Denne protokol er designet til at vurdere immunterapeutisk omdirigerede T-celle (bil T-celle) cytotoksicitet mod 3D struktureret kræft celler (spheroids) i realtid.
Immunterapi er blevet et område af voksende interesse i kampen mod kræft ellers uhelbredelige. Blandt alle immunterapeutisk metoder omdirigeret kimære antigen receptor (bil) T celler opnået de mest spektakulære resultater, navnlig med pediatric B-akut lymfoblastær leukæmi (B-ALL). Klassisk validering metoder af bil T celler er afhængige af brugen af specificitet og funktionalitet assays bil T celler mod målet celler i suspension og xenograft modeller. Desværre, bemærkninger, in vitro-er ofte afkoblet fra resultaterne i vivo og en masse indsats og dyr kunne være sparet ved at tilføje en anden skridt: brugen af 3D kultur. Produktionen af spheroids ud af potentielle target-cellerne, der efterligner 3D-struktur af tumorcellerne, når de er i aflægger i en dyremodel repræsenterer et ideelt alternativ. Her rapporterer vi en overkommelig, pålidelig og nem metode til at producere spheroids fra en transduced kolorektal cellelinie som en efterprøvelse værktøj for adoptivforældre celleterapi (eksemplificeret her af CD19 bil T-celler). Denne metode er kombineret med et avanceret live imaging system, der kan følge klumpformet vækst, effektor celler cytotoksicitet og tumor celle apoptose.
Adoptivforældre celle overførsel (ACT) repræsenterer den næste generation kræftbehandling. Det er baseret på indsprøjtning af effektor celler (T – eller NK-celler) i en patient. Disse celler kan være genetisk modificerede med en receptor, der vil guide dem til deres mål, tumor, og ødelægge den. For nylig blev denne tilgang vist sig at være muligt, når en kimære Antigen Receptor (bil) rettet mod B-celle markør CD19 blev indført i patienten T celler til at dræbe sin kræft1. I tilfælde af CAR, som er en kunstig receptor, design består af specifikt antistof fragmenter, antigenet bindende domæne reduceret til en enhed udpegede enkelt kæde variable fragment (scFv), forbundet med T-celle signalering domæner. Selv om der er flere designs, de mest almindeligt anvendte versioner omhandlet som andengenerations bildesign, består af CD3z for TCR signalering og et co-stimulatory domæne (CD28, 4-1BB, OX40, osv.) 1 , 2. feltet immunterapi rettet de fleste af sin opmærksomhed mod denne nye form for handling, når CD19 bil-T celler efficaciously behandlet mange patienter med B-celle maligniteter3,4. Efter denne succes, forskere forsøgt at udnytte de lignende design ved at målrette andre epitoper for solide tumorer med begrænset succes. Desværre, knaphed på tumor gruppespecifikke antigener og de barskere tumor microenvironments gengives bil T celler mindre effektiv mod solide tumorer5.
I øjeblikket, stole de mest almindeligt anvendte i vitro validering strategier på todimensionelle (2D) systemer, der kun vedrører et fragment af de allerede nævnt solid tumor udfordringer. Klassisk, omfatter 2D in vitro- systemer en blanding af bil T-celler og target kræft cellelinjer som encellelag vurdering af funktionalitet og specificiteten af disse effektor celler. Selv om disse strategier er vigtige og vitale dele af undersøgelserne, tager de ikke hensyn til komplekse morfologi og tredimensionale (3D) struktur af kræft celler6. Kræftceller dyrkes i 3D systemer, omtales som spheroids, erhverve nye fænotypisk træk gennem ændringer i gen expression profil7, som kan påvirke anerkendelse af omdirigerede effektor celler. Birgersdotter og kolleger viste, at en Hodgkin lymfom (HL) cellelinie når kun dyrkes i en 3D kultur model erhverver en gen expression profil, der svarer til primær tumor prøver8. Derfor, spheroids eller lignende 3D kultur metoder tilbud mere relevant i vitro modeller i stedet for standard 2D systemer. Sådanne systemer er også svarer til in vivo-undersøgelser, som ses som det sidste trin i valideringsprocessen for en given bil. I betragtning af at 2D systemer ikke efterligne morfologi af kræft klynger, spheroids tilbyder lignende formationer for at vurdere funktionaliteten af bil T celler forud for in vivo modeller. I en undersøgelse, Pickl et al. konstateret, at en klumpformet model af human epidermal vækstfaktor receptor (HER2) overekspression kræftceller viste lignende signaling profiler til in vivo modeller9. Dette understøtter yderligere, at spheroids tilbyder mere relevante og afslutning-til-in vivo vurdering af bil T-celler. Derudover bil T-celle validering mod spheroids kan hjælpe med at vurdere deres effektivitet, mere kritisk og forhindre, at nogle af designene flytter til in vivo-undersøgelser for tidligt10; således bidrager til etisk berørte forskning ved at ofre færre dyr. Derudover er protokoller ved hjælp af spheroids ikke dyrere end klassisk 2D systemer og meget hurtigere i forhold til klassisk i vivo undersøgelser. Taget sammen, kan man forudsige, at medtagelsen af klumpformet undersøgelser snart vil blive standardpraksis at sammenkæde in vitro- og in vivo undersøgelser.
Vi præsenterer her, forberedelse af spheroids fra colon cancer cellelinie HCT 116. Denne cellelinje blev ændret for at udtrykke den menneskelige CD19 molekyle at gengive det følsomme over for CD19 bil T-celler og give en klar vurdering af aflivning ved hjælp af en klinisk validerede bil konstruktion.
Brugen af spheroids som et innovativt værktøj til at validere fremtidige kræftbehandling er blevet et område af voksende interesse i de seneste år. Spheroids repræsenterer en mellemting mellem klassisk 2D analyse af in vitro- og in vivo vurdering. Metoden yderligere holder en masse løfte om deres styrke i form af tumor mikro-miljø efterligne samt gen profilering7. Den protokol, der præsenteres i denne publikation blev tilpasset fra Saheen et al.11 til Incu…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det norske Forskningsråd under Grants #244388, #254817 og #284983; Norske Cancer Society (#6829007); Norske sundhed Region syd øst under Grant #17/00264-6 og #2016006.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |