Summary
Este protocolo está diseñado para evaluar la citotoxicidad de T-cell (T-cell de coche) redireccionada inmunoterapéutico contra células cancerosas estructuradas 3D (esferoides) en tiempo real.
Abstract
La inmunoterapia se ha convertido en un campo de creciente interés en la lucha contra el cáncer de otra manera intratable. Entre todos los métodos de inmunoterapia, receptor del antígeno quimérico (coche) redirigido las células de T obtenidas los resultados más espectaculares, en particular con leucemia linfoblástica aguda-B pediátrica (B-ALL). Métodos de validación clásica de células T auto confían en el uso de especificidad y ensayos de funcionalidad de las células de T automóvil contra las células de la blanco en suspensión y en modelos de xenoinjerto. Por desgracia, observaciones in vitro a menudo se desemparejan de resultados obtenidos en vivo y un montón de esfuerzo y animales podría salvarse mediante la adición de un paso: el uso de la cultura 3D. La producción de esferoides de potenciales células Diana que imitan la estructura 3D de las células tumorales cuando son engrafted en el modelo animal representa una alternativa ideal. Aquí, Divulgamos un método asequible, fiable y fácil de producir esferoides de una línea de células transduced de colon como una herramienta de validación para la terapia celular adoptiva (ejemplificada aquí por las células CD19 coche T). Este método es junto con un avanzado sistema de proyección de imagen vivo que puede seguir el crecimiento del esferoide, efectoras células de citotoxicidad y tumor apoptosis de las células.
Introduction
Transferencia celular adoptiva (ACT) representa el tratamiento de cáncer de próxima generación. Se basa en la inyección de células efectoras (células T o NK) en un paciente. Estas células pueden ser modificadas genéticamente con un receptor que se guía a su destino, el tumor y lo destruyen. Este enfoque fue demostrado recientemente para ser factible cuando un Receptor de antígeno quimérico (coche) dirigido contra el marcador de células B CD19 fue introducido en las células T del paciente para matar su cáncer1. En el caso del coche, que es un receptor artificial, el diseño consiste de fragmentos de anticuerpos específicos, el antígeno vinculante dominio reducido a un fragmento variable de cadena única designada de entidad (scFv), vinculados a los dominios de señalización del T-cell. Aunque existen varios diseños, las versiones más utilizadas que se refiere como diseños de coches de segunda generación, consisten en CD3z para señalización del TCR y un dominio coestimuladoras (CD28, 4-1BB, OX40, etcetera.) 1 , 2. el campo de la inmunoterapia dirigida la mayor parte de su atención a esta nueva forma de acto cuando las células CD19 coche-T eficazmente trataron numerosos pacientes con neoplasias de células B3,4. Tras este éxito, los investigadores intentaron explotar los diseños similares apuntando a otros epitopos para tumores sólidos con éxito limitado. Lamentablemente, la escasez de antígenos específicos de tumor y los microambientes de tumor más prestados del coche T células menos eficaces hacia tumores sólidos5.
En la actualidad, las estrategias de validación más comúnmente utilizado en vitro dependen de sistemas bidimensionales (2D) que sólo se refieren a un fragmento de los desafíos ya mencionados tumor sólido. Clásico, 2D en vitro sistemas implican una mezcla de células T auto y líneas celulares de cáncer destino como monocapas para evaluar la funcionalidad y la especificidad de estas células efectoras. Aunque estas estrategias son parte importante y vital de los estudios, no toman en consideración la compleja morfología y estructura tridimensional (3D) de las células de cáncer6. Las células cancerosas cultivadas en sistemas 3D, denominados esferoides, adquieren nuevos rasgos fenotípicos a través de cambios en el gene expresión perfil7, que puedan influir en el reconocimiento por células efectoras redirigida. Birgersdotter y colegas demostraron que una línea de células de linfoma (HL) de Hodgkin cuando se cultiva solamente en un modelo 3D de la cultura adquiere un perfil de expresión génica que es similar al de las muestras del tumor primario8. Por lo tanto, esferoides o similar 3D cultura oferta de metodologías más relevantes modelos in vitro frente a los sistemas 2D estándar. Estos sistemas también son similares a estudios in vivo que se ven como el último paso en el proceso de validación de un determinado coche. Teniendo en cuenta que los sistemas 2D no imitan la morfología de racimos de cáncer, esferoides ofrecen formaciones similares para evaluar la funcionalidad de las células de T automóvil antes modelos en vivo. En un estudio, Pickl et al identificaron que un modelo esferoide del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) overexpressing células cancerosas demostraron perfiles de señalización similares a modelos en vivo9. Esto apoya aún más que los esferoides ofrecen más relevantes y cerrar-a-en vivo la evaluación de las células de T del coche. Además, validación de coche T-cell contra esferoides podría ayudar a evaluar más críticamente su eficacia y evitar algunos de los diseños que se mueva para estudios in vivo prematuramente10; contribuyendo a la investigación ética preocupada por sacrificar menos animales. Además, protocolos con esferoides no son más caros que los sistemas 2D clásicos y mucho más rápido en comparación con los estudios clásicos en vivo . Tomados en conjunto, se puede predecir que la inclusión de estudios esferoide se convertirá pronto en práctica estándar para vincular los estudios in vitro e in vivo.
Presentamos la preparación de esferoides de la línea de células de cáncer de colon HCT 116. Esta línea celular fue modificada para expresar la molécula CD19 humana para hacerla sensible a las células CD19 coche T y para proporcionar una evaluación clara de la matanza con una construcción de coche clínicamente validada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generación de esferoides de línea celular de cáncer colorrectal
- Monocapas de células de lavado HCT 116 (transduced estable para expresar del racimo de la diferenciación 19 (CD19) y la proteína de fluorescencia verde (GFP)) con el fosfato tampón salino (PBS, 5 mL de 25 cm2 o 10 mL para un frasco de 75 cm2 ). Añadir tripsina (0,5 mL de 25 cm2 o 1 mL para un frasco de 75 cm2 ) e Incube las células a 37 ° C durante 5 minutos.
- Compruebe separación de células bajo un microscopio y neutralizar la enzima de disociación celular con medio completo del Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL de 25 cm2 o 20 mL para un frasco de 75 cm2 ).
- Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces con 5 mL de medio RPM1 1640 completo.
- Contar las células mediante exclusión del azul tripán en un contador de células compatibles.
- Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender en Medio RPMI para obtener 5 x 103 células/mL.
- Transferir la suspensión a un depósito estéril y dispensar 200 μL/pocillo en un 96-bien alrededor de las placas inferiores utilizando una pipeta multicanal.
- Transferir la placa al aparato de proyección de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
- Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione Programa para adquirir | Lanzamiento añadir buque | Exploración en calendario | Crear buque: nuevo.
-
Seleccione Análisis tipo: esferoide. Seleccionar los canales de interés: fase + Brightfield (para seguir el crecimiento de esferoides), verde (para seguir la señal del tumor, adquisición tiempo 300 ms) y rojo (para seguir el apoptosis, adquisición tiempo 400 ms).
- Seleccione la deseada ampliación: 10 x.
- Elige el modelo de placa y su posición en el cajón. Seleccione la posición de los pozos a la imagen. Escriba la descripción del experimento: nombre, tipo de células, número de células.
- Para la configuración de análisis, seleccione Diferir el análisis hasta más tarde. Haga clic derecho sobre la línea de tiempo y seleccione la opción Set seleccionado analizar grupo intervalo y establecer añadir exploraciones cada a 4 h y un total de 24 h. ajustar la hora de inicio deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de proyección de imagen automatizado).
-
Iniciar sesión en el software de imágenes para comprobar cada 2 días para el crecimiento de esferoides.
- Elija la opción Más reciente explora y haga doble clic en el experimento deseado. Seleccione trasmitida en el panel de canales de imagen y luego utilice la herramienta de características de imagen de medida para medir el diámetro de los esferoides. Tarda 6 días para un esferoide alcanzar el tamaño deseado: 0,5 mm de diámetro. Añadir 50 μl de Medio RPMI completo por pozo en el día 4 para limitar el efecto de evaporación media.
2. generación de células CD19 coche T
-
Expansión de células CD19 coche T
Nota: La expresión estable de células CD19 coche T fue adquirida por transducción retroviral a granel del donante sano PBMCs como se describió anteriormente16. La codificación del constructo retroviral para CD19 coche es un coche de segunda generación y consiste en fmc63 fragmentos cadena, bisagra de CD8 y dominio transmembrana, un dominio coestimuladoras 4-1BB y finalmente un dominio de CD3ζ.- Para expandir, cultura T transduced las células en presencia de bolas magnéticas anti-CD3/28 con un celular a proporción de grano de 1:1 para 10-11 días. Durante la expansión, las células están en medio completo (VIVO X 15, 5% suero de reemplazo y IL-2 humana recombinante de 100 U/mL).
Nota: La densidad ideal para una expansión eficaz es de 1 a 2 x 106 células/mL. Dependiendo del número inicial, las células pueden ampliarse en frascos (frascos de 25 cm2 a 20 mL, frascos de 75 cm2 a 40 mL de volumen total) en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad). - Como grupo de control negativo para los siguientes ensayos, son no-transduced PBMCs (se hará referencia como Mock) en el protocolo de expansión paralelo a las células CD19 coche T.
- El día 3, añadir medio fresco cada día y las células se dividen en frascos de cultivo más si es necesario.
- Día 10 – 11, centrifugar las células a 500 x g por 5 min Quite el sobrenadante y combinar todas las celdas en un tubo de 50 mL y resuspender las células en 30 mL de medio completo fresco.
- Coloque el tubo de 50 mL que contiene las células resuspendidas en un soporte magnético para separar las bolas magnéticas en el medio de cultivo.
- Espere de 2 a 3 minutos para las cuentas a cobrar en el lado del tubo.
- Retire el medio de cultivo con una pipeta y transfiéralo a un tubo nuevo sin tocar las zonas de recogida de grano magnético.
- Repita los pasos con respecto a la eliminación de grano (2.1.5–2.1.7) una vez más para limitar el número de granos en el medio de cultivo final.
- Resuspender y contar las celdas, ajustar la densidad a 1 ó 2 x 106 células/mL en medio completo.
- Resto de las células de al menos 4 h hasta la noche. Directamente les congelar abajo a-80 ° C y transferir los frascos a un tanque de nitrógeno líquido en el día siguiente para almacenamiento a largo plazo. Alternativamente, uno puede prolongar el resto hasta la noche para su uso inmediato.
- Para expandir, cultura T transduced las células en presencia de bolas magnéticas anti-CD3/28 con un celular a proporción de grano de 1:1 para 10-11 días. Durante la expansión, las células están en medio completo (VIVO X 15, 5% suero de reemplazo y IL-2 humana recombinante de 100 U/mL).
-
Control de la expresión de CD19 coche en células T primarias
- Contar el número de células T ampliadas como los números pueden variar un poco después de la cultura durante la noche o moderado después de la congelación/descongelación.
- Transferencia de 5 x 105 células de ambos coches de CD19 y mofa de las células T primarias para separar los tubos de citómetro de flujo.
- Lavar las células con 200 μL de tampón de flujo (2% FBS en PBS) y centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 minutos repiten los pasos de lavado para eliminar cualquier artefactos causados por el medio de cultivo.
- Preparar el anticuerpo primario (biotina cabra anti-ratón IgG, F(ab') ₂ fragmento específico) al realizar la dilución 1: 200 en flujo tampón.
- Resuspender las células en 100 μL de la mezcla de anticuerpos por el tubo e incubar en hielo por 15 minutos Repita el paso anterior de lavado dos veces para quitar exceso del anticuerpo.
- Preparar el anticuerpo secundario (estreptavidina-PE) como dilución 1: 400 en flujo tampón.
- Resuspender las células en 100 μL de la mezcla de anticuerpos por el tubo e incubar en hielo para 15 minutos Repita el paso anterior de lavado dos veces para eliminar el exceso del anticuerpo.
- Resuspender las células en 200 μL de tampón de flujo por tubo y analizar en un citómetro de flujo.
- Utilizamos las células de T burlan la puerta negativa y positiva y analizar CD19 coche transduced las células de T por consiguiente.
3. 3D Tumor esferoide asesinato ensayo
-
Después de 6 días o una vez esferoides alcance el tamaño deseado, retire la placa de la incubadora. Usando una pipeta multicanal, suavemente Retire 100 μL/pocillo de medio RMPI 1640 completo de las placas de esferoide.
- Para este paso, ángulo de las puntas hacia el interior pared de la placa de 96 pozos, evitando el contacto con el fondo del pozo con el fin de minimizar la alteración de los esferoides. Restante de volumen debe ser alrededor de 100 μl.
- Preparar una solución de 1: 200 de anexina V rojo mezclando 50 μl de anexina V rojo con 9,95 mL de Medio RPMI 1640 completo.
- Añadir 100 μL/pocillo de la solución de la anexina V rojo de 1: 200.
- Transferir la placa a una incubadora (37° C, 5% CO2, 95% de humedad) de 15 minutos.
- Cosechar las células CD19 del coche T transduced en un tubo de 15 mL y centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces con 2 mL de medio RPM1 1640 completo.
- Contar las células mediante exclusión del azul tripán en un contador de células compatibles.
- Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender en Medio RPMI para obtener 2 x 105 células/mL.
- Transferir la suspensión a un depósito estéril y dispensar 100 μL/pocillo en un 96-pozo redondo inferior esferoide placa con una pipeta multicanal.
- Transferir la placa al aparato de proyección de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
-
Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione programa para adquirir.
- Haga clic en la línea de tiempo de exploración y seleccione Editar línea de tiempo. Haga clic derecho en el grupo de exploración y elimínelo. Haga clic en la línea de tiempo y seleccione la opción Set seleccionado analizar grupo intervalo y añadir exploraciones cada a 1,5 h y para un total de 24 h.
- Establezca la hora inicial deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de proyección de imagen automatizado). Seleccione guardar análisis de programación.
4. Análisis de la imagen automatizado
- Ingresa en adquisición, escoger la opción Más reciente explora y seleccione la opción Iniciar análisis . Seleccione crear nueva definición de análisis | Tipo de análisis: esferoide. Marque los canales de imagen para analizar (fase + Brightfield, verde y rojo).
- Seleccionar al menos 10 imágenes representativas: por lo general, 1 por estado y por lo menos 3 puntos del tiempo (principio, medio y final de la adquisición).
- Vista previa por defecto analizar procedimiento en la pila de toda la imagen.
- Modificar los parámetros para la máscara del brightfield. Parámetros típicos son: sensibilidad 10, agujero relleno 1.000 μm2, min area 1.000 μm2. Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.
- Modificar los parámetros de la máscara verde (GFP). Parámetros típicos son: segmentación de sombrero con radio 200 μm y umbral 3 GCU, borde escindido, agujero llenar 5.000 μm2, ajuste tamaño -2 píxeles, área mínima 3.000 μm2. Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.
- Modificar los parámetros de máscara roja (anexina V). Parámetros típicos son: segmentación de sombrero con radio 150 μm y umbral 2 GCU, borde escindido, agujero llenar 5.000 μm2, ajuste tamaño 0 pixeles, área mínima 1.000 μm2. Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.
-
Inicie el analizador.
- Una vez hecho el análisis, extraer la medición de interés. Seleccione el archivo analizado y luego la opción Gráfico de mediciones . Seleccionar las métricas de interés, la exploración y el pozo. Normalmente, total intensidad de roja y verde dentro de los límites de brightfield dar las medidas más precisas mediante la restricción de la señal de fluorescencia a los límites de esferoides determinado por la máscara de brightfield (figura 3). Extracto de las métricas en varios formato haciendo clic en "Exportar datos".
- Proceder a la extracción de las imágenes y películas seleccionando el archivo analizado y luego seleccione la opción exportar imágenes y películas . Dos opciones están disponibles, ya sea "como muestra" para recuperar imágenes y películas como visto en el software de proyección de imagen (imágenes compuestas generalmente), o "almacenada" para recuperar datos de raws para análisis externo a través de software de tercera parte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Como puede verse en la figura 1, es crucial para controlar mediante citometría de flujo, el nivel de expresión de CD19 en células T (figura 1A) y el nivel de CD19 en líneas celulares de tumor HCT116 (figura 1B). Figura 2 ejemplifica el resultado de un experimento típico del esferoide. El aparato de proyección de imagen automatizado toma fotografías en cuatro canales diferentes: campo claro, fluorescencia de la fase, verde y rojo. Canal de fase se utiliza para afirmar la formación de esferoides mostrando límites alto contrastadas cerca de los esferoides (que es un signo de formación esferoide). Campo brillante se utiliza durante el proceso de análisis para detectar el tamaño de los esferoides y restringir la señal verde (tumor) y la señal roja (apoptosis) de los límites antes mencionados. Permite no considerar eventos no relacionados directamente con esferoides (las células del tumor por ejemplo aislado y su apoptosis). Líneas verdes y rojas representan señales rojo y verdes respectivamente, consideradas en el cálculo de métricas. En la figura 2, campo claro, canales rojo, verde y fase se obtuvieron a través de la opción "como" mientras que las imágenes compuestas fueron extraídas a través de la opción "Como aparece" y son representativos de los parámetros de la muestra en la figura 3. Como puede verse en la figura 2, a diferencia de las células T se burlan, células CD19 coche T fueron capaces de matar específicamente a los esferoides y disminuir grandemente el número de células del tumor vivo.
Figura 3 muestra la evolución del total verde y roja señal medida dentro de los límites del esferoide en el tiempo. Como puede verse, poco después de la inyección de células CD19 coche T, tamaño de los esferoides se contrae rápidamente (medida por la señal de fluorescencia verde) y aumenta rápidamente (según lo medido por la señal de fluorescencia roja) de la señal de las apoptosis.
Figura 1: superficie de expresión de la coche de CD19 CD19. (A) superficial expresión de CD19 en células de T retrovirally transduced. Las células fueron analizadas por citometría de flujo antes del ensayo de esferoide via biotinilado anti anti-ratón Fab como primaria y anti-estreptavidina-PE como anticuerpo secundario. (B) la expresión superficial de CD19 en células HCT116 retrovirally transduced. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: evaluación de la citotoxicidad de células CD19 coche T contra esferoides tumorales. Lapso de tiempo de crecimiento de esferoide HCT116; en t = 138 h, Mock o CD19 coche T las células fueron introducidas a una densidad de 20000 células/pocillo. Señal verde corresponde a las células HCT116 GFP + y contorno verde corresponde a la esferoide detectado. Señal roja corresponde a la apoptosis como supervisado por anexina V y contorno de color rojo corresponde a los eventos de apoptosis detectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: mediciones de total de la señal rojo y verde en brightfield máscara de límites en el tiempo. Total señales rojas y verdes dentro de parámetros de máscara de brightfield fueron obtenidas después de analizados y graficados en función del tiempo. Línea punteada corresponde a la introducción de células efectoras (CD19CAR o Mock T-cells). Medida corresponde a la media ± SEM (n = 12). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El uso de esferoides como una innovadora herramienta para validar el tratamiento futuro contra el cáncer se ha convertido en un campo de creciente interés en los últimos años. Esferoides representan un paso intermedio entre el clásico 2D análisis in vitro y en vivo. El método más sostiene una gran promesa en cuanto a su potencia en términos de tumor micro-ambiente imitando así como gene perfiles7. El protocolo presentado en esta publicación es una adaptación del Saheen et al11 el S3 Incucyte y representa un método asequible y fácil para producir esferoides 3D tumor de células colorrectales. Generación de esferoide a un dispositivo de proyección de imagen de alto rendimiento de acoplamiento permite confiable y rápida detección de una amplia gama de agentes antitumorales y supervisar la capacidad del mencionado agente para desestabilizar la estructura del tumor.
Hay varios pasos críticos a tener en cuenta con respecto a este protocolo. En primer lugar, el número inicial de células del tumor debe ajustarse precisamente. Si la densidad celular inicial es demasiado alta, las células degradarán el PLL de la capa rápidamente y comenzará a formar una monocapa adherente. Por otra parte, un número bajo de células presenta una alta variabilidad en cuanto a tamaño del esferoide y el número de esferoides por pozo. En segundo lugar, el uso de un dispositivo de proyección de imagen automatizado es exponer las células potenciales fototoxicidad (sobre todo si se utilizan varios canales de fluorescencia); se recomienda ajustar la frecuencia de imagen para reducir al mínimo el daño a los esferoides. Es un parámetro crítico a considerar con el fin de capturar los eventos de interés confiablemente (una imagen cada 4 horas antes de la introducción de células efectoras y uno cada 90 min después representa el mejor compromiso a nuestro conocimiento). En tercer lugar, se recomienda ser especialmente cuidadoso para evitar la evaporación media que puede ocurrir pocos días después de la introducción de células efectoras. En cuarto lugar, el número de efector células deben también ajustarse precisamente: el número debe ser lo suficientemente alto como para matar a esferoides tumorales eficientemente pero también tan bajo como sea posibles permitir que el mayor potencial para el proceso de proyección de imagen óptima. En quinto lugar, en un experimento típico, un pozo contiene esferoides de 2 a 4 que pueden fusionarse en uno; se recomienda prestar atención a posibles picos que pueden estallar en las mediciones después de este evento y los desprecian. En sexto lugar, en una placa de 96 pocillos, en promedio 20 a 50 pozos contienen esferoides en número y tamaño; se recomienda comprobar los pozos a considerarse para el análisis antes de la introducción de las células efectoras se va a ahorrar tiempo de cálculo. Finalmente, el análisis está parcialmente automatizado pero requiere algunas entradas del usuario con respecto a los diferentes parámetros. Se recomienda tener especial cuidado en este paso y centrarse en el equilibrio entre sensibilidad y especificidad. Si el tipo de tratamiento de drogas células efectoras difiere ampliamente dentro de un experimento, podría ser necesario ejecutar diferentes tipos de análisis para seleccionar uno que se adapte lo mejor.
Este método es hasta ahora sólo se limita a un determinado tipo de células adherentes (en esta publicación HCT 116); desarrollo se necesita adicional para generalizar este protocolo para cada línea de células cancerosas. Aunque una amplia gama de métodos ya está disponible para un mayor número de blanco las células12,13,14,15, la mayoría de ellos se basan en el uso de costosos y complejos procedimientos. Nuestro método, aunque limitada a unos pocos tipos de células diana hasta ahora, es interesante ya que requiere insumos muy limitados desde el experimentador y permite una rápida y fácil la pantalla de varios fármacos o tratamientos de inmunoterapia (células de CD19 coche aquí). Su fiabilidad y su capacidad para adaptarse a diferentes tipos de tratamientos hacen este método una herramienta de gran alcance en el contexto del proceso de validación de tratamiento contra el cáncer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Consejo de investigación noruego bajo becas #244388, 254817 # y #284983; la sociedad de cáncer Noruega (#6829007); La región de salud de Noruega del sudeste bajo la subvención #17/00264-6 y #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
