Summary
Здесь мы представляем протокол для получения стромальные сосудистой дроби от жировой ткани через ряд механических процессов, которые включают эмульгирования и несколько centrifugations.
Abstract
Стромальные сосудистой дроби (СФДВ) стал регенеративной инструментом для различных заболеваний; Однако законодательство строго регулирует клинического применения клеточных продуктов с помощью коллагеназы. Здесь мы представляем протокол для создания инъекционные смеси СФДВ клеток и родной внеклеточная матрица из жировой ткани, чисто механического процесса. Lipoaspirates поместить в центрифуге и вращаться на 1200 x g на 3 мин. Средний слой собираются и разделены на два слоя (плотностью внизу) и низкой плотностью жиров на вершине. Верхний слой непосредственно эмульгированных переключив intersyringe, со скоростью 20 мл/сек для 6 x до 8 x. Эмульгированные жиры центрифугируют в 2000 x g на 3 мин, липкое вещество под слоем нефти является сбор и определяется как внеклеточного матрикса (ECM) / SVF-гель. Масло в верхнем слое собирается. Примерно в 5 мл масла добавляется 15 мл высокой плотности жира и эмульгированных переключив intersyringe, со скоростью 20 мл/сек для 6 x до 8 x. Эмульгированные жиры центрифугируют в 2000 x g на 3 мин, и липкое вещество также ECM/SVF-гель. После пересадки ECM/SVF-гель в обнаженной мышей трансплантат собирают и оценены гистологическое обследование. Результат показывает, что этот продукт имеет потенциал, чтобы восстановить в нормальных жировой ткани. Эта процедура не является процедурой простые, эффективные механические диссоциации уплотнить клетки СФДВ, встроенный в их естественной поддержки ECM для восстановительных целей.
Introduction
Стволовых клеток лечение обеспечивают парадигмы для восстановления тканей и регенерации, так что они могут предложить альтернативные терапевтический режим для различных заболеваний1. Стволовые клетки (например, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и эмбриональных стволовых клеток) имеют большой лечебный потенциал, но ограничены из-за регулирования клеток и этических соображений. Жировой производные мезенхимальных стромальных/стволовые клетки (ИСС) легко получить от lipoaspirates и не подлежат тем же ограничениям; Таким образом он стал тип ячейки для практической восстановительной медицины2. Кроме того они nonimmunogenic и обильные ресурсы из аутологичной жира3.
В настоящее время ИСС получаются главным образом коллагеназы опосредованной пищеварение жировой ткани. Стромальные сосудистой часть жировой ткани (СФДВ) содержит ИСС, клетки эндотелия прародителю, pericytes и иммунных клеток. Хотя получение высокой плотности СФДВ/ИСС ферментативно было показано иметь благотворное воздействие, в нескольких странах законодательство строго регулирует клиническое применение продуктов на основе клеток с помощью коллагеназы4. Переваривания жировой ткани с коллагеназы за 30 мин до 1 ч для получения СФДВ клеток увеличивает риск как экзогенные материал в подготовке и биологического загрязнения. Адгезивная культуры и очистки ИСС, который принимает дней недели, требуют конкретного лабораторного оборудования. Кроме того в большинстве исследований, используются СФДВ клетки и ИСС в суспензии. Без защиты внеклеточного матрикса (ECM) или другой перевозчик свободные ячейки являются уязвимыми, вызвать задержку бедных клеток после инъекции и компромисс лечебный результат5. Все эти причины ограничить дальнейшее применение стволовых клеток.
Чтобы получить ИСС из жировой ткани без коллагеназы опосредованной пищеварение, несколько процедур механической обработки, включая центрифугирования, механического измельчения, дробления, пюре и измельчения, были развитые6,7 , 8 , 9. Предполагается, что эти методы уплотняют ткани и ИСС, механически нарушая Зрелые адипоциты и их везикул, содержащих нефть. Кроме того эти препараты, содержащие высокие концентрации ИСС, показал значительный терапевтический потенциал как регенеративной медицины в животных моделей8,9,10.
В 2013 году Tonnard et al. представил nanofat, прививки техника, которая включает в себя производство эмульгированные lipoaspirates, intersyringe, обработки11. Усилие сдвига, созданный intersyringe ветра может выборочно перерыв Зрелые адипоцитов. Основываясь на своих выводах, мы разработали метод чисто механической обработки, который удаляет большинство липидов и жидкость в lipoaspirates, оставляя только СФДВ клетки и фракционированный ECM, который ECM/SVF-гель12. Здесь мы описываем подробности процесса механического человека производные жировой ткани производить ECM/SVF-гель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование был одобрен этические Наблюдательный Совет в больнице Nanfang, Гуанчжоу, Китай. Жировая ткань была собрана из здоровых доноров, которые дал письменное информированное согласие принять участие в исследовании. Все эксперименты на животных были утверждены Nanfang больница институциональных животное уход и использование Комитетом и в соответствии с руководящими принципами национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (Китай).
1. Подготовка ECM/SVF-геля
- Урожай жира.
- Выполнения липосакции на человека с 3-мм многопортовые канюли, которая содержит несколько резкий боковые отверстия 1 мм в диаметре, на -0,75 atm давление всасывания.
- Собирайте 200 мл lipoaspirates в стерильный пакет.
- Подготовьте Колман сало.
- Перевести lipoaspirates на четыре 50 мл трубки и позволяют заготовленной жира, чтобы стоять еще 10 мин.
- Собирать жир на верхний слой в два 50 мл трубки с помощью пипетки ширококонечных для передачи и отказаться от части жидкого на нижнем слое.
- С помощью 50 мл трубки, центрифугировать жирового слоя в 1200 x g при комнатной температуре (RT) 3 мин.
- Определите верхний слой (примерно 80 мл) как Колман сало.
- Перенести верхний 2/3 Колман Сало 20 мл с помощью пипетки ширококонечных и определить эту часть как low-density жира.
- Перенести нижней 1/3 Колман сало еще 20 мл с помощью пипетки ширококонечных и определить эту часть как высокой плотности жира.
- Производят ECM/SVF-гель от низкой плотности жира.
- С помощью двух шприцы 20 мл, женщина женщина разъем Luer-Lock (с внутренним диаметром 2,4 мм) соединен intershift 20 мл low-density жира.
- Держать конюшню перенося скорость (в 20 мл/с) и повторите для 6 x до 8 x.
- Центрифугировать смеси на 2000 x g в РТ за 3 мин.
- Соберите часть нефти на вершине в тубе 10 мл с помощью пипетки ширококонечных RT для дальнейшего использования.
- Собирать липкое вещество в средний слой, который ECM/SVF-гель (рис. 1A), используя широкий наконечник пипетки и отбросить жидкости в нижнем слое.
- Производят ECM/SVF-гель с высокой плотности жира.
- Добавьте 5 мл масла (сборник из шага 1.3.4) 15 мл высокой плотности жира.
- Intershift смешанные жира между шприцы 6 x до 8 x до тех пор, пока flocculate наблюдается в пределах эмульсии.
- Центрифугировать смеси на 2000 x g в РТ за 3 мин.
- Отменить часть нефти на вершине.
- Сбор липкое вещество в средний слой (ECM/SVF-гель) с помощью пипетки ширококонечных и утилизируйте жидкость в нижнем слое.
- Смешайте ECM/SVF-гель от шагов 1.3.5 и 1.4.5.
2. ню мыши модель ECM/SVF-гель трансплантата
- Анестезировать обнаженной мышей (8 недель старые, женщина) с изофлюрановая (1% - 3%) Ингаляционная анестезия в комнате животных операции.
- Передать ECM/SVF-гель 1 мл шприц.
- Подключите 1 мл шприц с тупым инфильтрации канюли.
- Вставьте канюлю подкожно в каждом фланге мыши.
- Придать 0,3 мл ECM/SVF-геля.
3. ткань уборка на 3, 15 и 90 дней после инъекции ECM/SVF-гель
- Анестезировать мышей с изофлюрановая (1% - 3%) Ингаляционная анестезия.
- Пожертвуйте мышей методом шейки матки дислокации.
- Сделать надрез на срединной мыши спинной кожи с Ножницы хирургические.
- Вскрыть и урожай жир имплантатов на обе стороны мыши. Внедрите жир имплантатов в параформальдегида 4% на RT на ночь.
- Обезвоживания тканей в повышении концентрации этанола: 70% этанол, два изменения, 1 ч; 80% этанола, одно изменение, 1 ч; 95% этиловом спирте, одно изменение, 1 ч; 100% этанола, три изменения, 1,5 ч ксилол, три изменения, 1,5 ч.
- Проникнуть в ткани с парафина (58-60 ° C), два изменения, 2 ч.
- Внедрить в блоков парафина ткани. Вырезать секций при толщине около 4 мкм и положить их на слайдах.
4. гематоксилином и эозином
- Deparaffinize блок слайды парафин путем замачивания их в ксилоле I, II и III (10 мин).
- Увлажняет разделов ткани, передавая их через снижение концентрации (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) этанол ванн на 3 мин.
- Промойте разделов ткани в дистиллированной воде (5 мин).
- Пятно в разделах ткани в гематоксилином за 5 мин.
- Промойте разделов ткани в проточной водопроводной воды за 20 мин Decolorize кислоты спиртовой 1% (1% HCl в 70% спирта) для 5 s. промыть в проточной водопроводной воды до тех пор, пока разделы синий снова.
- Добавить две-три капли эозина Y краски непосредственно на слайды, пипетки и пусть красителя набор для 10 мин.
- Слайды промойте в проточной воде в течение 1-5 мин.
- Обезвоживает слайды в повышении концентрации (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) этанола на 3 мин.
- Снимите слайды в ксилоле I и II за 5 мин.
- Смонтируйте слайды в монтаж средств массовой информации.
5. immunofluorescent окрашивание
- Deparaffinize разделов ткани в ксилоле I, II и III (5 мин).
- Увлажняет разделов ткани, передавая их через различные концентрации (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) алкоголь ванн на 3 мин.
- Инкубируйте в подразделах 3% H2O2 решения в метаноле на RT за 10 мин.
- Промойте слайды 2 x с дистиллированной водой, 5 мин.
- Падение слайды в корзине слайд. Добавить 300 мл буфера цитрата 10 мм (pH 6.0) и инкубировать слайды при температуре 95-100 ° C на 10 мин.
- Прохладный слайды в РТ за 20 мин.
- Промойте слайды 2 x с фосфат амортизированное saline (PBS), 5 мин.
- 100 мкл 10% плода бычьим сывороточным на слайды и инкубировать в камере увлажненный в РТ за 1 час.
- Инкубируйте в разделах основное антитело раствором (морская свинка анти мыши Perilipin, 1: 400) при 4 ° C на ночь.
- Промойте слайды с PBS 3 x, 5 мин.
- Инкубировать секции раствором вторичные антитела (IgG коза анти Гвинея свиньи-488) за 2 ч на RT.
- Промойте слайды с PBS 3 x, 5 мин.
- Протрите воды вокруг секции с чистой ткани бумаги.
- Drop 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и Alexa Fluor 488-конъюгированных isolectin в круг, чтобы охватить раздел на слайде.
- Маунт coverslips и дайте им высохнуть в темноте.
- Наблюдать за слайды с флуоресцентный Микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После обработки Колман сало ECM/SVF-гель, объем отбрасываются нефти занимает 80% от окончательного объема, и только 20% объема жировой ткани сохранились в слой нефти рассматривается как ECM/SVF-гель (рис. 1А). ECM/SVF-гель имеет гладкую жидкость как текстуру, что позволяет ему пройти через 27 G тонкой иглой; Однако Колман сало состоит из неотъемлемой жировой структуры с большой волокна и может идти только через 18 G канюля (рис. 1Б).
На третий день после трансплантации появилось большое количество мелких preadipocytes с несколькими внутриклеточных липидного капель, обширные хорошо васкуляризированной соединительной ткани и проникли воспалительных клеток. Начиная с 15-й день, количество воспалительных клеток начал получить постепенно снижается, и адипоцитов начал зрелым. В день 90 большинство васкуляризированной соединительной ткани в имплантатов была заменена Зрелые адипоцитов (рис. 2, верхняя группа).
ECM/SVF-гель имплантатов содержал несколько perilipin положительных адипоциты, 3 дней после пересадки. Мелкие preadipocytes с несколькими каплями внутриклеточных липидов начали появляться на 15 день. Каждое поле ECM/SVF-гель графт разделы на день 90 показали многочисленные perilipin позитивных адипоциты и новообразованных кровеносных сосудов (рис. 2, Нижняя панель).
Рисунок 1 : Изображения ECM/SVF-геля. Центрифугировали Колман сало и ECM/SVF-гель после обработки (A). ECM/SVF-геля могут быть легко введены через иглу 27 G; Однако Колман сало можно передавать только через 18 G канюля (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Гистологические изменения в ECM/SVF-гель после трансплантации. ECM/SVF-гель показали обширные хорошо васкуляризированной соединительной ткани и проникновения воспалительных клеток на 3 день. Впоследствии большинство васкуляризированной соединительной ткани был заменён на структуру, содержащую Зрелые адипоцитов (верхняя группа). Immunofluorescent окрашивание показывает что большинство тканей состоит из области perilipin отрицательных на 3 день. 15-й день появилась большая часть perilipin + адипоцитов. После 90 дней (Нижняя панель) были найдены многочисленные perilipin позитивных адипоцитов. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На основе стволовых клеток регенеративной терапии показал большие потенциальные выгоды в различных заболеваний. ИСС являются выдающиеся лечебные кандидатов, потому что они легко получить и имеют потенциал для восстановления тканей и регенерации тканей Роман15. Однако существуют ограничения на расширение его клинического применения, поскольку оно требует сложных процедур для изоляции клетки и коллагеназы для обработки6. Таким образом крайне важно разработать простой метод для получения стволовых клеток без использования коллагеназы.
В этом исследовании мы представили чисто механический процесс жировой ткани для получения СФДВ клетки, которые находятся под защитой собственных жировых ECM. Кроме того этот процесс является коллагеназа бесплатно. Предыдущие исследования по сравнению различных intersyringe обработки раз и показал, что intersyringe обработки стандартных Колман сало, за 1 мин потока со скоростью 10 мл/сек является оптимальный протокол для производства ECM/SVF-гель12. С помощью intersyringe ветра, уничтожаются большинство адипоцитов в lipoaspirates, с большинством СФДВ клеток и ECM сохранились. Таким образом intersyringe сдвиг является ключевым моментом всего процесса. Intersyringe переключения скоростей скорость и время, затраченное на проведение перенося определить уровень разрушения жировой ткани, потому что прозрачные силы, созданные процессом intersyringe ассоциируется с перенося скорость. Мы предлагаем, что смещение скорость должна быть стабильной по 20 мл/s. недостаточно уничтожения приводит к остальные нежелательные адипоциты, в то время как overdestruction приводит к повреждение клеток СФДВ. Продукт этот протокол может быть определена как ECM/SVF-гель, только если она достигла следующие критерии: 1) его окончательный объем составляет ~ 20% от первоначального объема; 2) он легко вводится через иглу 27 G. Предыдущие исследования показали, что ECM/SVF-гель содержит высокой плотности обоих CD45-/ CD31- / CD34 + ИСС и плотность клеток СФДВ > 4.0 x 105 клеток/мл12.
Во время процесса создания ECM/SVF-гель центрифугирование был проведены 2 x, до и после intersyringe ветра. Перед intersyringe ветра мы используем центрифугирования для создания «градуированные плотности» жира. Это является еще одним ключевым шагом. Было доказано, что с высокой плотностью жировой слой внизу, после центрифугирования, богат конденсированных ECM, но имеет меньше нефти, в то время как low-density толстый слой на верхней части имеет больше нефти, но менее ECM волокна16,17. Таким образом эти два слоя должны обрабатываться двумя разными способами. Низкой плотности жира непосредственно могут пройти intersyringe обработки уничтожить адипоцитов. Однако высокой плотности жира на нижний слой требует дополнительной нефти для облегчения уничтожение адипоцитов. Добавлено масло может уменьшить плотность высокой плотности жира, что делает намного легче переносить. Кроме того масло может помочь извлечь больше нефти из сломанной адипоцитов; Однако водный жидкости нельзя. Таким образом мы добавили дополнительные нефть плотности жира. Центрифугирование после перехода intersyringe в том, чтобы отделить часть нефти из SVF клеток и ECM. Масла следует избегать в конечный продукт.
Трансплантация ECM/SVF-гель привели к большой удержания курса. Как мы упоминали выше, ключевой шаг обработки ECM/SVF-гель-intersyringe ветра, который разрушает большую часть адипоцитов. Таким образом мало адипоцитов оставался в ECM/SVF-гель. Как показано на рисунке 2, небольшой площади perilipin позитивных появилась в трансплантированы ECM/SVF-гель на 3 день. Однако после 15 дней, много perilipin положительных адипоцитов появилась и стала зрелой после 90 дней. Предыдущий исследование показало, что трансплантация ECM/SVF-гель индуцированной хост клеточный жировой ткани регенерации14. С помощью античеловеческие лейкоцитарный антиген для выявления происхождения новообразованной адипоциты, мы обнаружили, что, хотя большинство клеток в СФДВ трансплантата производные, большая часть недавно сформированной жировой ткани была хост производные. ECM/SVF-гель имеет большой регенеративные функции, как сообщалось ранее. Этот продукт был большой терапевтические эффекты в заживления ран12. Кроме того она помогла улучшить выживаемость свободного лоскута в мышиной модели путем ускорения ангиогенеза10.
SVF-гель является аутологичной инъекционные, содержащие родной ECM и функциональных клеточных компонентов. Продукт от lipoaspirate генерируется простой механический процесс, который может легко выполняться без каких-либо озабоченности относительно регулирования вопросов. Однако регенеративный эффект ECM/SVF-гель остается неясным. Для того, чтобы лучше характеризуют благотворное влияние ECM/SVF-гель, дальнейшие исследования, чтобы охарактеризовать основные молекулярные механизмы регенеративный эффект ECM/SVF-гель находятся на пути.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальный научный фонд природы Китая (81471881, 81601702, 81671931), фонд естественных наук в провинции Гуандун Китая (2014A030310155), и администратор Nanfang Больница фонда (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
- Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
- Halme, D. G., Kessler, D. A.
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
- van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
- Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
- Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
- Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
- Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
- Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
- Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
- Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
- Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
- Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
- Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).
