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Biochemistry

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

doi: 10.3791/58763 Published: February 7, 2019

Summary

大規模な感度を考慮した結合親和性平衡、ソリューションを決定するための手法をご紹介します。これは、転写因子の DNA 結合の定量的解析を向上します。メソッドは、制御された配信システムで自動蛍光異方性測定に基づいています。

Abstract

転写因子 (TF) の正確な定量化-DNA の相互作用は遺伝子発現の規則を理解するため。以来、既存のアプローチは大きな制約に苦しむ、大規模に感度が高い TF DNA 結合親和性を決定するための新しい方法を開発しました。試金は確立された蛍光異方性 (FA) の原則に依存しているが、重要な技術的な改善を紹介します。まず、TF と多孔質の agarose のゲルのマトリックスで DNA の蛍光に分類された参照を組み込むことによって単一の井戸の完全 FA 競争力のある滴定曲線を測定します。ラベルのない DNA オリゴマーは上の競争相手としてロードされ、拡散を時空間的勾配を形成します。カスタマイズされた落射蛍光顕微鏡のセットアップを使用して生成される FA グラデーション、読み出します。この改善されたセットアップを同じような分子量の分子に対しても確実に定量化する弱いと強力なバインディングが可能、FA 信号検出の感度が大幅に増加します。このファッションのウェル プレートのウェルあたり 1 つの滴定曲線を測定することができ、フィッティング処理を通じて絶対的な解離定数 (KD) とアクティブな蛋白質の集中の両方を抽出できます。与えられたコンセンサス シーケンスのバインドのすべてのシングル ポイント突然変異のバリエーションをテストすることにより単板に通常の TF の全体結合特異性風景を調査して我々。結果位置の重み行列 (Pwm) アウトパ フォーム TF 占有体内を予測の他のメソッドから派生したものです。従来の自動化された蛍光顕微鏡とデータ解析パイプラインのヒップ-FA を実装するための詳細なガイドを紹介します。

Introduction

定量的な方法で彼らの結合の好みを決定する重要遺伝子の転写因子 (TFs) の中心的な役割を与えられました。・ フォン ・ ヒッペルによる独創的研究によって制御される RNA のポリメラーゼ プロモーターを募集の下流のイベント中のバインドは熱力学の平衡で記述するよう規制 TFs が急速に DNA を認識概念が導入されて遅い速度1生体内でバインディングを示唆して、この絵は可能性がより複雑な2,3;それにもかかわらず、これらの一般的な仮定は良い近似として役立ち、シス要素を検索し、シーケンス4,5,6から式を予測する多くの計算のアプローチを支持しています。平衡バインディングが概念として正常に採用されてこのようにしながら TF DNA の相互作用を決定する方法が現在バインドの特異性に焦点を当てる、通常直接測定平衡結合親和性。TF DNA 結合の系統的測定はかなりの技術的な課題を表し、既存の方法いくつかの異なる制限があります。

結合親和性の測定または genomic フラグメント内のサイトのバインドの正確な局在、深い (チップ seq)7、最も普及している生体内でテクニックをシーケンス続いてクロマチン免疫沈降は許可されていません。いくつかの in vitroメソッドは、DNase フット プリント8、電気泳動の移動性シフト (EMSA)9、表面プラズモン共鳴 (SPR)10、マイクロ スケール働く11などは結合親和性を測定することができます。しかし、彼らは比較的低いスループットです。ハイスループット技術タンパク質結合マイクロ アレイ12、HT SELEX13,14, 細菌 1 ハイブリッド (B1H)15などが結合親和性を測定し、通常過度に降伏することは逆に、特定のシーケンス、主因は厳しい選択をバインドまたは洗浄の手順が必要です。最近の進展、ディープ シーケンス ベース ヒット フリップ16や笑顔 Seq19と SELEX seq17、マイクロ ベース三富18絶対結合親和性; の抽出を可能にします。ただし、彼らはラベル付きの TF と DNA の蛍光強度を測定に依存します。蛍光信号、したがって、なる低蛋白質濃度と低 KD値を決定する制限 (< ~ 10 nM)。さらに、これらのメソッドで TF DNA 結合が行われる薄い表面上不明確な結合および/または自動蛍光バック グラウンド、弱い結合を正確に定量化することは困難になると問題を提起します。

これらの制限に対処するため TF DNA の親和性風景平衡、高性能蛍光異方性 (ヒップ-FA)20と呼ばれるソリューションを決定するための新しい手法を提案します。手法は確立された蛍光異方性 (FA) アッセイ21に基づくが、高感度とカスタマイズされた自動顕微鏡や分析のセットアップを使用して大規模な結合定数を測定する変更します。

FA アッセイ標識分子の分子の回転を測定することによって TF、この場合の結合パートナーに (DNA オリゴマー) のような蛍光に分類された種との相互作用を監視します。TF に結合する、回転速度が高い流体力学的半径と分子量増加 FA で結果バインドの複合体のため低下します。非常に強い結合の正確な測定 (KD < ~ 1 nM) ラベルの付いた参照 DNA の低濃度の使用が必要です (c < ~ 1 nM)。これは、標準的なマイクロ プレート リーダーなど市販の装置では実現困難です。さらに、連結および非連結の複合体のサイズに大きな差 (10 ~ 100 倍) は通常必要な TF 結合ドメインを通常ほぼ同じ分子量の短い DNA オリゴマーとの間の相互作用の測定を禁止します。.最後に、による滴定曲線は、通常合成と titrating 種の濃度シリーズを含む複数の井戸の測定が必要です。

これらの問題に対処する単一の井戸の z 位置の違いで FA 計測ができ、高い検出感度を達成するために変更された広視野の顕微鏡のセットアップを使用します。これにより、種同様の分子量と高親和性の結合相互作用を監視することができます。高いスループットを実現するには、ウェル プレート形式とよく管理された配信システム (図 1) を使用して単一の全体の滴シリーズの実施で FA を測定します。さらに、競争の結合の試金を採用し、結合定数だけでなく、アクティブなタンパク質の濃度を抽出します。表現された TF 分子の部分だけがタンパクや劣化によるアクティブなので、これはアッセイの重要な機能です。実験装置は、XY ・ Z ピエゾ ステージを搭載した商業落射蛍光顕微鏡に基づいています。我々 は外部レーザ励起、システムをアップグレードし、2 つ高量子効率光検出 (図 1b1 c) を持つ EM CCD カメラのチップ上の線形偏波成分の放出を検出します。超高感度センサーと結合した高開口数 (NA) 目的が使用され、したがって高感度 FA 計測を affords します。蛍光 z スタックを記録することによって相互作用を結合測定できます光の z 軸に沿って反応に異種のマトリックスを使用する場合。すべてのこれらの変更は既存のシステムに容易に実装することができます、費用対効果。

我々 は、ラベル付けされていない DNA オリゴマーの結合親和性を参考に蛍光に分類された DNA と比較して測定競争の結合の試金を採用しています。TF と参照 DNA 結合の相互作用のない環境を構成する、多孔質 agarose ゲルのマトリックス (細孔サイズ 〜 1 μ m) で一定濃度組み込まれます。参照 DNA は、Cy5 とともに表示されます。この色素は、比較的長い蛍光寿命により FA 計測に適してことを証明 (~ 1 ns) と可視スペクトル (低自動蛍光バック グラウンド) ので、遠赤色蛍光性の放出。TF 濃度はモル超過 Cy5 参照 DNA、すべて参照 DNA が蛋白質にバインドされていることを確認します。ラベルのない競技者 DNA の溶液はゲルの表面上に堆積しとzが変わって濃度勾配c (z, t)を確立する多孔性のマトリックスの内部拡散-フォーカル プレーンと時間t (図の位置1図 2a から 2 c)。Cy5 参照 DNA に結合する TF がローカル ライバル Cy5 参照 DNA FAREF(z, t)の動的に変化する FA につながるバインディングの競合している DNA の異なる濃度にさらされている従って (図 2b2 c)。

ライバルの濃度 c(z,t) を決定する個別井戸 (校正ウェルズ) ナイル青 (NB) FANB(z, t)の動的に変化する FA の信号の測定 (図 2、3)。この色素は DNA に主体し、それにより競合企業 DNA の DNA センサーとして機能します。この制御の配信システムと 1 つのウェル プレート (96 または 384 ウェル プレート形式) 内で数十数百の異なる DNA タンパク質結合親和性を測定できます。測定が TF からラベル参照 DNA の完全な変位まで順番に実行されます。長さNのコンセンサス配列のすべて3 N単一ベースの突然変異の親和性を測定することにより特定の因子の結合特異性を決定しました。ヒップ FA タンパク質の少量が必要です (~ 滴定曲線あたり pmols) 低速で比較的大きいスケールで測定しながら KDs [係数が変化 (CV) < 20%] の決定の可変性と。このメソッドは、手動でまたは完全に自動化ロボット システムでは、さらに低い CVs (図 4、上部のパネル) の結果を使用して実施できます。解離定数は 0.5 まで高精度で測定されます nM。非常に高い親和性の (KD < 500 pM)、標準的な競争力のある滴定 (図 5) を使用して、低レベル (< 100 nM) でライバル DNA 濃度測定の誤りが原因。

ヒップ-FA は、ほぼ任意の標準実装、反転、蛍光顕微鏡、自動 XY ステージとピエゾ z 軸ステージの可用性を提供できます。光学部品は、長距離目標装備自動広視野セットアップ中造られました。実習では、アッセイは (の特定作業、距離と開口数) 他の特性の目的に適応することができます。ただし、パラメーターの最適化が必要です ( z間の距離-スライス、気孔率およびagarose のゲル等の高さ。)。他の種類のレーザーやカメラの使用も可能です。プロトコル セクションの全体の実験とデータ解析の詳細な説明を記します。

Protocol

1. 偏光顕微鏡

  1. 広視野レーザ照明のフォーカスを連続的なダイオード レーザーの 638 nm 行 (40 mW) ビームのクリーンアップのためのマルチモード光ファイバーの開口部。レーザー光の偏光状態を設定するのには、ファイバーの出力で直線偏光子をマウントします。
  2. ダイクロイック ミラー (640 nm のカット) とバンドパス フィルター (帯域 700/75) 発光の励起コンポーネントをブロックします。
  3. その垂直と平行偏光成分に放出される光を分割偏光ビームスプリッターを通過する蛍光信号をしましょう。その後に焦点を当てる非反射ビーム (並列コンポーネント) と 200 ミリメートルの焦点距離の色消しレンズで反射されたビーム (垂直コンポーネント) (図 1b1 c) 裏面照射型 EM CCD カメラのチップ。ミラーを使用すると、レンズに向かって垂直ビームの方向を調整します。

2 設計および参照の蛍光標識 DNA オリゴマーのテスト

  1. 参照 DNA のコア シーケンスを確認: 転写因子とのバインディングの競合ラベルのないライバル DNA オリゴマーの解離定数 (KD2) を測定する競争の試金をに基づいてメソッドを蛍光に分類された DNA の TF にアフィニティが参照 (KD1) として機能します。他のソースから得られるコンセンサス配列のように DNase フット プリントまたは細菌 1 ハイブリッド開始ポイント5,15として使用できます。
    注: 親指のルールとして、DNA の一致シーケンスと比較して TF に結合親和性 7 倍低下する 3 適切な参照。
  2. ヒップ fa KD1s を前の手順で派生したコンセンサス配列の 2-3 仮単一突然変異の測定します。バインディングの完全な損失を避けるためにも固有ではない一致シーケンス内の位置を変更してみてください。
    注意: リファレンス ・ シーケンスが (私達はこのプロトコルの巨大な Gt で使用)、興味の転写因子に拘束されることが重要ですが、余りに強く、弱い競争相手が高濃度で打ち勝つことができますように。
  3. 拡張コア モチーフ (8-12 ペアを一般的にベース) による対称を追加する以上 16 塩基対の長さに並ぶ両側 (追加する適切なバインディングの側鎖) のシーケンス。必要に応じて (長時間拘束ドメイン、たとえば)、(〜 50 基本対の長さ腰 FA 試金でテスト済み) まで長いシーケンスを使用します。
    注意: は異所性結合部位を作成する予想される拠点を追加しないように注意してください。(例えば、 PySite22) このプロセスを容易に使用可能な Pwm から結合部位を予測計算ツールを使用します。
  4. ラベル参照 DNA として蛍光でラベル付けされている順序オリゴマーでは転送するか、または逆に 3'、5' 端のストランド。たとえば cy5 の組合せ、Bodipy 650 または 10 μ m (100 μ M 10 x の在庫) 水と希釈濃度で他の適切な染料として段階的手順 3.1 で説明を使用します。
  5. 33 mM カリウム リン酸バッファーを追加して 500 mL の結合バッファー × 1 を準備 (pH = 7.0)、90 mM, 塩化ナトリウムと蒸留水で 0.01% 非イオン性洗剤。また 3 x 3 倍濃度でを除いて同じコンポーネントが含まれる結合バッファーを準備します。原液として x 結合バッファー 1 の結合バッファー x 3 を使用する場合準備ボリューム > 500 mL。そうでなければ、250 mL を準備します。
    注: この構成は、転写因子安定しグルタチオン s-トランスフェラーゼ (GST) 二量体化を防ぐために最適化されていました。
  6. 0.8 を含む結合バッファーを 200 μ l 添加の FA 手順 1 で説明した測定顕微鏡のセットアップで nM を参照ガラス底顕微鏡 96 ウェル プレート (TF 濃度の異なる 5-6 ウェルズ) TF の異なる量の存在下で DNA を標識使用する TF 濃度を決定します。TF の増加額で滴定シリーズを実行し、試金のためカーブを DNA 参照オリゴマーの完全な結合を示す高原に達する濃度を選択します。
    注: 最適な TF 濃度は TF DNA 解離定数の値に依存します。一般的に、低い KDsは低濃度を必要とします。

3. オリゴマー焼鈍

  1. ラベル付き参照 (前の手順で決められた順) DNA の DNA オリゴマーをアニール、7 μ L 色素標識 10 mM の前方の単一座礁させた DNA 溶液と水の 186 μ L でそのラベルのない逆の補数の 10 mM 濃度の 7 μ L を混ぜます。
  2. ライバルの DNA シーケンスのためミックス 20 μ L (水、製造元によって提供される) で 100 mM ソリューションの対応する逆の 100 mM の 20 μ L で前方の単一座礁させた DNA の一本鎖測定する個人競技者の各シーケンスの DNA。
  3. 熱処理を施した別標準 PCR サーマルサイクラー 3 分 70 ° C までのソリューションを加熱し、0.1 K/s の速度で RT に温度低下によってを実行します。PCR 機がその速度で温度勾配をサポートしていない場合は単に気温の低下とともに段階的な孵化を行う (テストされた 3 の 99 サイクル サイクルあたり-0.40 k s)。

4. ゲル作製

注: 次のセクションについて説明しますジェルの 2 種類の準備: 1) 滴定井戸蛋白質が付いているゲルを含み、それぞれライバルの DNA シーケンスのためDの K を決定するために使用し、2) 校正井戸に NB の使用すべての特定の時間ポイントと獲得高さで DNA 濃度を決定します。96 ウェル プレートで実験の準備にフォーカスがあるが、384 ウェル プレート形式の対応するボリュームが示されています。

  1. 研究所電子レンジで沸騰することにより結合バッファーで 0.5 %w/v 低融点アガロースを溶解します。完全な分解の後 ddH2O 可能の蒸発を補うために、もう一度ボリュームを調整します。
    注: 利便性のためのゲルの 10 20 10 mL 因数の在庫を準備、75 ° c が必要なときそれらを溶かします。室温ゲル株式を格納できます。
    注意: は、電子レンジでゲル溶液の過熱を避けるために注意してください。短い加熱時間の間揺れとの間隔が望ましい。
  2. 滴定および校正の井戸を準備するには、最初揺れ下 75 ° C で 2 つの 10 mL ゲル株式因数を溶かします。
    1. 各競技者の 240 μ L (20% のオーバーヘッドを含む) を使用 (n = ライバル シーケンスの数)。
    2. 等しい温度と両方のゲルの粘性を確保するのに NB 校正もゲルの同じボリュームを使用します。
    3. 35 ° C に温度を設定し、平衡に温度を待ちます。
  3. 滴定井戸 1.4 nM (最終濃度) 交配参照 DNA (で得られたステップ 3) TF タンパク質を追加 (最終濃度 CTF = 20-60 nM ステップ 2.6 で決定した)、n x 200 μ L または、96 n x 13 μ L の総ボリュームでバッファーの DTT (0.2 mM)、およびバインディング-384 ウェル プレートそれぞれ (プラス オーバーヘッド) の形式、または。反転振動で徹底的にミックス (ボルテックスにかけないでください)。
  4. ゆっくりとウェル プレート滴定井戸に前の手順で作製したゲル溶液の 96 ウェル プレート形式 (386 井戸 13 μ L/ウェル) ウェルあたり 200 μ L を追加します。
  5. 校正井戸最初追加 5 nM NB (合計ボリューム調整数と使用するウェル プレート形式によって井戸; 通常 5-6 ウェル プレートあたりで十分です) の井戸の外溶けたゲル。
  6. ピペットの 200 μ L (384 ウェル プレート形式の 13 μ L) ニオブ添加ゲルのウェル プレート滴定ウエル内でゆっくりと気泡を避けるようにしてください。
    注: 電子 pipets またはロボットの使用状況は、再現性を著しく増加します。
  7. 常温では、10 分の 4 ° C で別の 10 分を固めるゲルを聞かせて (結露ガラスからその後必要に応じてを削除) します。不均一なゲルの表面を避けるために完全に水平面上のこれらのすべての手順を実施することを確認します。
    注意: タンパク質含有ゲルは通常安定した 4 ° C で、少なくとも数時間、

5. ライバル DNA ソリューションを追加します。

注: 以下の解決策は滴定を開始する前に準備する必要があります、同時に校正と滴定の井戸の上に追加されます。

  1. 焼なましラベル参照 DNA および蛋白質結合バッファー x 3 で 3 回でゲル株式因数より高い濃度を追加します。
    1. それぞれ 40 μ L で得られた溶液のミックス 20 μ L は、手順 3 で取得した競合企業 DNA ソリューションを熱処理しました。
    2. 各校正も焼鈍競合 (同じ長さの任意のシーケンスに適して) DNA の 40 μ L で 15 mM NB ソリューションを含む結合バッファー x 3 の 20 μ L をミックスします。
      注: 384 ウェル プレート、合計で 60 μ L ではなく 21 μ L を使用します。
  2. 必要に応じて、380 で吸光度を測定することによって分光板のさまざまな坑井のゲルの高さレベルの均一性をチェック (吸光度値がゲルの高さに比例して) ウェル プレート リーダーを使用して nm。
  3. (手順 3 で焼鈍) 混合競技者 DNA ソリューション、ゲルの上に 50 μ L (384 ウェル プレート形式の 7 μ L) を追加します。利用可能な場合、電子マルチ チャンネル pipets または 96 チャネル ピペッティング ヘッドを使用して可能な限り同時にすべての競合他社のソリューションを追加しようとしました。競合他社のソリューションの付加の後で顕微鏡段階のプレートを置き、測定はすぐに (ステップ 7) を始めます。

6. 画像の取得

  1. Zのシリーズも順次取得-スタック (例えば、使用 12 面と照明時間の 100-300 ms)。よく表面に余りに近くで画像撮影を避けるため (< ここで使用される板で ~1.4 μ m) 任意偏波のバイアスを除外します。
  2. ラベルの参照、DNA、TF からの完全なバインド解除まで測定の 10-25 サイクルを行います。エンドポイントはバインディングと競技者 DNA の拡散によって 1-2 時間後通常達されます。

7. FA(z,t)の生データからの抽出

  1. ウェル プレートをイメージされている、一度生蛍光画像から偏波 (I+) (I=) 平行、垂直に興味の領域強度コンポーネント (図 1c) のピクセルの平均値を計算します。これは、ヒップ FA ソフトウェア23を使用して自動的に行うことができます。
    注: ヒップ FA ソフトウェア、取扱説明書、およびテスト データセットは、ダウンロードした23をすることができます。また、以下で詳細に説明されているよう私は= 、私+を抽出し、滴定曲線の下流の分析を実行するその他のカスタム書かれたソフトウェアを使用します。
  2. 各ウェルの FA を計算します。各ウェルのスクリプトが各 z 位置でFA(z,t)を計算し、時点tによると。
    式 1:Equation 1
    ここで G は垂直チャネルというバイアスの G 因子を修正する計測器です。
  3. 知られている異方性の蛍光色素を含む任意の溶液の FA を測定することにより顕微鏡のセットアップの G 因子を決定します。信号の 2 つの偏光成分を抽出し、式 1 を使用してGソリューションの FA を知ることを得る (G = このセットアップで 1.15)。

8. FANBからライバル DNA 濃度の定量のための検

  1. 各前方および逆引き参照のオリゴマー (100 mM ストック濃度; 使用するライバル シーケンスが同じ長さで任意のランダム シーケンス) の 120 μ L をアニールと NB を含む結合バッファー x 3 の 120 μ L ミックス (15 nM)。
  2. 合計で 6 希釈で x 結合バッファー 1 で 1:2 の希釈で希釈系列を準備します。200 μ L x 5 を含む結合バッファー 1 で 0.5% 低融点アガロース (T > 35 ° C) ゲルのこれらの希釈のミックス 50 μ L をトリプリケートで NB の nM。
  3. 96 ウェル プレートの前の手順で準備 6 ソリューションの各 200 μ L を追加し、完全なゲル化、ルート メジャー FA ソリューションのNBでヒップ FA セットアップを使用して、1 時間を確保するための 4 ° C で 1 時間のプレートを格納します。
  4. 前の手順に従ってFANB (z, t)を抽出し、ヒルの式を使用してデータに合います。
    式 2:Equation 2
    CDNAが DNA オリゴマーの濃度をk結合部位の半分で DNA オリゴマーの濃度が占められる;FAmaxは正規化定数;nはヒル係数。kFAmaxnは、フィッティング処理中にパラメーターとして設定されます。
  5. (左下のパネル)、ヒップ FA ソフトウェアのフィッティング処理から得られる 3 つのパラメーターを入力します。
  6. 検数ヵ月ごとまたは顕微鏡のセットアップで変更した後定量を繰り返します。

9. ライバル DNA 濃度の定量

  1. ヒップ FA ソフトウェアを使用して、c を抽出する (z、t)からFANB(z, t)測定 (図 3)。まず前のセクションで説明するよう校正曲線を取得し、継ぎ手パラメーターをソフトウェアに入力してください (詳細についてはマニュアルを参照してください)。
  2. C < 100 nM (詳細についてはマニュアルを参照してください) を使用するためc(z,t)を自動的に推定するプログラムを使用して agarose のゲルのマトリックス内で競合企業 DNA の一次元拡散を記述する方程式 3 (図 3b) と仮定すると自由拡散。
    式 3:Equation 3
    C0は競合企業 DNA の初期濃度です。erfは誤差関数;zは位置;Dは競合企業 DNA の拡散係数です。t0測定の開始時刻です。使用無料のパラメーターが C0 z/Equation 4.

10 非常に強力な DNA 結合のヒップ fa 従来の競争力のある滴定

  1. 連続濃度の 96 ウェル プレート (または 384 ウェル プレート) の行に異なる競合企業 DNA オリゴマーを希釈: 0、1.25、3.5 インチ、9、19、45、90、190、425、900、1900 年と 4000 nM。Cy5 標識参照 DNA を追加 (1 nM) との結合バッファー (図 5) ウェルあたり 200 μ L の容量で、一定の濃度で TF (20 ~ 50 nM)。熱力学の平衡を達成するまでに 40 分を待つし、(ヒップ FA セットアップ) と連携して各ウェルの z スタック (計算の FA 値を平均することによって変動を減少ウェルあたりのいくつかの画像を取得)。
  2. 平衡バインディングの滴定曲線を構築し、方程式 4 (図 5b) とそれらに合います。KDs は、従来の競争力のある滴定と同じによって得られる股関節 FA agarose のゲル行列20を使用して決定されます。

11 FA の滴定曲線のフィッティング手順

  1. 表示ヒップ FA ソフトウェアの個人競技者のシーケンスのため再建された滴定曲線FA(z,t) = f[c(z,t)]データの品質を視覚的に確認し、(詳細についてはマニュアルを参照してください)。必要な場合は、手順 10 でライバル DNA 濃度の定量に使用するパラメーターを絞り込みます。
  2. 競争力のある滴定試金24の解析解を与える方程式 4 を使用して自動的に各個々 の滴定曲線を合わせてください。
    式 4:Equation 5
    :Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    ここでRTは蛋白質の集中;LTは、ラベル付けされていないとLSTは分類された DNA の集中;KD2は解離定数が決定されます。RTは作業中のタンパク質の濃度ABは、正規化パラメーター。

    まずKD1、異なるKD2の値の決定のための参照として機能するを確認します。KD1はラベルのない競技者 DNA のシーケンスとして色素参照 DNA の配列を選択することによって容易にアッセイで判断できます (マニュアル参照)。
  3. ソフトウェアで KD1の値を入力し、プレートのすべてのライバル DNA KD2の値を計算します。
    注: フィッティング処理の自由パラメーターがKD2 RTA、およびb.
  4. 解離定数KD2およびアクティブな蛋白質RTプレートのすべての個々 の滴定井戸の濃度をソフトウェアで「エクスポート」ボタンをクリックしてエクスポートします。

12. PWM 建設、蛋白質 DNA 相互作用と擬似カウントの特異性

20を前述のように、オンライン ツール WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) を使用して別の Pwm のシーケンスのロゴを作成します。

Representative Results

分割遺伝子ネットワーク25,26, 転写制御を通して主のショウジョウバエの胚の前方後方体パターンを生成する TFs ヒップ FA に適用した.このネットワークから選んだ bZIP ドメイン TF 巨大 (Gt) の詳細な分析 (図 4)。GST 融合 DBD を使用し、表現するエシェリヒア属大腸菌GST 融合タンパク質の構築フルレングス転写因子はエクスプレスし、の DNA 結合ドメイン (DBD)13としてほとんど同じバインディング設定を生成することは困難なのでつながれてだけで20と同じ結果を提供します。

Gt コンセンサス シーケンス (、TTACGTAAC) では、我々 は上記のように決定最強のバインド シーケンスを表します。その後、5' と 3' 端に追加の基地に挟まれた 10 mer Gt コンセンサス シーケンス (合計 30) 内のすべての可能なシングル ポイント変異の結合エネルギーに及ぼす影響を調べた。そのゲルのサンプルは、オートメーションを使用して作り出された 2 つの複製と比較のため手動で生成される 1 つの追加の複製を測定しました。〜 > 2000 nM 単独変異シーケンスは、0.6 KDs とまた「非バインド」シーケンス (データは示されていない) へのバインドの完全な欠如を確認しました。

TF DNA 結合特異性は通常スコアが結合モチーフの各位置で可能な限り各塩基配列に割り当てられている位置重量行列 (PWM) を使用してモデル化します。PWM では、各位置は結合強度を個別に貢献し、バインドの設定27TF の十分なモデルを構成するほとんどの場合を想定しています。私たち親和性測定に基づく改訂を実現して生成した次の手順28,29を設立し、既報文献の 2 つを実現してそれらを比較して。最初はヌクレオチド DNA のフット プリントの45、によって識別されるサイトのバインドから使用頻度に基づいており、2 つ目の PWM は細菌 1 ハイブリッド (B1H) 選択によって得られました。15

(図 4、上部のパネル) の 3 つの複製の Pwm の類似性が高い (複製 3) 手動で調製した試料を含む、ヒップ FA 法の高い再現性を示します。ヒップ FA によって得られる Pwm は全体的な得られる Pwm のよう他の方法 (図 4、下部のパネルとがありますの有意な偏差: 位置 2 (黒矢印)、コアの bZIP モチーフ T の突然変異の開始 > (G、C、A) につながる一致しているヒップ FA で得られるモチーフでバインディングの損失を完了 B1H モチーフではなく、バインディングまま脚 (G, A) の比較的強い、DNase のフット プリントで得られる。逆に、位置 7 (灰色の矢印)、突然変異 T > C 前に測定した Pwm に基づく予期されたものより多くの強力なバインディングに 。

その他の逸脱は微妙、劣らず重要です。全体的に、ヒップ FA PWM は他の 2 つよりも特定コンセンサスから多くの突然変異はまだ適度に強い結合の結果という事実を反映しました。これは、情報コンテンツ (IC) を使用して定量化することができます。IC は IC と比較して股関節 FA マトリックス (3 つの複製の平均) の 11.5 ビット = 13.4 ビットと DNase のフット プリントと B1H 行列 16.8 ビットそれぞれ。一般に (しかしない普遍的に)、ヒップ FA によって得られる Pwm が20を調べた 26 TFs に基づく他の方法によって得られるものより特定性の低い。

Figure 1
図 1:ヒップ FA アッセイと実験装置の回路図の描写。(滴定の競争相手単一の井戸で DNA のゲル a) 配信システム。(b) ヒップ FA 顕微鏡のセットアップ。EM CCD カメラに偏光蛍光光検出の自動化された広視野顕微鏡をカスタマイズしました。並列 (赤) を決定するために使用の興味の 2 つの領域 (c) Raw 蛍光画像と垂直 (グリーン) 偏光コンポーネント。(96 ウェル プレートの d) 典型的なレイアウトです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 生 FA データおよび再建された滴定曲線。(よく注意を含む校正 a) 典型的なFA(z,t)軌道(b, c)強い (b) とより穏健な (c) DNA 結合競合他社への連結を測定する 2 つの滴定井戸のFA(z,t)時間の軌跡。(d, e)対応する FA 滴定測定を再建され、強い (d)、中等度 (e) バインドの曲線します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: ライバル DNA c の濃度を決定する (z、t)ナイル青 (NB) を使用します。(16 塩基対の DNA オリゴマーのため a) FA 濃度校正曲線。従来の滴シリーズの NB は濃度の異なる DNA の競争相手と共に agarose のゲルに埋め込まれます。NB の DNA に対する親和性はシーケンスに依存しない20;したがって、同じ校正曲線は c を決定する使用できます (z、t)同じ長さの異なる DNA シーケンス。(b) 競技者 DNA 時間拡散プロフィル 5 校正井戸を用いて任意のz高さで。測定サイクルごとに 4 つの nb の井戸の平均 FAs は白いドットとして表示されます。曲線が装着式 3 (ホワイト ライン、色で個々 の井戸) と c を使用して (z、t)低濃度 (C < ~ 100 nM) 推定フィッティング曲線によって決定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: TF 巨大 (Gt) bZIP ドメイン家族の特異性をバインドします。3 複製のヒップ FA Pwm: オートメーションを使用して作製した 2 つと 1 つを手動で準備 (上部パネル) が DNase のフット プリントと細菌 1 ハイブリッド (B1H) 選択法 (下段) による生成を実現すると比較されます。全体的にみて、ヒップ FA 結合モチーフは以前のデータ同意するが、また黒と灰色の矢印で強調されているように、大きな違いを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: ヒップ FA と従来の競争力のある滴。(a) プレート デザインは、96 ウェル プレートの 1 つの行に結合バッファーで希釈した直列 8 の異なるライバル DNA を示しています。FA ヒートマップは強み異なる任意のバインドに対して表示されます。(b) 競争力のある滴定 3 競技者 Dna の異なる親和性を持つ Bcd TF へのバインドします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

ヒップ FA は TF DNA 相互作用のバインディングの好みの風景を決定するための包括的な新しい方法です。それは変異 DNA モチーフのバリエーション、直接しきい値上バインダーのセットのヌクレオチドの発生の頻度の結合の好みが反映されている任意の根本的な仮定を避けることの結合親和性を測定します。測定は固定化と機械的又は化学的結合反応、平衡条件を可能な限り近似に干渉せずソリューションで行われます。管理配信システム内の 1 つによる滴定曲線の測定をも可能し、蛋白質の保存中のスループットと信頼性を向上します。高感度蛍光検出高集光効率の高開口数と EM CCD カメラと目標を使用できます。したがって、この設定で小さい FA 変更 10-15 mP を正確に検出することができます; のような低実際には、つまり、バインディングが最小限 (低 2 の質量比) した後の質量増加が容易に検出する任意の結合の反作用。これは通常マイクロ プレート リーダーのような商業システムの場合ではありません。高い感度、ヒップ FA は分からなかった範囲に確実に測定することができます解離定数の範囲を拡張します。結合エネルギーは複数の一桁を正確に決定されます。

改訂された Pwm の品質を評価するには、分析20の 2 つのタイプを実行されます。我々 は、分割遺伝子ネットワークの 5 つの要因のため、異なる Pwm が 21 分割遺伝子のゲノム領域の実験的チップ seq プロファイルを予測することがどれだけテスト。2 番目のテストとして参加する TFs の結合の好みとタンパク質濃度に基づくセグメンテーション エンハンサーの発現パターンを予測するシーケンス-式モデル4を使用しました。両方の練習でより少なく特定のヒップ FA Pwm が大幅に実行がわかった具体的なフット プリントや B1H Pwm20より。

De novoメソッドとは異なりヒップ FA 与えられた TF のバインド設定のいくつかの事前知識が必要です。しかし、コンセンサス シーケンスが多く TFs の知られている、多くの既存方法13,14,15を提供できます。必要な場合は、繰り返し真最適な結合順序を見つけることができます。

Cy5 と Bodipy 650 蛍光標識 DNA 参照オリゴマーを使いました。これらの染料は、連結および非連結のラベル参照 DNA の異方性は異なるテスト染料の中で最大だったので FA 計測のためによく実行する実証されています。これにより、FA 値の最大動的範囲。一般的に、蛍光寿命 ≥ 1 と任意の蛍光染料 ns は最初にテストする必要が合うようになります。可能であれば、近赤外線範囲の蛍光を発する染料を使用して蛋白質の蛍光を最小にすることをお勧めします。

実験プロシージャの最も重要なステップは、ウェル プレートにゲルのピペットです。良い再現性には、できる限り均一するゲルのボリュームが必要です。データを評価するとき、ゲルの高さの変化が競争力のある DNA オリゴマーのそしてこうして親和性の変化は拡散率の変化に変換されます。これは技術的な複製の差異の主な情報源です。電子ピペットまたはオートメーション技術の使用は、再現性を向上させます。ゆっくりと慎重にピペッティングによるゲル内の空気の泡を回避できます。また、できるだけ小さな遅延として滴定の井戸の上にすべての競合他社のソリューションを追加することが重要です。最高の再現性、ピペッティング ロボットを用いた熱インキュベーター プロセス全体を自動化することができます。オートメーションにプロトコルを転送するための重要な部分は反応槽温度の必要な最適化とインキュベーション時間です。ゲルの粘度の最適なバランスを見つけることを確認してください (すなわち。 寒すぎるではありません) とタンパク質 (すなわち、あまりにもホットではない) の安定性。これは両方依存井戸に使用される蛋白質の安定性のゲルの払出速度に。

ヒップ FA ライバル DNA オリゴマーの制御された配信システムを活用します。滴定曲線を構築する各指定されたzのライバルの DNA 濃度c(z,t)を決定する必要がある-ゲルのマトリックス内での位置し、時間点t。KDsの決定c(z,t)に直接依存しているので、これはもう一つの重要なステップです。DNA 濃度センサーとして NB 色素を含む校正井戸は、(図 1d図 2) この目的のために使用されます。通常、プレートごと NB を含む 3-5 校正井戸で十分です。任意のヒップ-FA を評価する前に実験、NB 競合他社が異なる (図 3 任意のシーケンスの DNA と agarose のゲルの溶解の従来の滴シリーズを実行することによってセットアップは NB 較正曲線を作成する必要があります。 )、ステップ 8 で詳細に説明します。非常に強力なバインディングの場合 (KD < 500 pM)、ライバル DNA の低濃度の定量に使用される外挿となる制限より少なく直接測定よりも正確だから。しかし、このような低 KDs と TFs の agarose のゲルのマトリックス (図 5) を使用せず結合バッファーで従来の競争力のある滴定を実行するヒップ FA の設定を使用できます。たとえば、競合企業 DNA の 12 の異なる濃度の 1 つによる滴定は、96 ウェル プレートの 1 つの行で実行できます。

管理配信システムも必要です高速 TF DNA 結合動態と安定した蛋白質拡散以来 agarose のゲルが (遅い) が動的です。蛍光 DNA の参照に分類、それぞれにバインドされる興味の TFs の FA、時間をかけて、次に股関節 FA セットアップを直接両方のプロパティをテストできます。要因を検討の KKOFF率を測定し、, 秒20、その他研究30に従ってするミリ秒の順序にそれらを発見しました。これは測定が平衡で開催できるように十分に速いです。他のバインディングは遅い反応速度で反応、場合その濃度を下げるか、ゲルの気孔のサイズを減らすことによって競合他社の拡散を調整できます。テスト済みの TFs の場合すべてがあるオフ高速 T (~ 秒)、約 1-2 時間の総計測時間は各測定で熱力学の平衡を確認するのに十分な。

タンパク質に関連する別の問題は、FA の測定を変える可能性のあるタンパク質の凝集体の形成です。(Tenside) のような異なる添加物を含む他のバッファー状態の使用は、必要に応じて集計の形成を防ぐことができます。

我々 は PWM; の線形性の仮定の下で働いています。ただし、ヒップ FA はコンセンサス配列のすべての可能なディ-遺伝子変異を含むように拡張できます。最後に、ヒップ FA は他の種類の結合の相互作用を測定する合わせることができます。前提条件は、使用可能な適切な参照分子拘束タンパク質を蛍光標識することができます。配位子; の任意の種類の制御の配信システムと濃度勾配を生成できます。したがって、タンパク質・ タンパク相互作用は同様に高い再現性とスループット測定できます。

Disclosures

著者は利害の衝突を宣言しません。

Acknowledgments

J. ミュラー cDNA クローンとガリア研究室、特に S. Bergelt のメンバー、貴重なアドバイスと活発な議論をありがとうございます。この作品は、SFB 646、ゲノム発現とメンテナンス (CJ、P.B.) は、センターの統合蛋白質科学 (u. g.)、定量的生物ミュンヘン (修士) の大学院の調節ネットワークによって支えられました。U. g. は同毛皮 Bildung und 上海虹橋ドイツ研究振興協会 (SFB 646、SFB 1064、CIPSM、QBM) によってサポートを認めている (BMBF: ドクロ - Innovationswettbewerb Systembiologie)、フンボルト財団 (アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト、教授)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

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References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).
蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定
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Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

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