Summary
Dieses Protokoll dient zur Immuntherapie umgeleiteten T-Zellen (Auto T-Zelle) Zytotoxizität gegen 3D strukturierte Krebszellen (Sphäroide) in Echtzeit zu bewerten.
Abstract
Immuntherapie hat ein wachsendes Interesse an den Kampf gegen den Krebs sonst unbehandelbaren entwickelt. Unter allen immuntherapeutischen Methoden umgeleitet chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zellen die spektakulärsten Ergebnisse, insbesondere mit pädiatrischen B-akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL). Klassische Validierungsmethoden Auto T-Zellen verlassen sich auf die Verwendung von Spezifität und Funktionalität Assays der Auto-T-Zellen gegen die Ziel-Zellen in Suspension und Xenograft-Modelle. Leider, in-vitro-Beobachtungen sind oft Ergebnisse in Vivo entkoppelt und einiges an Aufwand und Tiere könnte erspart werden, indem man einen weiteren Schritt: die Verwendung von 3D Culture. Die Produktion der Sphäroide aus potenziellen Zielzellen, die 3D-Struktur der Tumorzellen zu imitieren, wenn sie in das Tiermodell aufgeprägt sind stellt eine ideale Alternative dar. Hier berichten wir über eine erschwingliche, zuverlässige und einfache Methode, um Sphäroide aus einem ausgestrahlt kolorektalen Zelllinie als ein Validierungstool für Adoptiv-Therapie (hier am Beispiel CD19 Auto T-Zellen) produzieren. Diese Methode ist gekoppelt mit eine erweiterte live-imaging-System, das Sphäroid Wachstum verfolgen kann, Effektor Zellen Zytotoxizität und Tumor Zellapoptose.
Introduction
Adoptiveltern Zelltransfer (ACT) repräsentiert die nächste Generation-Krebs-Behandlung. Es stützt sich auf die Injektion von Effektorzellen (T - und NK-Zellen) in einem Patienten. Diese Zellen können genetisch mit einem Rezeptor geändert werden, die zu ihrem Ziel, den Tumor zu führen und zu zerstören. Vor kurzem wurde dieser Ansatz gezeigt, möglich sein, wenn ein gegen den B-Zell-Marker CD19 Chimeric Antigen Rezeptor (Auto) in die Patienten T-Zellen zu töten, seine/ihre Krebs-1eingeführt wurde. Bei Auto, welches eine künstliche Rezeptor, das Design besteht aus spezifischen Antikörperfragmente der Antigen-bindende Domäne auf eine Entität benannten einzelne Kette Variable Fragment (ScFv), reduziert auf die T-Zelle Signalisierung Domänen verknüpft. Zwar gibt es mehrere Entwürfe, die am häufigsten verwendeten Versionen bezeichnet als zweite Generation Auto-Designs, der CD3z für die TCR Signalisierung und einer co-stimulatory Domäne bestehen (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) 1 , 2. Feld Immuntherapie geleitet die meisten ihre Aufmerksamkeit auf diese neue Form des Gesetzes, wenn CD19 CAR-T-Zellen wirksam zahlreiche Patienten mit B-Zell-Tumoren3,4 behandelt. Nach diesem Erfolg versuchten Forscher ähnliche Entwürfe zu nutzen, indem Sie auf andere Epitope bei soliden Tumoren mit begrenztem Erfolg. Der Mangel an spezifischen Tumorantigenen und den härteren Tumor Mikroumgebungen gerendert CAR T Zellen leider weniger effektiv gegen solide Tumore5.
Setzen derzeit, die am häufigsten verwendeten in Vitro Validierungsstrategien auf zweidimensionale (2D) Systeme, die nur ein Fragment der bereits genannten soliden Tumoren Herausforderungen anzugehen. Klassisch, beinhalten 2D in-vitro- Systeme eine Mischung aus Auto-T-Zellen und Ziel Krebszelllinien als Monolagen zur Beurteilung der Funktionalität und Spezifität dieser Effektor-Zellen. Obwohl diese Strategien wichtige und entscheidende Teile des Studiums sind, sie nicht die komplexe Morphologie und dreidimensionale (3D) Struktur der Krebs Zellen6berücksichtigen. Krebszellen in 3D Systeme, genannt Sphäroide, kultiviert erwerben neue phänotypische Merkmale durch Veränderungen im gen Ausdruck Profil7, in dem die Anerkennung durch die umgeleiteten Effektorzellen beeinflussen könnten. Birgersdotter und Kollegen gezeigt, dass eine Hodgkin Lymphom (HL) Zell-Linie, wenn nur in einem 3D Culture Modell gewachsen ein Genexpressionsprofil erwirbt, die primären Tumor Proben8ähnlich ist. Daher culture Sphäroide oder ähnliche 3D Methoden Angebot relevanter in Vitro Modellen im Gegensatz zu standard-2D-Systeme. Solche Systeme sind auch ähnlich wie in vivo-Studien, die als der letzte Schritt im Prozess Validierung eines bestimmten Autos gesehen werden. Wenn man bedenkt, dass 2D Systeme versagen, die Morphologie des Krebs-Cluster zu imitieren, Sphäroide bieten ähnliche Formationen zur Beurteilung der Funktionalität des CAR-T-Zellen vor dem in-vivo-Modelle. In einer Studie, Pickl Et Al. festgestellt, dass ein Sphäroid Modell des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (HER2) Krebszellen überexprimiert ähnliche Signalisierung Profile zur in-vivo Modelle9demonstriert. Dies unterstützt weiter die Sphäroide relevant und Nähe zu in Vivo Beurteilung der Auto-T-Zellen bieten. Darüber hinaus Auto T-Zell-Validierung gegen Sphäroide könnte helfen, ihre Wirksamkeit mehr kritisch zu beurteilen und verhindern, dass einige der Designs bewegt, in vivo Studien vorzeitig10; so, zur ethisch betreffenden Forschung durch weniger Tiere zu opfern. Darüber hinaus sind Protokolle mit Sphäroide nicht teurer als klassische 2D Systeme und viel schneller im Vergleich zu klassischen in Vivo Studien. Zusammen genommen, kann man voraussagen, dass die Einbeziehung der Sphäroid Studien gängige Praxis bald, in vitro und in vivo Studien zu verknüpfen.
Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung der Sphäroide aus der Dickdarm-Krebs-Zell-Linie HCT-116. Diese Zelllinie wurde geändert, um das menschliche CD19-Molekül empfindlich gegen CD19 Auto T-Zellen zu rendern und eine klare Einschätzung der Tötung mit einer klinisch validierte Auto-Konstrukt zum Ausdruck bringen.
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Protocol
1. Generation der Sphäroide von Colorectal Krebs-Zell-Linie
- Waschen HCT-116 (stabil auszudrücken, Differenzierung-19-Cluster (CD19) und grüne Fluoreszenz Protein (GFP) ausgestrahlt) Zelle Monolagen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 5 mL für ein 25 cm2 oder 10 mL für ein 75 cm2 Fläschchen). Hinzufügen von Trypsin (0,5 mL für ein 25 cm2 oder 1 mL für ein 75 cm2 Fläschchen) und Zellen bei 37 ° C für 5 min inkubieren.
- Überprüfen Sie Ablösung der Zelle unter dem Mikroskop und Zelle Dissoziation Enzym mit kompletten Roswell Park Memorial Institute 160 Medium (RPMI 1640) zu neutralisieren (RPMI 1640 + 10 % FCS + Gentamycin; 10 mL für ein 25 cm2 oder 20 mL für ein 75 cm2 Fläschchen).
- Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut von oben und unten mehrmals mit 5 mL des kompletten DZ1 1640 Medium pipettieren.
- Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung auf einem kompatiblen Handy-Zähler.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut in RPMI Medium, 5 x 103 Zellen/mL zu erhalten.
- Die Zellsuspension auf einem sterilen Behälter übertragen und 200 µL/Well in eine 96-Well Runde Bodenplatten mit einer Mehrkanal-Pipette zu verzichten.
- Übertragen Sie die Platte auf das automatisierte bildgebenden Gerät in einen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2).
- Melden Sie sich bei der Software zur Datenerfassung, wählen Sie Zeitplan zu erwerben | Start hinzufügen Schiff | Scannen nach Zeitplan | Schiff zu schaffen: neue.
-
Wählen Sie Scan-Typ: Sphäroid. Wählen Sie die Kanäle von Interesse: Phase + Hellfeld (, Sphäroide Wachstum zu folgen), grün (Tumor Signal folgen, Erwerb Zeit 300 ms) und rot (Apoptose zu folgen, Erwerb Zeit 400 ms).
- Wählen Sie die gewünschte Vergrößerung: 10 X.
- Wählen Sie Das Schalenmodell und seine Position in der Schublade. Wählen Sie die Position der Brunnen zum Bild. Geben Sie die Beschreibung des Experiments: Name, Art der Zellen, Anzahl der Zellen.
- Wählen Sie für die Analyse-Setup Verschieben Analyse bis später. Rechtsklick auf die Zeitleiste und Option Festlegen ausgewählt Scan-Intervall und setzen Scans hinzufügen jedes bis 4 h und für eine Gesamtmenge von 24 h. Legen Sie die gewünschte Startzeit (mindestens 1 h nach der Inkubation in der automatisierten bildgebende Apparatur).
-
Überprüfen Sie alle 2 Tage für das Wachstum der Sphäroide, indem Sie sich in der imaging-Software.
- Wählen Sie die Option Ansicht den letzten scannt , und doppelklicken Sie auf das gewünschte Experiment. Wählen Sie Hellfeld im Kanälebedienfeld Bild aus und verwenden Sie dann das Tool messen Bild Funktionen zur Messung des Durchmessers der Sphäroide. Es dauert 6 Tage für ein Sphäroid, die gewünschte Größe zu erreichen: 0,5 mm Durchmesser. Fügen Sie 50 µL kompletten RPMI Medium pro Bohrloch am Tag 4, mittlere Verdunstung Effekt zu begrenzen.
2. Generation von CD19 Auto T-Zellen
-
Ausbau des CD19 Auto T-Zellen
Hinweis: Stabile Expression von CD19 Auto T-Zellen wurde von Schüttgut retrovirale Transduktion des gesunden Spenders PBMCs als zuvor beschriebenen16übernommen. Für CD19 Auto kodierenden retroviralen Konstrukt ist ein der zweiten Generation Auto und besteht aus fmc63-ScFv-Kette, CD8 Scharnier und transmembrane Domäne, eine 4-1BB co-stimulatory Domain und schließlich ein CD3ζ-Domäne.- Um zu erweitern, Zellen Kultur transduced T in Anwesenheit von Anti-CD3/28 magnetische Beads mit einer Zelle Wulst-Verhältnis von 1:1 für 10 – 11 Tage. Während der Expansion Zellen sind im kompletten Medium (X-VIVO 15, 5 % Serum Ersatz, und 100 U/mL rekombinanten menschlichen Il-2).
Hinweis: Die optimale Dichte für einen effizienten Ausbau ist 1 bis 2 x 106 Zellen/mL. Abhängig von der ursprünglichen Anzahl können Zellen in Flaschen (25 cm2 Fläschchen 20 ml, 75 cm2 Flaschen bis 40 mL Gesamtvolumen) in eine Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) erweitert werden. - Als Negativkontrolle Gruppe für die folgenden Tests gehören nicht ausgestrahlt PBMCs (wird als Mock bezeichnet werden) zum Ausbau Protokoll parallel zur CD19 Auto T-Zellen.
- Am 3. Tag ab, fügen Sie frisches Medium jeden Tag und teilen Sie die Zellen in mehr Kulturflaschen, falls erforderlich.
- Am Tag 10 – 11, Zentrifuge Zellen bei 500 X g für 5 min. Überstands entfernen und kombinieren Sie alle Zellen in einem 50 mL-Tube und Aufschwemmen der Zellen in ~ 30 mL frische komplette Medien.
- Legen Sie die 50 mL-Tube mit der resuspendierte Zellen auf einem Magnetstativ, magnetische Beads aus dem Kulturmedium zu trennen.
- Warten Sie 2 – 3 min. für die Perlen auf der Seite der Röhre zu sammeln.
- Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Pipette und Übertragung auf einen neuen Schlauch ohne magnetische Bead Kollektion Zonen zu berühren.
- Wiederholen Sie die Schritte zur Perle Entfernung (2.1.5–2.1.7) einmal mehr um die Anzahl der Perlen in der endgültigen Kulturmedium.
- Aufschwemmen Sie und zählen Sie die Zellen, passen Sie die Dichte auf 1 bis 2 x 106 Zellen/mL in kompletten Medium.
- Ruhen Sie die Zellen für mindestens 4 h bis über Nacht. Dann direkt frieren sie unten bei-80 ° C und übertragen Sie die Fläschchen mit einem flüssigen Stickstoff-Tank am folgenden Tag für die Langzeitlagerung. Alternativ kann man den Rest bis zu über Nacht für den sofortigen Einsatz verlängern.
- Um zu erweitern, Zellen Kultur transduced T in Anwesenheit von Anti-CD3/28 magnetische Beads mit einer Zelle Wulst-Verhältnis von 1:1 für 10 – 11 Tage. Während der Expansion Zellen sind im kompletten Medium (X-VIVO 15, 5 % Serum Ersatz, und 100 U/mL rekombinanten menschlichen Il-2).
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CD19 Ausdruck Fahrzeugbeherrschung auf primäre T-Zellen
- Die Anzahl der erweiterten T-Zellen, wie die Zahlen nach Übernachtung Kultur oder mäßig nach Frost/Tau-Wechseln leicht variieren können.
- Übertragen Sie 5 x 105 Zellen aus beiden CD19-Auto und Mock primäre T-Zellen, Flow Cytometry Rohre zu trennen.
- Waschen Sie die Zellen mit 200 μl Puffer fließen (2 % FBS mit PBS-Puffer) und Zentrifuge die Rohre bei 500 X g für 5 min. wiederholen Waschschritte get rid of verursacht durch das Kulturmedium Artefakte.
- Bereiten Sie den primären Antikörper (Biotin Goat Anti-Maus IgG, F(ab') ₂ Fragment spezifischen) mit Verdünnung 1: 200 in Puffer fließen.
- Zellen in 100 μl Antikörper-Mix pro Röhre Aufschwemmen und Inkubation auf Eis für 15 min. Wiederholen Sie die vorherigen Waschschritt zweimal, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
- Bereiten Sie den sekundären Antikörper (Streptavidin-PE) als 1: 400 Verdünnung im Puffer fließen.
- Zellen in 100 μl Antikörper-Mix pro Röhre Aufschwemmen und Inkubation auf Eis für 15 min. Wiederholen Sie die vorherigen Waschschritt zweimal, um loszuwerden überschüssige Antikörper.
- Zellen in 200 μL der Flow Puffer pro Röhre Aufschwemmen und auf einem Durchflusszytometer analysiert.
- Verwendung Mock T-Zellen die negativen und positiven Tor einrichten und analysieren CD19 Auto ausgestrahlt T-Zellen entsprechend.
3. 3D Tumor Sphäroid Tötung Assay
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Nach 6 Tagen oder einmal Sphäroide erreichen Sie die gewünschte Größe, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator. Entfernen Sie mit einem Mehrkanal-Pipette, vorsichtig 100 µL/Well des kompletten RMPI 1640 Medium von den Sphäroid Platten.
- Für diesen Schritt Winkel die Spitzen nach innen Wand der 96-Brunnen Platte, Vermeidung von Kontakt mit dem Boden des Brunnens um Störungen der Sphäroide zu minimieren. Volumen der verbleibenden muss rund 100 µL betragen.
- Bereiten Sie eine 1: 200-Lösung von Annexin V rot durch das Mischen von 50 µL Annexin V rot mit 9,95 mL komplette RPMI 1640 Medium.
- 100 µL/Well 1: 200 Annexin V rot Lösung hinzufügen.
- Die Platte auf ein Brutkasten für 15 min (37° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) übertragen.
- Ernten Sie die transduced Auto CD19 T-Zellen in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. entfernen den Überstand mit einer Pipette und Aufschwemmen von oben und unten mehrmals mit 2 mL des kompletten DZ1 1640 Medium pipettieren.
- Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung auf einem kompatiblen Handy-Zähler.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut in RPMI Medium, 2 x 105 Zellen/mL zu erhalten.
- Die Zellsuspension auf einem sterilen Behälter übertragen und 100 µL/Well in eine 96-Well Runde Sphäroid Bodenplatte mit einer Mehrkanal-Pipette zu verzichten.
- Übertragen Sie die Platte wieder auf das automatisierte bildgebenden Gerät in einen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2).
-
Melden Sie sich bei der Software zur Datenerfassung, wählen Sie Zeitplan zu erwerben.
- In der Scan-Zeitleiste mit der rechten Maustaste und wählen Sie Bearbeiten Zeitleiste. Mit der rechten Maustaste auf die Scan-Gruppe, und löschen Sie ihn. Auf der Zeitleiste mit der rechten Maustaste und wählen Sie Set ausgewählt Scan-Intervall und fügen Sie Scans alle 1,5 h und für eine Gesamtmenge von 24 h.
- Legen Sie die gewünschte Startzeit (mindestens 1 h nach der Inkubation in der automatisierten bildgebende Apparatur). Wählen Sie Speichern Scans Zeitplan.
4. automatische Bildanalyse
- Melden Sie sich bei Erwerb, wählen Sie die Option " Ansicht den letzten Scans " und wählen Sie Starten Analyseoption. Wählen Sie erstellen neue Analysedefinition | Berechnungsart: Sphäroid. Kreuzen Sie die Bild-Kanäle (Phase + Hellfeld, grün und rot) zu analysieren.
- Wählen Sie mindestens 10 repräsentative Bilder: in der Regel 1 pro Zustand und mindestens 3 Zeitpunkten (Anfang, Mitte und Ende des Erwerbs).
- Vorschau der Standardwert analysieren Verfahren auf dem ganzen Bildstapel.
- Ändern Sie die Parameter für Hellfeld-Maske. Typische Kennwerte sind: Empfindlichkeit 10, Bohrung Füllung 1.000 µm2, min. Bereich 1.000 µm2. Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.
- Ändern Sie die Parameter für grüne Maske (GFP). Typische Kennwerte sind: Segmentierung der Zylinder mit Radius 200 µm und Schwelle 3 AVV, Rand abgespalten, Loch zu stopfen, 5.000 µm2, Adjust-2 Pixel, Bereich min. 3.000 µm2. Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.
- Ändern Sie die Parameter für die rote Maske (Annexin V). Typische Kennwerte sind: Segmentierung der Zylinder mit Radius 150 µm und Schwelle 2 AVV, Rand abgespalten, Loch zu stopfen, 5.000 µm2, passen Sie Größe 0 Pixel, Bereich min. 1.000 µm2. Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.
-
Starten Sie den Analyzer.
- Sobald die Analyse abgeschlossen ist, extrahieren Sie die Messung von Interesse. Wählen Sie die analysierten Datei und dann die Option Grafik Metriken . Wählen Sie die Metrik der Zinsen, der Scan und Brunnen. In der Regel rot und grün Gesamtintensität im Hellfeld Grenzen geben die genauesten Messungen durch die Beschränkung des Signals der Fluoreszenz der Sphäroide Grenzen bestimmt durch die Hellfeld-Maske (Abbildung 3). Ausgewählte Kennzahlen in mehreren Datei-Format durch Klicken auf "Daten exportieren" zu extrahieren.
- Fahren Sie mit der Extraktion von Bildern und Filmen durch die Auswahl der analysierten Datei und wählen Sie dann die Option exportieren Sie Bilder und Filme . Zwei Optionen stehen zur Verfügung, entweder "als"abrufen Bilder und Filme als angezeigt auf der imaging-Software (in der Regel zusammengesetzte Bilder), entweder "gespeichert" zum Abrufen von raw-Daten für externe Analysen durch dritte Teil Software gesehen.
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Representative Results
Wie in Abbildung 1ersichtlich ist, ist es durch Durchflusszytometrie Ausdruck von CD19 Auto auf T-Zellen (Abbildung 1A) und das Niveau der CD19 auf Tumorzelllinien HCT116 (Abbildung 1 b) zu überprüfen, das entscheidend. Abbildung 2 veranschaulicht das Ergebnis einer typischen Sphäroid-Experiments. Das automatisierte bildgebenden Gerät nimmt Bilder in vier verschiedene Kanäle: Hellfeld, Phase, grüne und rote Fluoreszenz. Phase-Kanal wird verwendet, um die Bildung von Sphäroide durch die Anzeige sehr kontrastreichen Grenzen in der Nähe der Sphäroide (das ist ein Zeichen der Sphäroid Bildung) geltend zu machen. Hellfeld ist während des Analyseprozesses verwendet, um die Größe der Sphäroide erkennen und der grünen (Tumor) und rote Signal (Apoptose) der oben genannten Grenzen zu beschränken. Sie ermöglicht die Veranstaltungen direkt in keinem Zusammenhang mit Sphäroide (z. B. isolierte Tumorzellen und deren Apoptose) nicht berücksichtigt. Grüne und rote Linien darstellen bzw. grüne und rote Signale, die bei der Berechnung von Kennzahlen berücksichtigt. In Abbildung 2, Hellfeld, wurden Phase, grün und rot-Kanäle über das "wie"gespeichert"Option extrahiert, während zusammengesetzte Bilder durch die"Wie angezeigt"Option extrahiert wurden und sind repräsentativ für die Metrik in Abbildung 3dargestellt. Wie in Abbildung 2, im Gegensatz zu verspotten T-Zellen zu entnehmen konnten CD19 Auto T-Zellen spezifisch töten die Sphäroide und stark vermindert die Anzahl der live Tumorzellen.
Abbildung 3 zeigt die Entwicklung der gesamten grünen und roten Signal gemessen innerhalb der Sphäroid Grenzen im Laufe der Zeit. Wie man sehen kann, kurz nach CD19 Auto T Zelle Injektion, die Sphäroide Größe schrumpft schnell (gemessen mit grünen Fluoreszenzsignal) und die Apoptose signal steigt schnell (wie durch rote Fluoreszenz-Signal gemessen).
Abbildung 1: Oberfläche Ausdruck der CD19 Auto und CD19. (A) Oberflächenexpression von CD19 Auto auf T-Zellen retrovirally ausgestrahlt. Zellen wurden von Durchflusszytometrie vor der Sphäroid Test per mouse-Fab biotinylierte als primäre und als sekundäre Antikörper Anti-Streptavidin-PE analysiert. (B) Oberflächenexpression von CD19 auf retrovirally ausgestrahlt HCT116 Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beurteilung der CD19 Auto T-Zell-Zytotoxizität gegen Tumor Sphäroide. Zeitraffer der HCT116 Sphäroid Wachstum; bei t = 138 h Mock oder CD19 Auto T-Zellen wurden bei einer Dichte von 20000 Zellen/gut eingeführt. Grünes Signal entspricht HCT116 GFP + Zellen und grünen Umriss entspricht der erkannten Sphäroid. Rotes Signal entspricht Apoptose von Annexin V überwacht und roten Umriss auf die erkannten Apoptose-Ereignisse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Messungen der roten und grünen Gesamtsignal im Hellfeld Maske Grenzen im Laufe der Zeit. Total rote und grüne Signale im Hellfeld Maske Metriken erhielten nach analysiert und als Funktion der Zeit dargestellt. Gestrichelte Linie entspricht der Einführung der Effektorzellen (CD19CAR oder Mock T-Zellen). Maßnahme entspricht dem Mittelwert ± SEM (n = 12). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Verwendung von Sphäroide als ein innovatives Tool, um zukünftige Krebsbehandlung zu überprüfen ist ein Feld des wachsenden Interesses in den letzten Jahren geworden. Sphäroide stellen eine Zwischenstufe zwischen klassischen 2D in-vitro-Analyse und in-vivo Bewertung dar. Die Methode weiter hält eine Menge Versprechen bezüglich ihrer Wirksamkeit in Bezug auf Tumor imitiert Mikro-Umgebung sowie Profilierung7gen. Das Protokoll in dieser Publikation vorgestellt wurde von Saheen Et Al.11 Incucyte S3 und stellt eine erschwingliche und einfache Methode, 3D Tumor Sphäroide von kolorektalen Zelllinien zu produzieren. Kupplung Sphäroid Generation zu einer Hochdurchsatz-Bildverarbeitungsgerät ermöglicht zuverlässige und schnelle screening von eine Vielzahl von Anti-Tumor-Agenten und überwachen die Fähigkeit des vorgenannten Agenten, Tumor-Struktur zu destabilisieren.
Es gibt mehrere wichtige Schritte bezüglich dieses Protokolls berücksichtigen. Zuerst muss die Startnummer der Tumorzellen genau eingestellt werden. Wenn Start Zelldichte zu hoch ist, werden die Zellen der PLL verschlechtern Beschichtung schnell und startet eine anhaftende monomolekularen Film zu bilden. Auf der anderen Seite wird eine geringe Anzahl von Zellen eine hohe Variabilität hinsichtlich der Sphäroid Größe und die Anzahl der Sphäroide pro Bohrloch einführen. Zweitens ist die Verwendung von einem automatisierten Bildverarbeitungsgerät auszusetzen Zellen zu potentiellen Phototoxizität (vor allem, wenn mehrere Fluoreszenz-Kanäle verwendet werden); Es wird empfohlen, die Bildfrequenz zur Minimierung von Schäden an der Sphäroide anpassen. Es ist ein kritischer Parameter zu prüfen, um die Ereignisse von Interesse zuverlässig zu erfassen (ein Bild alle 4 Stunden vor Effektor Zellen Einführung und ein repräsentiert alle 90 min nach den besten Kompromiss nach unserer Kenntnis). Drittens empfehlen wir besonders vorsichtig mittlere Verdunstung zu vermeiden, die auftreten können, ein paar Tage nach Effektor Zellen Einführung. Viertens: die Anzahl der Effektor-Zellen muss auch genau angepasst werden: die gewünschte Nummer muss hoch genug, um effizient, aber auch so niedrig wie möglich, um das größte Potenzial für optimale bildgebende Verfahren ermöglichen Tumor Sphäroide zu töten. Fünftens: in ein typisches Experiment enthält eine gut 2-4 Sphäroide, die ineinander verschmelzen können; Es wird empfohlen, mögliche Spitzen achten, die in der Metrik nach diesem Ereignis ausbrechen kann und sie nicht zu beachten. Sechstens: auf einer 96-Well-Platte im Durchschnitt 20 bis 50 Brunnen enthalten Sie Sphäroide in gewünschte Anzahl und Größe; Wir empfehlen die Brunnen für die Analyse vor der Einführung der Effektorzellen berücksichtigt werden, da es Rechenzeit sparen. Zu guter Letzt die Analyse ist teilweise automatisiert aber erfordert einige Eingaben vom Benutzer über die verschiedenen Parameter. Es wird dringend empfohlen, in diesem Schritt besonders achten und sich auf ein Gleichgewicht zwischen Sensitivität und Spezifität konzentrieren. Wenn der Typ der Effektor Zellen/medikamentöse Behandlung häufig innerhalb eines Experiments unterscheidet, kann es laufen verschiedene Arten der Analyse, die auszuwählen, die am besten notwendig sein.
Diese Methode ist bisher nur beschränkt auf eine bestimmte Art von adhärente Zell-Linie (in dieser Publikation HCT-116); Entwicklung ist weiter verpflichtet dieses Protokoll für jede Krebszelle Zeile verallgemeinern. Zwar bereits eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung, für eine größere Anzahl von Ziel Zellen12,13,14,setzen15, die meisten von ihnen auf den Einsatz von teuren und/oder komplexe Verfahren. Unsere Methode ist zwar ein paar Arten von Zielzellen so weit begrenzt interessant, da es sehr begrenzte Eingaben aus der Experimentator erfordert und einen schnellen und einfachen Bildschirm von verschiedenen Drogen und/oder Immuntherapie Behandlungen (hier Auto CD19-Zellen ermöglicht). Seine Zuverlässigkeit und seine Fähigkeit, verschiedene Arten von Behandlungen angepasst werden machen diese Methode ein mächtiges Werkzeug im Rahmen des Anti-Krebs-Behandlung Validierungsprozess.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Norwegischen Forschungsrat unter Stipendien #244388, #254817 und #284983 unterstützt; der norwegische Krebsgesellschaft (#6829007); Der norwegische Gesundheitsregion Süd-Ost unter Grant #17/00264-6 und #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
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