Summary
Aquí, presentamos un protocolo para obtener la fracción vascular estromal de tejido adiposo a través de una serie de procesos mecánicos, que incluyen múltiples centrifugados y emulsificación.
Abstract
Fracción vascular estromal (SVF) se ha convertido en una herramienta regenerativa para varias enfermedades; sin embargo, la legislación regula estrictamente la aplicación clínica de células usando colagenasa. Aquí, presentamos un protocolo para generar una mezcla inyectable de SVF células y matriz extracelular nativa del tejido adiposo mediante un proceso puramente mecánico. Lipoaspirates se pone en una centrífuga y rota a 1.200 x g durante 3 minutos. La capa media se recoge y se separa en dos capas (alta densidad grasa en la parte inferior) y baja densidad grasa en la parte superior. La capa superior se emulsiona directamente cambiando de intersyringe, a un ritmo de 20 mL/s de 6 x a 8 x. La grasa emulsionada se centrifuga a 2.000 x g durante 3 min, y la sustancia pegajosa en la capa de aceite se recoge y se define como la matriz extracelular (ECM) / gel de SVF. Se recoge el aceite en la capa superior. Aproximadamente 5 mL de aceite se añade a 15 mL de grasa de alta densidad y emulsionado cambiando de intersyringe, a un ritmo de 20 mL/s de 6 x a 8 x. La grasa emulsionada se centrifuga a 2.000 x g durante 3 min, y la sustancia pegajosa es SVF/ECM-gel. Después del trasplante del ECM o SVF-gel en ratones desnudos, el injerto es cosechado y evaluado por la examinación histologic. El resultado demuestra que este producto tiene el potencial para la regeneración en el tejido adiposo normal. Este procedimiento es un procedimiento de disociación mecánica simple y efectiva para condensar las células SVF incrustadas en su natural apoyo ECM con fines regenerativos.
Introduction
Terapias con células madre ofrecen un cambio de paradigma para la regeneración y reparación de los tejidos por lo que pueden ofrecer un régimen terapéutico alternativo para varias enfermedades1. Las células madre (p. ej., células madre pluripotentes inducidas y las células madre embrionarias) tienen un gran potencial terapéutico pero son limitadas debido a la regulación de la célula y consideraciones éticas. Derivados del adiposo mesenquimales estromales/células madre (ASCs) son fáciles de obtener de lipoaspirates y no está sujeto a las mismas restricciones; así, se ha convertido en un tipo de célula ideal para medicina regenerativa práctica2. Además, son nonimmunogenic y tienen recursos abundantes de grasa autóloga3.
En la actualidad, ASCs se obtienen principalmente por digestión con colagenasa-mediada del tejido adiposo. La fracción vascular estromal (SVF) de tejido adiposo contiene ASCs, células progenitoras endoteliales, pericitos y células inmunes. Aunque obtener una alta densidad de SVF/ASC enzimático fue demostrado para tener efectos beneficiosos, la legislación en varios países regula estrictamente el uso clínico de productos basados en células con colagenasa4. Digerir el tejido adiposo con colagenasa durante 30 min a 1 h para obtener células SVF aumenta el riesgo de material exógeno en la preparación y la contaminación biológica. La cultura adherente y la purificación de la ASC, que dura días a semanas, requieren equipo de laboratorio específico. Por otra parte, en la mayoría de los estudios, las células SVF y ASC se utiliza en suspensión. Sin la protección de matriz extracelular (ECM) o de otro transportista, células libres son vulnerables, causar una retención celular pobre después de la inyección y comprometer el resultado terapéutico5. Todas estas razones limitan el uso adicional de la terapia de células madre.
Para obtener ASCs de tejido adiposo sin digestión mediada por la colagenasa, varios procedimientos de tratamiento mecánico, como centrifugación, mecánico para picar, triturar, triturar y picar, han sido desarrollados6,7 , 8 , 9. estos métodos se piensan para condensar tejido y ASCs interrumpiendo mecánicamente adipocytes maduros y sus vesículas que contienen el aceite. Por otra parte, estos preparados, que contienen altas concentraciones de ASCs, demostraron un potencial terapéutico considerable como medicina regenerativa en animales modelos8,9,10.
En 2013, Tonnard et al. introdujo la nanofat injerto técnica, que consiste en producir emulsionado lipoaspirates intersyringe procesamiento11. La fuerza de corte por intersyringe cambio selectivamente puede romper adipocitos maduros. De acuerdo con sus resultados, se desarrolló un método de proceso puramente mecánico que quita la mayor parte de los lípidos y el líquido en el lipoaspirates, dejando solamente las células SVF y ECM fraccionada, que es el SVF/ECM-gel12. Adjunto, describimos los detalles del proceso mecánico de derivados humanos el tejido adiposo para producir el gel o SVF-ECM.
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Protocol
Esta investigación fue aprobada por la Junta de revisión ética en Nanfang Hospital, Cantón, China. Tejido adiposo se obtuvo de donantes sanos que dieron consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Nanfang Hospital institucional Animal cuidado y uso y realizados según los lineamientos de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (China).
1. ECM/SVF-gel de preparación
- La cosecha de grasa.
- Realizar liposucción en un ser humano con una cánula selectora de 3 mm, que contiene varios agujeros del lado agudo de 1 mm de diámetro, en -0.75 atm de presión de aspiración.
- Recoger 200 mL de lipoaspirates en una bolsa estéril.
- Preparar grasa Coleman.
- Transferencia de la lipoaspirates en cuatro tubos de 50 mL y permite la cosecha todavía reposar 10 minutos.
- Recopilar la grasa en la capa superior en dos tubos de 50 mL con una pipeta de Punta ancha para transferir y desechar la porción de líquido en la capa inferior.
- Utilizando tubos de 50 mL, centrifugados la capa de grasa x 1.200 g a temperatura ambiente (RT) por 3 minutos.
- Definir la capa superior (aproximadamente 80 mL) como grasa Coleman.
- Transferencia el 2/3 superiores de la grasa Coleman a un tubo de 20 mL usando una pipeta de Punta ancha y definir esta parte como baja densidad grasa.
- Transferencia el 1/3 inferior de la grasa Coleman a otro tubo de 20 mL usando una pipeta de Punta ancha y definir esta parte como la grasa de alta densidad.
- Productos ECM o SVF-gel de grasa de baja densidad.
- Utilizando dos jeringas de 20 mL, conectadas por un conector de Luer-Lock hembra a hembra (con un diámetro interno de 2,4 mm) para intershift de 20 mL de grasa de baja densidad.
- Mantener la velocidad de desplazamiento estable (a 20 mL/s) y repetición de 6 x a 8 x.
- Centrifugado la mezcla a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Recoger la porción de aceite en la parte superior en un tubo de 10 mL utilizando una pipeta de Punta ancha a temperatura ambiente para su uso posterior.
- Recoger la sustancia pegajosa en la capa media, que es SVF/ECM-gel (figura 1A), utilizando una pipeta de Punta ancha y deseche el líquido en la capa inferior.
- Productos ECM o SVF-gel de grasa de alta densidad.
- Añadir 5 mL de aceite (tomado del paso 1.3.4) a 15 mL de grasa de alta densidad.
- Intershift la grasa mixta entre jeringas 6 x 8 x hasta un flocular se observa dentro de la emulsión.
- Centrifugado la mezcla a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Deseche la porción de aceite en la parte superior.
- Recoger la sustancia pegajosa en la capa media (ECM/SVF-gel) usando una pipeta de Punta ancha y deseche el líquido en la capa inferior.
- Mezclar el gel ECM/SVF de pasos 1.3.5 y 1.4.5.
2. nude modelo SVF/ECM-gel del injerto
- Anestesiar los ratones nude (8 semanas viejo, mujer) con isoflurano (1-3%) Anestesia Inhalatoria en una sala de operación animal.
- Transferencia del ECM o SVF-gel en una jeringa de 1 mL.
- Conecte la jeringa de 1 mL con una cánula de infiltración embotado.
- Inserte la cánula por vía subcutánea cada flanco del ratón.
- Inyectar 0,3 mL del ECM o SVF-gel.
3. tejido cosecha en 3, 15 y 90 días después de la inyección de la ECM o SVF-gel
- Anestesiar los ratones con isoflurano (1-3%) anestesia inhalatoria.
- Sacrificar a los ratones por el método de la dislocación cervical.
- Hacer una incisión en la línea media de la piel dorsal del ratón con tijeras quirúrgicas.
- Disecar y los injertos de grasa en ambos lados del ratón de la cosecha. Incrustar los injertos de grasa en el paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante la noche.
- Deshidratar el tejido en el aumento de las concentraciones de etanol: etanol al 70%, dos cambios, 1 h; un cambio en etanol al 80%, 1 h; un cambio en etanol al 95%, 1 h; etanol al 100%, tres cambios, 1,5 h cada uno; xileno, tres cambios, 1,5 h cada uno.
- Infiltrarse en el tejido con cera de parafina (58-60 ° C), dos cambios, 2 h.
- Incorporar el tejido en bloques de parafina. Cortar secciones en un espesor de aproximadamente 4 μm y ponerlos en las diapositivas.
4. hematoxilina y eosina
- Desparafinizar las diapositivas de bloque de parafina por sumergiéndolas en xileno I, II y III (10 min).
- Rehidratar las secciones de tejido al pasar a través de la disminución de las concentraciones (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) de baños de etanol durante 3 minutos.
- Enjuague las secciones del tejido en agua destilada (5 min).
- Mancha de las secciones de tejido en hematoxilina durante 5 minutos.
- Enjuague las secciones de tejido en el chorro del grifo durante 20 min decolore en alcohol ácido al 1% (1% ácido clorhídrico en alcohol al 70%) para 5 s. enjuague en agua de grifo hasta que las secciones azul nuevo.
- Añadir dos o tres gotas de colorante de la eosina Y directamente sobre el portaobjetos con una pipeta y permiten el colorante durante 10 minutos.
- Lave los portaobjetos en agua 1-5 minutos.
- Deshidratar el portaobjetos en el aumento de las concentraciones (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) de etanol durante 3 minutos.
- Limpiar el portaobjetos en xileno I y II durante 5 minutos.
- Montar las diapositivas en los medios de montaje.
5. inmunofluorescente de tinción
- Desparafinizar las secciones de tejido en xileno I, II y III (5 min).
- Rehidratar las secciones de tejido al pasar a través de diferentes concentraciones (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) de baños de alcohol durante 3 minutos.
- Incubar las secciones en una solución de 3% H2O2 en metanol a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Enjuague los portaobjetos 2 x con agua destilada, 5 minutos cada uno.
- Las diapositivas de la gota en una cesta portaobjetos. Añadir 300 mL de tampón citrato 10 mM (pH 6.0) e incubar los portaobjetos a 95-100 ° C durante 10 minutos.
- Enfriar el portaobjetos en RT por 20 min.
- Enjuague los portaobjetos 2 x con tampón fosfato salino (PBS), 5 minutos cada uno.
- Añada 100 μl de suero bovino fetal 10% en las diapositivas e incubar en cámara humidificada a temperatura ambiente durante 1 hora.
- Incubar las secciones con la solución de anticuerpo primario (conejillo de Indias anti-ratón Perilipin, 1: 400) a 4 ° C durante la noche.
- Enjuague los portaobjetos con PBS 3 x, 5 minutos cada uno.
- Incubar las secciones con la solución de anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-guinea pig-488) por 2 h a TA.
- Enjuague los portaobjetos con PBS 3 x, 5 minutos cada uno.
- Limpie el agua alrededor de la sección con papel limpio.
- 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y Alexa Fluor 488 conjugado proteína la gota en el círculo para cubrir la sección de la diapositiva.
- Monte el cubreobjetos y deje secar en la oscuridad.
- Observe las diapositivas con un microscopio de fluorescencia.
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Representative Results
Después de procesar la grasa Coleman a gel o SVF-ECM, el volumen de petróleo desechado ocupa 80% del volumen final, y sólo el 20% de tejido adiposo conservado bajo la capa de aceite se considera como ECM o SVF-gel (figura 1A). ECM/SVF-gel tiene una textura suave de tipo líquido que le permite ir a través de una aguja fina 27 G; sin embargo, Coleman grasa se compone de una estructura grasa integral con fibras grandes y sólo puede ir a través de una cánula 18 G (figura 1B).
El día 3 después del trasplante, aparecieron gran número de preadipocytes pequeñas con múltiples gotitas de lípidos intracelulares, extenso tejido conectivo bien vascularizado y células inflamatorias infiltradas. A partir del día 15, el número de células inflamatorias comenzó a recibir reducido gradualmente, y adipocitos comenzaron a madurar. Día 90, la mayor parte del tejido conectivo vascularizado en los injertos había sido reemplazada por adipocitos maduros (figura 2, panel superior).
Injertos de ECM o SVF-gel contienen unos adipocitos perilipin positivo, 3 días después del trasplante. Preadipocytes pequeñas con múltiples gotitas de lípidos intracelulares comenzaron a aparecer el día 15. Cada campo de ECM o SVF-gel del injerto las secciones el día 90 demostró numerosos adipocitos perilipin-positivo y los vasos sanguíneos recién formados (figura 2, panel inferior).
Figura 1 : Imágenes del SVF-gel ECM. Coleman grasa centrifugada y SVF/ECM-gel después de procesar (A). ECM/SVF-gel se puede inyectar fácilmente a través de una aguja de 27 G; sin embargo, Coleman grasa sólo puede pasar a través de una cánula 18 G (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Cambio histológico en el ECM, SVF-gel después del trasplante. ECM/SVF-gel mostró extenso tejido conectivo bien vascularizado y la infiltración de células inflamatorias en el día 3. Posteriormente, la mayor parte del tejido conectivo vascularizado fue substituido por una estructura que contiene adipocitos maduros (panel superior). Muestra la coloración inmunofluorescente que la mayor parte del tejido está compuesto por la zona perilipin negativo el día 3. Día 15, una porción grande de perilipin + adipocitos apareció. Se encontraron numerosos adipocitos perilipin positivo después de 90 días (panel inferior). Las barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Terapia Regenerativa de células madre ha mostrado un gran beneficio potencial en diferentes enfermedades. ASCs son candidatos terapéuticos porque son fáciles de obtener y tienen la capacidad de reparación de los tejidos y la regeneración de nuevos tejidos15. Sin embargo, existen limitaciones a la expansión de su uso clínico, ya que requiere procedimientos complicados para aislar células y colagenasa para el procesamiento de6. Por lo tanto, es esencial desarrollar una técnica sencilla para obtener células madre sin el uso de colagenasa.
En este estudio, se presenta un proceso puramente mecánico de tejido adiposo para obtener las células SVF, que están protegidas por el ECM adiposo nativo. Además, este proceso es libre de colagenasa. Un anterior estudio comparada diferentes intersyringe tiempos de procesamiento y demostró que el procesamiento intersyringe de grasa Coleman estándar para 1 min a un flujo de 10 mL/s es el protocolo óptimo para producir el gel o SVF-ECM12. Mediante el uso de cambio de intersyringe, más adipocitos en la lipoaspirates son destruidas, con la mayoría de las células de la SVF y ECM conservado. Así, intersyringe cambio es el paso clave de todo el proceso. La intersyringe velocidad de desplazamiento y el tiempo empleado en llevar a cabo el desplazamiento en determinan el nivel de destrucción del tejido adiposo porque la fuerza sheering creada por el proceso de intersyringe se asocia con la velocidad de desplazamiento. Sugerimos que la velocidad de desplazamiento debe ser estable a 20 mL/s. destrucción insuficiente conduce a restantes adipositos no deseados, mientras que overdestruction produce daños en las células SVF. El producto de este protocolo puede ser definido como gel o SVF-ECM sólo si llegó a los siguientes criterios: 1) su volumen final es ~ 20% del volumen inicial; 2) fácilmente se inyecta a través de una aguja de 27 G. Un estudio anterior demostró que el gel o SVF-ECM contiene altas densidades de ambos CD45-/ CD31 - CD34 + ASC y la densidad celular SVF es > 4.0 x 105 células/mL12.
Durante el proceso de creación de ECM o SVF-gel, centrifugación fue realizado 2 x, antes y después del desplazamiento intersyringe. Antes de la intersyringe cambio, utilizamos la centrifugación para crear "densidades graduales" de la grasa. Este es otro paso clave. Se ha demostrado que la capa de grasa de alta densidad en la parte inferior, después de la centrifugación, es rica en ECM condensada pero tiene menos petróleo, mientras que la capa de grasa de baja densidad en la parte superior tiene más petróleo pero menos ECM fibra16,17. Así, estas dos capas deben ser procesadas de dos maneras diferentes. Grasa de baja densidad puede experimentar directamente el procesamiento intersyringe para destruir los adipocitos. Sin embargo, la alta densidad grasa en la capa inferior requiere aceite adicional para facilitar la destrucción de los adipocitos. El aceite añadido puede disminuir la densidad de la grasa de alta densidad, haciendo mucho más fácil el desplazamiento. Además, el aceite puede ayudar a extraer más petróleo de los adipocitos rotos; sin embargo, no líquido acuoso. Por lo tanto, hemos añadido aceite extra para la grasa de alta densidad. La centrifugación después de la intersyringe cambio es separar la porción de aceite de las células de la SVF y ECM. Aceite debe evitarse en el producto final.
El trasplante de ECM o SVF-gel resultó en una tasa de retención grandes. Como mencionamos anteriormente, el paso clave del proceso de la SVF/ECM-gel es intersyringe cambio, que destruye la mayor parte de los adipocitos. Así, poco adipocitos seguía siendo en el ECM o SVF-gel. Como se muestra en la figura 2, una pequeña área de perilipin positivo apareció en el ECM o SVF-gel trasplantado el día 3. Sin embargo, después de 15 días, un montón de adipocitos perilipin positivo apareció y se convirtió la madurito después de 90 días. Un estudio anterior ha demostrado que el trasplante de gel o SVF-ECM inducido huésped mediada por células del tejido adiposo regeneración14. Utilizando antígeno humano del leucocito para identificar el origen de los adipocitos recién formados, descubrimos que, aunque la mayoría de las células en el SVF derivados del injerto, la mayor parte del tejido adiposo recién formado fue derivado de host. ECM/SVF-gel tiene una gran función regenerativa, como ya informamos anteriormente. Este producto tenía grandes efectos terapéuticos en heridas12. Por otra parte, que ayudó a mejorar la tasa de supervivencia de la aleta libre en un modelo de ratón mediante la aceleración de la angiogénesis10.
SVF-gel es un autólogo inyectable que contiene ECM nativa y funcionales componentes celulares. El producto se genera de la lipoaspiración por un simple proceso mecánico, que puede realizarse fácilmente sin ninguna preocupación por cuestiones regulatorias. Sin embargo, el efecto regenerador de ECM o SVF-gel sigue siendo confuso. Para caracterizar mejor los efectos beneficiosos del gel o SVF-ECM, las posteriores investigaciones para caracterizar los mecanismos moleculares subyacentes del efecto regenerador de ECM o SVF-gel están en el camino.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de ciencia natural de China (81471881, 81601702, 81671931), la Fundación de Ciencias naturales de la provincia China de Guangdong (2014A030310155) y el administrador de la Fundación de Nanfang Hospital (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
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