Dit protocol is ontworpen voor het beoordelen van de immunotherapeutische omgeleide T-cel (auto T-cel) cytotoxiciteit tegen 3D gestructureerde kankercellen (spheroïden) in real-time.
Immunotherapie is uitgegroeid tot een gebied van de groeiende interesse in de strijd tegen kanker anders onbehandelbaar. Onder alle immunotherapeutische Doorverwezen chimeer antigeen receptor (auto) T-cellen verkregen van de meest spectaculaire resultaten, in het bijzonder met pediatrische B-acute lymfatische leukemie (B-ALL). Validatie van de klassieke methoden van auto T-cellen zijn, is afhankelijk van het gebruik van specificiteit en testen van de functionaliteit van de auto T cellen tegen doelcellen in suspensie en in xenograft-modellen. Helaas, opmerkingen in vitro zijn vaak losgekoppeld van de resultaten verkregen in vivo en veel inspanning en dieren kan worden gespaard door toe te voegen een andere stap: het gebruik van 3D-cultuur. De productie van spheroïden uit potentiële doelcellen die de 3D structuur van de tumorcellen na te bootsen wanneer ze worden geaccepteerd in de diermodel vertegenwoordigt een ideaal alternatief. Wij rapporteren hier een betaalbare, betrouwbare en gemakkelijke methode voor de productie van spheroïden van een getransduceerde colorectal cellijn als een hulpmiddel van de bevestiging voor adoptief celtherapie (hier wordt geïllustreerd door CD19 auto T-cellen). Deze methode is in combinatie met een geavanceerd levende imaging systeem dat sferoïde groei kan volgen, effector cellen apoptosis van cytotoxiciteit en tumor cel.
Adoptief cel overdracht (ACT) vertegenwoordigt de volgende generatie kankerbehandeling. Zij beroept zich op de injectie van effector cellen (T – of NK-cellen) in een patiënt. Deze cellen kunnen genetisch worden gewijzigd met een receptor die hen leiden naar hun doel, de tumor, en vernietigen. Deze aanpak werd onlangs aangetoond dat het haalbaar wanneer een chimeer antigeen Receptor (auto) gericht tegen de markering van de B-cel CD19 werd geïntroduceerd in de patiënt T-cellen te doden zijn/haar kanker1. In het geval van auto, die een kunstmatige receptor is, het ontwerp bestaat uit specifieke antilichaam fragmenten, het antigeen-bindend domein teruggebracht tot een entiteit aangewezen één keten variabele fragment (scFv), gekoppeld aan de signalering domeinen van T-cel. Hoewel er verschillende ontwerpen zijn, de meest gebruikte versies waarnaar wordt verwezen als tweede generatie auto ontwerpen, bestaan uit CD3z voor TCR signalering en een co-stimulatory domein (CD28, 4-1BB, OX40, enz.) 1 , 2. het veld immunotherapie geregisseerd allermeest naar de aandacht voor deze nieuwe vorm van wet wanneer CD19 auto-T-cellen spenderen vele patiënten met B-cel maligniteiten3,4 behandelde. Na dit succes, onderzoekers geprobeerd misbruik te maken van de vergelijkbare ontwerpen door gericht op andere epitopes voor solide tumoren met beperkt succes. Helaas, de schaarste van specifieke antigenen van de tumor en de hardere tumor microenvironments gesmolten auto T cellen minder doeltreffend naar solide tumoren5.
Op dit moment vertrouwen de meest gebruikte in vitro validatie strategieën op tweedimensionale (2D) systemen die alleen betrekking hebben op een fragment van de al genoemde solide tumor uitdagingen. Klassiek, waarbij 2D in vitro systemen een mengsel van auto T-cellen en cellijnen van doel kanker als monolayers de functionaliteit en de specificiteit van deze cellen effector te beoordelen. Hoewel deze strategieën belangrijk en essentieel onderdeel van de studies zijn, doen ze niet rekening houden met de complexe morfologie en driedimensionale (3D) structuur van de kanker cellen6. Kankercellen gekweekt in 3D systemen, aangeduid als spheroïden, verwerven nieuwe fenotypische kenmerken door veranderingen in gen expressie profiel7, die de erkenning door omgeleide effector cellen kunnen beïnvloeden. Birgersdotter en collega’s aangetoond dat een lijn van de cel van Hodgkin-lymfoom (HL), wanneer alleen gegroeid in een 3D cultuur model verwerft een genexpressie profiel dat is vergelijkbaar met primaire tumor monsters8. Daarom, spheroïden of soortgelijke 3D cultuur methodologieën aanbod relevanter in vitro modellen in tegenstelling tot standaard 2D systemen. Dergelijke systemen zijn ook vergelijkbaar met in vivo onderzoek die worden gezien als de laatste stap in het validatieproces voor een bepaalde auto. Gezien het feit dat 2D systemen niet na te bootsen de morfologie van kanker clusters, spheroïden bieden gelijkaardige formaties om te beoordelen van de functionaliteit van auto T cellen voorafgaand aan in vivo modellen. In een studie, Pickl et al. geïdentificeerd dat een sferoïde model van menselijke epidermale groeifactor receptor (HER2) overexpressing van kankercellen aangetoond vergelijkbare signalering profielen in vivo modellen9. Verder ondersteunt dit dat spheroïden meer relevante en close-te-in vivo beoordelingvan de auto T-cellen bieden. Bovendien, auto T-cel validatie tegen spheroïden zou kunnen helpen hun werkzaamheid meer kritisch te beoordelen en te voorkomen dat enkele van de ontwerpen verhuizen naar in vivo onderzoek voortijdig10; aldus, bij te dragen aan ethisch betrokken onderzoek door het offeren van minder dieren. Bovendien, protocollen met behulp van spheroïden zijn niet duurder dan de klassieke 2D systemen en veel sneller in vergelijking met de klassieke in vivo studies. Samen genomen, kan men voorspellen dat de opneming van sferoïde studies standaardpraktijk koppeling van in vitro en in vivo studies zal binnenkort.
Hier presenteren we de voorbereiding van de spheroïden van de dikke darm kanker cellijn HCT 116. Deze cellijn was aangepast zodat het menselijke CD19 molecuul te gevoelig voor CD19 auto T-cellen maken en te zorgen voor een duidelijke evaluatie van het doden met behulp van een klinisch gevalideerde auto construct express.
Het gebruik van spheroïden als een vernieuwend hulpmiddel voor het valideren van toekomstige kankerbehandeling is uitgegroeid tot een gebied van groeiende belangstelling in de afgelopen jaren. Spheroïden vertegenwoordigen een tussenstap tussen klassieke 2D analyse van in vitro en in vivo beoordeling. De methode verder houdt een heleboel belofte met betrekking tot hun potentie in termen van tumor nabootsen van de micro-omgeving en gene7profilering. Het protocol gepresenteerd in deze publicatie we…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Noorse Onderzoeksraad onder subsidies #244388, #254817 en #284983; de Noorse Cancer Society (#6829007); De Noorse gezondheid regio Zuid-Oost onder Grant #17/00264-6 en #2016006.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |