Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58763
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Gene Center and Department of Biochemistry, Center for Protein Science Munich (CIPSM), Ludwig-Maximilians-Universität München

Summary

Här presenterar vi en nya metoden för att fastställa bindande tillhörighet vid jämvikt och i lösning med hög känslighet i stor skala. Detta förbättrar kvantitativ analys av transkription faktorn-DNA-bindning. Metoden är baserad på automatiserade fluorescens anisotropi mätningar i en kontrollerad leverans system.

Abstract

Exakt kvantifiering av transkriptionsfaktor (TF)-DNA interaktioner är viktigt för att förstå reglering av genuttryck. Eftersom befintliga strategier lider betydande begränsningar, har vi utvecklat en ny metod för att bestämma TF-DNA bindande samhörighet med hög känslighet i stor skala. Analysen bygger på etablerade fluorescens anisotropi (FA) principen men introducerar viktiga tekniska förbättringar. Först, vi mäter en full FA konkurrenskraftiga Titrerkurvan i en enda väl genom att införliva TF och fluorescently märkta referens DNA i en porös agaros gelmatris. Omärkta DNA oligomer är laddad på toppen som en konkurrent och genom diffusion, bildar en plats och tid övertoning. Den resulterande FA-gradienten läses sedan upp med en anpassad epifluorescence Mikroskop setup. Denna förbättrade inställning ökar känsligheten hos FA signal upptäckt, så att både svaga och starka bindning till kvantifieras på ett tillförlitligt sätt, även för molekyler av liknande molekylvikter. På detta sätt, vi kan mäta en Titrerkurvan per brunn flera platta och genom montering förfarande, vi kan extrahera både absoluta dissociationskonstant (KD) och aktiva proteinkoncentration. Genom att testa alla enpunkts-mutation varianter av ett visst samförstånd bindande sekvens, kan vi överblicka hela bindande specificitet landskap av en TF, vanligtvis på en enda plåt. De resulterande position vikt matriserna (PWMs) överträffa dem härrör från andra metoder att förutsäga i vivo TF beläggning. Här presenterar vi en utförlig guide för att genomföra HiP-FA på konventionella automatiserade fluorescerande Mikroskop och data analys pipeline.

Introduction

Gett den centrala rollen som transkriptionsfaktorer (TFs) i genreglering, att fastställa sina bindande preferenser på ett kvantitativt sätt är av största vikt. Banbrytande studier av von Hippel infördes uppfattningen att föreskrivande TFs snabbt erkänna DNA, så att deras bindning är väl beskrivna av den thermodynamic equilibriumen, medan nedströms händelserna rekrytera RNA-polymeras att arrangören styrs av långsammare kinetik1. Senaste in-vivo studier tyder på att denna bild är sannolikt mer komplexa2,3. dock dessa allmänna antaganden fungera som bra approximationer och stött många beräkningsvetenskapliga metoder för att hitta cis-reglerande element och förutsäga uttryck från sekvenser4,5,6. Medan jämvikt bindande har således lyckat använts som begrepp, nuvarande metoder för att bestämma TF-DNA interaktioner fokuserar på bindande specificitet och vanligtvis inte direkt åtgärd bindande tillhörighet vid jämvikt. Systematisk mätning av TF-DNA-bindning representerar en stor teknisk utmaning, och de befintliga metoderna har flera olika begränsningar.

Kromatin immunoprecipitation följt av djupa sekvensering (ChIP-seq)7, vanligaste i vivo tekniken, tillåter inte mätning av bindande tillhörighet eller exakt lokalisering av bindande platser inom genomisk fragment. Flera in vitro- metoder, inklusive DNAS Footprints8, elektroforetiska mobilitet Skift (EMSA)9, ytan plasmon resonans (SPR)10och hur provtagningsutrustningen skall thermophoresis11 är kunna mäta bindande tillhörighet, men de är relativt låg genomströmning. Däremot är hög genomströmning tekniker inklusive protein bindande microarrays12, HT-SELEX13,14och bakteriell one-hybrid (B1H)15 inte kunna mäta bindande samhörighet och vanligtvis ger alltför specifika bindande sekvenser, främst på grund av det stränga urvalet eller tvätt steg nödvändigt. Nyare utvecklingar inkluderar djupsekvensering baserat HiTS-FLIP16, SELEX-seq17, och mikrofluidik-baserade MITOMI18 eller leende-Seq19, som möjliggör utvinning av absolut bindande tillhörighet; dock de förlitar sig på att mäta fluorescens intensiteter av märkta TF och DNA. Fluorescens signaler, därför blir begränsande vid låg protein koncentrationer och att fastställa låga KD -värden (< ~ 10 nM). Dessutom finns TF-DNA bindning i dessa metoder, som äger rum på tunna ytor, att ta upp frågor med ospecifik bindning och/eller auto-fluorescens bakgrund, vilket gör det svårt att exakt kvantifiera svag bindning.

För att hantera dessa begränsningar, har vi utvecklat en ny metod för att bestämma TF-DNA affinitet landskapet vid jämvikt och i lösning, som vi kallade högpresterande fluorescens anisotropi (HiP-FA)20. Tekniken är baserad på etablerade fluorescens anisotropi (FA) assay21 men ändrades för att mäta bindande konstanter med hög känslighet och på storskaliga använder en anpassad automatiserad mikroskopet och analys setup.

FA analysen övervakar växelverkan av fluorescently märkta arter (som en DNA oligomer) till en bindande partner, i detta fall en TF, genom att mäta molekylär rotation av märkt molekylen. Vid bindning till TF minskar dess rotationshastighet på grund av den högre hydrodynamiska radien och molekylvikt av bundna komplexet, vilket resulterar i ökad FA. Korrekt mätning av mycket starka bindning (KD < ~ 1 nM) kräver användning av låga koncentrationer av märkt, referens DNA (c < ~ 1 nM). Detta är svårt att uppnå med ett kommersiellt medel som en standard microplate reader. Dessutom är en stor storlek skillnad (10 – 100-faldigt) mellan de bundna och obundna komplex oftast nödvändigt, förbjuda mätning av interaktioner mellan TF bindande domäner och korta DNA-oligomerer, som vanligtvis är av ungefär samma molekylvikt . Slutligen, en full Titrerkurvan normalt kräver förberedelse och mätning av flera brunnar innehållande en koncentration serie för titrering arter.

För att lösa problemen, använder vi en widefield mikroskopi setup, modifierad för att uppnå hög upptäckt känslighet och tillåta FA mätningar vid olika z-positioner för en enda brunn. Detta gör det möjligt för oss att övervaka bindande interaktioner mellan arter av liknande molekylvikt och med hög affinitet. Högre dataflöde uppnås genom att mäta FA i flera platta format och utför en hela titrering serie i en väl kontrollerad leverans system med (figur 1en). Genom att anställa en konkurrenskraftiga bindande assay, extrahera vi dessutom inte bara bindande konstanterna utan också koncentrationen av aktivt protein. Detta är ett viktigt inslag i analysen, eftersom endast en del av de uttryckta TF-molekylerna är aktiva på grund av protein Skellefteåsjukan eller nedbrytning. Den experimentella setup är baserad på en kommersiell epifluorescensmikroskop utrustad med XY - och Z-piezo stadier. Vi uppgraderade systemet med externa laser excitation, sedan upptäckt två utsända linjär polarization komponenter på chip i en EM-CCD-kamera med hög quantum effektivitet för lättare identifiering (figur 1b och 1 c). Systemet använder en hög numeriska bländaröppningen (NA) mål kopplat till en extremt känslig sensor och således ger mycket känsliga FA mätningar. Genom att registrera fluorescens z-stackar, kan bindande interaktioner mätas längs optiska z-axeln när du använder en heterogen matris för reaktanterna. Alla dessa modifieringar lätt kan genomföras på ett befintligt system och är kostnadseffektiva.

Vi anställer en konkurrenskraftiga bindande analys där affinitet av en omärkt DNA oligomer mäts i jämförelse med fluorescently märkta DNA, som fungerar som en referens. TF och referens DNA införlivas vid fasta koncentrationer i en porös agaros gelmatris (por storlek ~ 1 µm) som utgör en icke-interagera miljö för bindningen. Hänvisningen DNA är märkt med Cy5. Detta färgämne visade sig vara väl lämpad för FA mätningar på grund av dess relativt lång fluorescens livstid (~ 1ns) och fluorescens utsläpp i den mån av det synliga spektrumet (låg auto-fluorescens bakgrund). TF koncentrationen är i molar överskott över Cy5-referens DNA, att säkerställa att alla referens DNA är bundet till protein. En lösning av omärkta konkurrent DNA sedan deponeras på gel ytan och diffunderar inne i porösa matrisen, upprätta en koncentrationsgradient c (z, t) som ändras över z-fokalplanet och tiden t (figur 1a, figur 2a-2 c). TF bunden till Cy5-referens DNA är således lokalt utsatt för olika koncentrationer av konkurrenten DNA som tävlar för bindande, vilket leder till ett dynamiskt föränderliga FA av Cy5-referens DNA FAREF(z, t) (figur 2b och 2 c).

För att avgöra den konkurrent koncentrationen c(z,t), vi mäter i separata brunnar (kalibrering brunnar) dynamiskt föränderliga FA signal för Nilen blå (NB) FANB(z, t) (figur 2en och 3). Denna färg intercalates i DNA och fungerar därmed som en DNA sensor för konkurrenten DNA. Med denna kontrollerad leverans system, kan tiotals till hundratals olika DNA-protein bindande tillhörighet mätas inom en flera platta (96 - eller 384-bra platta format). Mätningen utförs sedan sekventiellt tills fullständig förskjutning av den märkta referensen DNA från TF. Vi fastställt bindande specificiteten för en given faktor genom att mäta tillhörighet av alla 3 N enda-base mutationer av samförstånd sekvensen av längden N. HipHop-FA kräver låga mängder protein (~ pmols per Titrerkurvan) och visar låg variabilitet vid fastställandet av KDs [koefficient av variation (CV) < 20%], samtidigt som mätningar i relativt stor skala. Metoden kan utföras manuellt eller helt automatiserad använder ett robotsystem, vilket resulterar i ännu lägre CVs (figur 4, övre panelen). Dissociation konstanter mäts med hög noggrannhet ner till 0,5 nM. För extremt hög affinitet (KD < 500 pM), vi använder en standard konkurrenskraftiga titrering (figur 5) på grund av felaktigheter i mäta konkurrent DNA koncentrationer på låga nivåer (< 100 nM).

HipHop-FA kan tillämpas på nästan alla standard, inverterad, fluorescerande epifluorescensmikroskop, förutsatt tillgängligheten av en automatiserad XY-etapp och en piezo z-axeln. Optiska komponenter byggdes runt en automatiserad widefield setup utrustad med en långväga mål. I praktiken kan analysen anpassas till målen med andra egenskaper (särskilt arbets-, avstånd- och numerisk bländare). Men detta kräver optimering av parametrarna (avstånd mellan z-segment, porositet och höjd av agarosgel, etc.). Användning av andra typer av lasrar eller kamera är också möjligt. En detaljerad beskrivning av hela experimentella förfarandet och dataanalys ges nedan i avsnittet protokoll.

Protocol

1. polarisering mikroskopi

  1. För widefield laserbestrålning, fokusera en 638 nm linje av en kontinuerlig diodlaser (40 mW) på bländaren på multimode optisk fiber för balk rensning. Montera en linjär polarisator vid utgången av fiber för att ställa in polariseringen av laserljus.
  2. Blockera komponenten excitation av utsända ljuset med en dichroic spegel (640 nm cut-off) och ett bandpassfilter (bandpass 700/75).
  3. Låt fluorescens signalen passerar genom en polariserande stråldelare, som delar sig utsända ljuset i dess vinkelrätt och parallella polariserade komponenter. Sedan, fokusera icke-reflekterade strålen (parallella komponenten) och den reflekterade strålen (vinkelräta komponenten) med en akromatisk lins av 200 mm brännvidd på chip av en back-belysta EM-CCD kamera (figur 1b och 1 c). Använd en spegel för att justera riktningen på den perpendicularen strålen in mot linsen.

2. design och testning av lysrör-märkta referens DNA Oligomer

  1. Bestämmer vilken kärna sekvens av hänvisningen DNA: metoden är baserad på en konkurrenskraftiga analys som mäter dissociationskonstant (KD2) mellan en transkriptionsfaktor och omärkt konkurrent DNA oligomer som tävlar för bindning med ett fluorescently märkt DNA vars affinitet till TF fungerar som en referenser (KD1). Sekvensen konsensus som erhållits från andra källor som DNAS Footprints eller bakteriell 1-hybrid kan fungera som en start punkt5,15.
    Obs: som en tumregel, en lämplig referens DNA har en 3 till 7-fold minskning affinitet till TF jämfört med sekvensen konsensus.
  2. Mäta av HipHop-FA KD1s 2-3 preliminärt enstaka mutationer av samförstånd sekvensen härrör i föregående steg. Försök att mutera positioner i samförstånd sekvens som inte är alltför specifika att undvika fullständig förlust av bindande.
    Obs: Det är viktigt att sekvensen referens är bunden av transkriptionsfaktor av intresse (vi använde i detta protokoll Giant Gt), men inte för starkt, så att svagare konkurrenter kan konkurrera ut det vid höga koncentrationer.
  3. Förlänga Kärnmotivet (8-12 bas par generellt) till en längd av 16 baspar eller mer genom att lägga till symmetriskt flankerande sekvens på båda sidor (Lägg till sida kedjor för korrekt bindning). Om det behövs (för längre Bidar domäner, till exempel), använder längre sekvenser (upp till ~ 50 bas par i längd testades med HipHop-FA-analys).
    Varning: Var noga med att inte lägga till baser som förväntas skapa ektopisk bindningsställen. Använda beräkningsverktyg som förutsäga bindningsställen från tillgängliga PWMs att underlätta denna process (t.ex. PySite22).
  4. Som märkta referens DNA, ordning oligomerer som kallas fluorescently på antingen framåt eller omvänd strand i 3 eller 5' slutet. Använda, till exempel Cy5, Bodipy-650 eller någon annan lämplig färgämne vid en koncentration på 10 µM (100 µM 10 x lager) i vatten och späd stegvis som beskrivs i steg 3.1.
  5. Förbereda 500 mL 1 x bindande buffert genom att lägga till 33 mM kalium fosfatbuffert (pH = 7.0), 90 mM NaCl, och 0,01% icke-joniskt rengöringsmedel i destillerat vatten. Också förbereda 3 x bindande buffert, som innehåller samma komponenter, utom vid threefold koncentrationer. Om du använder 3 x bindande buffert som stamlösning för 1 x bindande buffert, förbereda volymer > 500 mL; Annars, bereda 250 mL.
    Obs: Denna sammansättning var optimerad för transkription faktorn stabilitet och att förhindra glutation S-transferas (GST) dimerization.
  6. Åtgärd med mikroskopi setup som beskrivs i steg 1 FA av 200 µL av bindande buffert innehållande 0,8 nM märkta referens DNA i närvaro av olika mängd TF i ett glas botten mikroskopi plattan med 96 brunnar (5-6 brunnar med olika TF koncentrationer) till avgör koncentrationen i TF att använda. Utföra en titrering serie med ökande mängder TF och välja för analysen koncentrationen som kurvan når en platå, som visar komplett bindningen av DNA referens oligomer.
    Obs: Den optimala TF koncentrationen beror på värdena på konstanterna som TF-DNA dissociation. Generellt kräver lägre KDs lägre koncentrationer.

3. oligomer glödgning

  1. För att glödga de DNA-oligomererna av märkta referens DNA (sekvens fastställs i föregående steg), blanda 7 µL av en 10 mM dye-märkt fram enkelsträngat DNA lösning och 7 µL av en 10 mM koncentration av dess omärkt omvänd komplement i 186 µL av vatten.
  2. För konkurrenten DNA sekvenser, blanda 20 µL av 100 mM lösningar (i vatten, som tillhandahålls av tillverkaren) framåt enkelsträngat DNA med 20 µL av 100 mM motsvarande omvänd enkelsträngat DNA för varje enskild konkurrent sekvens skall mätas.
  3. Utföra glödgning separat i en vanlig PCR-apparat genom uppvärmning lösningar på 70 ° C i 3 min och minska temperaturen till RT med en hastighet av 0,1 K/s. Om PCR-maskinen används inte stöder temperaturgradienter i denna takt, helt enkelt göra stegvis inkubationer med minskande temperaturer (testade var 99 cykler av 3 s med -0,4 K per cykel).

4. gel förberedelse

Obs: I följande avsnitt förklaras utarbetandet av två olika slags geler: 1) titrering brunnarna innehålla geler med protein och används för att bestämma KDs för respektive konkurrent DNA sekvenser, och 2) kalibrering brunnarna utnyttja NB till bestämma DNA koncentrationen vid varje given tidpunkt punkt och förvärv höjd. Fokus ligger på utarbetandet av experimentet i en plattan med 96 brunnar, men motsvarande volymer för en plattan med 384 brunnar format är också indicerat.

  1. Lös 0,5% w/v låg smältpunkt agaros i bindande bufferten genom att koka den i mikrovågsugn laboratorium. Efter fullständig upplösning, volymen igen med ddH2O att kompensera för eventuella avdunstning.
    Obs: För bekvämlighet, förbereda ett lager av 10-20 10 mL alikvoter av gelerna och smälta dem vid 75° C när de behövs. Gel bestånd kan lagras på RT.
    Varning: Var noga med att undvika underkylning av gellösningen i mikrovågsugnen. Kort uppvärmningstid intervaller med skakningar i mellan är att föredra.
  2. För att förbereda titrering och kalibrering brunnar, först smälta två 10 mL gel lager alikvoter vid 75 ° C under skakning.
    1. Använd 240 µL (inklusive 20% overhead) för varje konkurrent (n = antal konkurrent sekvenser).
    2. Använd samma volym av gel för NB kalibrering brunnen för att säkerställa en lika temperatur och viskositet av både geler.
    3. Sedan inställd temperatur på 35 ° C och vänta tills temperaturen temperera.
  3. För titreringen brunnar, lägga till 1.4 nM (slutlig koncentration) hybridiseras referens DNA (införskaffad i steg 3), TF protein (slutlig koncentration CTF = 20-60 nM, vilket anges i steg 2,6), DTT (0,2 mM) och bindande buffert i en total volym av n x 200 µL eller n x 13 µL i en 96 - eller 384-well platta format, respektive (plus omkostnader). Blanda noggrant genom att vända/skaka (gör inte vortex).
  4. Tillsätt 200 µL per brunn i plattan med 96 brunnar format (13 µL per brunn för 386 brunnar) av gellösningen beredd i föregående steg i titrering brunnar väl plattan.
  5. För kalibrering brunnar, lägger du först till 5 nM NB till smält gelen utanför brunnarna (total volym beroende på det väl platta format som används och antalet kalibrering brunnar; oftast 5-6 per väl platta är nog).
  6. Pipettera 200 µL (13 µL för plattan med 384 brunnar-format) för NB som innehåller gel långsamt inom titrering brunnarna av väl plattan och se till att undvika luftbubblor.
    Obs: Användningen av elektroniska pipetter eller robotics ökar markant reproducerbarhet.
  7. Låt gelen stelna för 10 min vid RT och en annan 10 minuter vid 4 ° C (ta bort kondens från glaset efteråt om det behövs). Se till att utföra alla dessa steg på en helt horisontell yta att undvika inhomogena gel ytor.
    Obs: Protein innehållande gelerna är oftast stabila i minst flera timmar vid 4 ° C.

5. lägga till konkurrent DNA lösningen

Obs: Följande lösningar bör förberedas innan du påbörjar titreringen och läggs ovanpå kalibrering och titrering brunnarna samtidigt.

  1. Lägg till de glödgade märkta referens DNA och protein i 3 x bindande buffert på 3 gånger högre halter än de gel lager alikvoter.
    1. Blanda 20 µL av den erhållna lösningen med 40 µL av varje glödgas konkurrent DNA lösning som erhålls i steg 3.
    2. För varje kalibrering brunn, blanda 20 µL av 3 x bindande buffert innehållande 15 mM NB lösning med 40 µL av glödgad konkurrent DNA (en sekvens av samma längd är lämplig).
      Obs: För de 384 brunnar, använda 21 µL istället för 60 µL totalt.
  2. Alternativt, kontrollera homogenitet gel höjd nivåer i de olika brunnarna i plattan spectroscopically genom att mäta absorbansen vid 380 nm, med en flera Plattläsare (absorbansvärdena är proportionell till gel höjder).
  3. Tillsätt 50 µL (7 µL för plattan med 384 brunnar-format) av de blanda konkurrent DNA lösningar (glödgas i steg 3) ovanpå gelerna. Försök att lägga till alla konkurrent lösningar som samtidigt som möjligt med hjälp av elektroniska multikanal- eller en 96-kanal pipettering huvud, om tillgängligt. Efter tillägg av lösningarna som konkurrent, placera plattan på Mikroskop scenen och starta mätningarna omedelbart (steg 7).

6. bild förvärv

  1. Sekventiellt förvärva gånger serie z-stackar (t.ex. användning 12 flygplan och 100-300 ms av brinntid). Undvik att ta bilder för nära för att väl ytan (< ~1.4 µm med plattorna används häri) att utesluta någon polarisering bias.
  2. Utföra 10-25 cykler av mätningar tills fullständig uppdelningen av märkta referens DNA från TF. Slutpunkten uppnås vanligen efter 1-2 h, beroende på bindande kinetik och diffusivitet av konkurrenten DNA.

7. utvinning av FA(z,t) från rådata

  1. När en väl platta har varit avbildad, beräkna från raw fluorescens bilderna de genomsnittliga pixelvärdena i områden av intresse för parallellen (I=) och vinkelrätt (I+) polariserade intensitet komponenter (figur 1c). Detta kan göras automatiskt med den HipHop-FA programvara23.
    Obs: Programvaran HiP-FA, en bruksanvisning och en test datamängd kan vara hämtade23. Alternativt använda någon annan custom skrivna programvara extrahera I= och jag+ och utföra den efterföljande analysen av titrering kurvorna, som beskrivs i detalj nedan.
  2. Beräkna FA för varje brunn. För varje brunn, skriptet beräknar FA(z,t) på varje z-position och tid punkt t enligt:
    Ekvation 1:Equation 1
    Där G är instrumentet G-faktor som korrigerar för någon bias mot kanalen vinkelrätt.
  3. Bestäm G-faktorn av mikroskopi installationen genom att mäta FA av eventuella lösningar som innehåller ett fluorescerande färgämne av kända anisotropi. Extrahera de två polarisering komponenterna av signalen och sedan använda ekvation 1 för att få G, att veta FA av lösningen (G = 1.15 i denna inställning).

8. kalibreringskurvan för bestämning av konkurrent DNA-koncentration från FANB

  1. Glödga 120 µL av varje framåt och bakåt referens oligomer (100 mM lager koncentration, någon slumpmässig sekvens med samma längd som konkurrent sekvens kan användas) och blanda med 120 µL av 3 x bindande buffert innehållande NB (15 nM).
  2. Bered en utspädning serie med 1:2 utspädningar i 1 x bindande buffert med 6 utspädningar totalt. Blanda 50 µL av dessa spädningar med 200 µL 0,5% låg smältpunkt agarosgel (T > 35 ° C) 1 x bindande buffert innehållande 5 nM för NB i exemplar.
  3. Tillsätt 200 µL av varje av de 6 lösningar som förberett i föregående steg i en plattan med 96 brunnar och förvara plattan för 1 h vid 4 ° C att säkerställa fullständig gelation, då 1 h på RT. åtgärd FANB av lösningar med hjälp av inställningen för HiP-FA.
  4. Extrahera FANB (z, t) enligt föregående steg och passar data med hjälp av en Hill ekvation:
    Ekvation 2:Equation 2
    Där CDNA är koncentrationen av de DNA oligomer; k koncentrationen av de DNA-oligomererna på vilken halva av de bindande platserna är upptagna. FAmax är en normalisering konstant; och n är koefficienten som Hill. Karlsson, FAmax, och n är inställda som gratis parametrar under förfarandet för montering.
  5. Ange de tre parametrarna som erhållits från förfarandet montering i programvaran HiP-FA (i den vänstra nedersta panelen).
  6. Upprepa bestämning av kalibreringskurvan varje par månader eller efter ändringar i inställningarna för mikroskopi.

9. fastställande av konkurrent DNA koncentrationer

  1. Använda programvaran HiP-FA för att extrahera c (z, t) från FANB(z, t) mätningarna (figur 3). Först få kalibreringskurvan enligt beskrivningen i föregående avsnitt och ange parametrarna för montering av programvaran (se manual för detaljer).
  2. Använda programmet för att automatiskt extrapolera c(z,t) för c < 100 nM (se manual för detaljer) med ekvation 3 (figur 3b), som beskriver endimensionell diffusionen av konkurrenten DNA inom matrisen agaros gel, förutsatt att gratis diffusion.
    Ekvation 3:Equation 3
    Där C0 är den ursprungliga koncentrationen av konkurrenten DNA; ERF är felfunktionen; z är ståndpunkten. D är det diffusionskoefficienten konkurrenten DNA; och t0 är starttiden för mätningarna. De fria parametrar som används är C0 och z /Equation 4.

10. konventionell konkurrenskraftiga titrering med HipHop-FA för mycket stark DNA-bindning

  1. Seriellt späd de olika konkurrent DNA oligomererna i raderna i en plattan med 96 brunnar (eller plattan med 384 brunnar) vid koncentrationer: 0, 1,25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900, och 4000 nM. Lägg till Cy5-märkta referens DNA (1 nM) och TF (20-50 nM) vid en konstant koncentration, med en total volym på 200 µL per brunn i bindande buffert (figur 5en). Vänta 40 min tills termodynamisk jämvikt uppnås och förvärva (med HipHop-FA setup) z-staplar för varje brunn (flera bilder per brunn minskar variationen genom medelvärdena för de beräknade FA-värdena).
  2. Konstruera jämvikt bindande titrering kurvorna och passar dem med ekvation 4 (figur 5b). KDs bestäms genom konventionella konkurrenskraftiga titrering identiska med dem som erhålls genom HIP-FA använder en agaros gel matris20.

11. montering förfarande av FA titrering kurvor

  1. Visa i HipHop-FA programvaran rekonstruerade titrering kurvorna för enskilda konkurrent sekvenser FA(z,t) = f[c(z,t)] och visuellt kontrollera kvaliteten på uppgifterna (se manual för detaljer). Om det behövs förfina de parametrar som används för bestämning av konkurrent DNA koncentrationerna i steg 10.
  2. Passa varje enskild Titrerkurvan som automatiskt med hjälp av ekvation 4, vilket ger en analytisk lösning för konkurrenskraftiga titrering analyserna24.
    Ekvation 4:Equation 5
    Med:Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    Där RT är protein koncentrationen; LT är den omärkta och LST är märkt DNA koncentrationen; KD2 är den dissociationskonstant skall fastställas. RT är koncentrationen av aktivt protein; och A och B är normalisering parametrar.

    Först bestämma KD1, som fungerar som en referens för bestämning av de olika KD2 -värdena. KD1 är lätt kan fastställas med analys genom att välja dye-referens DNA-sekvens som sekvensen av omärkta konkurrenten DNA (se bruksanvisning).
  3. Ange det erhållna värdet på KD1 i programvaran och beräkna KD2 värdena för alla konkurrenten DNA på plattan.
    Obs: Gratis parametrarna för montering förfarandet är KD2, RT, A och B.
  4. Exportera dissociationskonstant KD2 och koncentrationen av aktivt protein RT för alla de enskilda titrering brunnarna i plattan genom att klicka på ”Exportera”-knappen i mjukvaran.

12. PWM konstruktion, specificitet av Protein-DNA-interaktion och Pseudo räknas

Skapa sekvens logotyper för de olika PWMs med verktyget online WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) enligt den tidigare20.

Representative Results

Vi tillämpat HiP-FA till TFs av segmentering gen nätverk25,26, som genererar främre-bakre kroppen mönstret av Drosophila embryon, till stor del genom Transkriptionsreglering. Från detta nätverk, vi valde bZIP domän TF Giant (Gt) för en detaljerad analys (figur 4). Eftersom fullängds transkriptionsfaktorer är svåra att uttrycka och ge mestadels samma bindande preferenser som deras DNA bindande domäner (DBD)13, vi använde den DBD smält till GST och uttryckt konstruktionen i E.coli GST fusionsproteinerna till leverera samma resultat som DBDs enbart20.

Gt samförstånd sekvensen (enTTACGTAAC) representerar den starkaste bindande sekvens som vi fastställt enligt ovan. Sedan undersökte vi påverkan på den bindande energin av alla möjliga enpunkts-mutationer inom 10-mer Gt samförstånd sekvensen (totalt 30), flankerad av ytterligare baser i 5' och 3' ändarna. Vi mätte två replikat vars gel prover producerades med hjälp av automatisering, och en ytterligare replikerar produceras manuellt för jämförelse. KDs varierade från 0,6 till > 2000 nM för ensamma muterade sekvenser, och vi bekräftade också total avsaknad av bindning till en ”icke-bindande” sekvens (inga data anges).

TF-DNA bindande särdrag är vanligtvis modelleras med en position vikt matris (PWM), där en Poäng tilldelas varje möjligt nukleotid på varje position i bindande motivet. PWM förutsätter att varje position bidrar till bindande styrka självständigt och i de flesta fall utgör en tillräcklig modell för TF bindande inställningar27. Genererade vi reviderade PWMs baserat på våra affinitet mätningar följande etablerade förfaranden28,29 och jämfört dem med två PWMs tidigare rapporterats i litteraturen. Först bygger på nucleotide frekvens räknas från bindande platser identifieras genom DNA Footprints4,5, och andra PWM erhölls genom bakteriell one-hybrid (B1H) val. 15

Hög likheten mellan PWMs för de tre replikat (figur 4, övre panelen), inklusive för provet beredd manuellt (replikera 3), visar hög reproducerbarhet av metoden HiP-FA. Medan de PWMs erhålls genom HiP-FA är övergripande liknar de PWMs som erhålls med de andra metoderna (figur 4, nedre panelen), finns betydande avvikelser: på position 2 (svart pil), början av core bZIP motivet, mutationer T > (G, C, A) leda till komplett förlust av bindning i motivet erhålls genom HiP-FA, vilket är förenligt med B1H motiv men inte med som erhållits med DNAS Footprints, där bindningen förblir relativt starka baser (G, A). Omvänt, på position 7 (grå pil), mutationen T > C leder till mycket starkare bindande än vad som förväntades baserat på de tidigare uppmätta PWMs.

Andra avvikelser är subtila men inte mindre viktigt. Övergripande, HiP-FA PWM är mindre specifik än de andra två, vilket återspeglar det faktum att många mutationer från konsensus fortfarande leda till måttligt stark bindning. Detta kan kvantifieras med datainnehåll (IC). IC är 11,5 bitar för HiP-FA matrisen (medelvärde av de tre replikat), jämfört med IC = 13,4 och 16,8 bitar för DNAS Footprints och B1H matriser, respektive. Generellt (dock inte allmänt), den PWMs erhålls genom HiP-FA är mindre specifik än sådana som erhållits genom andra metoder, baserat på 26 TFs undersökt20.

Figure 1
Figur 1:Schematisk skildringar av HipHop-FA test och experiment. (a) gel leveranssystem för titrering konkurrent DNA i enstaka brunnar. (b) HIP-FA mikroskopi setup. Anpassade automatiska widefield Mikroskop med polariserade fluorescens ljus upptäckt på en EM-CCD-kamera. (c) Raw fluorescens bild med två områden av intresse som används för att bestämma parallellen (röd) och den vinkelrätt (grön) polariserade komponenter. (d) typiska layouten för en plattan med 96 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Raw FA data och rekonstruerade titrering kurvor. (a) typiska FA(z,t) bana för en kalibrering brunn innehållande NB. (b, c) FA(z,t) tid bollbanor för två titrering brunnar mäta bindning till en stark (b) och mer moderat (c) DNA bindande konkurrent. (d, e) Motsvarande rekonstruerade FA titrering mätningar och monterade kurvor för stark (d) och måttlig (e) bindande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Att bestämma koncentrationen av konkurrent DNA c (z, t) med Nilen blå (NB). (a) FA-koncentration kalibreringskurvan för 16 baspar DNA oligomerer. I en konventionell titrering serie, är NB inbäddad i agarosgel tillsammans med olika koncentrationer av konkurrent DNA. Affinitet för NB DNA är sekvens-oberoende20; därför samma kalibreringskurvorna kan användas för att bestämma c (z, t) för olika DNA-sekvenser av samma längd. (b) konkurrent DNA tid diffusion profil på en godtycklig z höjd fastställs med hjälp av fem kalibrering brunnar. För varje mätning cykel visas de genomsnittliga FAs fyra NB-innehållande brunnar som vita prickar. Kurvorna är försedda med ekvation 3 (vit linje, enskilda brunnar i färg) och c (z, t) vid låga koncentrationer (C < ~ 100 nM) bestäms av extrapolerade montering kurvan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Bindande särdrag bZIP domän familjen TF Giant (Gt). HipHop-FA PWMs av tre replikat: två tillagas med automation och en manuellt beredd (övre panel) jämförs med PWMs genereras av DNAS Footprints och av bakteriell one-hybrid (B1H) val av metoden (nedre panelen). Övergripande, HIP-FA bindande motiven håller med tidigare data men också Visa signifikanta skillnader, som markerade med svarta och grå pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Konventionella konkurrenskraftiga titrering med HipHop-FA. (a) plattan design visar 8 olika konkurrent DNA seriellt spädas i bindande buffert i en enda rad med en plattan med 96 brunnar. En FA värmekarta visas för olika godtyckliga bindande styrkor. (b) konkurrenskraftiga titrering av tre konkurrent DNAs bindande till Bcd TF med olika tillhörighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

HipHop-FA är en omfattande ny metod för att fastställa bindande preferens landskap av TF-DNA interaktioner. Den mäter bindande tillhörighet mutationsanalys DNA motiv varianter direkt, att undvika eventuella underliggande antagandet att bindande inställningar återspeglas i frekvensen nukleotid i en uppsättning av ovan-tröskel bindemedel. Mätning sker i lösningen utan immobilisering och mekaniska eller kemiska störningar med bindande reaktionen, tillnärma jämvikt villkor så nära som möjligt. Kontrollerad leverans systemet tillåter mätning av en full Titrerkurvan inom en enda väl och ökar både genomströmning och tillförlitlighet samtidigt spara protein. Med ett mål med en hög numerisk bländare och EM-CCD-kamera med en hög ljus insamlingskapacitet tillåter för mycket känsliga fluorescerande ljus upptäckt. Därför med denna setup ändras små FA så låg som 10-15 mP kan identifieras korrekt; i praktiken innebär detta att någon bindande reaktion som upptäcks lätt massa ökningen efter bindande är minimal (så lågt som en massa förhållandet 2). Detta är vanligtvis inte fallet med kommersiella system som mikroplattan läsare. På grund av dess höga känslighet utökar HiP-FA räckvidden för dissociation konstanter som kan mätas på ett tillförlitligt sätt in i picomolar spänner. Bindande energier bestäms exakt över flera tiopotenser.

För att utvärdera kvaliteten på de reviderade PWMs, utfört vi två typer av analys20. Vi testade, för fem faktorer av segmentering gen nätverket, hur väl olika PWMs kan förutsäga experimentella ChIP-seq profiler i genomisk regionerna av 21 segmentering gener. Som ett andra test använde vi en sekvens-till-uttryck modell4 som förutspår uttrycksmönster av segmentering förstärkare på grundval av bindande preferens och protein koncentrationen av deltagande TFs. I både övningar, fann vi att den mindre specifika HiP-FA PWMs presterar betydligt bättre än den mer specifika Footprints och B1H PWMs20.

Till skillnad från de novo metoder kräver HiP-FA vissa förkunskaper om en given TFS bindande preferens. Men samförståndet sekvenser är känd för många TFs och många befintliga metoder kan förse dem13,14,15. Om det behövs kan sekvensen sant optimala bindande hittas iterativt.

Vi använde DNA referens oligomerer fluorescently märkt med Cy5 och Bodipy-650. Dessa färgämnen har visat för att utföra väl för FA mätningar sedan anisotropin bundna och obundna märkt-reference DNA var den största bland de olika testa färgämnena. Detta garanterar en maximal dynamiska räckvidd för FA värden. I allmänhet någon fluorescerande färgämne med en fluorescens livslängd ≥ 1 ns sannolikt kommer att vara lämpliga men måste testas först. Om möjligt är det klokt att använda färgämnen som fluorescerar i intervallet nära-IR för att minimera protein autofluorescens.

Det mest kritiska steget av experimentella förfarandet är den pipettering av gelen väl plattorna. Bra reproducerbarhet kräver gel volymerna vara så enhetliga som möjligt. Förändringar i gel höjd översätts till förändringar av diffusivitet för den konkurrenskraftiga DNA oligomer, och därmed uppenbara förändringar av tillhörighet när utvärdering av data. Detta är den huvudsakliga källan av variansen i en tekniskt replikera. Användning av en elektronisk Pipettera eller automation teknik förbättrar reproducerbarhet. Luftbubblor i gelen kan undvikas genom långsam och försiktig pipettering. Det är också viktigt att lägga till alla konkurrent lösningar ovanpå titrering brunnarna med som liten fördröjning som möjligt. För bästa reproducerbarhet, kan hela processen automatiseras med hjälp av en pipettering robot med värme inkubatorer. En viktig del för att överföra protokollet till automation är nödvändig optimering av inkubator temperatur och inkubationstider. Se till att hitta en optimal balans mellan viskositeten av gelen (dvs., inte för kallt) och stabiliteten i proteiner (dvs, inte för varmt). Detta beror både på gelerna tubens hastighet in i brunnar och stabilitet av protein används.

HipHop-FA använder sig av en kontrollerad leveranssystem för de konkurrent DNA oligomererna. För att konstruera titreringar kurvor, är det nödvändigt att bestämma den konkurrent DNA koncentrationen c(z,t) för varje givet z-position inom gelmatrisen och tid punkt t. Detta är ett annat viktigt steg, eftersom fastställandet av KDs beror direkt på c(z,t). Kalibrering brunnar som innehåller NB färgämnet som en sensor för DNA-koncentration används för detta ändamål (figur 1d, figur 2en). Vanligtvis räcker 3-5 kalibrering brunnar innehållande NB per platta. Innan utvärdera någon HiP-FA experiment, NB kalibreringskurvan borde konstrueras för struktur genom att utföra en konventionell titrering serie NB upplöst i agarosgel med en konkurrent DNA sekvenser med olika koncentrationer (figur 3 en), som förklaras i detalj i steg 8. Vid mycket starka bindning (KD < 500 pM), extrapoleringen används för bestämning av låga koncentrationer av konkurrent DNA blir begränsande, eftersom det är mindre exakt än en direkt mätning. Dock för TFs med sådan låg KDs, kan den HipHop-Anl. inställningen användas för att utföra en konventionell konkurrenskraftiga titrering i bindande buffert utan användning av en agaros gelmatris (figur 5). Exempelvis kan en fullständig titrering med 12 olika koncentrationer av konkurrent DNA utföras i en enda rad med en plattan med 96 brunnar.

Kontrollerad leverans systemet kräver också snabb TF-DNA bindande kinetik och stabila proteiner, sedan diffusion men agarosgel är dynamiska (även om långsam). Båda egenskaperna kan testas direkt med den HipHop-Anl. inställningen av följande, över tiden, FA av TFs sevärdheter när bunden till deras respektive fluorescently märkta referens DNA. Vi mätte KON och KOFF priser för de undersökta faktorerna och funnit dem vara storleksordningen millisekunder till några sekunder20, i enlighet med andra studier30. Detta är tillräckligt snabbt för att säkerställa att mätningarna sker vid jämvikt. När det gäller andra bindande reaktioner med långsammare kinetik, kan diffusivitet av konkurrenten stämmas av sänka dess koncentration eller minska gel porstorlek. När det gäller testade TFs, som alla har snabb TOFF (~ sekunder), en total mättid på ca 1-2 h är tillräcklig för att säkerställa termodynamisk jämvikt vid varje mätning.

En annan potentiell problem relaterat till protein är bildandet av protein aggregat som kan förändra FA mätningar. Användning av andra buffert villkor som innehåller olika tillsatser (som tensider) kan förhindra sammanlagda bildande, om det behövs.

Vi har arbetat med linjäritet antagande av PWM; dock kan HIP-FA skalas för att inkludera alla möjliga di-nukleotid mutationer av sekvensen konsensus. Slutligen, HiP-FA kan anpassas att mäta andra typer av bindning interaktioner. Förutsättningen är att ha tillgängliga en lämplig referens molekyl bunden av det protein som kan märkas fluorescently. Med kontrollerad leverans system, kan en koncentrationsgradient skapas för någon form av liganden; protein-protein och drog-protein interaktioner kan därför mätas med likaså HiFi och genomströmning.

Disclosures

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar J. Müller för cDNA kloner och medlemmar av Gallien labbet, särskilt S. Bergelt, för värdefulla råd och pigg diskussion. Detta arbete stöds av SFB 646, regulatoriska nätverk i genomet uttryck och underhåll (C.J., P.B.), centrum för integrerad Protein Science (U.G.) och forskarskolan för kvantitativa biovetenskaper München (M.S.). U.G. erkänner stöd genom den Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), den Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: Eriksson - Innovationswettbewerb Systembiologie), och Humboldt-stiftelsen (Alexander von Humboldt, Professur).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. , Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. , Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).

Tags

Biokemi fråga 144 transkriptionsfaktor protein-DNA-interaktion bindande specificitet affinitet fluorescens anisotropi segmentering nätverk
Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., … More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter