Summary
Denne protokol er designet til at vurdere immunterapeutisk omdirigerede T-celle (bil T-celle) cytotoksicitet mod 3D struktureret kræft celler (spheroids) i realtid.
Abstract
Immunterapi er blevet et område af voksende interesse i kampen mod kræft ellers uhelbredelige. Blandt alle immunterapeutisk metoder omdirigeret kimære antigen receptor (bil) T celler opnået de mest spektakulære resultater, navnlig med pediatric B-akut lymfoblastær leukæmi (B-ALL). Klassisk validering metoder af bil T celler er afhængige af brugen af specificitet og funktionalitet assays bil T celler mod målet celler i suspension og xenograft modeller. Desværre, bemærkninger, in vitro-er ofte afkoblet fra resultaterne i vivo og en masse indsats og dyr kunne være sparet ved at tilføje en anden skridt: brugen af 3D kultur. Produktionen af spheroids ud af potentielle target-cellerne, der efterligner 3D-struktur af tumorcellerne, når de er i aflægger i en dyremodel repræsenterer et ideelt alternativ. Her rapporterer vi en overkommelig, pålidelig og nem metode til at producere spheroids fra en transduced kolorektal cellelinie som en efterprøvelse værktøj for adoptivforældre celleterapi (eksemplificeret her af CD19 bil T-celler). Denne metode er kombineret med et avanceret live imaging system, der kan følge klumpformet vækst, effektor celler cytotoksicitet og tumor celle apoptose.
Introduction
Adoptivforældre celle overførsel (ACT) repræsenterer den næste generation kræftbehandling. Det er baseret på indsprøjtning af effektor celler (T - eller NK-celler) i en patient. Disse celler kan være genetisk modificerede med en receptor, der vil guide dem til deres mål, tumor, og ødelægge den. For nylig blev denne tilgang vist sig at være muligt, når en kimære Antigen Receptor (bil) rettet mod B-celle markør CD19 blev indført i patienten T celler til at dræbe sin kræft1. I tilfælde af CAR, som er en kunstig receptor, design består af specifikt antistof fragmenter, antigenet bindende domæne reduceret til en enhed udpegede enkelt kæde variable fragment (scFv), forbundet med T-celle signalering domæner. Selv om der er flere designs, de mest almindeligt anvendte versioner omhandlet som andengenerations bildesign, består af CD3z for TCR signalering og et co-stimulatory domæne (CD28, 4-1BB, OX40, osv.) 1 , 2. feltet immunterapi rettet de fleste af sin opmærksomhed mod denne nye form for handling, når CD19 bil-T celler efficaciously behandlet mange patienter med B-celle maligniteter3,4. Efter denne succes, forskere forsøgt at udnytte de lignende design ved at målrette andre epitoper for solide tumorer med begrænset succes. Desværre, knaphed på tumor gruppespecifikke antigener og de barskere tumor microenvironments gengives bil T celler mindre effektiv mod solide tumorer5.
I øjeblikket, stole de mest almindeligt anvendte i vitro validering strategier på todimensionelle (2D) systemer, der kun vedrører et fragment af de allerede nævnt solid tumor udfordringer. Klassisk, omfatter 2D in vitro- systemer en blanding af bil T-celler og target kræft cellelinjer som encellelag vurdering af funktionalitet og specificiteten af disse effektor celler. Selv om disse strategier er vigtige og vitale dele af undersøgelserne, tager de ikke hensyn til komplekse morfologi og tredimensionale (3D) struktur af kræft celler6. Kræftceller dyrkes i 3D systemer, omtales som spheroids, erhverve nye fænotypisk træk gennem ændringer i gen expression profil7, som kan påvirke anerkendelse af omdirigerede effektor celler. Birgersdotter og kolleger viste, at en Hodgkin lymfom (HL) cellelinie når kun dyrkes i en 3D kultur model erhverver en gen expression profil, der svarer til primær tumor prøver8. Derfor, spheroids eller lignende 3D kultur metoder tilbud mere relevant i vitro modeller i stedet for standard 2D systemer. Sådanne systemer er også svarer til in vivo-undersøgelser, som ses som det sidste trin i valideringsprocessen for en given bil. I betragtning af at 2D systemer ikke efterligne morfologi af kræft klynger, spheroids tilbyder lignende formationer for at vurdere funktionaliteten af bil T celler forud for in vivo modeller. I en undersøgelse, Pickl et al. konstateret, at en klumpformet model af human epidermal vækstfaktor receptor (HER2) overekspression kræftceller viste lignende signaling profiler til in vivo modeller9. Dette understøtter yderligere, at spheroids tilbyder mere relevante og afslutning-til-in vivo vurdering af bil T-celler. Derudover bil T-celle validering mod spheroids kan hjælpe med at vurdere deres effektivitet, mere kritisk og forhindre, at nogle af designene flytter til in vivo-undersøgelser for tidligt10; således bidrager til etisk berørte forskning ved at ofre færre dyr. Derudover er protokoller ved hjælp af spheroids ikke dyrere end klassisk 2D systemer og meget hurtigere i forhold til klassisk i vivo undersøgelser. Taget sammen, kan man forudsige, at medtagelsen af klumpformet undersøgelser snart vil blive standardpraksis at sammenkæde in vitro- og in vivo undersøgelser.
Vi præsenterer her, forberedelse af spheroids fra colon cancer cellelinie HCT 116. Denne cellelinje blev ændret for at udtrykke den menneskelige CD19 molekyle at gengive det følsomme over for CD19 bil T-celler og give en klar vurdering af aflivning ved hjælp af en klinisk validerede bil konstruktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generation af Spheroids fra kolorektal Cancer cellelinie
- Vaske HCT 116 (stabilt transduced for at udtrykke klynge af differentiering 19 (CD19) og grøn fluorescens Protein (NGL)) celle encellelag med phosphat bufferet saltvand (PBS, 5 mL til en 25 cm2 eller 10 mL til en 75 cm2 kolbe). Tilføje trypsin (0,5 mL til en 25 cm2 eller 1 mL til en 75 cm2 kolbe) og inkuberes celler ved 37 ° C i 5 min.
- Kontrollere celle detachement under et mikroskop og neutralisere celle dissociation enzym med komplet Roswell Park Memorial Institute 160 medium (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + phosphatbufferet; 10 mL til en 25 cm2 eller 20 mL til en 75 cm2 kolbe).
- Centrifuge cellesuspension ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette og resuspend af pipettering op og ned flere gange med 5 mL af komplet RPM1 1640 medium.
- Tælle celler benytter Trypan blå udelukkelse på en kompatibel celle counter.
- Centrifuge cellesuspension ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette og resuspend på RPMI medium til at opnå 5 x 103 celler/mL.
- Overføre cellesuspension til en steril reservoir og dispensere 200 µL/brønd i en 96-brønd runde nederst plader ved hjælp af en multikanalpipette.
- Overføre pladen til automatiseret billedbehandling apparatet inde i en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Logge ind køb softwaren, skal du vælge Tidsplan at erhverve | Lanceringen tilføje fartøj | Scan på tidsplan | Oprette fartøj: nye.
-
Vælg Skan Type: klumpformet. Vælg kanalerne af interesse: fase + Brightfield (til at følge spheroids vækst), grøn (for at følge tumor signal, erhvervelse tid 300 ms) og rød (for at følge apoptose, erhvervelse tid 400 ms).
- Vælg den ønskede forstørrelse: 10 x.
- Vælge den plade model og sin position i skuffen. Vælg placering af brønde til billede. Angiv beskrivelsen af eksperimentet: navn, type celler, antallet af celler.
- Vælg Udsætte analyse indtil senerefor opsætningen analyse. Højreklikke på tidslinjen og Indstille valgt Skan Grupperingsinterval vælge og indstille tilføje scanninger hver til 4 h og For alt til 24 h. indstille det ønskede starttidspunkt (mindst 1 time efter inkubation i automatiseret billedbehandling apparatet).
-
Kontroller hver 2 dage for væksten af spheroids ved at logge ind i imaging software.
- Vælge indstillingen Vis seneste scanner og dobbeltklik på den ønskede eksperiment. Vælg Brightfield i billede-kanalpanel og derefter bruge værktøjet foranstaltning billede funktioner til at måle diameteren af spheroids. Det tager 6 dage for en klumpformet at nå frem til den ønskede størrelse: 0,5 mm i diameter. Tilføje 50 µL af komplet RPMI medium pr. brønd på dag 4 at begrænse medium fordampning effekt.
2. generation af CD19 bil T celler
-
Udvidelse af CD19 bil T celler
Bemærk: Stabil udtryk af CD19 bil T-celler blev erhvervet af bulk retroviral transduktion af raske donorer PBMC som tidligere beskrevet16. Retroviral konstruere kodning for CD19 bil er en anden generation bil og består af fmc63 scFv kæde, CD8 hængsel og transmembrane domæne, en 4-1BB co-stimulatory domæne og endelig et CD3ζ domæne.- For at udvide, kultur af transduced T celler i overværelse af anti-CD3/28 magnetiske perler med en celle til perle forholdet 1:1 til 10-11 dage. Under udvidelsen af celler er i komplet medium (X-VIVO 15, 5% Serum udskiftning og 100 U/mL rekombinant humant IL-2).
Bemærk: Den ideelle tæthed for en effektiv udvidelse er 1 til 2 x 106 celler/mL. Afhængigt af den indledende nummer kan celler udvides i kolber (25 cm2 flasker til 20 mL, 75 cm2 flasker til 40 mL af det samlede volumen) i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed). - Som en negativ kontrolgruppe for de følgende assays, omfatte ikke-transduced PBMC (vil blive omtalt som Mock) til ekspansion protokol parallelt med CD19 bil T-celler.
- På dag 3 og fremefter, tilføje frisk medium hver dag og opdele celler i flere kultur kolber, hvis nødvendigt.
- Dag 10-11, centrifuge celler på 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og kombinere alle cellerne i en 50 mL tube og resuspend celler i ~ 30 mL frisk komplet medier.
- Placer 50 mL tube de resuspenderede celler på en magnetisk stand til at adskille de magnetiske perler fra næringssubstratet.
- Vente 2-3 min for perlerne at samle på siden af røret.
- Fjerne næringssubstratet med en pipette og overførsel til en ny tube uden at røre magnetisk bead samling zoner.
- Gentag trin vedrørende perle fjernelse (2.1.5–2.1.7) endnu engang til at begrænse antallet af perler i det endelige næringssubstratet.
- Resuspend og tælle cellerne, skal du justere tæthed til 1-2 x 106 celler/mL i komplet medium.
- Hvile celler for mindst 4 h op til natten. Derefter direkte fryse dem ned ved-80 ° C og overføre hætteglassene til en flydende kvælstof tank den følgende dag til langtidsopbevaring. Alternativt, man kan forlænge resten op til natten til umiddelbar brug.
- For at udvide, kultur af transduced T celler i overværelse af anti-CD3/28 magnetiske perler med en celle til perle forholdet 1:1 til 10-11 dage. Under udvidelsen af celler er i komplet medium (X-VIVO 15, 5% Serum udskiftning og 100 U/mL rekombinant humant IL-2).
-
CD19 bil udtryk kontrol på primære T celler
- Tæller antallet af udvidet T celler som tallene kan variere en smule efter natten kultur eller moderat efter fryse/tø.
- Overføre 5 x 105 celler fra begge CD19 bil og Mock primære T-celler til at adskille flow flowcytometri rør.
- Cellerne vaskes med 200 μl af Flow Buffer (2% FBS i PBS), og der centrifugeres rør på 500 x g i 5 min. Gentag trinene vask at slippe af enhver artefakter forårsaget af næringssubstratet.
- Forberede det primære antistof (Biotin ged anti-mus IgG, F(ab') ₂ Fragment specifikke) ved at udføre 1:200 fortynding i Flow Buffer.
- Resuspend celler i 100 μl antistof mix pr tube og Ruger på isen til 15 min. Gentag de forrige vask trin to gange for at fjerne overskydende antistof.
- Forberede den sekundær antistof (Streptavidin-PE) som 1: 400 fortynding i Flow Buffer.
- Resuspend celler i 100 μl antistof mix pr tube og Ruger på isen til 15 min. Gentag de forrige vask trin to gange for at slippe af med overskydende antistof.
- Resuspend celler i 200 μl af Flow Buffer pr tube og analysere det på en flow Flowcytometret.
- Brug Mock T-celler til at konfigurere de negative og positive gate og analysere CD19 bil transduced T-celler i overensstemmelse hermed.
3. 3D Tumor klumpformet drab Assay
-
Efter 6 dage eller en gang spheroids nå den ønskede størrelse, fjerne pladen fra rugemaskinen. Ved hjælp af en multikanalpipette, forsigtigt fjerne 100 µL/brønd af komplet RMPI 1640 medium fra klumpformet plader.
- For dette trin, vinkel tips indefter væg af 96-brønde plade, undgå kontakt med bunden af brønden for at minimere forstyrrelser af spheroids. Resterende volumen skal være omkring 100 µL.
- Forberede en 1:200 løsning af Annexin V rød ved at blande 50 µL af Annexin V rød med 9,95 mL af komplet RPMI 1640 medium.
- Tilsæt 100 µL/brønd af 1:200 Annexin V røde løsning.
- Overføre pladen til en inkubator (37° C, 5% CO2, 95% fugtighed) i 15 min.
- Høste de transduced bil CD19 T celler i en 15 mL rør og centrifugeres dem på 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette og resuspend af pipettering op og ned flere gange med 2 mL af komplet RPM1 1640 medium.
- Tælle celler benytter Trypan blå udelukkelse på en kompatibel celle counter.
- Centrifuge cellesuspension ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette og resuspend på RPMI medium til at opnå 2 x 105 celler/mL.
- Overføre cellesuspension til en steril reservoir og afpipetteres 100 µL/brønd i en 96-brønd runde klumpformet bundplade ved hjælp af en multikanalpipette.
- Overføre pladen tilbage til automatiseret billedbehandling apparatet inde i en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed).
-
Logge ind køb softwaren, skal du vælge tidsplan til at erhverve.
- Højreklik på Scan tidslinjen, og vælg Rediger tidslinje. Højreklik på gruppen scan og slet den. Højreklik på tidslinjen og vælge Sæt valgt Skan Grupperingsinterval indstilling og indstille tilføje scanninger hver til 1,5 h og For i alt 24 h.
- Angiv det ønskede starttidspunkt (mindst 1 time efter inkubation i automatiseret billedbehandling apparatet). Vælg Gem tidsplan scanninger.
4. automatiske billedanalyse
- Logge ind erhvervelse, vælge indstillingen Vis seneste scanner og vælg Launch analyse indstilling. Vælg Opret ny analyse Definition | Analysetype: klumpformet. Marker billedet kanaler for at analysere (fase + Brightfield, grøn og rød).
- Vælg mindst 10 repræsentative billeder: typisk 1 pr. betingelse og mindst 3 gang point (begyndelse, midte og afslutning af erhvervelse).
- Preview standard analysere procedure i hele billedet stakken.
- Ændre parametrene for brightfield maske. Typiske parametre er: følsomhed 10, hul fyld 1.000 µm2, min område 1.000 µm2. Se et eksempel på den hele billedstak og kontrollere, at de valgte parametre opdager spheroids præcist.
- Ændre parametrene for grønne maske (NGL). Typiske parametre er: Top hat segmentering med radius 200 µm og tærskel 3 an, kant udskilt, hul fyld 5.000 µm2, Juster størrelse -2 pixels, område min 3.000 µm2. Se et eksempel på den hele billedstak og kontrollere, at de valgte parametre opdager spheroids præcist.
- Ændre parametrene for røde maske (Annexin V). Typiske parametre er: Top hat segmentering med radius 150 µm og tærskel 2 an, kant udskilt, hul fyld 5.000 µm2, Juster størrelse 0 pixel, område min. 1.000 µm2. Se et eksempel på den hele billedstak og kontrollere, at de valgte parametre opdager spheroids præcist.
-
Lancere analyzer.
- Når analysen er færdig, skal du udpakke måling af interesse. Vælg filen analyseret og derefter indstillingen Graf målinger . Vælg målinger af interesse, scan og brønden. Typisk, samlede røde og grønne intensitet indenfor brightfield grænser giver de mest præcise målinger af begrænser signalet fra fluorescens spheroids grænser fastsættes af brightfield maske (figur 3). Udtrække udvalgte målinger i flere filformat ved at klikke på "Eksporter Data".
- Fortsæt til udvinding af billeder og film ved at vælge filen analyseret og derefter vælge indstillingen Eksporter billeder og film . To valgmuligheder er tilgængelige, enten "som vises" til at hente billeder og film som set på imaging software (normalt sammensatte billeder), enten "som gemt" til at hente raw data til eksterne analyse gennem tredje-del software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som det kan ses i figur 1, er det afgørende at kontrollere ved flowcytometri udtryk af CD19 bil på T-celler (figur 1A) og niveauet af CD19 på HCT116 tumor cellelinjer (figur 1B). Figur 2 illustrerer resultatet af en typisk klumpformet eksperiment. Automatiseret billedbehandling apparatet tager billeder i fire forskellige kanaler: lysfelt, fase, grøn og rød fluorescens. Fase kanal bruges til at hævde dannelsen af spheroids ved at vise meget kontrast grænser nær spheroids (hvilket er et tegn på klumpformet dannelse). Lysfelt bruges under analyse proces til at registrere størrelsen af spheroids og begrænse de grønne signal (tumor) og røde signal (apoptose) til de ovennævnte grænser. Det gør det muligt at ikke overveje begivenheder direkte relateret til spheroids (for eksempel isolerede tumorceller og deres apoptose). Grønne og røde linjer repræsenterer henholdsvis grøn og rød signaler i betragtning i beregningen af målinger. I figur 2, lysfelt, blev fase, grøn og rød kanaler udtrukket via indstillingen "som gemt" sammensatte billeder blev udtrukket gennem "Som viste" valgmulighed og repræsentative målinger vises i figur 3. Som det ses i figur 2, i modsætning til Mock T celler, har CD19 bil T celler kunnet specifikt dræbe spheroids og høj grad mindske antallet af levende tumorceller.
Figur 3 viser udviklingen i alt grønne og røde signal målt indenfor klumpformet grænser over tid. Som det kan ses, kort tid efter CD19 bil T celle indsprøjtning, spheroids' størrelse krymper hurtigt (som målt ved de grønne fluorescens signal) og apoptose signal stiger hurtigt (som målt ved de røde fluorescens signal).
Figur 1: overflade udtryk af CD19 bil og CD19. (A) overflade udtryk af CD19 bil på Retroviralt transduced T-celler. Celler blev analyseret ved flowcytometri før klumpformet assay via mouse-Fab biotinylated som primære og anti-Streptavidin-PE som sekundær antistof. (B) overflade udtryk af CD19 på Retroviralt transduced HCT116 celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vurdering af CD19 bil T-celle cytotoksicitet mod tumor spheroids. Tidsforskydning af HCT116 klumpformet vækst; på t = 138 h Mock eller CD19 bil T celler blev introduceret med en tæthed på 20000 celler/brønd. Grønne signal svarer til HCT116 normal god landbrugspraksis + celler og grønne kontur svarer til den fundne klumpformet. Røde signal svarer til apoptose, som overvåges af Annexin V og rød kontur svarer til de fundne apoptose begivenheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: målinger af samlede røde og grønne signal inden for brightfield maske grænser over tid. Samlede røde og grønne signaler i brightfield maske målinger blev opnået efter analyseret og afbildet som en funktion af tiden. Stiplet linje svarer til indførelsen af effektor celler (CD19CAR eller Mock T-celler). Foranstaltning svarer til den gennemsnitlige ± SEM (n = 12). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af spheroids som et innovativt værktøj til at validere fremtidige kræftbehandling er blevet et område af voksende interesse i de seneste år. Spheroids repræsenterer en mellemting mellem klassisk 2D analyse af in vitro- og in vivo vurdering. Metoden yderligere holder en masse løfte om deres styrke i form af tumor mikro-miljø efterligne samt gen profilering7. Den protokol, der præsenteres i denne publikation blev tilpasset fra Saheen et al.11 til Incucyte S3 og repræsenterer en overkommelig og nem metode til at producere 3D tumor spheroids fra kolorektal cellelinjer. Kobling klumpformet generation til en høj overførselshastighed imaging enhed tillader pålidelig og hurtig screening af en bred vifte af anti-tumor agenter og overvåge de førnævnte agent evne til at destabilisere tumor struktur.
Der er flere vigtige skridt at tage i betragtning med hensyn til denne protokol. Først, det første nummer af tumorceller skal justeres præcist. Hvis udgangspunktet celle tætheden er for høj, cellerne vil forringe PLL belægning hurtigt og vil begynde at danne et vedhængende éncellelag. På den anden side vil et lavt antal celler indføre en høj variation med hensyn til klumpformet størrelse og antallet af spheroids pr. brønd. Andet, anvendelse af en automatiseret imaging enhed er udsætter celler til potentielle fototoksicitet (især hvis flere fluorescens kanaler bruges); Det anbefales at justere billedet frekvens for at minimere skaderne på spheroids. Det er en afgørende parameter at overveje for at fange begivenhederne af interesse pålideligt (et billede hver 4 timer før effektor celler introduktion og en hver 90 min efter repræsenterer det bedste kompromis til vores viden). Tredje, anbefaler vi at være særlig omhyggelig med at undgå medium fordampning, der kan forekomme et par dage efter effektor celler introduktion. For det fjerde antallet af effektor celler behov også skal justeres præcis: det ønskede nummer skal være høj nok til at dræbe tumor spheroids effektivt men også så lavt som muligt at give den højeste potentiale for optimal billedprocessen. For det femte i en typisk eksperiment indeholder en brønd 2 til 4 spheroids, der kan hånd i hånd i en; Det anbefales at være opmærksom på potentielle pigge, der kan bryde ud i målinger efter denne begivenhed, og at se bort fra dem. For det sjette på en 96-brønd plade, i gennemsnit 20 til 50 brønde indeholde spheroids i ønskede antal og størrelse; vi anbefale at checke wells betragtes for analyse før indførelsen af effektor celler, da det vil spare beregningen tid. Endelig, analysen er delvist automatiseret men nødvendiggør nogle input fra brugeren med hensyn til de forskellige parametre. Det anbefales stærkt at tage særlig pleje i dette trin og at fokusere på en balance mellem sensitivitet og specificitet. Hvis typen af effektor celler/narkotikabehandling varierer meget inden for et eksperiment, kan det være nødvendigt at køre forskellige typer af analyse til at vælge den, der passer bedst.
Denne metode er hidtil kun begrænset til en bestemt type af vedhængende cellelinje (i denne publikation HCT 116); yderligere er udvikling forpligtet til at generalisere denne protokol til hver linje, kræft celle. Selv om en bred vifte af metoder er allerede til rådighed for et større antal mål celler12,13,14,15, de fleste af dem er afhængige af brugen af dyre og/eller komplicerede procedurer. Vores metode, er selv begrænset til nogle få typer af target-cellerne hidtil, interessant, da det kræver meget begrænset input fra eksperimentatoren og tillader en hurtig og nem skærm af forskellige stoffer og/eller immunterapi behandlinger (her bil CD19 celler). Dens pålidelighed og dens evne til at tilpasses til forskellige slags behandlinger gør denne metode et stærkt værktøj i forbindelse med anti-kræft behandling valideringsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det norske Forskningsråd under Grants #244388, #254817 og #284983; Norske Cancer Society (#6829007); Norske sundhed Region syd øst under Grant #17/00264-6 og #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
