontrollen av FNP er vist i Figur 4, hvor varierende de relative mengdene av kjernemateriale-poly(styrene)1.8 k i dette tilfellet- og PS -b-PEG stabilisator resulterte i partikler størrelser som varierte fra 49-152 nm. Disse partikkelstørrelser ble generert med THF strømmer som inneholder en totale masse konsentrasjon av kjernen og stabilisator av 20 mg/mL, hvor 25%, 50% og 75% av var kjernemateriale poly(styrene). Polydispersity av nanopartikler var alltid mindre enn 0,15. Omfattende diskusjon av parameteren effekter på partikkelstørrelse produsert av FNP kan finnes i litteratur10. Lasting stilles ved å holde løsemiddel volum konstant og varierende forhold volumene av kjernen og stabilisator lager løsninger. Tilsvarende kan den totale masse konsentrasjonen endres ved å forberede lager løsninger på verdier enn 10 mg/mL. Under visse forhold er det mulig å observere en tom micelle befolkning av DLS27. Dette har ikke noen skadelig effekt enn utvide størrelsesDistribusjon målt partikkel. Når størrelsen er like, kan dette manifestere som en enkelt bred topp i stedet for to separate toppene.

Samme CIJ blandebatteri kan også brukes til å kapsle hydrofile forbindelser ved iFNP, som eksemplifisert i trinn 2 av protokollen. Partiklene produsert i rapporterte utformingen er rundt 65 nm med en lav polydispersity av 0,08. StørrelsesDistribusjon kan ses i figur 5A (stiplet linje). Effekten av crosslinking PAA karboksylsyre rester på partikkel stabilitet er demonstrert av DLS analyse i en sterke løsemidler som DMSO, som vist i figur 5B. Funksjonen autokorrelasjon for godt-krysskoblet partikler bør starte nær verdien 1 og slipp kraftig 0 om gangen karakteristiske som er knyttet til partikkelstørrelse (heltrukket linje). Partikler som svulmer mye eller løses ikke krysskoblet og Vis minimal autokorrelasjon signal (stiplet linje). For iFNP manifestere mislykkede forsøk på lignende måter som FNP ovenfor. Synlig aggregater kan bli sett eller dårlig DLS autokorrelasjon funksjonen form kan observeres. MIVM kan brukes for FNP eller iFNP når mer enn to innløp bekker på grunn av systemet begrensninger som løselighet eller kjemiske inkompatibilitet. En mindre versjon av MIVM (μMIVM) med sin stand blandebatteri er vist i figur 2. Som med CIJ, kan denne blandebatteri brukes til å kapsle hydrofobe eller hydrofile forbindelser22. En protokoll for innkapsling av en hydrofile protein, egg, av iFNP ble beskrevet i trinn 3. Partikkel størrelsesDistribusjon vises i figur 5A (heltrukket linje). Størrelsen er rundt 125 nm med en PDI av 0,16. En generell protokoll for sprøyten pumpe drift ved større skala er gitt i trinn 4.

Figure 1
Figur 1: blandebatteri assembly og intern flyt mønster skjemaer. (A) den trange impinging jetfly (CIJ) mikser med vedlagte sprøyter er plassert over undertrykking av badekaret. Ikke avbildet er en rør bar i quench bad ampullen og røre plate. Blande geometrien er avbildet i utvidet visning viser de to strømmen sundene som impinge midt i kammeret. (B) en multi innløp vortex blandebatteri (μMIVM) er vist med glass sprøyter og plassert i stå ovenfor en quench bad. Mobile platen og mekanisk stopper har blitt beskåret fra bildet. Utvidet visning viser vortex kammeret og inntak kanaler skjematisk. (C) en skjematisk fremstilling av kjerne-shell NPs produsert av FNP. Rød kuler representerer den terapeutiske som, kombinert med blå skjult polymer blokken, utgjør kjernen NP. Gul polymer blokken danner pensel lag formidle steric stabilisering med NPs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: μMIVM terminologi og komponenter for assembly. ΜMIVM krever en mikser stå å aktivere uniform depresjonen i fire sprøyter. I dette tilfellet må sprøyte stempelet høydene alle være ensartet å sikre konsekvent miksing. Det kan også brukes med sprøyte pumper. Standen blandebatteri med merket komponenter vises til venstre i figuren. Til høyre er demontert blandebatteri med O-ring på plass på blande geometri disken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Partikkel størrelse distribusjon av polymere nanopartikler som inneholder en kjerne av vitamin E og stabilisert av PS -b-PEG. Dynamisk lysspredning (DLS) gir intensitet-vektet størrelse distribusjoner som angir NP diameter fordelingen. Kurver er gjennomsnittet av tre eksemplarer analyser for hvert forsøk og har vært skala for å produsere identiske maksimal topp høyder. De fire replikat (heltrukket linje) indikerer den høye reproduserbarhet metoden (standardavvik = 7 nm). Også inkludert er en representant klikke (stiplet linje), som sprøyte langsommere eller ujevn depresjonen i to sprøyter, som resulterer i større partikkel diameter. Standardavviket av NP inkludert klikke var 14 nm. (Innsatt) Uten PS -b-PEG stabilisator, store mikron skala aggregater (eller dråper, i tilfelle av en olje som vitamin E) er dannet. Funksjonen DLS autokorrelasjon rensing uten stabilisator (stiplet linje) vises sammen med en representant autokorrelasjon fra en hydrogenion gjenskape (heltrukket linje). Funksjonen autokorrelasjon viser en rekke karakteristiske tidsrammer for kontroll prøven, som angir polydisperse innbyggere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: partikkel størrelse-kontrollen av FNP gjennom varierende relative prosenter av materialet til stabilisator. Intensitet-vektet størrelse distribusjonen av tre formuleringer med en poly(styrene) kjerne stabilisert av PS -b-PEG er avbildet. Den totale masse konsentrasjonen i THF var 20 mg/mL av antisolvent var vann. Formuleringene ble utarbeidet i en CIJ mikser. Brøkdel av massen består av kjernemateriale vises i forklaringen. For eksempel 25% kjernen utvalget inneholder 5 mg/mL poly(styrene) og 15 mg/mL PS -b-pinne. De gjennomsnittlige størrelsene for 25% (heltrukket linje), 50% (stiplet linje) og 75% (blandet dash linje) core belastninger var 49 nm, 96 nm og 152 nm, henholdsvis. Alle PDI verdier var mindre enn 0,15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: karakterisering av invertert NPs i en CIJ mikser eller μMIVM. (A) DLS kurver er gjennomsnittet av tre eksemplarer analyser for hver formulering. Den stiplede linjen angir størrelsesDistribusjon av 3 k MD partikler gjort i CIJ mikseren mens den heltrukne linjen er størrelsesDistribusjon av OVA partikler i μMIVM. (B) styrke crosslinking kan vurderes av DLS med DMSO som fortynningsmiddel. Funksjonen DLS autokorrelasjon angir styrken på crosslinking gjennom første autokorrelasjon verdien og observasjon av en ryddig overgang til en verdi på null. Den stiplede linjen viser autokorrelasjon funksjonen for en partikkel med ingen crosslinker viser et svakt første signal og en bred nedbrytning tiden. Den heltrukne linjen viser autokorrelasjon etter en sterk crosslinker (i dette tilfellet tetraethylenepentamine), som viser et sterkt signal om første og en definert forfall tidsskala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Supersaturation, S, som en funksjon av de relative blandingsforhold organisk løsemiddel vann. (A) sammenligning av høyeste oppnåelige supersaturation for (○) boscalid, plantevernmidler og (■) peptid B, en syv-rester modell peptid. Organisk strømmen inneholder boscalid i en konsentrasjon av 230 mg/mL og peptid B på 200 mg/mL, konsentrasjonene metning. Det er en maksimal supersaturation som avhenger av hver aktive farmasøytiske ingrediens (API) / løsemiddel systemet. (B) når konsentrasjonen av boscalid i organisk strømmen er redusert 20-fold, forholdene som supersaturation og nanoprecipitation er oppnådd blir begrenset. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Elsevier9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Innkapsling av hydrofobe forbindelser som vitamin E, som i trinn 1 av protokollen, har vært mye beskrevet9,14,28. Relativt er monodisperse partikler produsert fordi tidsskalaen for miksing er kortere enn tidsskalaen for aggregering og vekst av partikler. Spesielt blir blandet løsemiddel/antisolvent løsningen raskt homogen, som gjør at nucleation å skje jevnt. Montering av blokk copolymer til partikkel overflaten deretter gir steric stabilisering som stopper partikkel vekst5. Siden blande tid i kammeret (turbulens) er en funksjon av strømningshastigheter innløpet til CIJ eller MIVM, er det en vik, som oppstår etter overgangen til turbulente miksing, hvor partikkelstørrelse er i hovedsak konstant13. Dette gir mer robusthet til prosessen som noen parti til parti variasjon i innløpet strømningshastighet (dvs., sprøyte depresjon fart) kan tolereres uten betydelig innvirkning på den endelige NP størrelsen sett fra Figur 3. Tregere eller ujevn innløp hastigheter kan resultere i større partikler eller mer polydisperse distribusjoner, som for eksempel klikke. FNP har også blitt utvidet for å kapsle hydrofile forbindelser i nanopartikler av inverse Flash NanoPrecipitation. Disse invertert nanopartikler kan deretter brukes til å opprette microparticles eller være belagt med PEG opprette vann-dispergerbare nanopartikler25. De underliggende prinsippene for montering forblir den samme, men det er ekstra kompleksitet crosslinking partikkel kjernen. Dette er nødvendig for stabilisering av partikkel i vandig miljø. Generelt, er en 1:1 gratis forhold sammenlignet polyacid blokken tilstrekkelig, men ioniske interaksjoner kan fremmes ved pH justering gjennom tillegg av en base19. I denne protokollen, har bare første prosesstrinnet til skjemaet invertert NPs blitt beskrevet.

I tillegg til rask miksing er vellykket formulering av FNP eller iFNP der flere vilkår kan være møtte9,14. Først hele strømmen innganger må blandbar. Mens emulsjoner blir brukt til å produsere NPs krever FNP en enhetlig løsning fase i mikseren. Andre må kjernen være nesten uløselig på løsemiddel betingelsene i mikseren (for CIJ, en 50/50 blanding av volumet) å kjøre rask nucleation. Ellers, en betydelig del blir unencapsulated eller fremskynde etter ytterligere fortynning med antisolvent. MIVM kan aktivere høyere antisolvent innhold i miksing kammeret til adressen kjernen materiale løselighet begrensninger. Det er ofte nyttig å generere supersaturation kurver fra løselighet data som en funksjon av løsemiddel sammensetning å lede prosessen design9. Figur 6 viser representant kurver for to forbindelser. Lav supersaturation på blande kammer forhold fortjeneste ved forskjellige komposisjoner, vanligvis ved hjelp av MIVM. Høyere supersaturation favoriserer nucleation av kjernen komponenten partikkel vekst men en konflikt i samlingen kjernemateriale og stabilisatoren kan resultere i store mengder av den terapeutiske. D'Addio og Prud'homme har gjennomgått anvendelsen av slike supersaturation kurver i detalj9. Endelig BCP må molecularly oppløst i løsemidler strømmen og antisolvent strømmen må være selektiv for en blokk. BCP må være tilstrekkelig amphiphilic til å gi både en solvophobic drivkraft fra skjulte blokken å forankre stabilisator på partikkel overflaten og solvated blokken å formidle steric stabilitet partikkel. Løsemidler utenom det som er beskrevet i protokollen kan brukes så lenge de oppfyller disse betingelsene.

Praksis med manuell sprøyte operasjonen kan forbedre suksessrate under screening. Som nevnt ovenfor, betyr drift over overgangen til homogen, turbulente blanding forhold at små variasjoner i infusjonshastigheten er tolerert i prosessen28. Skalere opp til pumpen-drevet, datastyrt flyter gir enda større gevinster i konsistensen på grunn av reproduserbar innløp flow priser. Når som helst under etterbehandling av partikler, kan visuell inspeksjon eller DLS analyse indikere tilstedeværelse av store mengder som kan skyldes tilfeldig støv eller partikkel ustabilitet. Ved behov kan strømmen filtreres med en riktig filter porestørrelse. I fravær av aggregater, har vi funnet at mindre enn 5% er vanligvis tapt ved filtrering PEG-belagt nanopartikler hvis nominell filter er større enn størrelsesDistribusjon partikkel. Når du filtrerer aggregater, er eksperimentell bestemmelse av masse tapt under prosessen nødvendig. Kvantifisering av masse tapet kan utføres på to måter. Totalt tørrstoff massen i et gitt volum kan bestemmes av thermogravimetric analyse før og etter filtrering å identifisere omfanget av endring (se Tilleggsinformasjon delen 2). Alternativt partikler kan være gjenopprettet (f.eksav lyophilization) og oppløst i et godt løsningsmiddel. Konsentrasjonen av kjernemateriale kan deretter direkte måles ved en passende teknikk som UV-synlig spectrophotometry eller kromatografi.

For FNP, må de resterende 10 vol % organisk løsemiddelet (f.eksTHF) fjernes fra vandig spredning. Dette kan gjøres etter fordamping destillasjon14,29, dialyse30eller tangentiell flyt filtrering31,32. Praktiske hensyn for hvert er beskrevet i sitatene gitt. For dialyse er typisk membraner 3,5 kDa eller 6-8 kDa konsentrasjon, om større alternativer er tilgjengelig. Denne molekylvekt cutoff er tilstrekkelig for fjerning når dialyzed 24 h bruker flere bad endringer. Bruk av tangentiell flyt filtrering innebærer noen Prosessutvikling som må være forsiktig å unngå inducing samling på grunn av konsentrasjon polarisering på membran overflaten. Vi har funnet at å redusere den organiske løsemidler sammensetningen under en system-avhengige verdi, vanligvis 2-10 vol %, eliminerer samling på membran overflaten. Etter bearbeiding, konsentrasjonen av nanopartikler bestemmes lett av thermogravimetric analyse (se Tilleggsinformasjon delen 2). Er det ofte ønskelig å transport eller lagre partikler i en svært stabil form. Aqueous dispersions kan bare være frosset raskt bruke en tørris/aceton blanding og deretter lagret på-80 ° C. Alternativt, tørt pulver kan fås ved lyophilization33,34 eller spray tørking24. Ofte legges en kryoprotektant til redusere hydrogenion aggregering under frysing eller tørke. Sukker (sucrose, trehalose, etc.), poly(ethylene glycol) eller syklodekstriner kan bli vist for effektivitet over en rekke konsentrasjoner av overvåking størrelse av DLS35,36,37, 38. Vanlige NP stabilitetsproblemer under behandlingen er ofte knyttet til løselighet eller fase separasjon i kjernen resulterer i omorganisering mot en lavere energi tilstand under forhold der mobilitet er økt. Bruk av co kjernen materialer, alternativ stabilisatorer eller endret eksternt løsning komposisjon kan forbedre stabilitet14,16,17,39,40, 41.

Som nevnt ovenfor, kan MIVM høyere antisolvent innhold i miksing kammeret når må oppnådde høy supersaturation. Det kan også gi fysiske segregering av arter i mer enn to bekker når reaktivitet eller løselighet betingelser krever det.. Et eksempel er dannelsen av zein protein-stabilisert nanopartikler antibiotika clofazimine24. Den hydrofobe clofazimine er innført i en aceton strøm; Zein er innført i en 60% ethanolic vandig strøm; kasein, hvilke komplekser med zein, er med en vandig buffer strøm, og den fjerde er ekstra buffer for å øke andelen vann aceton og etanol. To løsemiddel bekker er nødvendig siden clofazimine og zein ikke er løselig i et felles løsemiddel. Denne prosessen kan ikke gjøres i en to-jet CIJ blandebatteri. Denne protein-stabilisert formulering demonstrerer også at FNP ikke er begrenset til BCP stabilisatorer. Janus partikler har vært produsert uten stabilisator42 og en rekke rimelige stabilisatorer er blitt demonstrert for muntlig programmer24. Spesielt kan copolymers som hydroksypropylcellulose methylcellulose brukes i stedet for blokk copolymers24. Kjernen materialer kan gjøres mer hydrofobe av en rekke teknikker. Hydrofobe ion sammenkobling er brukt for å kapsle en rekke forbindelser som har middels løselighet43,44,45. Ekstremt hydrofobe prodrugs har blitt generert og deretter innkapslet46. Nukleinsyrer har vært innkapslet gjennom complexation med kationisk lipider47. Viktigere, har disse studier vist at FNP kan produsere en rekke partikkel overflaten kjemikalier. Videre, blandet stabilisatorer som inneholder en brøkdel av BCP som er endret med en målretting ligand på hele kjeden har blitt brukt. Dette gjør nøyaktig kontroll over ligand innhold på overflaten siden partikkel sammensetningen gjenspeiler Inndataflyten komposisjon23,48. Tilsvarende er det mulig å bruke flere kjernekomponentene også, inkludert fargestoffer og uorganisk nanopartikler3,8.

Flash NanoPrecipitation er en skalerbar tilnærming til polymere nanopartikler består av enten en hydrofobe eller en hydrofile kjerne. Hvis kriteriene som foreskrives ovenfor er oppfylt, er vanligvis over 95% av kjernemateriale innkapslet med høy masse brøk i partikkel. De tre eksemplene presenteres her ble utført på benken skala, krever noen milligram og ca 0,5 mL i hver vik stream. Dette gir rask screening av partikkel betingelser for formulering optimalisering. Skalere opp bly formuleringer større satsvise størrelser er et spørsmål om kjører prosessen for lenger, som kan lett oppnås gjennom bruk av sprøyten pumper eller Strømningsreguleringsutstyr. Derimot overfor skalere opp av bulk tillegg nanoprecipitation veldokumenterte utfordringer i å opprettholde tilstrekkelig micromixing på tillegg og regnskap for effekten av skiftende fartøyet geometri49. Dette er en stor barriere, siden det er avgjørende å produsere partikler på en konsekvent måte å møte FDA krav50. MicroFluidics teknikker kan også produsere uniform, reproduserbare nanopartikler, men bare gjør produksjonen i området mg. For eksempel rapportert Karnik et al. produksjon priser på 0,25 mg/min for en narkotika-versjon studere51. Ytterligere skalere opp vanligvis innebærer parallelization høy Capital som koster12. Med FNP er det enkelt å produsere 1 gram nanopartikler på 600 mg/min med en sprøytepumpe og noen tilbehør til å koble til mikseren viker. Følgelig representerer FNP både en tilgjengelig lab skala screening verktøyet samt en skalerbar tilnærming til NP produksjon for translasjonsforskning arbeid.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), Bill og Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) og National Science Foundation Graduate forskning fellesskap (DGE-1656466) tildelt K.D.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting - CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule - CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing - CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting - MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing - MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J., Corrie, S. R. Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research. 33 (10), 2373-2387 (2016).
  2. D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  3. Gindy, M. E., Prud'homme, R. K. Multifunctional nanoparticles for imaging, delivery and targeting in cancer therapy. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (8), 865-878 (2009).
  4. Chen, G., Roy, I., Yang, C., Prasad, P. N. Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy. Chemical Reviews. 116 (5), 2826-2885 (2016).
  5. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302-118302 (2003).
  6. Schubert, S., Delaney, J. J. T., Schubert, U. S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 7 (5), 1581-1588 (2011).
  7. Lebouille, J. G. J. L., Stepanyan, R., Slot, J. J. M., Cohen Stuart, M. A., Tuinier, R. Nanoprecipitation of polymers in a bad solvent. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 225-235 (2013).
  8. Akbulut, M., et al. Generic method of preparing multifunctional fluorescent nanoparticles using flash nanoPrecipitation. Advanced Functional Materials. 19 (5), 718-725 (2009).
  9. D'Addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (6), 417-426 (2011).
  10. Pagels, R. F., Edelstein, J., Tang, C., Prud'homme, R. K. Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano Letters. 18 (2), 1139-1144 (2018).
  11. Ding, S., Anton, N., Vandamme, T. F., Serra, C. A. Microfluidic nanoprecipitation systems for preparing pure drug or polymeric drug loaded nanoparticles: an overview. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (10), 1447-1460 (2016).
  12. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  13. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE Journal. 49 (9), 2264-2282 (2003).
  14. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  15. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  16. Kumar, V., Wang, L., Riebe, M., Tung, H. H., Prud'homme, R. K. Formulation and stability of itraconazole and odanacatib nanoparticles: Governing physical parameters. Molecular Pharmaceutics. 6 (4), 1118-1124 (2009).
  17. Liu, Y., Kathan, K., Saad, W., Prud'homme, R. K. Ostwald Ripening of β -Carotene Nanoparticles. Physical Review Letters. 98 (3), 036102-036102 (2007).
  18. Liu, Y., Cheng, C., Liu, Y., Prud'homme, R. K., Fox, R. O. Mixing in a multi-inlet vortex mixer (MIVM) for flash nano-precipitation. Chemical Engineering Science. 63, 2829-2842 (2008).
  19. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Polymeric nanoparticles and microparticles for the delivery of peptides, biologics, and soluble therapeutics. Journal of Controlled Release. 219, 519-535 (2015).
  20. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Ch. 11. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 249-274 (2017).
  21. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Ch. 12. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 275-296 (2017).
  22. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a Small-Scale Multi-Inlet Vortex Mixer for Scalable Nanoparticle Production and Application to the Encapsulation of Biologics by Inverse Flash NanoPrecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  23. Gindy, M. E., Ji, S., Hoye, T. R., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'Homme, R. K. Preparation of poly(ethylene glycol) protected nanoparticles with variable bioconjugate ligand density. Biomacromolecules. 9 (10), 2705-2711 (2008).
  24. Zhang, Y., et al. Design and Solidification of Fast-Releasing Clofazimine Nanoparticles for Treatment of Cryptosporidiosis. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3480-3488 (2017).
  25. Pagels, R. F. Polymeric Nanoparticles and Microparticles for the Delivery of Hydrophobic and Hydrophilic Therapeutics. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2018).
  26. Frisken, B. J. Revisiting the method of cumulants for the analysis of dynamic light-scattering data. Applied Optics. 40 (24), 4087-4091 (2001).
  27. Budijono, S. J., Russ, B., Saad, W., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Block copolymer surface coverage on nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 360 (1-3), 105-110 (2010).
  28. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation of Organic Actives and Block Copolymers using a Confined Impinging Jets Mixer. Australia Journal of Chemistry. 56, 1021-1024 (2003).
  29. Kumar, V., Prud'homme, R. K. Nanoparticle stability: Processing pathways for solvent removal. Chemical Engineering Science. 64 (6), 1358-1361 (2009).
  30. Shi, L., Shan, J., Ju, Y., Aikens, P., Prud'homme, R. K. Nanoparticles as delivery vehicles for sunscreen agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 122-129 (2012).
  31. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of Diafiltration and Tangential Flow Filtration for Purification of Nanoparticle Suspensions. Pharmaceutical Research. 22 (12), 2152-2162 (2005).
  32. Pansare, V. J., Tien, D., Thoniyot, P., Prud'homme, R. K. Ultrafiltration of nanoparticle colloids. Journal of Membrane Science. 538, 41-49 (2017).
  33. D'Addio, S. M., et al. Novel Method for Concentrating and Drying Polymeric Nanoparticles: Hydrogen Bonding Coacervate Precipitation. Molecular Pharmaceutics. 7 (2), 557-564 (2010).
  34. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1688-1713 (2006).
  35. Correa, S., et al. Highly Scalable, Closed-Loop Synthesis of Drug-Loaded, Layer-by-Layer Nanoparticles. Advanced Functional Materials. 26 (7), 991-1003 (2016).
  36. Figueroa, C. Engineering Nanoparticles for Pharmaceutical Applications: Formulation and Freeze-drying Techniques. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2014).
  37. Harada, A., Li, J., Kamachi, M. Preparation and properties of inclusion complexes of polyethylene glycol with alpha-cyclodextrin. Macromolecules. 26 (21), 5698-5703 (1993).
  38. Troiano, G., Song, Y. -H., Zale, S., Wright, J., Van Geen Hoven, C. Stable Formulations for Lyophilizing Therapeutic Particles. United States patent. , (2013).
  39. Kumar, V., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Fluorescent polymeric nanoparticles: Aggregation and phase behavior of pyrene and amphotericin B molecules in nanoparticle cores. Small. 6 (24), 2907-2914 (2010).
  40. Budijono, S. J., et al. Synthesis of stable block-copolymer-protected NaYF4:Yb3+, Er3+up-converting phosphor nanoparticles. Chemistry of Materials. 22 (2), 311-318 (2010).
  41. Chen, T., et al. Protected peptide nanoparticles: Experiments and brownian dynamics simulations of the energetics of assembly. Nano Letters. 9 (6), 2218-2222 (2009).
  42. Sosa, C., et al. Soft Multifaced and Patchy Colloids by Constrained Volume Self-Assembly. Macromolecules. 49 (9), 3580-3585 (2016).
  43. Pinkerton, N. M., et al. Formation of stable nanocarriers by in situ ion pairing during block-copolymer-directed rapid precipitation. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 319-328 (2013).
  44. Lu, H. D., Rummaneethorn, P., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Hydrophobic Ion Pairing of Peptide Antibiotics for Processing into Controlled Release Nanocarrier Formulations. Molecular Pharmaceutics. 15 (1), 216-225 (2018).
  45. Lu, H. D., et al. Encapsulation of OZ439 into Nanoparticles for Supersaturated Drug Release in Oral Malaria Therapy. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 970-979 (2018).
  46. Ansell, S. M., et al. Modulating the Therapeutic Activity of Nanoparticle Delivered Paclitaxel by Manipulating the Hydrophobicity of Prodrug Conjugates. Journal of Medicinal Chemistry. 51 (11), 3288-3296 (2008).
  47. Gindy, M. E., et al. Mechanism of macromolecular structure evolution in self-assembled lipid nanoparticles for siRNA delivery. Langmuir. 30 (16), 4613-4622 (2014).
  48. D'Addio, S. M., et al. Optimization of cell receptor-specific targeting through multivalent surface decoration of polymeric nanocarriers. Journal of Controlled Release. 168 (1), 41-49 (2013).
  49. Perry's Chemical Engineers' Handbook. , McGraw-Hill. 19-20 (2007).
  50. Torrice, M. Does nanomedicine have a delivery problem? ACS Central Science. 2 (7), 434-437 (2016).
  51. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).

Tags

Bioteknologi problemet 143 hydrogenion micromixing blokk copolymer narkotika-leveranser peptid protein prosessen skalere opp
Flash NanoPrecipitation for innkapsling av hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Markwalter, C. E., Pagels, R. F.,… More

Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter