Summary
Dit protocol is ontworpen voor het beoordelen van de immunotherapeutische omgeleide T-cel (auto T-cel) cytotoxiciteit tegen 3D gestructureerde kankercellen (spheroïden) in real-time.
Abstract
Immunotherapie is uitgegroeid tot een gebied van de groeiende interesse in de strijd tegen kanker anders onbehandelbaar. Onder alle immunotherapeutische Doorverwezen chimeer antigeen receptor (auto) T-cellen verkregen van de meest spectaculaire resultaten, in het bijzonder met pediatrische B-acute lymfatische leukemie (B-ALL). Validatie van de klassieke methoden van auto T-cellen zijn, is afhankelijk van het gebruik van specificiteit en testen van de functionaliteit van de auto T cellen tegen doelcellen in suspensie en in xenograft-modellen. Helaas, opmerkingen in vitro zijn vaak losgekoppeld van de resultaten verkregen in vivo en veel inspanning en dieren kan worden gespaard door toe te voegen een andere stap: het gebruik van 3D-cultuur. De productie van spheroïden uit potentiële doelcellen die de 3D structuur van de tumorcellen na te bootsen wanneer ze worden geaccepteerd in de diermodel vertegenwoordigt een ideaal alternatief. Wij rapporteren hier een betaalbare, betrouwbare en gemakkelijke methode voor de productie van spheroïden van een getransduceerde colorectal cellijn als een hulpmiddel van de bevestiging voor adoptief celtherapie (hier wordt geïllustreerd door CD19 auto T-cellen). Deze methode is in combinatie met een geavanceerd levende imaging systeem dat sferoïde groei kan volgen, effector cellen apoptosis van cytotoxiciteit en tumor cel.
Introduction
Adoptief cel overdracht (ACT) vertegenwoordigt de volgende generatie kankerbehandeling. Zij beroept zich op de injectie van effector cellen (T - of NK-cellen) in een patiënt. Deze cellen kunnen genetisch worden gewijzigd met een receptor die hen leiden naar hun doel, de tumor, en vernietigen. Deze aanpak werd onlangs aangetoond dat het haalbaar wanneer een chimeer antigeen Receptor (auto) gericht tegen de markering van de B-cel CD19 werd geïntroduceerd in de patiënt T-cellen te doden zijn/haar kanker1. In het geval van auto, die een kunstmatige receptor is, het ontwerp bestaat uit specifieke antilichaam fragmenten, het antigeen-bindend domein teruggebracht tot een entiteit aangewezen één keten variabele fragment (scFv), gekoppeld aan de signalering domeinen van T-cel. Hoewel er verschillende ontwerpen zijn, de meest gebruikte versies waarnaar wordt verwezen als tweede generatie auto ontwerpen, bestaan uit CD3z voor TCR signalering en een co-stimulatory domein (CD28, 4-1BB, OX40, enz.) 1 , 2. het veld immunotherapie geregisseerd allermeest naar de aandacht voor deze nieuwe vorm van wet wanneer CD19 auto-T-cellen spenderen vele patiënten met B-cel maligniteiten3,4 behandelde. Na dit succes, onderzoekers geprobeerd misbruik te maken van de vergelijkbare ontwerpen door gericht op andere epitopes voor solide tumoren met beperkt succes. Helaas, de schaarste van specifieke antigenen van de tumor en de hardere tumor microenvironments gesmolten auto T cellen minder doeltreffend naar solide tumoren5.
Op dit moment vertrouwen de meest gebruikte in vitro validatie strategieën op tweedimensionale (2D) systemen die alleen betrekking hebben op een fragment van de al genoemde solide tumor uitdagingen. Klassiek, waarbij 2D in vitro systemen een mengsel van auto T-cellen en cellijnen van doel kanker als monolayers de functionaliteit en de specificiteit van deze cellen effector te beoordelen. Hoewel deze strategieën belangrijk en essentieel onderdeel van de studies zijn, doen ze niet rekening houden met de complexe morfologie en driedimensionale (3D) structuur van de kanker cellen6. Kankercellen gekweekt in 3D systemen, aangeduid als spheroïden, verwerven nieuwe fenotypische kenmerken door veranderingen in gen expressie profiel7, die de erkenning door omgeleide effector cellen kunnen beïnvloeden. Birgersdotter en collega's aangetoond dat een lijn van de cel van Hodgkin-lymfoom (HL), wanneer alleen gegroeid in een 3D cultuur model verwerft een genexpressie profiel dat is vergelijkbaar met primaire tumor monsters8. Daarom, spheroïden of soortgelijke 3D cultuur methodologieën aanbod relevanter in vitro modellen in tegenstelling tot standaard 2D systemen. Dergelijke systemen zijn ook vergelijkbaar met in vivo onderzoek die worden gezien als de laatste stap in het validatieproces voor een bepaalde auto. Gezien het feit dat 2D systemen niet na te bootsen de morfologie van kanker clusters, spheroïden bieden gelijkaardige formaties om te beoordelen van de functionaliteit van auto T cellen voorafgaand aan in vivo modellen. In een studie, Pickl et al. geïdentificeerd dat een sferoïde model van menselijke epidermale groeifactor receptor (HER2) overexpressing van kankercellen aangetoond vergelijkbare signalering profielen in vivo modellen9. Verder ondersteunt dit dat spheroïden meer relevante en close-te-in vivo beoordelingvan de auto T-cellen bieden. Bovendien, auto T-cel validatie tegen spheroïden zou kunnen helpen hun werkzaamheid meer kritisch te beoordelen en te voorkomen dat enkele van de ontwerpen verhuizen naar in vivo onderzoek voortijdig10; aldus, bij te dragen aan ethisch betrokken onderzoek door het offeren van minder dieren. Bovendien, protocollen met behulp van spheroïden zijn niet duurder dan de klassieke 2D systemen en veel sneller in vergelijking met de klassieke in vivo studies. Samen genomen, kan men voorspellen dat de opneming van sferoïde studies standaardpraktijk koppeling van in vitro en in vivo studies zal binnenkort.
Hier presenteren we de voorbereiding van de spheroïden van de dikke darm kanker cellijn HCT 116. Deze cellijn was aangepast zodat het menselijke CD19 molecuul te gevoelig voor CD19 auto T-cellen maken en te zorgen voor een duidelijke evaluatie van het doden met behulp van een klinisch gevalideerde auto construct express.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generatie van spheroïden van Colorectal kanker cellijn
- Wassen HCT 116 (stabiel getransduceerde om uit te drukken Cluster van differentiatie 19 (CD19) en groene fluorescentie proteïne (GFP)) cel monolayers met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 5 mL of 10 mL voor een 75 cm2 kolf voor een 25 cm2 ). Voeg trypsine (0,5 mL voor een 25 cm2 of 1 mL voor een kolf van 75 cm2 ) en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Controleren van mobiele-detachement onder een microscoop en cel dissociatie enzym met volledige Roswell Park Memorial Instituut 160 medium (RPMI 1640) te neutraliseren (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamycine; 10 mL voor een 25 cm2 of 20 mL voor een kolf van 75 cm2 ).
- Centrifuge celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant met behulp van een precisiepipet en resuspendeer op en neer waarbij verschillende malen met 5 mL van volledige RPM1 1640 medium.
- Cellen tellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting op een compatibele mobiele teller.
- Centrifuge celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant met behulp van een precisiepipet en resuspendeer in RPMI middellange tot het verkrijgen van 5 x 10-3 cellen/mL.
- De celsuspensie overbrengen in een steriele reservoir en afzien van 200 µL per putje in een 96-Wells ronde bodem platen met een meerkanaalspipet.
- De plaat overbrengen in de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur in een incubator (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%).
- Log in op de acquisitie software, selecteert u Schema te verwerven | Lancering toevoegen schip | Scannen op schema | Schip maken: nieuwe.
-
Selecteer scantype: sferoïde. Selecteer de kanalen van belang: fase + helderveld (te volgen spheroïden groei), groen (volg tumor signaal en acquisitie tijd 300 ms) en rood (volg apoptosis en acquisitie tijd 400 ms).
- Selecteer de gewenste vergroting: 10 x.
- Kies de plaat model en haar positie in de lade. Selecteer de positie van putten om het imago. Voer een omschrijving in voor het experiment: naam, soort cellen, aantal cellen.
- Voor de opstelling van de analyse, uitstellen analyse tot een Later momentinschakelt. Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en selecteer Instellen geselecteerd Scan Groepeerinterval optie en stel toevoegen scans elke 4 h en u wilt voor een totaal van 24 h. instellen de gewenste begintijd (ten minste 1 h na incubatie in de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur).
-
Om de 2 dagen voor de groei van de spheroïden controleren door in te loggen in de imaging software.
- Kies de optie Weergave recente scant en dubbelklik op het gewenste experiment. Helderveld selecteren in het deelvenster beeld kanalen en gebruik vervolgens het hulpprogramma voor het maatregel image - functies voor het meten van de diameter van de spheroïden. Het duurt 6 dagen voordat een sferoïde te bereiken van de gewenste grootte: 0,5 mm diameter. Voeg 50 µL van volledige RPMI medium per putje op dag 4 om middellange verdamping gevolgen te beperken.
2. productie van CD19 auto T cellen
-
Uitbreiding van CD19 auto T cellen
Opmerking: Stabiele expressie van CD19 auto T cellen overgenomen door bulk retrovirale transductie van de gezonde donor PBMCs als eerder beschreven16. De retrovirale construct codering voor CD19 auto is een tweede generatie auto en bestaat uit fmc63 scFv keten, CD8 scharnier en transmembraan domein, een 4-1BB co-stimulatory domein en tot slot een CD3ζ domein.- Uit te breiden, cultuur de getransduceerde T cellen in aanwezigheid van anti-CD3/28 magnetische kralen met een cel parel/verhouding van 1:1 voor 10 – 11 dagen. Tijdens de expansie, cellen zijn in volledige medium (X-VIVO 15, 5% Serum vervanging, en 100 U/mL recombinante menselijke IL-2).
Opmerking: De ideale dichtheid voor een efficiënte uitbreiding is 1 tot 2 x 106 cellen/mL. Afhankelijk van het eerste nummer, kunnen cellen worden uitgebreid in kolven (25 cm2 flacons met 20 mL, 75 cm2 kolven tot 40 mL van het totale volume) in een cel cultuur incubator (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%). - Als een negatieve controlegroep voor de volgende tests, bevatten niet-getransduceerde PBMCs (zal worden verwezen als Mock) bij de uitbreiding protocol parallel aan de CD19 auto T-cellen.
- Op dag 3 en vanaf, voeg verse medium dagelijks en verdelen van de cellen in meer cultuur kolven, indien nodig.
- Op dag 10 – 11: centrifuge cellen bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant en combineren van alle cellen in een tube van 50 mL en resuspendeer de cellen in ongeveer 30 mL verse volledige media.
- Plaats de tube van 50 mL, met de geresuspendeerde cellen op een magnetische stand te scheiden van de magnetische kralen van het kweekmedium.
- Wacht 2-3 min voor de kralen te verzamelen aan de kant van de buis.
- Verwijder het kweekmedium met een pipet en overdracht aan een nieuwe buis zonder het aanraken van de magnetische kraal collectie zones.
- Herhaal de stappen met betrekking tot de verwijdering van de Parel (2.1.5–2.1.7) eens te meer op het beperken van het aantal parels in het uiteindelijke kweekmedium.
- Resuspendeer de cellen tellen en aanpassen van de dichtheid op 1 tot 2 x 106 cellen/mL in volledige medium.
- Rusten de cellen voor ten minste 4 h tot overnachting. Vervolgens direct bevriezen ze neer bij-80 ° C en de flesjes overbrengen in een tank met vloeibare stikstof op de volgende dag voor langdurige opslag. U kunt ook kunt een verlengen de rest tot 's nachts voor onmiddellijk gebruik.
- Uit te breiden, cultuur de getransduceerde T cellen in aanwezigheid van anti-CD3/28 magnetische kralen met een cel parel/verhouding van 1:1 voor 10 – 11 dagen. Tijdens de expansie, cellen zijn in volledige medium (X-VIVO 15, 5% Serum vervanging, en 100 U/mL recombinante menselijke IL-2).
-
CD19 auto expressie controle op primaire T cellen
- Tel het aantal uitgebreide T-cellen, zoals de nummers enigszins, na overnachting cultuur of matig na vorst/dooi variëren kunnen.
- 5 x 105 cellen van beide CD19 auto en Mock primaire T-cellen te scheiden van de stroom cytometry buizen overbrengen.
- Wassen van de cellen met 200 μL van Flow Buffer (2% FBS in PBS) en centrifuge de buizen bij 500 x g gedurende 5 min. Herhaal de stappen wassen om zich te ontdoen van alle artefacten, veroorzaakt door het kweekmedium.
- Het primaire antilichaam (Biotine geit-antimuis IgG, F(ab') ₂ Fragment specifieke) voor te bereiden door het uitvoeren van 1:200 verdunning in Flow Buffer.
- Resuspendeer de cellen in 100 μl van antilichaam mix per buis en incubeer op ijs voor 15 min. Herhaal de vorige stap van het wassen tweemaal te verwijderen overtollige antilichaam.
- Het secundaire antilichaam (streptavidine-PE) voor te bereiden als 1:400 verdunning in Flow Buffer.
- Resuspendeer de cellen in 100 μl van antilichaam mix per buis en incubeer op ijs voor 15 min. Herhaal de vorige stap van het wassen tweemaal om zich te ontdoen van overtollige antilichaam.
- Resuspendeer de cellen in 200 μL van Flow Buffer per buis en analyseren op een stroom cytometer.
- Gebruik bespotten T cellen instellen van de negatieve en positieve poort en analyseren van CD19 auto getransduceerde T cellen dienovereenkomstig.
3. 3D Tumor sferoïde doden Assay
-
Na 6 dagen of eens spheroïden bereiken de gewenste grootte, verwijderen de plaat uit de incubator. Met behulp van een meerkanaalspipet, zachtjes verwijderen 100 µL per putje van volledige RMPI 1640 medium de sferoïde platen.
- Voor deze stap, hoek de tips naar binnen muur van de 96-wells-plaat, vermijden van contact met de bodem van de put om te minimaliseren van de verstoring van de spheroïden. Resterende volume moet ongeveer 100 µL.
- Bereid de oplossing van een 1:200 Annexine v rood door het mengen van 50 µL van Annexine V rood met 9.95 mL van volledige RPMI 1640 medium.
- Voeg 100 µL per putje van de 1:200 Annexine V rood oplossing.
- De plaat overbrengen in een incubator (5% CO2, 37° C, luchtvochtigheid van 95%) gedurende 15 minuten.
- Oogst de getransduceerde auto CD19 T-cellen in een tube van 15 mL en centrifuge hen bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet en resuspendeer op en neer waarbij verschillende malen met 2 mL van volledige RPM1 1640 medium.
- Cellen tellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting op een compatibele mobiele teller.
- Centrifuge celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min. verwijderen supernatant met behulp van een precisiepipet en resuspendeer in RPMI middellange tot het verkrijgen van 2 x 105 cellen/mL.
- De celsuspensie overbrengen in een steriele reservoir en breng 100 µL per putje in een 96-Wells ronde bodemplaat sferoïde met een meerkanaalspipet.
- De plaat ook terug overzetten naar de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur in een incubator (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%).
-
Log in op de acquisitie software, selecteert u schema te verwerven.
- Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn van de Scan en selecteer Bewerken tijdlijn. Klik met de rechtermuisknop op de groep van de scan en verwijder deze. Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en Stel geselecteerd Scan Groepeerinterval optie selecteren en instellen toevoegen scans elke 1,5 h en u wilt voor een totaal van 24 h.
- Stel de gewenste begintijd (ten minste 1 h na incubatie in de geautomatiseerde beeldvormende apparatuur). Selecteer Opslaan planning scans.
4. automatische beeldanalyse
- Log in acquisitie, kies de optie Weergave recente scant en selecteer de optie Launch Analysis . Selecteer Create nieuwe analyse definitie | Soort analyse: sferoïde. De kanalen van de afbeelding om te analyseren (fase + helderveld, groen en rood) aan te kruisen.
- Selecteer ten minste 10 representatieve beelden: meestal 1 per voorwaarde en ten minste 3 punten van de tijd (begin, Midden en einde van de overname).
- Preview de standaard analyseren procedure op de hele afbeelding stack.
- De parameters voor helderveld masker wijzigen. Typische parameters zijn: gevoeligheid 10, gat vullen 1.000 µm2, min gebied 1.000 µm2. Op de hele afbeeldingsstapel bekijken en controleren dat de geselecteerde parameters de spheroïden nauwkeurig detecteren.
- Het wijzigen van de parameters voor groene masker (GFP). Typische parameters zijn: hoge hoed segmentatie met RADIUS-200 µm en drempel 3 GCU, rand afgesplitst, gat vullen 5.000 µm2, aanpassen grootte -2 pixels, gebied min 3.000 µm2. Op de hele afbeeldingsstapel bekijken en controleren dat de geselecteerde parameters de spheroïden nauwkeurig detecteren.
- Het wijzigen van de parameters voor rode masker (Annexine V). Typische parameters zijn: hoge hoed segmentatie met RADIUS-150 µm en drempel 2 GCU, rand afgesplitst, gat vullen 5.000 µm2, aanpassen grootte 0 pixels, gebied min 1.000 µm2. Op de hele afbeeldingsstapel bekijken en controleren dat de geselecteerde parameters de spheroïden nauwkeurig detecteren.
-
Start de analyzer.
- Zodra de analyse wordt gedaan, pak de meting van belang. Selecteer het geanalyseerde bestand en vervolgens de optie Maatstelsel van de grafiek . Selecteer de statistieken van belang, de scan en de put. Totale rode en groene intensiteit binnen de grenzen van de helderveld geven meestal de meest nauwkeurige metingen door het beperken van het signaal van de fluorescentie tot de grenzen van de spheroïden bepaald door de helderveld masker (Figuur 3). Pak de geselecteerde statistieken in verschillende bestandsindeling door te klikken op "Gegevens exporteren".
- Gaat u verder met de winning van de afbeeldingen en films door het selecteren van de geanalyseerde file en selecteer vervolgens de optie afbeeldingen exporteren en films . Twee opties zijn beschikbaar, ofwel "als weergegeven" ophalen afbeeldingen en films als gezien op de denkbaar software (meestal samengestelde afbeeldingen), ofwel "als opgeslagen" ruwe gegevens voor externe analyse via derde-deel software op te halen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals te zien in Figuur 1, is het van cruciaal belang om te controleren door stroom cytometry van het niveau van expressie van CD19 auto op T-cellen (figuur 1A) en het niveau van de CD19 op HCT116 tumor cellijnen (figuur 1B). Figuur 2 illustreert het resultaat van een typische sferoïde experiment. De geautomatiseerde beeldvormende apparatuur neemt foto's in vier verschillende kanalen: helder veld, fase, groen en rood fluorescentie. Fase kanaal wordt gebruikt om te beweren de vorming van spheroïden door sterk contrasterende grenzen in de buurt van de spheroïden (dat is een teken van sferoïde vorming) weer te geven. Helder veld is gebruikt tijdens het analyseproces te sporen van de grootte van de spheroïden en de groene signaal (tumor) en rood signaal (apoptosis) beperken tot de bovengenoemde grenzen. Het kan men niet overwegen gebeurtenissen niet direct verwant aan spheroïden (bijvoorbeeld geïsoleerde tumorcellen en hun apoptosis). Groene en rode contouren vertegenwoordigen respectievelijk groene en rode signalen beschouwd in de berekening van de statistieken. In Figuur 2, helder veld, werden fase, rode en groene kanalen gehaald via de optie "zoals deze is opgeslagen" overwegende dat samengestelde afbeeldingen werden gehaald via de "Als weergegeven" optie en representatief voor de statistieken weergegeven in Figuur 3 zijn. Zoals te zien is in Figuur 2, in tegenstelling tot bespotten T cellen, konden CD19 auto T cellen specifiek de spheroïden te doden en sterk verminderen van het aantal levende tumorcellen.
Figuur 3 toont de evolutie van de totale groene en rode signaal gemeten binnen de grenzen van de sferoïde na verloop van tijd. Zoals kan worden gezien, kort na de CD19 auto T cel injectie, de spheroïden grootte krimpt snel (zoals gemeten door groene fluorescentie signaal) en de apoptosis signaal stijgt snel (zoals gemeten door rode fluorescentie signaal).
Figuur 1: oppervlakte van uitdrukking van de CD19 auto- en CD19. (A) oppervlakte expressie van CD19 auto op retrovirally getransduceerde T-cellen. Cellen werden geanalyseerd door stroom cytometry vóór de bepaling van de sferoïde via anti-mouse-Fab biotinyleerd als primaire en anti-streptavidine-PE als secundair antilichaam. (B) oppervlakte expressie van CD19 op retrovirally getransduceerde HCT116 cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: beoordeling van CD19 auto T-cel cytotoxiciteit tegen tumor spheroïden. Time-lapse van HCT116 sferoïde groei; op t = 138 h, Mock of CD19 auto T cellen werden geïntroduceerd op een dichtheid van 20000 cellen per putje. Groene signaal komt overeen met HCT116 GFP + cellen en groene rand correspondeert met het gedetecteerde sferoïde. Rood signaal correspondeert met apoptosis zoals gecontroleerd door Annexine V en rode omtrek correspondeert met het gedetecteerde apoptosis gebeurtenissen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: metingen van de totale rode en groene signaal binnen helderveld grenzen na verloop van tijd maskeren. Totale rode en groene signalen binnen helderveld masker statistieken werden verkregen na geanalyseerd en als functie van de tijd uitgezet. Onderbroken lijn komt overeen met de invoering van effector cellen (CD19CAR of Mock T-cellen). Maatregel komt overeen met de gemiddelde ± SEM (n = 12). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van spheroïden als een vernieuwend hulpmiddel voor het valideren van toekomstige kankerbehandeling is uitgegroeid tot een gebied van groeiende belangstelling in de afgelopen jaren. Spheroïden vertegenwoordigen een tussenstap tussen klassieke 2D analyse van in vitro en in vivo beoordeling. De methode verder houdt een heleboel belofte met betrekking tot hun potentie in termen van tumor nabootsen van de micro-omgeving en gene7profilering. Het protocol gepresenteerd in deze publicatie werd aangepast van Saheen et al.,11 tot en met de Incucyte S3 en vormt een betaalbare en eenvoudige methode voor de productie van 3D tumor spheroïden van colorectale cellijnen. Koppeling sferoïde generatie een beeldapparaat hoge gegevensdoorvoer mogelijk maakt van betrouwbare en snelle screening van een groot aantal anti-tumor agenten en controleren van het vermogen van de bovengenoemde agent te destabiliseren tumor structuur.
Er zijn verschillende kritische stappen om rekening te houden met betrekking tot dit protocol. Ten eerste moet het beginnummer van tumorcellen juist worden aangepast. Als de startende celdichtheid te hoog is, de cellen de PLL zal degraderen coating snel en zal beginnen te vormen van een aanhangend enkelgelaagde. Aan de andere kant, zal een laag aantal cellen introduceren een hoge variabiliteit in termen van sferoïde grootte en het aantal spheroïden per putje. Ten tweede, het gebruik van een geautomatiseerde beeldapparaat is bloot cellen aan potentiële fototoxiciteit (vooral als verschillende fluorescentie kanalen worden gebruikt); het is aanbevolen om de frequentie van de afbeelding om te minimaliseren van de schade aan de spheroïden aanpassen. Het is een kritieke parameter te overwegen om de gebeurtenissen van belang betrouwbaar (een afbeelding elke 4 uur vóór effector cel invoering en één vertegenwoordigt elke 90 min na het beste compromis om onze kennis). Ten derde, is het raadzaam met name voorzichtig om te voorkomen dat middelgrote verdamping die een paar dagen na effector cel invoering kan optreden. Ten vierde, het aantal effector cellen moet ook nauwkeurig worden aangepast: het gewenste nummer moet hoog genoeg zijn om te doden van tumor spheroïden efficiënt maar ook zo laag mogelijk om de hoogste potentieel voor optimale imaging proces. Ten vijfde, in een typisch experiment, een goed bevat 2 tot en met 4 spheroïden die in een samensmelten kunnen; het wordt aangeraden aandacht te schenken aan potentiële pieken die in de statistieken na deze gebeurtenis kan uitbarsten en te negeren hen. Ten zesde, op een 96-wells-plaat, in gemiddeld 20 tot 50 putjes bevatten spheroïden in het gewenste aantal en de grootte; het is raadzaam om de controle van de putten als het bespaart rekentijd voor analyse vóór de invoering van de effector cellen worden beschouwd. Tot slot, de analyse is gedeeltelijk geautomatiseerd maar sommige bijdragen van de gebruiker met betrekking tot de verschillende parameters vereist. Het wordt aangeraden om te nemen bijzondere aandacht aan deze stap en om zich te concentreren op een evenwicht tussen de gevoeligheid en specificiteit. Als het soort effector cellen/medicamenteuze behandeling sterk binnen één experiment verschilt, is het mogelijk dat het noodzakelijk voor stormloop van verschillende soorten analyse om te selecteren die het best past.
Deze methode is tot nu toe alleen beperkt tot een bepaald soort aanhangend cellijn (in deze publicatie HCT 116); verdere is ontwikkeling vereist om te generaliseren van dit protocol aan elke regel kanker cel. Hoewel een breed scala aan methoden is al beschikbaar voor een groter aantal target cellen12,13,14,vertrouwen15, allermeest zij op het gebruik van dure en/of complexe procedures. Onze methode, is hoewel tot nu toe beperkt tot een paar soorten doelcellen interessant omdat het vereist weinig ingangen van de experimentator en een snel en gemakkelijk scherm van verschillende drugs en/of immunotherapie behandelingen (hier auto CD19 cellen) toelaat. De betrouwbaarheid en de mogelijkheid om te worden aangepast aan verschillende soorten behandelingen maken van deze methode een krachtig instrument in het kader van het validatieproces anti-kankerbehandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Noorse Onderzoeksraad onder subsidies #244388, #254817 en #284983; de Noorse Cancer Society (#6829007); De Noorse gezondheid regio Zuid-Oost onder Grant #17/00264-6 en #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
