Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58763
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Gene Center and Department of Biochemistry, Center for Protein Science Munich (CIPSM), Ludwig-Maximilians-Universität München

Summary

Burada büyük ölçüde yüksek hassasiyet ile bağlama benzeşim denge ve çözüm belirlemek için yeni bir yöntem mevcut. Bu transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı kantitatif analiz artırır. Yönteminin otomatik floresans anizotropi ölçümlerde kontrollü bir iletim sistemi temel alır.

Abstract

Transkripsiyon faktörü (TF) doğru miktar-DNA etkileşimleri Gen ifadesinin düzenlenmesinde anlamak için gerekli. Varolan yaklaşımları önemli kısıtlamalar acı beri TF-DNA bağlayıcı benzeşim büyük ölçüde yüksek hassasiyetle belirlemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Tahlil kurulan floresans anizotropi (FA) ilkesine dayanır ama önemli teknik geliştirmeler içerir. İlk olarak, TF ve fluorescently etiketli başvurusu DNA gözenekli özel jel Matristeki dahil ederek tek iyi bir tam SK rekabetçi titrasyon eğrisi ölçüyoruz. Etiketlenmemiş DNA oligomer üstünde belgili tanımlık tepe rakip olarak yüklenir ve difüzyon spatio-zamansal bir degrade oluşturur. Elde edilen SK geçişin ardından özelleştirilmiş epifluorescence mikroskop kurulumu kullanarak okunur. Bu gelişmiş kurulum büyük FA sinyal algılama, güvenilir, hatta benzer moleküler ağırlık moleküller için sayısal güçlü ve zayıf bağlamaya izin vererek hassasiyeti artırır. Bu şekilde çok iyi bir tabak kuyu başına bir titrasyon eğrisi ölçebilir ve uygun yordam, biz mutlak ayrışma sabiti (KD) ve aktif protein konsantrasyonu ayıklayabilirsiniz. Tüm tek nokta mutasyon değişik sıralı bağlama belirli bir fikir birliği test ederek, genellikle tek bir plaka üzerinde bir TF tüm bağlamayı özgüllük manzara anket. Elde edilen pozisyon ağırlık matrisleri (PWMs) bu vivo içinde TF doluluk öngörmede diğer yöntemleri elde daha iyi performans. Burada, geleneksel otomatik floresan mikroskop ve veri analiz boru hattı üzerinde HiP-FA uygulamak için ayrıntılı bir rehber mevcut.

Introduction

Transkripsiyon faktörleri (TFs) merkezi rol bağlama tercihlerini nicel bir şekilde büyük önem olduğunu belirleme gen Yönetmelikte verilen. Öyle ki RNA polimeraz organizatörü için işe aşağı akım olaylar tarafından denetlenir kendi bağlama iyi termodinamik denge tarafından açıklanan seminal çalışmaları von Hippel tarafından yasal TFs hızla DNA, tanımak kavramı tanıttı daha yavaş kinetik1. Vivo bağlama çalışmalar büyük olasılıkla daha karmaşık2,3, bu tablo öneririz; Bununla birlikte, bu genel varsayımlar iyi yaklaşımları hizmet ve CIS düzenleyici elemanlarının bulmak ve dizileri4,5,6ifade tahmin etmek için birçok hesaplama yaklaşımlar destekledim. Denge bağlama böylece başarıyla bir kavram olarak istihdam edilmiştir, TF-DNA etkileşimleri belirlemek için geçerli yöntemleri özgüllük bağlama odaklanmak ve genellikle doğrudan ölçü birimi bağlama benzeşim, denge yok. TF-DNA bağlayıcı sistematik ölçümü önemli bir teknik sorun temsil eder ve varolan yöntemleri birkaç farklı kısıtlamalar bulunmaktadır.

(ChIP-seq)7, en yaygın vivo içinde tekniği, sıralama derin tarafından takip kromatin immunoprecipitation bağlama benzeşim ölçümü veya siteler genomik parçaları içinde bağlama hassas yerelleştirme izin vermez. DNaz footprinting8, elektroforetik hareketlilik ÜSTKRKT (Emsan)9, yüzey plasmon rezonans (SPR)10ve microscale thermophoresis11 de dahil olmak üzere birkaç vitro yöntem bağlama benzeşim ölçmek mümkün, Ama onlar nispeten düşük işlem hacmi. Bunun tersi olarak, protein bağlayıcı microarrays12, HT-SELEX13,14ve bakteriyel bir hibrid (B1H)15 de dahil olmak üzere yüksek işlem hacmi teknikleri bağlama benzeşim ölçmek ve genellikle aşırı verim mümkün değildir özel sıraları, esas olarak sıkı seçim nedeniyle bağlama veya adımları gerekli yıkama. Daha yeni gelişmeler derin sıralama dayalı sayısı-FLIP16, SELEX seq17ve havacilik-esaslı MITOMI18 veya gülümseme-Seq19, mutlak bağlayıcı benzeşim çıkarılması için izin içerir; Ancak, onlar floresans yoğunluklarda etiketli TF ve DNA ölçme üzerinde güveniyor. Düşük protein konsantrasyonları ve düşük KD değerleri belirlemede sınırlama olmak floresan sinyallerini, bu nedenle, (< ~ 10 nM). Ayrıca, bu yöntemler TF-DNA bağlamasında belirsiz bağlama ve/veya doğru bir şekilde zayıf bağlama ölçmek zordur otomatik floresans arka plan ile sorunları yükselterek, ince yüzeyler üzerinde yer almaktadır.

Bu sınırlamaları gidermek için TF-DNA benzeşme manzara denge ve yüksek performanslı floresans anizotropi (HiP-FA)20aradık çözüm belirlemek için yeni bir yöntem geliştirdi. Teknik üzerinde kurulan floresans anizotropi (FA) tahlil21 temel ancak bağlama sabitler ile yüksek hassasiyet ve büyük ölçekli bir özelleştirilmiş otomatik mikroskop ve analiz kurulumunu kullanarak ölçmek için değiştirilmiş.

SK tahlil (gibi bir DNA oligomer) fluorescently etiketli türler arasındaki etkileşimin bir TF, bu durumda bir bağlama ortağına etiketli molekülünün moleküler döndürme ölçerek izler. TF için bağlama üzerine daha yüksek hidrodinamik RADIUS ve artan SK sonuç ilişkili karmaşık molekül ağırlığı nedeniyle onun dönüş hızı azalır. Çok güçlü bağlama doğru ölçüm (KD < ~ 1 nM) etiketli, referans DNA düşük konsantrasyonlarda kullanımını gerektirir (c < ~ 1 nM). Bu standart Mikroplaka okuyucusu gibi ticari bir araç elde etmek zordur. Buna ek olarak, bir büyük boy farkı (10-100 kat) ilişkili ve ilişkisiz kompleksleri genellikle gerekli ölçüm TF bağlayıcı etki alanları ve olan genellikle aşağı yukarı benzer moleküler ağırlıkları kısa DNA reaksiyonlar arasında bir köprü işlevi yasaklayan . Son olarak, bir tam titrasyon eğrisi normalde hazırlık ve ölçüm titrating türler için konsantrasyon içeren birden çok Wells gerektirir.

Bu sorunlara yönelik olarak yüksek algılama hassasiyet elde etmek ve SK ölçüleri farklı z-konumlarda bir tek şey izin vermek için değiştirilmiş bir widefield mikroskobu kurulum kullanın. Bu tür benzer molekül ağırlığı ve yüksek benzeşim ile arasındaki bağlama etkileşimleri izlemek sağlar. Yüksek işlem hacmi çok iyi plaka biçimleri ve tüm titrasyon dizisi de bir kontrollü teslimat sistemi (Şekil 1bir) kullanarak tek bir yerine getiren SK ölçerek elde edilir. Ayrıca, bir rekabetçi bağlama tahlil istihdam ederek, biz sadece da aktif protein konsantrasyonu bağlama sabitler ayıklayın. Yalnızca bir bölümünü ifade TF molekülleri protein misfolding veya bozulması nedeniyle etkin olduğundan bu testin, önemli bir özelliktir. Deneysel Kur XY ve Z piezo aşamaları ile donatılmış bir ticari epifluorescence mikroskop temel alır. Biz dış lazer uyarma sistemiyle yükseltilmiş sonra iki ışık algılama (Şekil 1b ve 1 c) için yüksek kuantum verimliliği ile doğrusal polarizasyon bileşenleri bir EM-CCD kamera yonga üzerinde yayılan algılandı. Sistem bir ultra-hassas sensör birleştiğinde bir yüksek sayısal diyafram (NA) hedefi kullanır ve böylece son derece hassas SK ölçümleri affords. Floresans z-yığınlar kaydederek, etkileşimleri bağlama optik z ekseni heterojen bir matris için Reaktanları kullanırken ölçülebilir. Tüm bu değişiklikler varolan bir sistemde kolayca uygulanabilir ve maliyet-etkin.

Biz hangi bir referans olarak hizmet vermektedir fluorescently etiketli DNA ile karşılaştırıldığında etiketlenmemiş bir DNA oligomer bağlama benzeşme ölçülür bir rekabetçi bağlama tahlil istihdam. TF ve başvuru DNA bağlama için bir sigara etkileşim ortamı oluşturan bir gözenekli özel jel matris (gözenek boyutu ~ 1 µm) sabit konsantrasyonlarda dahil edilmiştir. Referans DNA Cy5 ile etiketlenir. Bu boya nispeten uzun floresan ömrü nedeniyle SK ölçümler için uygun kanıtladı (~ 1ns) ve floresan emisyon far-red içinde görünür spektrumun (düşük auto-floresan arka plan). Tüm başvuru DNA protein bağlı garanti Cy5-başvuru DNA üzerinde molar fazla TF bölgedir. Etiketlenmemiş rakip DNA çözüm sonra jel yüzeyinde yatırılır ve üzerinde zdeğiştirir bir konsantrasyon gradyanı c (z, t) kurulması gözenekli matris içinde dağılır-odak düzlemi ve zaman t (Şekil konumunu 1a, Şekil 2-2 c). Cy5-başvuru DNA bağlı TF böylece yerel olarak rakip bağlama için yarışan DNA Cy5-başvuru DNA SKREF(z, t) dinamik olarak değişen bir FA için önde gelen farklı konsantrasyonlarda maruz kalmaktadır (Şekil 2b ve 2 c).

Rakip konsantrasyon c(z,t) belirlemek için biz ayrı wells (kalibrasyon wells) dinamik olarak değişen SK sinyal Nil Blue (NB) SKNB(z, t) ölçü (Şekil 2bir ve 3). Bu boya DNA intercalates ve böylece rakip DNA için DNA sensör davranır. Bu kontrollü iletim sistemi ile bir çok iyi plaka (96 - veya 384-da plaka biçimi) içinde onlarca yüzlerce farklı DNA-protein bağlayıcı benzeşim ölçülebilir. Ölçüm sonra TF etiketli başvurusundan DNA tam yerinden kadar sırayla gerçekleştirilir. Biz belirli bir faktör için bağlama özgüllük benzeşim, uzunluk Nfikir birliği dizi tüm 3 N tek-base mutasyonların ölçerek belirledi. HiP-FA protein düşük miktarda gerektirir (~ pmols titrasyon eğrisi başına) ve gösterir düşük değişkenlik ölçüleri nispeten büyük ölçüde izin verirken KDs [değişim (CV) < %20 katsayısı], belirlenmesi. Yöntem daha düşük CVs (Şekil 4, üst paneli) kaynaklanan bir robotik sistem kullanarak el ile veya tam otomatik yapılabilir. Ayrılma sabitler 0,5 aşağı yüksek doğruluk ile ölçülen nM. Son derece yüksek benzeşim (KD < 500 pM), rakip DNA konsantrasyonları düşük seviyelerde (< 100 nM) ölçüm yanlışlıklar nedeniyle standart rekabetçi titrasyon (Şekil 5) kullanın.

HiP-FA neredeyse herhangi bir standart üzerinde uygulanan, ters, otomatik bir XY sahne ve bir piezo z ekseni sahne kullanılabilirliği sağlanan epifluorescence floresan mikroskop. Optik bileşenleri bir uzun mesafe amacı ile donatılmış bir otomatik widefield Kur etrafında inşa edilmiştir. Uygulamada, tahlil hedefleri ile diğer özelliklerini (belirli çalışma, mesafe ve sayısal diyafram) için adapte edilebilir. Ancak, bu parametrelerin optimizasyonu gerektirir ( zarasındaki mesafeleri-dilimler, porozite ve yükseklik özel jel, vs.). Diğer tür lazerler veya kamera kullanımı da mümkündür. Tüm deneysel bir işlem ve veri analizi ayrıntılı bir açıklaması aşağıda Protokolü bölümünde verilmiştir.

Protocol

1. polarizasyon mikroskobu

  1. Widefield lazer aydınlatma için bir 638 nm çizgi sürekli diyot lazer odak (40 mW) düzenlediği optik fiber ışın temizleme için diyafram üzerinde. Bir doğrusal polarize lif çıktısını, lazer ışık kutuplaşma ayarlamak için mount.
  2. Dikroik ayna (640 nm kesme) ve bir bant filtre (bant 700/75) verilmiş ışıkla uyarma bileşeni engellemek.
  3. Floresans sinyal verilmiş ışık onun dik ve paralel polarize bileşenlerine ayırır bir polarize ışın ayırıcı geçmesine izin. Sonra sigara yansıyan ışın (paralel bileşeni) ve 200 mm odak uzaklığı, achromatic lens ile yansıyan ışın (dik bileşeni) bir arka ışıklı EM-CCD kamera (Şekil 1b ve 1 c) yongası üzerinde odaklanabilirsiniz. Dikey kiriş objektif doğru yönünü ayarlamak için bir ayna kullanın.

2. tasarım ve floresan etiketli başvuru DNA Oligomer test

  1. DNA başvuru çekirdek sırasını belirlemek: Bu yöntem bir transkripsiyon faktörü ve bağlama ile birlikte buz dansında yarışmaktadır etiketlenmemiş rakip DNA oligomer arasında ayrışma sabiti (KD2) ölçen bir rekabetçi tahlil dayanır bir fluorescently etiketli DNA'sı olan benzeşme TF için bir referans (KD1) olarak davranır. Diğer kaynaklardan elde edilen fikir birliği sıra gibi DNaz footprinting ya da bakteriyel 1-melez bir başlangıç noktası5,15hizmet verebilir.
    Not: bir kural olarak, uygun bir başvuru DNA 3 bağlama benzeşimi için fikir birliği dizisine göre TF 7-fold azalma vardır.
  2. HiP-FA KD1s mutasyonların 2-3 geçici tek önceki adımda elde edilen fikir birliği sırası tarafından ölçmek. Fikir birliği sıra bağlama tam kaybı olmaması için çok özel olmayan pozisyonlarda mutasyona çalışın.
    Not: Bu başvuru sıra faiz (biz bu protokol dev Gt için kullanılır), transkripsiyon faktörü tarafından bağlı olduğu önemlidir ama güçlü değil, zayıf rakipler yüksek konsantrasyonları kul böylece.
  3. Çekirdek motifi (8-12 çiftleri genellikle temel) genişletmek bir uzunluğu 16 baz çiftlerinin veya daha simetrik olarak ekleyerek için sıra (eklemek için uygun bağlama yan zincirler) her iki kanat. Gerekirse (daha uzun süre biding etki alanları, örneğin), uzun serileri (50'ye kadar ~ uzunluğu temel çiftleri HiP-FA tahlil ile test edildi) kullanın.
    Dikkat: ektopik bağlayıcı siteleri oluşturması beklenen üsleri eklemek dikkatli olun. Bu işlem (Örneğin, PySite22) kolaylaştırmak için kullanılabilir PWMs sitelerden bağlama tahmin hesaplama araçları kullanın.
  4. Etiketli başvuru olarak DNA, fluorescently olarak etiketlenir sipariş reaksiyonlar ya iletmek veya strand 3' veya 5' sonunda ters. , Örneğin Cy5, Bodipy-650 veya diğer uygun boya 10 µM (100 µM 10 x hisse senedi) su ve seyreltik bir konsantrasyon, kademeli olarak 3.1. adımda anlatılan kullanın.
  5. 500 mL 1 bağlayıcı arabelleğe x 33 mM potasyum fosfat tampon ekleyerek hazırlamak (pH = 7.0), 90 mM NaCl ve %0.01 non-iyonik deterjan distile su içinde. Ayrıca 3 x aynı bileşenleri dışında üç aşamalı konsantrasyonları içeren bağlama arabellek hazırlayın. 3 x bağlayıcı arabelleğe bağlama arabellek x 1 için hisse senedi çözüm olarak kullanılıyorsa, birimler > 500 mL hazırlamak; Aksi takdirde, 250 mL hazırlayın.
    Not: Bu kompozisyon transkripsiyon faktörü istikrar ve glutatyon S-transferaz (GST) dimerization önlemek için optimize edildi.
  6. Ölçü mikroskobu Kur ile açıklanan adım 1 0,8 içeren bağlama arabellek 200 µL FA için başvuru DNA TF farklı büyüklükte bir cam alt mikroskobu 96-şey plaka (5-6 wells farklı TF konsantrasyonları ile) huzurunda etiketli nM kullanmak için TF konsantrasyonu belirlemek. TF miktarda artan ile titrasyon serisi gerçekleştirmek ve kendisi için DNA başvuru oligomer tam bağlantısını gösteren bir plato eğri ulaşır konsantrasyonu tayini için seçin.
    Not: Optimum TF konsantrasyon TF-DNA ayrılma sabitler değerleri üzerinde bağlıdır. Genellikle, alt KDs düşük konsantrasyonlarda gerektirir.

3. oligomer tavlama

  1. Etiketli referans DNA (önceki adımda belirlenen sıra) DNA reaksiyonlar tavlamak için 7 ileri tek iplikçikli µL boya etiketli bir 10 mm DNA çözüm ve su 186 µL, etiketlenmemiş geriye doğru tamamlayıcı bir 10 mM konsantrasyon 7 µL karıştırın.
  2. Rakip DNA dizileri için 100 mM çözümleri (suda, üretici tarafından sağlanan) 20 µL mix 20 µL ters buna karşılık gelen 100 mm ile ileri tek iplikçikli DNA'ın tek DNA her bireysel rakip sırası için ölçülecek iplikçikli.
  3. Ayrı ayrı bir standart PCR cycler çözümleri için 3 dk. 70 ° c Isıtma ve RT için sıcaklık 0.1 K/s hızında azalan tarafından tavlama gerçekleştirin. PCR makinesi used sıcaklık degradeler o oranda desteklemiyorsa, sade bir şekilde sıcaklıklarda azalan ile kademeli incubations yapmak (test edildi 99 döngüleri 3 s-0.4 K ile devir başına).

4. jel hazırlık

Not: Aşağıdaki bölümde açıklanmaktadır jelleri iki farklı çeşit hazırlanması: 1) titrasyon wells jelleri protein içerir ve ilgili rakip DNA dizileri içinDs K belirlemek için kullanılan ve 2) kalibrasyon kuyuları için NF faydalanmak her zaman nokta ve satın alma yükseklikte DNA konsantrasyonu belirlemek. Odağı bir 96-şey plaka deneyde hazırlanması üzerindedir, ancak bir 384-şey plaka biçimi için karşılık gelen birimler de gösterilir.

  1. % 0,5 w/v düşük erime noktası özel bağlama arabellek bir laboratuvar mikrodalga fırında kaynatılarak geçiyoruz. Tam dağılmasından sonra mümkün buharlaşma için telafi etmek için tekrar GKD2O ile ses düzeyini ayarlayın.
    Not: Kolaylık sağlamak için 10-20 10 mL aliquots jeller, bir hazır hazırlamak ve gerektiğinde onları 75 ° C'de eritebilir. Jel hisse senetleri RT. saklanabilir
    Dikkat: jel çözüm mikrodalga fırında superheating önlemek dikkatli olun. Kısa bir Isıtma süre sallayarak ile aralıkları arasında tercih edilir.
  2. Titrasyon ve kalibrasyon kuyuları hazırlamak için ilk iki 10 mL jel hisse senedi aliquots 75 ° c altında sallayarak eritebilir.
    1. Her rakip için 240 µL (dahil olmak üzere % 20 ek yükü) kullanın (n = rakip dizileri sayısı).
    2. Jel NB kalibrasyon kuyu aynı hacmi bir eşit sıcaklık ve her iki jelleri viskozite emin olmak için kullanın.
    3. Sonra sıcaklık 35 ° C ila ayarla ve equilibrate sıcaklık için bekle.
  3. Titrasyon kuyular için 1.4 melezleşmiştir nM (son konsantrasyonu) başvuru DNA (elde edilen içinde adım 3), TF protein ekleyin (son konsantrasyon CTF 2.6. adımda belirlenen 20-60 nM =), n x 200 µL veya n x 13 µL 96 yılında toplam hacmi DTT (0.2 mM) ve bağlama arabellek -ya da sırasıyla (artı ek yükü) biçimi, 384-şey plaka. İyice sallayarak ters çevirme/Mix (değil girdap yapmak).
  4. 96-şey plaka biçimi (13 µL/386 kuyuları için de) jel çözümün bir kuyu başına 200 µL iyi plaka titrasyon kuyu içine önceki adımda hazırlanan yavaş yavaş ekleyin.
  5. Kalibrasyon kuyular için ilk 5 ekleyin nM NB wells (birim kullanılan iyi plaka biçime bağlı olarak ve kalibrasyon sayısına kuyuları; genellikle 5-6 iyi plaka başına yeter toplam) dışında erimiş jel için.
  6. 200 µL (384-şey plaka biçimi için 13 µL) yavaş yavaş iyi plaka titrasyon kuyu içinde jel içeren NB pipet ve hava kabarcıklarını önlemek emin olun.
    Not: Elektronik pipets veya Robotik kullanımını önemli ölçüde tekrarlanabilirlik artar.
  7. RT, 10 min ve başka bir 10 min 4 ° C'de kuvvetlendirmek jel izin (yoğunlaşma camdan daha sonra gerekirse kaldırın). İnhomogeneous jel yüzeyler önlemek için mükemmel yatay bir yüzey üzerinde tüm bu adımları yapmak emin olun.
    Not: Genellikle istikrarlı protein içeren jeller 4 ° C'de en az birkaç saat

5. rakip DNA çözüm ekleme

Not: Aşağıdaki çözümleri titrasyon başlamadan önce hazırlanmalı ve kalibrasyon ve titrasyon kuyuları üzerine aynı anda eklenir.

  1. Tavlanmış başvuru DNA ve protein bağlayıcı arabelleğe x 3 3 kez jel hisse senedi aliquots daha yüksek konsantrasyonlarda etiketli ekleyin.
    1. 3. adımda elde rakip DNA çözüm elde edilen çözüm mix 20 µL her 40 µL ile komplementer.
    2. Her kalibrasyon iyi için 3 x 15 mM NB solüsyon ile 40 µL tavlanmış rakip (herhangi bir dizisi aynı uzunlukta uygundur) DNA içeren bağlama arabellek 20 µL karıştırın.
      Not: Toplam 60 µL yerine 21 µL 384-şey plakalar için kullanın.
  2. İsteğe bağlı olarak, jel yükseklik düzeyleri farklı Wells plaka polimerlerin spectroscopically 380 absorbans ölçerek kontrol nm, bir çok iyi plaka okuyucu (absorbans değerleri jel zirvelere doğru orantılı) kullanarak.
  3. 50 µL (384-şey plaka biçimi için 7 µL) (adım 3'te komplementer) karışık rakip DNA çözümleri jelleri üstüne ekleyin. Tüm rakip çözümler mümkün olduğunca aynı anda elektronik çok kanallı pipets veya bir 96-kanal pipetting kafa kullanarak varsa eklemeyi deneyin. Rakip çözümleri eklenmesi sonra plaka mikroskop sahnesinde yerini ve ölçümler hemen (7. adım) başlatın.

6. resim alma

  1. Sırayla zserisi elde-yığınları (Örneğin, kullanım 12 uçak ve 100-300 ms aydınlatma zaman). İyi yüzeye çok yakın alma görüntüleri önlemek (< ~1.4 µm burada kullanılan plakalı) herhangi bir kutuplaşma önyargı dışlamak için.
  2. TF etiketli başvuru DNA'dan tam kesmeden kadar 10-25 döngüleri ölçümlerin gerçekleştirin. Bitiş noktası genellikle bağlama kinetik ve rakibin DNA Yayınım bağlı olarak 1-2 h sonra ulaşılır.

7. ham verilerden FA(z,t) çıkarılması

  1. İyi bir plaka yansıma sonra ham floresans görüntülerden polarize bölgelerinde faiz paralel (I=) ve dik (I+) yoğunluk bileşenin (Şekil 1c) ortalama piksel değeri hesaplamak. Bu HiP-FA yazılım23kullanılarak otomatik olarak yapılabilir.
    Not: HiP-FA yazılım, bir kullanım kılavuzu ve sınama veri kümesi indirilen23olabilir. Alternatif olarak, diğer özel olarak yazılmış yazılım özü ben= ve ben+ ve titrasyon eğrileri, aşağı akım çözümlemeyi gerçekleştirmek için aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kullanın.
  2. FA için her iyi hesaplayın. Her şey için komut dosyası FA(z,t) her z konumda hesaplar ve zaman gelin t göre:
    Denklem 1:Equation 1
    Nereye G düzeltir G-faktör herhangi bir önyargı dikey kanalı için araçtır.
  3. G-faktör mikroskobu kurulumunun bilinen anizotropi floresan bir boya içeren herhangi bir çözüm SK ölçerek belirlemek. Sinyal iki polarizasyon bileşenlerini ayıklamak ve Denklem 1 G, çözüm SK bilerek elde etmek için kullanın (G = 1,15 Bu Kur).

8. kalibrasyon eğrisi rakip DNA toplama SKNB üzerinden belirlenmesi için

  1. Her ileriye ve geriye doğru başvuru oligomer (100 mM hisse senedi toplama; kullanılan herhangi bir rasgele sıra rakip sıra can olarak aynı uzunlukta) 120 µL tavlama ve mix 3 NB içeren bağlama arabellek x 120 µL ile (15 nM).
  2. Seyreltme serisi toplam 6 dilutions ile bağlama arabellek x 1 1:2 dilutions ile hazırlayın. Bu dilutions Mix 50 µL % 0.5 düşük erime noktası özel (T > 35 ° C) jel 1 5 içeren bağlama arabellek x 200 µL ile NB nM triplicates içinde.
  3. Her bir 96-şey plaka önceki adımda hazırlanan 6 çözümleri 200 µL ekleyin ve 1 h 4 ° C'de tam jelleşme, o zaman 1 h RT. ölçü SKNB çözümleri, HiP-SK kurulumu kullanarak emin olmak için plaka saklayın.
  4. SKNB (z, t) göre önceki adımı ayıklamak ve Hill denklemi kullanarak veri uygun:
    Denklem 2:Equation 2
    CDNA DNA oligomer konsantrasyonu nerede; DNA reaksiyonlar bağlama sitelerin hangi yarıda konsantrasyonu işgal k ; SKmax bir normalleştirme sabitidir; ve n Hill katsayısıdır. k, SKmax ve n ücretsiz parametre olarak uygun işlem sırasında ayarlanır.
  5. HiP-FA yazılım (sol bölmedeki alt) uygun yordamda elde edilen üç parametre girin.
  6. Belirlenmesi birkaç ayda kalibrasyon eğrisinin veya mikroskobu ayarında değişiklik yaptıktan sonra tekrar.

9. rakip DNA konsantrasyonlarının tespiti

  1. HiP-FA yazılım kullanmak c ayıklayın (z, t) gelen SKNB(z, t) ölçümleri (Şekil 3). İlk önceki bölümde açıklandığı gibi kalibrasyon eğrisi elde edilir ve yazılım için uygun parametreleri girin (Ayrıntılar için kılavuzuna bakın).
  2. Program otomatik olarak c < 100 nM (Ayrıntılar için bkz: manuel) kullanmak için c(z,t) ulaşmak için kullanın Denklem 3 (Şekil 3b), özel jel matris içinde rakip DNA tek boyutlu difüzyon açıklar, varsayarak Ücretsiz difüzyon.
    Denklem 3:Equation 3
    C0 rakip DNA ilk konsantrasyonu nerede; ERF hata işlevidir; z konumudur; D rakip DNA difüzyon katsayısı olduğunu; ve t0 ölçümler başlangıç zamanı. C-0 kullanılan ücretsiz parametreler olabilir ve z /Equation 4.

10. geleneksel rekabet titrasyon HIP-FA ile çok güçlü DNA bağlama için

  1. Seri olarak farklı rakip DNA reaksiyonlar bir 96-şey plaka (veya 384-şey plaka) satırlardaki konsantrasyonları seyreltik: 0, 1,25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 ve 4000 nM. DNA Cy5 etiketli başvuru ekleyin (1 nM) ve sürekli bir konsantrasyon, bağlama arabellek (Şekil 5bir) bir kuyu başına 200 µL toplam hacmi ile TF (20-50 nM). Termodinamik denge elde kadar 40 dk bekleyin ve (HiP-SK kurulumu ile) elde z-yığınlar her şey için (iyi başına birkaç görüntüleri elde etme değişkenlik hesaplanan SK değerlerin ortalamasını tarafından azaltır).
  2. Denge bağlama titrasyon eğrileri oluşturabilir ve bunları denklem 4 (Şekil 5b) ile uygun. KDs kullanılanlarla aynı HIP-FA tarafından bir özel jel matris20kullanarak elde edilen geleneksel rekabet titrasyon tarafından belirlenir.

11. uygun yordamı SK titrasyon eğrileri

  1. Bireysel rakip serileri için yeniden oluşturulan titrasyon eğrileri HiP-FA yazılımında görüntülemek FA(z,t) f[c(z,t) =] ve görsel olarak veri kalite kontrol (Ayrıntılar için kılavuzuna bakın). Gerekirse, adım 10 rakip DNA konsantrasyonlarda belirlenmesi için kullanılan parametreler daraltın.
  2. Otomatik olarak rekabetçi titrasyon deneyleri24için analitik bir çözüm veren denklem 4 kullanarak her bireysel titrasyon eğrisi uygun.
    Denklem 4:Equation 5
    İle:Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    RT protein konsantrasyonu nerede; LT etiketsiz ve LST etiketli DNA toplama; KD2 belirlenecek ayrılma sabittir; RT aktif protein konsantrasyonu olduğunu; ve A ve B normalleştirme parametreleridir.

    Önce farklı KD2 değerlerinin belirlenmesi için bir referans olarak hizmet veren KD1, belirleyin. KD1 olduğunu boya-başvuru DNA dizisi etiketlenmemiş rakip DNA dizisi olarak seçerek tahlil ile kolayca belirlenebilir (kılavuzuna bakın).
  3. Yazılımda KD1 elde edilen değeri girin ve plaka üzerinde rakip DNA için KD2 değerleri hesaplamak.
    Not: Ücretsiz uygun yordam KD2, RT, A ve b parametreler
  4. Ayrışma sabiti KD2 ve konsantrasyon aktif protein RT plaka tüm bireysel titrasyon kuyuları için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı "Dışa aktar" düğmesini tıklatarak dışa aktarın.

12. PWM inşaat, özgüllük Protein-DNA etkileşim ve sözde sayar

Sıra logolar20daha önce açıklandığı gibi online alet WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) kullanarak farklı PWMs için oluşturun.

Representative Results

Biz büyük ölçüde üzerinden transkripsiyon yönetmelik Drosophila embriyo posterior anterior vücut desen oluşturan segmentasyon gen ağ25,26, TFs HiP-FA uygulanan. Bu ağdan bZIP seçtik etki alanı TF dev (Gt) için ayrıntılı analizi (Şekil 4). Tam uzunlukta transkripsiyon faktörleri hızlı ve çoğunlukla aynı bağlama Tercihler onların DNA bağlayıcı etki alanları (DBD)13olarak verim zor olduğundan, GST için erimiş DBD kullanılan ve E.coli GST füzyon proteinlerde yapı ifade DBDs tek başına20olarak aynı sonuçlar.

Gt fikir birliği sıra (birTTACGTAAC) yukarıda açıklandığı gibi belirlenen en güçlü bağlama sırasını temsil eder. O zaman 5' ve 3' ucunda ilave üsler çevrili 10-mer Gt fikir birliği dizisi (Toplam 30), içinde tüm olası tek-noktaya mutasyonların bağlama enerji etkisi araştırıldı. Biz iki çoğaltır olan jel örnekleri Otomasyon kullanarak üretildi ve el ile karşılaştırma için üretilen bir ek çoğaltma ölçüldü. KDs > 2000 nM tek başına mutasyona uğramış serileri için için 0,6 değişiyordu ve biz de bağlama "bağlayıcı" diziye (veri gösterilmez) eksiksiz eksikliği doğruladı.

TF-DNA bağlayıcı özelliklerine genellikle içinde bağlama motifi her pozisyonda olası her nükleotit bir puan atandığı konumu ağırlık matrisi (PWM), kullanarak modellenmiştir. PWM her pozisyon gücü bağımsız olarak bağlama için katkıda bulunur ve çoğu durumda yeterli bir model teşkil eder tercihleri27bağlama TF için varsayar. Gözden geçirilmiş PWMs bizim benzeşme ölçümleri dayalı oluşturulan aşağıdaki kurulan yordamlar28,29 ve onları daha önce literatürde bildirilen iki PWMs göre. İlk DNA footprinting4,5tarafından tanımlanan siteleri bağlama dan nükleotid frekansa sayıları dayalı ve ikinci PWM bakteriyel bir hibrid (B1H) seçerek elde edildi. 15

PWMs için üç çoğaltır (Şekil 4, üst paneli), yüksek benzerliği örnek (REPLICATE 3) el ile hazırlanan için de dahil olmak üzere, yüksek tekrarlanabilirlik HiP-FA yöntem gösterir. HiP-FA tarafından elde edilen PWMs genel olmakla birlikte elde edilen PWMs diğer yöntemleri ile (Şekil 4, alt paneli), orada benzer önemli sapmalar: pozisyonda 2 (siyah ok), çekirdek bZIP motifi, mutasyonlar T Başlat > neden olabiliyor (G, C, A) Komple HiP-tutarlı FA tarafından elde edilen motif bağlamasında kaybı B1H motifi ancak DNaz footprinting, bağlama üsleri (G, A) nispeten güçlü kalır ile elde değil. Bunun tersi olarak, 7 (gri ok), mutasyon T, pozisyon > C üzerinde daha önce ölçülen PWMs göre beklenen daha fazla güçlü bağlama yol açar.

Diğer sapmalar daha usta ama daha az önemli. Genel olarak, HiP-FA PWM fikir birliği üzerinden birçok mutasyon hala orta derecede güçlü bağlamasında neden gerçeği yansıtan diğer iki daha az özgüdür. Bu bilgi içeriği (IC) kullanarak sayısal. IC IC karşılaştırıldığında HiP-SK Matris (ortalama üç çoğaltır), 11,5 bittir 13.4 ufak tefek DNaz footprinting ve B1H matrisler, 16,8 bit sırasıyla =. Genellikle olsa (değil evrensel), HiP-FA tarafından elde edilen PWMs bu 26 TFs dayalı diğer yöntemlerle elde edilen20soruşturma daha az belirgin.

Figure 1
Resim 1:HIP-FA tahlil ve deneysel Kur şematik tasvirleri. (a) jel iletim sistemi için titrating rakip DNA tek Wells. (b) HIP-FA mikroskobu Kur. Bir EM-CCD kamera polarize floresan ışık algılama otomatik widefield mikroskopla özelleştirilmiş. (c) Raw floresan görüntü ilgi paralel (kırmızı) belirlemek için kullanılan iki bölgeleriyle ve dik (yeşil) polarize bileşenleri. (d) 96-şey plaka tipik düzeni. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Ham SK veri ve yeniden oluşturulan titrasyon eğrileri. (a) tipik FA(z,t) yörünge de NB içeren bir kalibrasyon için (b, c) FA(z,t) zaman yörüngeleri bağlama güçlü (b) ve daha ılımlı (c) DNA bağlama rakip ölçme iki titrasyon kuyuları için. (d, e) Karşılık gelen SK titrasyon ölçümleri yeniden ve güçlü (d) ve Orta (e) bağlama için eğrileri ile donatılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Rakip DNA c konsantrasyonu belirleme (z, t) kullanarak Nil Blue (NB). (a) SK-konsantrasyon kalibrasyon eğrisi 16 baz çifti DNA reaksiyonlar için. Bir geleneksel titrasyon serisi, NB özel jel rakip DNA'sı farklı konsantrasyonları ile birlikte gömülür. NB benzeşme DNA dizisi bağımsız20' dir; Bu nedenle, aynı kalibrasyon eğrileri c belirlemek için kullanılabilir (z, t) farklı DNA dizileri aynı uzunlukta için. (b) rakip DNA zaman difüzyon profil beş kalibrasyon wells kullanarak kararlı bir rasgele z yükseklikte. Her ölçüm döngüsü için dört NB içeren Wells ortalama FAs beyaz noktalar görüntülenir. Denklem 3 (beyaz çizgi, renk bireysel wells) ve c kullanarak eğrileri donatılmıştır (z, t) düşük konsantrasyonlarda (C < ~ 100 nM) tahmini uygun eğri tarafından belirlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Özelliklerine bZIP etki alanı ailesinin TF dev (Gt) bağlama. Üç çoğaltır, HIP-FA PWMs: iki Otomasyon kullanılarak hazırlanan ve bir el ile hazırlanan (üst paneli) DNaz footprinting ve bakteriyel bir hibrid (B1H) seçim yöntemi (alt paneli) tarafından oluşturulan PWMs ile karşılaştırılır. Genel olarak, HIP-FA bağlama motifleri ile önceki veri katılıyorum ama aynı zamanda siyah ve gri oklarla vurgulanmış olarak önemli farklılıklar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : HIP-FA ile geleneksel rekabet titrasyon. (a) plaka tasarım bağlama arabellekte bir 96-şey plaka tek bir satırda seri olarak seyreltilmiş 8 farklı rakip DNA gösterir. Bir SK ısı haritası farklı rasgele bağlama güçlü için gösterilir. (b) üç rakip DNA'lar rekabetçi titrasyon Bcd TF farklı benzeşim ile bağlama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

HiP-FA bağlama tercih manzara TF-DNA etkileşimlerin belirlenmesi için kapsamlı bir yeni yöntemidir. Bu bağlama benzeşim versiyonlarının bağlama tercihleri eşik yukarıda bağlayıcı kümesi nükleotit oluşum sıklığını yansıtılır herhangi bir temel varsayım kaçınarak mutational DNA motifi doğrudan, ölçer. Ölçüm çözüm immobilizasyon ve denge koşullarını mümkün olduğunca yaklaşıldığıdır bağlama tepki, mekanik ya da kimyasal müdahale olmadan gerçekleşir. Kontrollü teslimat sistemi ölçüm bir tam titrasyon eğrisi içinde tek bir de verir ve protein kaydedilirken performansı ve güvenilirliği artırmaktadır. Nesnel bir yüksek sayısal diyafram ve EM-CCD kamera ile yüksek ışık toplama verimliliği ile kullanma için son derece hassas floresan ışık algılama sağlar. Bu nedenle, bu kurulum ile düşük 10-15 mP doğru bir şekilde tespit edilebilir küçük SK değiştirir; uygulamada, bu demektir ki herhangi bir bağlama tepki için bağlama (düşük olarak 2 kitle oranında) en az sonra kitle artış kolayca algılanır. Bu genellikle Mikroplaka Okuyucular gibi ticari sistemleri ile durum böyle değil. Yüksek hassasiyeti nedeniyle, HiP-FA picomolar aralığına güvenilir bir şekilde ölçülebilir ayrılma sabitler aralığı genişletir. Bağlama enerjileri doğru bir şekilde birden fazla büyüklük belirlenir.

Gözden geçirilmiş PWMs kalitesini değerlendirmek için iki tür analiz20gerçekleştirilen. Test ettik segmentasyon gen ağ beş etmen için ne kadar iyi farklı PWMs deneysel ChIP-seq profilleri 21 segmentasyon genlerinin genomik bölgelerde tahmin edebilirsiniz. İkinci bir test olarak, segmentasyon arttırıcılar katılan TFs bağlama tercih ve protein konsantrasyonu temelinde ifade şekillerinin öngörür bir sıra ifade modeli4 kullandı. Her iki alýþtýrmalarda, daha az belirgin HiP-FA PWMs önemli ölçüde gerçekleştirmek bulduğumuz daha iyi daha belirgin footprinting ve B1H PWMs20.

De novo yöntemlerinden farklı olarak, HiP-FA bir verilen TF'ın bağlama tercih bazı ön bilgi gerektirir. Ancak, fikir birliği dizileri için birçok TFs bilinen ve birçok varolan Yöntem onları13,14,15temin edebilir. Gerekirse, gerçek en iyi bağlama sırası yinelemeli olarak bulunabilir.

Biz DNA başvuru reaksiyonlar fluorescently etiketli Cy5 ve Bodipy-650 ile kullanılır. Bu boyalar ilişkili ve ilişkisiz etiketli-başvuru DNA anizotropi yaşından beri farklı test edilmiş boyalar en büyük de FA ölçülerini gerçekleştirmek için kanıtlanmıştır. Bu maksimum dinamik aralığı için SK değerleri sağlar. Genel olarak, herhangi bir floresan boya ile floresan ömür boyu ≥ 1 ns ilk test gerekiyor uygun olması muhtemeldir. Mümkünse, bu protein autofluorescence en aza indirmek için yakın-IR aralığında Floresanda boya kullanmak için tavsiye edilir.

Deneysel işlemin en kritik adım jel iyi tabak içine pipetting olduğunu. İyi tekrarlanabilirlik jel birimleri olarak Tekdüzen olmasını gerektirir. Jel yükseklik değişiklikleri Yayınım rekabetçi DNA oligomer ve dolayısıyla benzeşme belirgin değişiklikleri değişiklikleri verileri değerlendirirken çevrilir. Bu teknik bir çoğaltma varyans ana kaynağıdır. Elektronik damlalıklı veya Otomasyon teknikleri tekrarlanabilirlik geliştirir. Hava kabarcıkları jel içinde yavaş ve dikkatli pipetting önlenebilir. Tüm rakip çözümleri ile titrasyon kuyu üstüne mümkün olduğunca küçük gecikme eklemek önemlidir. En iyi tekrarlanabilirlik için tüm süreç İnkübatörler ile pipetting bir robot kullanarak otomatik hale getirilebilir. Otomasyon için protokol aktarmak için önemli bir kuluçka sıcaklık gerekli optimizasyonu ve kuluçka süreleri parçasıdır. Viskozite jel arasındaki en iyi dengeyi bulmak emin olun (i.e. çok soğuk,) ve istikrar proteinlerin (Yani, çok sıcak değil). Bu ikisi de bağlıdır jelleri dağıtım hızı kullanılan protein kararlılığını ve kuyu içine üzerinde.

HiP-FA rakip DNA reaksiyonlar için kontrollü teslimat sistemi kullanır. Titrations eğriler oluşturmak için verilen her zrakip DNA toplama c(z,t) belirlemek gereklidir-pozisyon jel matris içinde ve zaman noktası t. KDs belirlenmesi doğrudan c(z,t)üzerinde bağlı olduğundan bu başka bir önemli adımdır. DNA toplama için sensör olarak NB boya içeren kalibrasyon wells (Şekil 1d, Şekil 2bir) bu amaç için kullanılır. Genellikle, 3-5 kalibrasyon wells NB plaka içeren yeterlidir. Herhangi bir HiP-FA değerlendirmeden önce deneme, NB kalibrasyon eğrisi kurulum için bir rakip DNA'sı farklı konsantrasyonlarda (Şekil 3 herhangi bir sıra ile özel jel içinde çözünmüş NB geleneksel titrasyon dizi gerçekleştirerek inşa edilmelidir bir), ayrıntılı 8. adımda açıklandığı gibi. Çok güçlü bağlama durumunda (KD < 500 pM), düşük konsantrasyonlarda rakip DNA tayini için kullanılan ekstrapolasyon sınırlama, ondan beri onun'daha az doğrudan bir ölçüm daha doğru olur. Ancak, böyle düşük KDs ile TFs için HiP-SK kurulumu geleneksel bir rekabetçi titrasyon bağlama arabellek bir özel jel matris (Şekil 5) kullanmaya gerek kalmadan gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bir tam titrasyon rakip DNA 12 farklı konsantrasyonları ile 96-şey plaka tek bir satır olarak gerçekleştirilebilir.

Özel jel rağmen (yavaş) dinamik olmasına rağmen kontrollü teslimat sistemi beri difüzyon hızlı TF-DNA bağlayıcı kinetik ve istikrarlı proteinler de gerektirir. Her iki özelliği doğrudan HiP-SK kurulumu ile yanında tabi, zaman, ne zaman kendi için başvuru DNA fluorescently etiketli bağlı faiz TFs SK içinde test edilebilir. KON ve KOFF oranları incelenen faktörleri için ölçülen ve saniye20, uygun olarak diğer çalışmalar30milisaniye sırasına gördüm. Bu ölçümler denge yerde almak emin olmak için yeterince hızlı. Yavaş kinetik diğer bağlayıcı etki söz konusu olduğunda, rakibin Yayınım onun konsantrasyonu düşürülmesi veya jel gözenek boyutunu küçültmeyi ayarlanabilir. Test TFs söz konusu olduğunda, tüm hızlı Tkapalı olması (~ saniye), toplam ölçüm yaklaşık 1-2 h her ölçüm, termodinamik denge sağlamak için yeterli zamanı.

Protein ile ilgili başka bir olası sorun SK ölçümleri değiştirebilir protein toplamları oluşumdur. (Tensides gibi) farklı katkı maddeleri içeren diğer tampon koşulları kullanım toplama oluşumu, gerekirse engelleyebilirsiniz.

PWM doğrusallık varsayımı altında çalıştım; Ancak, HIP-FA tüm olası di-nükleotit mutasyonlar fikir sırasının içerecek şekilde ölçeklenebilir. Son olarak, HiP-FA diğer tip-in bağlama etkileşimleri ölçmek için adapte edilebilir. İçin önkoşuldur kullanılabilir uygun başvuru molekül bağlı fluorescently etiketli protein tarafından. Kontrollü iletim sistemi ile her türlü ligand için konsantrasyon gradyanı oluşturulabilir; Bu nedenle, protein-protein ve uyuşturucu-protein etkileşimleri benzer şekilde yüksek sadakat ve işlem hacmi ile ölçülebilir.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çatışma bildirin.

Acknowledgments

J. Müller, değerli tavsiyeler ve ruhlu tartışma cDNA klonlar ve Galya laboratuarda özellikle S. Bergelt üyeleri için teşekkür ediyoruz. Bu eser SFB 646, genom ifade ve bakım (C.J., P.B.), tümleşik Protein bilim (U.G.) için merkezi ve Enstitü nicel Biosciences Münih (M.S.) için düzenleyici ağları tarafından desteklenmiştir. U.G. kabul eder Bundesministerium für Bildung und Forschung (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM) tarafından Deutsche Forschungsgemeinschaft destek (BMBF: efe - Innovationswettbewerb Systembiologie) ve Humboldt Vakfı (Alexander von Humboldt, Profesörlük).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. , Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. , Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).

Tags

Biyokimya sayı: 144 transkripsiyon faktörü protein-DNA etkileşim bağlama özgüllük bağlama benzeşme floresans anizotropi segmentasyon ağ
Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., … More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter