Bu iletişim kuralı immunotherapeutic yeniden yönlendirilen T-hücre (araba T-hücreli) sitotoksisite karşı 3D yapılandırılmış kanserli hücreleri (pulcuklarının) gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için tasarlanmıştır.
İmmünoterapi Aksi takdirde tedavi edilemez kansere karşı mücadele büyüyen ilgi alanı haline gelmiştir. Tüm immunotherapeutic Yöntemler arasında en çarpıcı sonuçlar, özellikle Pediatrik B akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ile elde edilen T hücreleri chimeric antijen reseptör (araba) yönlendirildi. Klasik doğrulama yöntemleri araba T hücrelerinin özgüllük kullanımı ve işlevselliği deneyleri hedef hücrelere süspansiyon ve xenograft modelleri karşı araba T hücrelerinin güveniyor. Ne yazık ki, tüp bebek yapılan gözlemleri kez vivo içinde elde edilen sonuçlar üzerinden decoupled ve çok çaba ve hayvanların bir adım daha ekleyerek bağışladı: 3D kültür kullanımı. Onlar hayvan modeli engrafted yükleyen tümör hücreleri 3D yapısını taklit potansiyel hedef hücrelere pulcuklarının üretim ideal bir alternatif temsil eder. Burada, evlat edinen hücre tedavisi (burada CD19 araba T hücreleri tarafından örneği) için bir doğrulama aracı olarak bir transduced kolorektal hücre satırından pulcuklarının üretmek için uygun fiyatlı, güvenilir ve kolay bir yöntem raporu. Bu yöntem küresel büyüme takip edebilirsiniz bir Gelişmiş canlı görüntüleme sistemi ile birleştiğinde, sitotoksisite ve tümör hücre apoptosis efektör hücreleri.
Evlat edinen hücre aktarımı (ACT) yeni nesil kanser muamele temsil eder. Efektör hücreler (T – veya NK-hücreleri) enjeksiyon bir hasta dayanmaktadır. Bu hücrelerin genetik olarak onlara onların hedefe, tümör, rehberlik ve onu yok bir reseptör ile değiştirilebilir. Son zamanlarda bu yaklaşım B-hücre işaretçisi CD19 karşı yönetmen Chimeric antijen reseptör (araba) hasta T hücreleri seçtiğin bu kullanıcı kanser1öldürmeye tanıttığında mümkün olduğu gösterilmiştir. Yapay bir reseptör olan araba söz konusu olduğunda tasarım spesifik antikor parçaları bir varlık belirlenmiş tek zincir değişken parçası (scFv), azaltılmış etki alanı bağlama antijen oluşur T-hücre sinyal etki alanlarına bağlı. Çeşitli tasarımlar olmakla birlikte, ikinci nesil araba tasarımları TCR sinyal için CD3z ve co-stimulatory etki alanı oluşur anılacaktır en çok kullanılan sürümleri (CD28, 4-1BB, OX40, vs.) 1 , 2. ne zaman CD19 araba-T hücreleri efficaciously B hücre maligniteler3,4ile çok sayıda hasta tedavi immünoterapi alan Yasası’nın bu yeni form dikkatini çoğunu yönetmen. Bu başarının, araştırmacılar diğer epitopları için sınırlı başarı ile solid tümör hedefleyerek benzer tasarımlar yararlanmaya çalıştı. Ne yazık ki, tümör belirli antijenleri ve araba T işlenen sert tümör microenvironments kıtlığı daha az etkili solid tümör5doğru hücreleri.
Şu anda, en sık kullanılan vitro doğrulama stratejileri yalnızca bir parçası zaten belirtilen solid tümör zorlukların adres iki boyutlu (2D) sistemleri üzerinde güveniyor. Klasik, 2D vitro sistemleri bu efektör hücreler özgüllük ve işlevlerinin değerlendirmek için monolayers araba T hücreleri ve hedef kanser hücre satırlarını içerir. Bu stratejileri önemli ve hayati parçaları çalışmaların olmakla birlikte, onlar karmaşık Morfoloji ve kanser hücreleri6üç boyutlu (3D) yapısını göz önünde değil. 3D sistemleri pulcuklarının anılacaktır, kültürlü kanser hücrelerinin yeni fenotipik özellikleri tanıma yeniden yönlendirilen efektör hücreleri tarafından etkisi gen ifade profil7, hangi değişiklikleri yoluyla elde. Birgersdotter ve arkadaşları bir Hodgkin Lenfoma (HL) hücre satırı yalnızca bir 3D kültür modelinde yetiştirilen birincil tümör örnekleri8‘ e benzer bir gen ifade profil tutar gösterdi. Bu nedenle, pulcuklarının veya benzer 3D metodolojileri teklif Standart 2D sistemleri karşı in vitro modellerinde daha alakalı kültür. Bu tür sistemlere de verilen bir araba doğrulama sürecindeki son adım olarak görülen içinde vivo çalışmalar benzer. 2D sistemleri kanser kümeleri morfolojisi taklit etmek başarısız göz önüne alındığında, pulcuklarının araba T hücreleri önce işlevselliğini değerlendirmek için benzer oluşumlar teklif içinde vivo modelleri. Bir çalışmada, Pickl vd. tanımlanan insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (HER2) kanser hücrelerinin overexpressing bir küresel model benzer sinyal profilleri içinde vivo modelleri9gösterdi. Bunu daha fazla pulcuklarının araba T hücrelerinin daha alakalı ve Kapat ve içinde vivo değerlendirme teklif destekler. Ayrıca, araba T-hücre doğrulama pulcuklarının karşı daha eleştirel onların etkinliğini değerlendirmek ve bazı tasarımlar içinde vivo çalışmalar için erken hareket etmesini önlemek yardımcı olabilir10; Böylece, etik ilgili araştırma için daha az sayıda hayvan kurban ederek katkıda. Ayrıca, pulcuklarının kullanarak iletişim kuralları klasik 2D sistemleri daha ve çok daha hızlı klasik içinde vivo çalışmalar ile karşılaştırıldığında daha pahalı değildir. Birlikte ele alındığında, tüp bebek ve içinde vivo çalışmalar bağlamak için standart bir uygulama haline yakında küresel çalışmalar dahil kimse tahmin edebilirsiniz.
Burada, kolon kanseri hücre satırından HCT 116 pulcuklarının hazırlanması mevcut. Bu hücre kültürünü insan CD19 molekül CD19 araba T hücreleri hassas işlemek için ve klinik olarak doğrulanmış bir araba inşa kullanarak öldürme net bir değerlendirme sağlamak için hızlı şekilde değiştirilmiştir.
Gelecekteki kanser tedavisi doğrulamak için yenilikçi bir araç olarak pulcuklarının kullanımı son yıllarda giderek artan ilgi alanı haline gelmiştir. Pulcuklarının klasik 2D tüp bebek analiz ve içinde vivo değerlendirme arasında bir ara adım temsil eder. Yöntemi daha fazla söz7profil oluşturma gen yanı sıra mikro-çevre tümörü taklit eden açısından onların potens ile ilgili bir çok tutar. Bu yayında sunulan Protokolü Saheen adapte vd.11</…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser hibe #244388, #254817 ve #284983 altında Norveç Araştırma Konseyi tarafından desteklenen; Norveç Kanser Derneği (#6829007); Norveç Sağlık bölge Güney Doğu Grant #17/00264-6 ve #2016006.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |