Summary
Bu iletişim kuralı immunotherapeutic yeniden yönlendirilen T-hücre (araba T-hücreli) sitotoksisite karşı 3D yapılandırılmış kanserli hücreleri (pulcuklarının) gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için tasarlanmıştır.
Abstract
İmmünoterapi Aksi takdirde tedavi edilemez kansere karşı mücadele büyüyen ilgi alanı haline gelmiştir. Tüm immunotherapeutic Yöntemler arasında en çarpıcı sonuçlar, özellikle Pediatrik B akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ile elde edilen T hücreleri chimeric antijen reseptör (araba) yönlendirildi. Klasik doğrulama yöntemleri araba T hücrelerinin özgüllük kullanımı ve işlevselliği deneyleri hedef hücrelere süspansiyon ve xenograft modelleri karşı araba T hücrelerinin güveniyor. Ne yazık ki, tüp bebek yapılan gözlemleri kez vivo içinde elde edilen sonuçlar üzerinden decoupled ve çok çaba ve hayvanların bir adım daha ekleyerek bağışladı: 3D kültür kullanımı. Onlar hayvan modeli engrafted yükleyen tümör hücreleri 3D yapısını taklit potansiyel hedef hücrelere pulcuklarının üretim ideal bir alternatif temsil eder. Burada, evlat edinen hücre tedavisi (burada CD19 araba T hücreleri tarafından örneği) için bir doğrulama aracı olarak bir transduced kolorektal hücre satırından pulcuklarının üretmek için uygun fiyatlı, güvenilir ve kolay bir yöntem raporu. Bu yöntem küresel büyüme takip edebilirsiniz bir Gelişmiş canlı görüntüleme sistemi ile birleştiğinde, sitotoksisite ve tümör hücre apoptosis efektör hücreleri.
Introduction
Evlat edinen hücre aktarımı (ACT) yeni nesil kanser muamele temsil eder. Efektör hücreler (T - veya NK-hücreleri) enjeksiyon bir hasta dayanmaktadır. Bu hücrelerin genetik olarak onlara onların hedefe, tümör, rehberlik ve onu yok bir reseptör ile değiştirilebilir. Son zamanlarda bu yaklaşım B-hücre işaretçisi CD19 karşı yönetmen Chimeric antijen reseptör (araba) hasta T hücreleri seçtiğin bu kullanıcı kanser1öldürmeye tanıttığında mümkün olduğu gösterilmiştir. Yapay bir reseptör olan araba söz konusu olduğunda tasarım spesifik antikor parçaları bir varlık belirlenmiş tek zincir değişken parçası (scFv), azaltılmış etki alanı bağlama antijen oluşur T-hücre sinyal etki alanlarına bağlı. Çeşitli tasarımlar olmakla birlikte, ikinci nesil araba tasarımları TCR sinyal için CD3z ve co-stimulatory etki alanı oluşur anılacaktır en çok kullanılan sürümleri (CD28, 4-1BB, OX40, vs.) 1 , 2. ne zaman CD19 araba-T hücreleri efficaciously B hücre maligniteler3,4ile çok sayıda hasta tedavi immünoterapi alan Yasası'nın bu yeni form dikkatini çoğunu yönetmen. Bu başarının, araştırmacılar diğer epitopları için sınırlı başarı ile solid tümör hedefleyerek benzer tasarımlar yararlanmaya çalıştı. Ne yazık ki, tümör belirli antijenleri ve araba T işlenen sert tümör microenvironments kıtlığı daha az etkili solid tümör5doğru hücreleri.
Şu anda, en sık kullanılan vitro doğrulama stratejileri yalnızca bir parçası zaten belirtilen solid tümör zorlukların adres iki boyutlu (2D) sistemleri üzerinde güveniyor. Klasik, 2D vitro sistemleri bu efektör hücreler özgüllük ve işlevlerinin değerlendirmek için monolayers araba T hücreleri ve hedef kanser hücre satırlarını içerir. Bu stratejileri önemli ve hayati parçaları çalışmaların olmakla birlikte, onlar karmaşık Morfoloji ve kanser hücreleri6üç boyutlu (3D) yapısını göz önünde değil. 3D sistemleri pulcuklarının anılacaktır, kültürlü kanser hücrelerinin yeni fenotipik özellikleri tanıma yeniden yönlendirilen efektör hücreleri tarafından etkisi gen ifade profil7, hangi değişiklikleri yoluyla elde. Birgersdotter ve arkadaşları bir Hodgkin Lenfoma (HL) hücre satırı yalnızca bir 3D kültür modelinde yetiştirilen birincil tümör örnekleri8' e benzer bir gen ifade profil tutar gösterdi. Bu nedenle, pulcuklarının veya benzer 3D metodolojileri teklif Standart 2D sistemleri karşı in vitro modellerinde daha alakalı kültür. Bu tür sistemlere de verilen bir araba doğrulama sürecindeki son adım olarak görülen içinde vivo çalışmalar benzer. 2D sistemleri kanser kümeleri morfolojisi taklit etmek başarısız göz önüne alındığında, pulcuklarının araba T hücreleri önce işlevselliğini değerlendirmek için benzer oluşumlar teklif içinde vivo modelleri. Bir çalışmada, Pickl vd. tanımlanan insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (HER2) kanser hücrelerinin overexpressing bir küresel model benzer sinyal profilleri içinde vivo modelleri9gösterdi. Bunu daha fazla pulcuklarının araba T hücrelerinin daha alakalı ve Kapat ve içinde vivo değerlendirme teklif destekler. Ayrıca, araba T-hücre doğrulama pulcuklarının karşı daha eleştirel onların etkinliğini değerlendirmek ve bazı tasarımlar içinde vivo çalışmalar için erken hareket etmesini önlemek yardımcı olabilir10; Böylece, etik ilgili araştırma için daha az sayıda hayvan kurban ederek katkıda. Ayrıca, pulcuklarının kullanarak iletişim kuralları klasik 2D sistemleri daha ve çok daha hızlı klasik içinde vivo çalışmalar ile karşılaştırıldığında daha pahalı değildir. Birlikte ele alındığında, tüp bebek ve içinde vivo çalışmalar bağlamak için standart bir uygulama haline yakında küresel çalışmalar dahil kimse tahmin edebilirsiniz.
Burada, kolon kanseri hücre satırından HCT 116 pulcuklarının hazırlanması mevcut. Bu hücre kültürünü insan CD19 molekül CD19 araba T hücreleri hassas işlemek için ve klinik olarak doğrulanmış bir araba inşa kullanarak öldürme net bir değerlendirme sağlamak için hızlı şekilde değiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nesil pulcuklarının kolorektal kanser hücre satırından
- Yıkama HCT 116 (farklılaşma 19 küme (CD19) ve yeşil floresans Protein (GFP) ifade etmek için stabil transduced) hücre monolayers fosfat ile arabelleğe alınmış serum (PBS; 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 10 mL 5 mL). Tripsin (0.5 mL 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 1 mL) ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- Hücre dekolmanı mikroskop altında kontrol ve hücre ayrılma enzim tam Roswell Park Memorial Enstitüsü 160 Orta (RPMI 1640) ile nötralize (RPMI 1640 + %10 FCS + viomisin; 10 mL 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 20 mL).
- Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez 5 mL ile tam RPM1 1640 orta pipetting tarafından resuspend.
- Uyumlu cep tezgahta Trypan mavi dışlama kullanarak hücreleri saymak.
- Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve 5 x 103 hücre/mL elde etmek için RPMI ortamda resuspend.
- Hücre süspansiyon için steril bir rezervuar aktarmak ve bir çok kanallı pipet kullanarak alt tabaklar yuvarlak bir 96 kuyuya 200 µL/iyi dağıtmak.
- Plaka otomatik görüntüleme cihazları bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) içeri aktarın.
- Oturum alma yazılımı içine, Zamanlama için alması seçin | Başlat Ekle gemi | Zamanlamaya göre tarama | Gemi oluşturun: yeni.
-
Tarama türü seçin: küresel. Faiz kanalları seçin: faz + (pulcuklarının büyüme takip için) aydınlık alan, (tümör sinyal takip etmek, satın alma zaman 300 ms) yeşil ve kırmızı (apoptosis izleyin, satın alma vakti 400 ms).
- İstediğiniz büyütme seçin: 10 x.
- Plaka modeli ve çekmeceyi konumunu seçin. Wells görüntü konumunu seçin. Deneme açıklamasını girin: adı, tipi hücre, hücre sayısı.
- Analiz kurulum için Erteleme analiz kadar daha sonraseçin. Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatın ve Grup aralığı tarama ayarla seçili seçeneği seçin ve ayarla eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 4 h ve için toplam 24 h için ayarlamak istediğiniz başlangıç saatini (en az 1 h otomatik görüntüleme cihazları kuluçka sonra).
-
2 günde pulcuklarının büyümesi için logging içine görüntüleme yazılımı ile kontrol edin.
- Görünüm son tarar seçeneği seçin ve istenen deney üzerinde çift tıklatın. Aydınlık alan görüntü Kanallar panelinde seçin ve ardından pulcuklarının çapını ölçmek için Ölçü resim özellikleri aracını kullanabilirsiniz. İstediğiniz boyuta ulaşmak bir küresel 6 gün sürer: 0,5 mm çapında. Tam RPMI orta iyi başına 50 µL orta buharlaşma etkisi sınırlamak için 4 gün ekleyin.
2. nesil CD19 araba T hücreleri
-
Genişleme CD19 araba T hücreleri
Not: CD19 araba T hücrelerinin istikrarlı ifade yukarıda açıklanan16olarak sağlıklı donör PBMCs toplu retroviral iletim tarafından satın alınmıştır. Retroviral yapı CD19 araba için kodlama ikinci nesil bir araba ve fmc63 scFv zincir, CD8 menteşe ve transmembran etki alanı, bir 4-1BB co-stimulatory ve bir CD3ζ etki alanı sonunda oluşur.- Genişletmek için kültür transduced T anti-CD3/28 manyetik boncuklar huzurunda bir hücre boncuk oranı 1:1 ile 10-11 gün boyunca hücreleri. Genişleme sırasında tam ortamda hücrelerdir (X-VIVO 15, %5 Serum değiştirme ve 100 U/mL rekombinant insan IL-2).
Not: İdeal verimli bir genişleme için 1-2 x 106 hücre/mL yoğunluğudur. Bağlı olarak ilk sayı, hücre hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) şişeler (25 cm2 şişe 20 ml, 75 cm2 şişe toplam hacminin 40 ml) genişletilebilir. - Aşağıdaki deneyleri için negatif kontrol grubu, Sigara transduced PBMCs CD19 araba T hücrelere paralel genişletme Protokolü (sahte anılacaktır) içerir.
- 3. gün tarih ve ileriye doğru her gün taze orta eklemek ve gerekirse daha fazla kültür şişeler hücreleri bölmek.
- Günde 10-11, 500 x g 5 dakika süreyle santrifüj hücreleri süpernatant kaldırmak ve bir 50 mL tüp içine tüm hücreleri birleştirmek ve ~ 30 mL taze tam medya hücrelerde resuspend.
- Manyetik boncuklar kültür ortamından ayırmak için manyetik bir stand resuspended hücreleri içeren 50 mL tüp yerleştirin.
- 2-3 dk tarafında tüp toplamak boncuk için bekleyin.
- Bir pipet ve yeni bir tüp transferi ile kültür orta manyetik boncuk toplama bölgelere dokunmadan kaldırın.
- Bir kez daha son kültür ortamı boncuklar sınırlamak için boncuk kaldırma (2.1.5–2.1.7) ile ilgili adımları yineleyin.
- Resuspend ve hücreleri saymak, yoğunluğu 2 x 106 hücre/ml tam orta 1'e ayarlayın.
- Hücrelerin en az 4 gece kadar s için tuttuğunuz. Sonra doğrudan bunları-80 ° C'de dondurmak ve uzun süreli depolama için ertesi gün bir sıvı azot tankı şişeleri aktarın. Alternatif olarak, bir dinlenme ilâ gecede acil kullanım için uzatmak.
- Genişletmek için kültür transduced T anti-CD3/28 manyetik boncuklar huzurunda bir hücre boncuk oranı 1:1 ile 10-11 gün boyunca hücreleri. Genişleme sırasında tam ortamda hücrelerdir (X-VIVO 15, %5 Serum değiştirme ve 100 U/mL rekombinant insan IL-2).
-
CD19 araba ifade denetimde birincil T hücreleri
- Sayıları biraz donma/çözülme orta veya gecede kültür sonra farklı olabilir gibi genişletilmiş T hücreleri sayar.
- 5 x 105 hücreleri her iki CD19 araba ve akış sitometresi tüpler ayırmak için sahte birincil T hücreleri aktarın.
- Hücreler akışı arabelleğe 200 μL ile yıkayın (%2 PBS FBS) ve santrifüj tüpleri 500 x g 5 dakika süreyle de kültür medyum tarafından neden olduğu herhangi bir eserler kurtulmak için çamaşır adımları yineleyin.
- Birincil antikor (Biotin keçi Anti-fare IgG, F(ab') ₂ parça belirli) akış arabellek 1: 200 seyreltme gerçekleştirerek hazırlayın.
- Antikor Mix tüp başına 100 μL hücrelerde resuspend ve 15 dk. tekrarlamak için iki kez aşırı antikor kaldırmak için önceki çamaşır adım buz üzerinde kuluçkaya.
- 1: 400 seyreltme arabelleği akış olarak ikincil antikor (Streptavidin-PE) hazırlayın.
- Antikor Mix tüp başına 100 μL hücrelerde resuspend ve 15 dk. tekrarlamak için iki kez aşırı antikor kurtulmak için önceki çamaşır adım buz üzerinde kuluçkaya.
- Akış arabellek 200 μL tüp başına hücrelerde resuspend ve bir akış sitometresi çözümleyebilirsiniz.
- Negatif ve pozitif geçidi ayarla ve CD19 araba çözümlemek için kullanım alay T hücreleri T hücreleri buna göre transduced.
3. 3D tümör küresel öldürme tahlil
-
6 gün sonra veya bir kez pulcuklarının istediğiniz boyuta ulaşmak, plaka kuluçka makinesi kaldırın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, küresel plakalar 100 µL/iyi tam RMPI 1640 orta yavaşça çıkarın.
- Bu adımda, ipuçları içine doğru açı duvar pulcuklarının rahatsızlık en aza indirmek için kuyunun ile temas kaçınarak 96-wells plaka. Birim kalan yaklaşık 100 µL olmalıdır.
- V kırmızı Annexin 1: 200 çözeltisi 50 µL v kırmızı Annexin tam RPMI 1640 orta 9.95 mL ile karıştırarak hazırlayın.
- V kırmızı Annexin çözüm 1: 200, 100 µL/iyi ekleyin.
- Plaka 15dk için bir kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) aktarın.
- 15 mL tüp ve onlara 500 x g 5 dakika süreyle bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez 2 mL ile tam RPM1 1640 orta pipetting tarafından resuspend santrifüj transduced araba CD19 T hücrelerinde hasat.
- Uyumlu cep tezgahta Trypan mavi dışlama kullanarak hücreleri saymak.
- Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve 2 x 105 hücre/mL elde etmek için RPMI ortamda resuspend.
- Hücre süspansiyon için steril bir rezervuar aktarmak ve bir çok kanallı pipet kullanarak alt küresel plaka yuvarlak bir 96 kuyuya 100 µL/iyi dağıtmak.
- Plaka geri otomatik görüntüleme cihazları bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) içeri aktarın.
-
Satın alma yazılımı içine oturum, için zamanlama alması seçin.
- İnceden inceye gözden geçirmek zaman çizelgesini sağ tıklatıp Zaman çizelgesi düzenlemek. Tarama grubu sağ tıklatın ve silin. Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatın ve Grup aralığı tarama ayarla seçili seçeneği seçin ve ayarla eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 1,5 saat ve Toplam için 24 h için.
- İstenen başlangıç saatini (en az 1 h otomatik görüntüleme cihazları kuluçka sonra) ayarlayın. Zamanlama taramalarıseçin.
4. otomatik görüntü analizi
- Edinme oturum, Görünümü son tarar seçeneği seçin ve Analiz Başlat seçeneğini belirleyin. Yeni analiz tanımı oluşturmak seçin | Analiz türü: küresel. (Faz + aydınlık alan, yeşil ve kırmızı) çözümlemek için resmin kanallarını kene.
- En az 10 temsili resim seçin: genellikle, koşul ve en az 3 saat puan (başlangıç, orta ve satın alma) başına 1.
- Önizleme varsayılan yordam tüm görüntü yığını üzerinde analiz.
- Aydınlık alan maskesi parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: duyarlılık 10, delik Dolgu 1000 µm2, min alan 1000 µm2. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.
- Yeşil maske (GFP) parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: silindir şapkalı bölümleme RADIUS 200 µm ve eşik 3 delik doldurmak 5000 µm2, ayar boyutu -2 piksel, alanı en az 3.000 µm2, kenar GCU, bölünmüş kapalı. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.
- Kırmızı maske (Annexin V) parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: silindir şapkalı bölümleme RADIUS 150 µm ve eşik 2 delik doldurmak 5000 µm2, ayar boyutu 0 piksel, alan dk 1000 µm2, kenar GCU, bölünmüş kapalı. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.
-
Analyzer'ı Başlat.
- Analizi yapıldıktan sonra faiz ölçümü ayıklayın. Parçalanmış dosya ve sonra Grafik ölçülerini seçeneği seçin. Faiz, tarama ve iyi ölçümleri seçin. Tipik olarak, aydınlık alan sınırları içinde toplam kırmızı ve yeşil yoğunluğu aydınlık alan maskesi (Şekil 3) kullanılarak belirlenen pulcuklarının sınırlarına floresans sinyalinin kısıtlayarak en doğru ölçümler vermek. Birkaç dosya biçiminde seçilen ölçümleri "Veriüzerinde" tıklatarak ayıklayın.
- Resim ve film ayıklama analiz dosya seçerek devam edin ve görüntüleri dışa aktar ve film seçeneği seçin. İki seçenek kullanılabilir ya da "olarak düşsel bilgisayar yazılımı (genellikle bileşik görüntüler), her iki"olarak üçüncü bölümü yazılım aracılığıyla dış analiz için ham veri almak için depolanan"görülen"al resim ve film için olarak görüntülenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1' de görüldüğü gibi bu akış sitometresi tarafından ifade CD19 arabanın T hücreleri (Şekil 1A) ve CD19 düzeyde HCT116 tümör hücre hatları (Şekil 1B) kontrol etmek önemlidir. Şekil 2 bir tipik küresel denemenin sonucu örneğidir. Otomatik görüntüleme cihazları dört farklı kanalları fotoğraf çeker: parlak alan, faz, yeşil ve kırmızı Floresans. Faz kanal pulcuklarının oluşumu (küresel oluşumu belirtisi olan) pulcuklarının yakınındaki yüksek kontrastlı sınırları görüntüleyerek assert kullanılır. Parlak alan çözümleme işlemi sırasında pulcuklarının boyutunu tespit ve yeşil sinyal (tümör) ve kırmızı sinyal (apoptoz) için yukarıda belirtilen sınırları kısıtlamak için kullanılır. Bir doğrudan pulcuklarının (örneğin izole tümör hücreleri ve onların apoptoz) ilgisiz olaylar dikkate değil sağlar. Yeşil ve kırmızı ana hatlarını sırasıyla yeşil ve kırmızı sinyalleri ölçümlerini hesaplamaya kabul temsil eder. Oysa bileşik görüntüler "Olarak görüntülenen" seçeneği ile elde ve Şekil 3' te görüntülenen ölçümleri temsilcisi Şekil 2' de, parlak alan, "depolanmış olarak" seçeneği ile faz, yeşil ve kırmızı kanalları elde. Şekil 2' de, alay T hücreleri farklı olarak görülen CD19 araba T hücreleri özellikle pulcuklarının öldürmek ve büyük ölçüde canlı tümör hücrelerinin sayısını azaltmak başardık.
Şekil 3 toplam yeşil evrimi görüntüler ve kırmızı sinyal küresel sınırları içinde zaman içinde ölçülen. Görüldüğü gibi kısa bir süre CD19 araba T hücre enjeksiyon sonra (yeşil floresans sinyal ile ölçülen) hızlı bir şekilde pulcuklarının boyutu küçülür ve Apoptozis arttıkça hızlı bir şekilde (kırmızı floresans sinyal göre ölçülen) sinyal.
Şekil 1: yüzey CD19 araba ve CD19 ifade. (A)CD19 araba retrovirally transduced T-hücreleri üzerinde yüzey ifadesidir. Hücreleri akış sitometresi küresel tahlil üzerinden mouse-Fab biotinylated olarak birincil ve ikincil antikor olarak anti-Streptavidin-PE önce tarafından analiz edildi. (B) retrovirally transduced HCT116 hücrelerde CD19 yüzey ifadesidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: CD19 araba T hücreli sitotoksisite tümör pulcuklarının karşı değerlendirilmesi. Zaman atlamalı HCT116 küresel büyüme; 138 h, t = sahte veya CD19 araba T hücre 20000 hücreler/iyi bir yoğunluk başlandı. Yeşil sinyal HCT116 GFP + hücrelere karşılık gelen ve yeşil anahat için tespit edilen küresel karşılık gelir. Kırmızı sinyal Annexin V tarafından izlenen apoptosis için gelir ve Kırmızı anahattı algılanan apoptosis olaylarına karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Toplam kırmızı ve yeşil sinyal içinde aydınlık alan ölçümleri maskesi sınırları zaman içinde. Aydınlık alan maskesi ölçüler içinde toplam kırmızı ve yeşil sinyalleri analiz ve zamanın bir fonksiyonu olarak çizilen sonra elde edilmiştir. Kesikli çizgi efektör hücreleri (CD19CAR veya sahte T-hücreleri) giriş karşılık gelir. Ölçü karşılık gelen ortalama ± SEM (n = 12). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelecekteki kanser tedavisi doğrulamak için yenilikçi bir araç olarak pulcuklarının kullanımı son yıllarda giderek artan ilgi alanı haline gelmiştir. Pulcuklarının klasik 2D tüp bebek analiz ve içinde vivo değerlendirme arasında bir ara adım temsil eder. Yöntemi daha fazla söz7profil oluşturma gen yanı sıra mikro-çevre tümörü taklit eden açısından onların potens ile ilgili bir çok tutar. Bu yayında sunulan Protokolü Saheen adapte vd.11 ' e Incucyte S3 ve 3D tümör pulcuklarının kolorektal hücre satırlarından üretmek için uygun maliyetli ve kolay bir yöntem temsil eder. Kaplin küresel nesil yüksek üretilen iş görüntü aygıtı için güvenilir ve hızlı anti-tümör ajanların geniş bir eleme izin verir ve yukarıda belirtilen Aracısı tümör yapısı istikrarsızlaştırmak yeteneği izlemek.
Bu iletişim kuralı ile ilgili dikkate almak için birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, tümör hücrelerinin başlangıç sayısı tam olarak ayarlanması gerekir. Başlangıç hücre yoğunluğu çok yüksek ise, hücreleri PLL düşer hızla kaplama ve bir yapisan monolayer kurmaya başlayacaktır. Öte yandan, az sayıda hücre küresel boyutu açısından yüksek bir değişkenliği ve iyi ücret pulcuklarının sayısı tanıtacak. İkinci olarak, otomatik bir görüntü aygıtı kullanımı (özellikle çeşitli floresan kanalları kullandıysanız) potansiyel fototoksisite hücrelere sunduğu; Bu pulcuklarının hasarı en aza indirmek için görüntü frekansını ayarlamak için tavsiye edilir. Güvenilir bir şekilde İlgilendiğiniz olayları yakalamak için düşünmeye kritik bir parametredir (her 4 saatte bir görüntü efektör hücre giriş ve bir daha önce her 90 dakika sonra bizim bilgi için en iyi temsil eder). Üçüncü olarak, bir kaç gün sonra efektör hücre giriş oluşabilir orta buharlaşma önlemek için özellikle dikkatli olmak öneririz. Dördüncü olarak, efektör sayısı da tam olarak ayarlanması gerekiyor hücreleri: istediğiniz sayıyı tümör pulcuklarının optimum görüntüleme işlemi için yüksek potansiyel izin vermek verimli, aynı zamanda düşük olarak mümkün olduğunca öldürmek için yüksek olması gerekiyor. Beşinci olarak, tipik bir deneyde, bir kuyunun içine bir birleşim 2-4 pulcuklarının içerir; Bu olay aşağıdaki ölçüler içinde patlak potansiyel sivri dikkat etmek ve onları göz ardı etmek önerilir. Altıncı, 96-şey plaka üzerinde ortalama 20-50 wells pulcuklarının istenen sayı ve boyutu içerir; hesaplama zaman kazandıracak gibi efektör hücreleri kullanılmaya başlamadan önce analiz için dikkate alınması gereken kuyu atmanızı öneririz. Son olarak, analiz kısmen otomatik ama bazı girişleri farklı parametreler ile ilgili olarak kullanıcıdan gerektirir. Bu adımda belirli bakım almak ve duyarlılık ve özgüllük arasında bir denge odaklanmak için önerilir. Efektör hücreler/uyuşturucu tedavisinin türü yaygın bir deney içinde farklıysa, en uygun olanı seçmek için analiz farklı türde çalıştırmak gerekli olabilir.
Bu yöntem şimdiye kadar sadece belirli bir tür yapisan hücre satırı (Bu yayın HCT 116); sınırlı daha fazla geliştirme her kanserli hücre satırı için bu protokolü genelleştirmek için gereklidir. Her ne kadar çok çeşitli yöntemler için hedef hücreler12,13,14,daha fazla sayıda mevcut zaten15, bunların çoğu pahalı ve/veya karmaşık prosedürleri kullanımı güveniyor. Deneyci çok sınırlı girdileri gerektirir ve çeşitli ilaçlar ve/veya immünoterapi tedavisi (burada araba CD19 hücreleri) hızlı ve kolay bir ekran verir gibi şimdiye kadar birkaç tip hedef hücreler için sınırlı olmasına rağmen bizim yöntem daha ilginçtir. Onun güvenilirlik ve onun yetenek çeşitli tedaviler için adapte için bu yöntem anti-kanser tedavisi doğrulama işlemi bağlamında güçlü bir araç olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser hibe #244388, #254817 ve #284983 altında Norveç Araştırma Konseyi tarafından desteklenen; Norveç Kanser Derneği (#6829007); Norveç Sağlık bölge Güney Doğu Grant #17/00264-6 ve #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
