Summary
Nous présentons ici un protocole pour obtenir la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux grâce à une série de procédés mécaniques, incluent l’émulsification et plusieurs centrifugations.
Abstract
Stroma vasculaire fraction (SVF) est devenu un outil régénératrice pour diverses maladies ; Cependant, la législation réglemente strictement l’application clinique des produits cellulaires à l’aide de la collagénase. Nous présentons ici un protocole visant à générer un mélange injectable de cellules SVF et native matrice extracellulaire du tissu adipeux par un procédé purement mécanique. Lipoaspirates sont placés dans une centrifugeuse et filés à 1 200 x g pendant 3 min. La couche intermédiaire est recueillie et séparée en deux couches (graisses haute densité en bas) et faible densité sur le dessus. La couche supérieure est directement émulsifiée par transfert intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante sous la couche d’huile est recueillie et définie comme la matrice extracellulaire (ECM) / SVF-gel. L’huile sur la couche supérieure est recueillie. Environ 5 mL d’huile est ajouté à 15 mL de graisse à haute densité et émulsionnée en décalant intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante est aussi ECM/SVF-gel. Après la greffe de l’ECM/SVF-gel sur des souris Nudes, le greffon est récolté et évalué par l’examen histologique. Le résultat montre que ce produit a le potentiel pour se régénérer dans le tissu adipeux normal. Cette procédure est une procédure de dissociation mécanique simple et efficace de condenser les cellules SVF incorporés dans leur ECM soutien naturel à des fins de récupération.
Introduction
Cellules souches offrent un changement de paradigme pour la régénération et la réparation des tissus, afin qu’ils puissent offrir un autre schéma thérapeutique pour diverses maladies1. Les cellules souches (par exemple, les cellules souches pluripotentes induites et les cellules souches embryonnaires) ont un grand potentiel thérapeutique, mais sont limités en raison de la régulation cellulaire et des considérations éthiques. Dérivé d’adipeux mésenchymateuses stromales/cellules souches (ASCs) sont faciles à obtenir de lipoaspirates et pas soumis aux mêmes restrictions ; ainsi, il est devenu un type de cellule idéal pour la pratique de la médecine régénérative,2. En outre, ils sont nonimmunogenic et disposent de ressources abondantes de graisse autologue3.
Actuellement, CRA est obtenus principalement par digestion de collagénase médiée par du tissu adipeux. La fraction stroma vasculaire (SVF) du tissu adipeux contient NASC, cellules endothéliales, péricytes et cellules immunitaires. Bien que l’obtention d’une haute densité de SVF/CRA enzymatiquement s’est avéré avoir des effets bénéfiques, la législation de plusieurs pays réglemente strictement l’application clinique des produits à base de cellules à l’aide de collagénase4. Digérer le tissu adipeux avec la collagénase pendant 30 min à 1 h pour obtenir les cellules SVF augmente le risque de ces deux matières exogènes dans la préparation et la contamination biologique. La culture adhérente et la purification des CRA, qui prend les jours de semaines, exigent l’équipement de laboratoire spécifiques. En outre, dans la plupart des études, des cellules SVF et CRA est utilisés en suspension. Sans la protection de la matrice extracellulaire (mec) ou un autre transporteur, cellules libres sont vulnérables, provoquer une rétention d’une pauvre cellule après l’injection et compromettre le résultat thérapeutique5. Toutes ces raisons limitent l’autre demande de thérapie de cellules souches.
Pour obtenir des CRA du tissu adipeux sans digestion induite par la collagénase, plusieurs procédures de traitement mécanique, y compris de centrifugation, mécanique, hacher, broyer, réduire en purée et hacher, ont été développés6,7 , 8 , 9. ces méthodes sont censés se condensent les tissus et CRA en perturbant mécaniquement les adipocytes matures et leurs vésicules contenant de l’huile. En outre, ces préparations, contenant des concentrations élevées des CRA, a montré un potentiel thérapeutique considérable comme médecine régénérative des animaux modèles8,9,10.
En 2013, Tonnard et coll. a présenté le nanofat technique, qui consiste à produire lipoaspirates émulsifiée par intersyringe traitement de11de greffage. La force de cisaillement créée par intersyringe déplacement peut briser sélectivement les adipocytes matures. Se fondant sur leurs constatations, nous avons développé une méthode de traitement purement mécanique qui élimine la plupart des lipides et fluide dans les lipoaspirates, laissant seulement les cellules SVF et fractionné ECM, qui est ECM/SVF-gel12. Ici, les auteurs décrivent les détails du processus mécanique d’origine humaine de tissus adipeux pour produire l’ECM/SVF-gel.
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Protocol
Cette recherche a été approuvée par la Commission d’examen éthique dans l’hôpital Nanfang, Guangzhou, Chine. Le tissu adipeux a été prélevé de donneurs sains qui a donné consentement éclairé pour participer à l’étude. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Nanfang hôpital Institutional Animal Care et effectuées conformément aux lignes directrices de la National Health and Medical Research Council (Chine).
1. ECM/SVF-gel de préparation
- Graisse de récolte.
- Effectuer la liposuccion sur un être humain avec une canule de 3 mm multiport, qui contient plusieurs trous côté pointu de 1 mm de diamètre, à -0,75 atm de pression d’aspiration.
- Recueillir 200 mL de lipoaspirates dans un sachet stérile.
- Préparer la graisse Coleman.
- Transférer le lipoaspirates dans quatre tubes de 50 mL et laisser la graisse récoltée reposer encore pendant 10 min.
- Recueillir la graisse sur la couche supérieure dans deux tubes de 50 mL à l’aide d’une pipette à embout large pour transférer et jeter la partie liquide à la couche inférieure.
- Utilisant des tubes de 50 mL, centrifuger la couche de graisse à 1 200 g à la température ambiante (RT) pendant 3 min.
- Définir la couche supérieure (environ 80 mL) sous forme de graisse de Coleman.
- Transférer les 2/3 supérieurs de la graisse de Coleman dans un tube de 20 mL à l’aide d’une pipette à embout large et définir cette partie sous forme de graisse faible densitée.
- Transférer 1/3 inférieur de la graisse de Coleman dans un autre tube de 20 mL à l’aide d’une pipette à embout large et définir cette partie sous forme de graisse haute densitée.
- Produire des ECM/SVF-gel provenant des lipides de basse densité.
- À l’aide de deux seringues de 20 mL, reliés par un connecteur Luer-Lock de femelle-femelle (d’un diamètre interne de 2,4 mm) pour intershift 20 mL de graisse faible densitée.
- Maintenir la stabilité de la vitesse de déplacement (à 20 mL/s) et répéter pour 6 x à 8 x.
- Centrifuger le mélange à 2 000 x g RT pendant 3 min.
- Recueillir la portion de l’huile sur le dessus dans un tube de 10 mL à l’aide d’une pipette de l’échelle-pointe à ta pour une utilisation ultérieure.
- Recueillir la substance collante dans la couche intermédiaire, qui est ECM/SVF-gel (Figure 1A), à l’aide d’une pipette à embout large et jetez le liquide à la couche inférieure.
- Produire des ECM/SVF-gel provenant des lipides de haute densité.
- Ajouter 5 mL d’huile (recueillie à l’étape 1.3.4) à 15 mL de graisse à haute densité.
- Intershift la graisse mixte entre seringues 6 x à 8 x jusqu'à ce qu’un floculent est observée au sein de l’émulsion.
- Centrifuger le mélange à 2 000 x g RT pendant 3 min.
- Jeter la partie de l’huile sur le dessus.
- Recueillir la substance collante dans la couche intermédiaire (ECM/SVF-gel) à l’aide d’une pipette à embout large et jeter le liquide à la couche inférieure.
- Mélanger l’ECM/SVF-gel des étapes 1.3.5 et 1.4.5.
2. modèle ECM/SVF-gel greffe souris nue
- Anesthésier les souris Nudes (8 semaines femme) à l’isoflurane (1 % - 3 %) anesthésie par inhalation dans une salle d’exploitation animale.
- Transférer l’ECM/SVF-gel dans une seringue de 1 mL.
- Connecter la seringue de 1 mL avec une canule infiltration émoussé.
- Insérer la canule sous la peau à chaque flanc de la souris.
- Injecter 0,3 mL de l’ECM/SVF-gel.
3. tissu récolte sur 3, 15 et 90 jours après l’Injection de l’ECM/SVF-gel
- Anesthésier les souris à l’isoflurane (1 % - 3 %) anesthésie par inhalation.
- Sacrifier les souris par la méthode de dislocation cervicale.
- Faites une incision à la ligne médiane de la peau du dos de la souris avec des ciseaux chirurgicaux.
- Disséquer et récolter les greffes de graisse sur les deux côtés de la souris. Incorporer les greffes de graisse à la paraformaldéhyde à 4 % à la droite du jour au lendemain.
- Déshydrater le tissu dans l’augmentation des concentrations d’éthanol : éthanol à 70 %, deux changements, 1 h chacun ; l’éthanol à 80 %, un changement, 1 h ; l’éthanol à 95 %, un changement, 1 h ; 100 % éthanol, trois changements, 1,5 h de chacun ; xylène, trois changements, 1,5 h chacune.
- Infiltrer le tissu avec de la cire de paraffine (58-60 ° C), deux changements, 2 h chaque.
- Incorporez le tissu dans des blocs de paraffine. Coupes sur une épaisseur d’environ 4 µm et placez-les sur des diapositives.
4. l’hématoxyline et éosine coloration
- Déparaffiner les diapositives de bloc de paraffine en les trempant dans du xylène, I, II et III (10 min chacun).
- Réhydrater les coupes de tissus en les passant à travers la baisse des concentrations (100 %, 100 %, 95 %, 80 %, 70 %) des bains d’éthanol pendant 3 min chaque.
- Rincer les sections de tissu dans l’eau distillée (5 min).
- Tacher les coupes de tissus à l’hématoxyline pendant 5 min.
- Rincer les coupes de tissus dans la gestion de l’eau du robinet pendant 20 min. Decolorize à 1 % d’alcool acide (1 % HCl dans l’alcool à 70 %) pour 5 s. rinçage à l’eau courante jusqu'à ce que les sections sont à nouveau en bleues.
- Ajouter deux ou trois gouttes d’éosine Y colorant directement sur les diapositives de la pipette et laissez le colorant durant 10 min.
- Laver les lames dans l’eau du robinet pendant 1 à 5 min.
- Déshydrater les diapositives de l’augmentation des concentrations (70 %, 80 %, 95 %, 100 %, 100 %) d’éthanol pendant 3 min chaque.
- Désactivez les diapositives dans le xylène I et II de 5 min chacun.
- Monter des diapositives dans le support de montage.
5. immunofluorescence
- Déparaffiner les coupes de tissus dans le xylène I, II et III (5 min).
- Réhydrater les coupes de tissus en les passant à travers différentes concentrations (100 %, 100 %, 95 %, 95 %, 70 %) des bains d’alcool pendant 3 min chaque.
- Incuber les sections dans une solution de2 % de 3 H2O dans le méthanol à RT pendant 10 min.
- Rincer les lames 2 x avec de l’eau distillée, 5 min chacun.
- Supprimer les diapositives dans un panier de diapositive. Ajouter 300 mL de tampon citrate de 10 mM (pH 6.0) et incuber les lames à 95-100 ° C pendant 10 min.
- Cool les diapositives de RT pendant 20 min.
- Rincer les lames 2 x avec saline tamponnée au phosphate (PBS), 5 min chacun.
- Ajouter 100 µL de sérum de veau fœtal de 10 % sur les diapositives et les incuber dans une chambre humidifiée à RT pendant 1 h.
- Incuber les sections avec la solution d’anticorps primaire (cobaye anti-souris Perilipin, 1 : 400) à 4 ° C jusqu’au lendemain.
- Rincer les lames avec du PBS 3 x, 5 min chaque.
- Incuber les sections avec la solution d’anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-Guinée pig-488) pendant 2 h à température ambiante.
- Rincer les lames avec du PBS 3 x, 5 min chaque.
- Essuyez l’eau autour de la section avec le mouchoir en papier propre.
- Déposez 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et conjugué Alexa Fluor 488 isolectine dans le cercle pour couvrir la section sur la diapositive.
- Monter les lamelles et les laisser sécher dans l’obscurité.
- Observer les diapositives avec un microscope à fluorescence.
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Representative Results
Après le traitement de la graisse de Coleman à ECM/SVF-gel, le volume d’huile mis au rebut reprend 80 % du volume final, et seulement 20 % du tissu adipeux, conservé sous la couche d’huile est considérée comme ECM/SVF-gel (Figure 1A). ECM/SVF-gel a une texture liquide lisse qui lui permet de passer par une fine aiguille 27 G ; Cependant, graisse de Coleman se compose d’une structure adipeuse intégrale avec des fibres de gros et ne peut aller que dans une canule de 18 G (Figure 1B).
Jour 3 après la transplantation, un grand nombre de petits préadipocytes avec plusieurs des gouttelettes de lipides intracellulaires, étendue du tissu conjonctif très vascularisé et infiltré de cellules inflammatoires est apparu. À partir de 15 jours, le nombre de cellules inflammatoires ont commencé à se réduire progressivement, et adipocytes a commencé à mûrir. 90 jours, la plupart du tissu conjonctif vascularisé dans les greffons avait été remplacée par adipocytes matures (Figure 2, panneau supérieur).
ECM/SVF-gel greffes contenaient quelques adipocytes perilipin positifs, 3 jours après la transplantation. Préadipocytes de petite taille avec des gouttelettes de lipides intracellulaires multiples ont commencé à apparaître au jour 15. Chaque champ de l’ECM/SVF-gel greffer des sections sur 90 jours, a montré de nombreux adipocytes perilipin positifs et les vaisseaux sanguins nouvellement formés (Figure 2, panneau inférieur).
Figure 1 : Images de l’ECM/SVF-gel. Centrifugé Coleman gras et ECM/SVF-gel après traitement (A). ECM/SVF-gel peut être facilement injecté avec une aiguille de 27 G ; Cependant, la graisse Coleman ne pouvez transmettre via une canule de 18 G (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les changements histologiques dans l’ECM/SVF-gel après la transplantation. ECM/SVF-gel a montré une vaste du tissu conjonctif très vascularisé et infiltration de cellules inflammatoires au jour 3. Par la suite, la plupart du tissu conjonctif vascularisé a été remplacé par une structure contenant des adipocytes matures (panneau du haut). Par immunofluorescence souillant montre que la majeure partie du tissu est composé de la zone perilipin-négatif le jour 3. De 15 jours, une grande partie de perilipin + adipocytes est apparu. Nombreux adipocytes perilipin séropositifs ont été retrouvées après 90 jours (panneau inférieur). Les barres d’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Sur les cellules souches de thérapie régénérative a montré un grand bénéfice potentiel dans différentes maladies. CRA est les candidats thérapeutiques exceptionnels parce qu’ils sont faciles à obtenir et ont la capacité de réparation tissulaire et la régénération des tissus nouveaux15. Cependant, il y a des limites à l’élargissement de son application clinique, car cela nécessite des procédures complexes d’isoler les cellules et collagénase de traitement6. Ainsi, il est essentiel de développer une technique simple pour obtenir des cellules souches sans l’utilisation de la collagénase.
Dans cette étude, nous avons présenté un procédé purement mécanique des tissus adipeux afin d’obtenir des cellules SVF, qui sont protégés par l’ECM adipeuse native. En outre, ce processus est exempt de collagénase. Une précédente étude a comparé différentes intersyringe temps de traitement et a montré que le traitement intersyringe de graisse Coleman standard pour 1 min à un débit de 10 mL/s est le protocole optimal de production d’ECM/SVF-gel12. Grâce au décalage intersyringe, la plupart des adipocytes dans le lipoaspirates sont détruites, avec la plupart des cellules SVF et ECM préservé. Ainsi, intersyringe déplacement est l’étape clé de l’ensemble du processus. La vitesse de déplacement intersyringe et le temps passé à effectuer le déplacement déterminent le niveau de destruction du tissu adipeux car la tonture force créée par le processus intersyringe est associée à la vitesse de déplacement. Nous suggérons que la vitesse de déplacement doit être stable à 20 mL/s. destruction insuffisante conduit à des adipocytes indésirables restants, tandis qu’overdestruction se traduit par endommager les cellules SVF. Le produit du présent protocole peut être défini comme ECM/SVF-gel que si elle a atteint les critères suivants : 1) son volume final est environ 20 % de son volume initial ; 2) il est facilement injecté avec une aiguille de 27 G. Une étude antérieure a montré que l’ECM/SVF-gel contient une densité élevée de ces deux CD45-/ CD31- / CD34 + CRA et la densité des cellules SVF est > 4,0 x 105 cellules/mL12.
Au cours du processus de création d’ECM/SVF-gel, centrifugation a été menée 2 x, avant et après le déplacement intersyringe. Avant l’intersyringe transfert, nous utilisons centrifugation pour créer « classé densités » de graisse. Il s’agit d’une autre étape clé. Il a été prouvé que la couche de graisse à haute densité dans la partie inférieure, après centrifugation, est riche en ECM condensée mais a moins d’huile, tandis que la couche de graisse faible densitée sur le dessus a plus d’huile mais moins ECM fibre16,17. Ainsi, ces deux couches doivent être traitées de deux manières différentes. Graisse basse densitée peut subir directement le traitement intersyringe pour détruire les adipocytes. Cependant, la graisse haute densitée à la couche inférieure nécessite d’huile supplémentaire pour faciliter la destruction des adipocytes. L’huile ajoutée peut diminuer la densité de la graisse haute densitée, rendant le déplacement est beaucoup plus facile. En outre, l’huile peut aider à extraire l’huile plus d’adipocytes cassés ; Cependant, on ne peut pas liquide aqueux. Ainsi, nous avons ajouté l’huile extra de la graisse haute densitée. La centrifugation après l’intersyringe déplacement consiste à séparer la portion d’huile des cellules SVF et ECM. L’huile doit être évitée dans le produit final.
La transplantation d’ECM/SVF-gel a entraîné un taux de rétention grande. Comme nous l’avons mentionné ci-dessus, l’étape clé de la transformation de l’ECM/SVF-gel est intersyringe de déplacement, qui détruit la plupart des adipocytes. Ainsi, peu d’adipocytes est resté dans l’ECM/SVF-gel. Tel qu’illustré à la Figure 2, une petite zone de perilipin-positif est apparu dans l’ECM/SVF-gel transplanté au jour 3. Cependant, après 15 jours, beaucoup d’adipocytes perilipin positif est apparu et est devenu mature après 90 jours. Une étude antérieure a montré que la transplantation d’ECM/SVF-gel induite hôte médiation cellulaire du tissu adipeux régénération14. Utilisez anti-human leucocyte antigen pour identifier l’origine des adipocytes nouvellement formés, nous avons découvert que, bien que la plupart des cellules dans le SVF était d’origine greffe, la plupart du tissu adipeux nouvellement formé a été hôte dérivé. ECM/SVF-gel possède une grande fonction régénératrice, comme nous l’indiquions précédemment. Ce produit avait des effets thérapeutiques dans la cicatrisation des12. En outre, il a contribué à améliorer le taux de survie du lambeau libre dans un modèle murin en accélérant l’angiogenèse10.
SVF-gel est un injectable autologue contenant ECM native et les composants cellulaires fonctionnels. Le produit est généré à partir de lipoaspirate par un procédé mécanique simple, qui peut être réalisé facilement sans aucune préoccupation au sujet de questions de réglementation. Cependant, l’effet régénérateur de ECM/SVF-gel reste peu clair. Afin de mieux caractériser les effets bénéfiques de l’ECM/SVF-gel, autres investigations afin de caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents de l’effet régénérateur de ECM/SVF-gel sont en cours.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de Science de Nature de Chine (81471881, 81601702, 81671931), la Fondation des sciences naturelles de la Province du Guangdong en Chine (2014A030310155) et la fondation d’administrateur de l’hôpital Nanfang (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
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