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Medicine

左心房狭窄による肺静脈動脈化術とグループ 2 肺高血圧症ラット

doi: 10.3791/58787 Published: November 18, 2018
* These authors contributed equally

Summary

左心房狭窄 (LAS) はグループ 2 肺高血圧症 (PH) と肺静脈の本来のメカニズムを研究するために使用される外科的手法です。ここでは、肺静脈動脈化術を引き起こすし、PH をラットに適度なチタン クリップを使用して左心房を収縮するプロトコルを提案します。

Abstract

僧帽弁狭窄症による肺静脈動脈化術とグループ 2 肺高血圧症 (PH) のメカニズムは明確ではありません。グループ 2 の齧歯動物モデルがない PH、僧帽弁狭窄症 (MS)、疾患のメカニズムや潜在的な治療戦略の検討を容易にするため。肺静脈うっ血による肺静脈本来、グループ 2 の新規ラット モデル左心房狭窄 (LAS) による PH。ラスは、半分閉じたチタン クリップを使用して左心房の収縮によって実現されます。ラス術後後僧帽弁流入速度のより大きいモデルまたは心エコー上 2.0 m/s と等しいラット徐々 に肺静脈動脈化術とグループ 2 を開発 8-10 週間の期間で PH。このプロトコルではラスベガス手術を実行する方法のステップバイ ステップの手順を提供します。ラスの示されたラット モデル人間の MS を模倣し、肺静脈動脈化術の基盤となる分子機構の研究やグループ 2 の治療法の臨床評価のために役立ちます PH。

Introduction

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この資料の目的は、ラットでラス手術を実行する方法のステップバイ ステップの手順をデモンストレーションすることです。手術によるラスは、密接に MS を模倣と cor1左心房の機械的閉塞の作成を含む人間の三。左心室 (LV) 流入の多い閉塞肺静脈循環の渋滞が発生し、患者は徐々 に PH を開発します。世界保健機関は、PH2,3,4の最も一般的なグループであるグループ 2、左心疾患により PH を分類します。左心疾患患者における PH の診断に関連付けられて 1 年標準化された死亡率4の 7 倍増加より大きいを。現在、グループ 2 の承認された治療がない基になる治療から離れて PH 左心疾患 (例えば、僧帽弁狭窄の外科的交換)。ただし、有効な僧帽弁置換術は MS5症例の半分までで完全に PH を解決しません。この永続的な PH は改造のために不利な肺血管、不十分と理解されています。したがって、動物モデル、グループ 2 で不利な肺血管のリモデリングの分子メカニズムの私達の理解を高めることに重要な PH です。

横大動脈バンド8,9,10齧歯動物では最もよく使用されるグループ 2 PH 動物モデルとグループ 2 博士冠動脈結紮67のいくつかの動物モデルがあります。これらのモデルの主な欠点は、グループ 2 PH 研究の結果を解釈することは困難になる LV の関与です。対照的に、LV はラスベガス モデルにそのまま残ります。さらに、10 週間期間11以上 PH の遅く、進歩的な開発になるために、ラス モデルは臨床的に関連します。ヒトでは、僧帽弁ドップラー流速 2.0 m/s11より大きく、我々 はまた、カットオフとしてラス手術が有意な狭窄を生み出したかどうかを決定するためにこの番号を使用する場合に MS が重要と見なされます。さらに、ラスベガス モデルは、軽度または中等度の PH を生成するが、人間の患者、すなわち肺静脈動脈化術11の開発と同様、特性の組織学的変化を示しています。ラス ラット モデルが斬新で、臨床的に関連するグループ 2 PH 保存左心室機能搭載です。永続的な肺血管リモデリング、分子標的を識別する、グループ 2 の新規治療法をテストの病態生理を勉強に適しています PH。

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Protocol

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ラスの実験的プロトコルは、東京慈恵会医科大学大学院の医学動物ケア委員会と大学研究倫理委員会 (プロトコル #2015-118) によって承認されています。

1. 術前準備

  1. 動物実験施設に到着後、5 週齢雄スプレイグ ラット操作の前に彼らの新しい家に順応するまでの 1 週間で 150 に 200 g の間を提供します。
  2. オートクレーブに入れることによって手術前に次の機器を準備: 1) の小動物人工呼吸器、2) 麻酔器、3) 挿管キット (止血鉗子、舌圧子、18 G 血管カテーテルのペアの構成)、4) 手術器具 (カーブタイプ鉗子のペアなどストレート ピンセットのペア、針ドライバー、胸リトラクター、はさみのペア、5-0 のモノフィラメント縫合糸、クリップ アプリケータ、中型大型クリップ 23 G 胸管)。
  3. 滅菌綿棒、ガーゼ出血に対処する準備ができているあります。
  4. 手術中に動物体の温度 37 ° C 前後を維持するために加熱パッドを使用します。

2. 麻酔、気管内挿管

  1. 2 L/分部屋の空気と混合 5% イソフルランと部屋に誘導ラットを麻酔します。
  2. 挿管前に毛シェーバーとラットの胸毛を剃るし、細い髪を削除する脱毛クリームを適用します。
  3. 挿管前に十分な麻酔を確認するペダルの反射を確認します。
  4. 文字列で前歯をフックし、2 本のピンを持つ文字列を保護します。
  5. 止血鉗子でラットの口を開き、口の中に舌圧子を挿入します。
  6. 声帯を視覚化する舌圧子を持ち上げます。
    注: それは声帯を視覚化するためにラットの頭部に強い光を当てると便利です。
  7. 気管に気管内チューブとして 18 G 血管カテーテルを挿入し、すばやく、レスピレーターにカテーテルを接続します。
  8. 100 呼吸/分の呼吸速度とグラム当たり 10 μ L を一回換気量を設定します。
  9. 2 リットル/分の部屋の空気と混合 2% イソフルレン麻酔を維持します。

3. 手術部位の準備

  1. クロルヘキシジン ・ アルコール x3 のスクラブを交互に手術部位を準備します。
  2. ブプレノルフィンを与える 0.01 mg/kg 皮下。
  3. 滅菌ドレープでラットをカバーします。
  4. 成功した挿管や麻酔の維持を確認するためペダルの反射を確認します。

4. 左心房狭窄手術

  1. ルールとラットの左の脇下 2 cm 切開部位をマークします。
  2. はさみのペアで胸部側面壁切開を左 2 cm を作る。
  3. 4 番目と胸腔に入るまでストレートとカーブタイプ鉗子を使用して 5 番目の肋骨の間の肋間筋を区切ります。
  4. 胸リトラクターを胸腔内に挿入します。胸腺と心の直接可視化を取得する肋間筋を分離する直線と曲線の鉗子を使用し続けます。
  5. ストレート ピンセットのペアで胸腺を持ち上げます。はさみのペアで中心部をカバーする胸腺を削除します。切断または任意の主要な血管に突っついてを避けてください。
  6. 慎重に右下左心耳、左心室の表面を 5-0 のモノフィラメント縫合糸を渡します。主要な冠動脈に針を刺してを渡すことを避けるため。
  7. 後の縫合は、場所、重大な出血、ネクタイ緩い結び目がないです。
  8. 縫合糸を引き上げ、胸の中心を持ち上げるに転送。
  9. 胸から心臓を持ち上げたが、一度は、僧帽弁の真上、左心房に中型大型クリップをすばやく適用します。
    注: クリップは途中閉鎖、左心房、左心房狭窄の原因を挟むクリップの先端であります。
  10. すぐに胸に戻って心を置きます。心がない 30 以上の胸の外側を確認 s。
  11. 中心部を持ち上げるために使用宿泊縫合を削除します。
  12. 簡単な中断されたパターンを使用して 5-0 モノフィラメント縫合糸で胸部を閉じます。
  13. 胸に 10 mL の注射器に接続されている 23 G 胸管を挿入、胸の壁の筋肉や簡単な縫合で皮膚を閉じると進みます。
  14. 空気、血液、および経由で胸水を注射器 10 cc 添付と、プル、チューブを使用して挿入されたドレーンを描画します。
  15. 簡単な中断されたパターンを使用して 5-0 モノフィラメント縫合と皮膚の層を閉じます。
  16. ブプレノルフィンを与える 0.01 mg/kg 皮下。
  17. イソフルランをオフにします。
  18. 自発呼吸を観察後、人工呼吸器を外します。
  19. 挿管ラットを維持し、それが目覚めるまで加熱パッドで回復します。
  20. 安全に extubate 後次の徴候の 1 つ以上されているラットの観察: ラット動こうとその 4 つの手足、その立ち直り反射が回復、咽頭反射が回復または自発的な排尿が表示されます。

5. 手術後のケア

  1. すべての 8-12 h、与えるブプレノルフィン 0.01 mg/kg 皮下。カルプロフェン 5 mg/kg を与え皮下日常的に 2 日間、その後、必要に応じて、ラットは井戸の周りが動いていないのように見えるそれは痛みでは。
  2. ラット水栓、術後すぐから飲酒問題がありますと、手術後の右通常生理食塩水 5 mL を皮下与えます。

6. 心エコー法による左心房狭窄の成功の確認

  1. 左室流入速度を決定するため手術後 2 週間経胸壁心エコー検査を実行します。
  2. 手順 1 に記載されているラットを麻酔します。
  3. 麻酔導入後に、鼻の円錐形を用いた 2 L/分部屋の空気と混合 2% イソフルラン麻酔を維持します。
  4. ラットの胸部壁毛シェーバーでひげをそるし、脱毛クリームを使用して、残りの髪を削除します。
  5. 胸の左側にある第 5 肋周辺にある中心部の頂点に超音波プローブを配置します。4 部屋の眺望が得られるまで、プローブをこの地域に移動します。
  6. 僧帽弁輪のすぐ上のパルス波ドップラー モードを使用して左室流入速度を測定します。
  7. 2.0 m/s を超える LV 流入速度は 8-10 週間後ラスベガス手術で中等度の肺高血圧症の開発のため必要です。

7. 偽の操作

  1. クリップ (ステップ 4.9) を適用するを除いて年齢をマッチさせた、sham コントロール (SOC) ラットを作成する上記のすべての手順を実行します。

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Representative Results

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心エコー検査、術後 2 週間を使用して、ラスベガスの有効性を確認します。LV の流入速度が 2.0 m/s、4 室表示と測定を超えるとラットは有意な狭窄症 (図 1) を開発し、適度な PH および肺静脈動脈化術 8-10 週間後ラスベガス手術を確実に開発すると見なされます。

10 週間後ラスベガス外科ラス群ラット表示左心房拡大 (図 2 b)、肺うっ血 (図 2 e)、右心室 (RV) 圧負荷 (図 2 f)、および増加の肺静脈血流 (図 2 階G) SOC グループ (図 2 a-E) のラットと比較して。また増加の右心室収縮期血圧にある、ラスベガス グループSOC グループ (図 3)。病理組織検査で肺の断面弾性バン維 (EVG) で染色を示します (PA) 増加した肺動脈と肺静脈 (PV) 内側の厚さと増加 PV 寸法、ラスベガス グループで SOC グループ (図 4 a-D)。さらに、α-平滑筋アクチン (αSMA) 免疫染色は、PA と、ラスコントロール群 (図 4 e,F) の太陽光発電の平滑筋細胞数の増加を示しています。したがって、ラスベガス モデル muscularization PA でラス ラットの PV が増加します。

ラスベガス グループに SOC のグループを比較する手術パラメーターを表 1にまとめます。具体的には、RV-重量比および肺-重量比が大幅増加、ラスベガス グループで SOC グループ。右心室収縮期圧、右室拡張末期圧、推定ラ圧力などの血行動態的パラメーターが大幅に SOC グループ (表 1) と比較してラスベガス グループで増加します。

Figure 1
図 1: 偽駆動制御 (SOC) の左室流入速度を比較する代表的な心エコー検査(LAS) ラット心房狭窄します。(A) 4 部屋ビューと対応する SOC ラットの色ドップラー エコー。(B) 4 室流入速度とラス ラットの対応する色のドップラー エコー。(C) ピーク左室流入速度、SOC ラット (0.94 m/s)(D) のラス ラット (2.12 m/s)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 偽駆動制御 (SOC) 代表的な巨視的および心エコー所見左心房狭窄 (LAS) ラット 10 週間手術後。(A) 肉眼所見、SOC ラット(B) ラス ラットから心から心臓の左心房の拡張を示す。ブラック スケール バーは、SOC ラット(D)、ラス ラット肺肺うっ血を表わすから 1 cm。 (C) 肺の肉眼所見を表します。(E) 心エコー短軸ビュー、SOC ラット(F) ラス ラット心室中隔が平坦化を示すの増加右室自由壁の厚さ。(G) 肺静脈血流、SOC ラットラス ラット (H) を示したは、太陽光発電の流入を増加しました。この図を再現、藤本から変更11権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 偽駆動制御 (SOC) ラットの代表的な血行動態記録ラス ラットにおける右室 (RV) 圧力の増加が左心室 (LV) 圧力に差が認められなかった左心房狭窄 (LAS) ラット。図を再現、藤本から変更11権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 偽駆動制御 (SOC) の代表的な組織学的変化左心房狭窄 (LAS) ラット、術後後 10 週間。肺染色弾ヴァン維 (EVA) ショー (A B) 断面増加肺動脈 (PA) (C D) 肺静脈 (PV) 厚みとラスベガス グループで太陽光発電の増加寸法。Α-平滑筋アクチン (αSMA) 染色 (E F) の血管壁で積極的に陽性細胞数の増加を示しています PA と (G H) ラスベガス グループの太陽光発電。スケール バーは、100 μ m を表します。この図を再現、藤本から変更許可を得て11 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

施行中のパラメーター SOC グループ (n = 5) 列 1 ラスベガス グループ (n = 5) 列 2 列 3
中央値 デュラセル 中央値 デュラセル P 値
BW 操作 (g) 195 190-205 194 190-208 0.98
BW 犠牲 (g) 416 410-420 452 390-505 0.65
RV 重量/BW 0.39 0.38 0.43 0.54 0.50 0.59 < 0.01
LV 重量/BW 1.91 1.85 1.95 1.98 1.78 2.20 0.69
RV 重量/左心室重量 0.2 0.22 0.19 0.27 0.27 0.28 < 0.01
肺重量/BW 0.37 0.36 0.41 0.47 0.42 0.51 < 0.01
心臓カテーテル検査
養豚 (mmHg) 18 16-20 40.6 30-50 < 0.01
還流 (mmHg) 1.6 1.0 2.0 3.4 3.0 から 4.0 < 0.01
LVSP (mmHg) 84 60-80 77.6 70-80 0.72
LVEDP (mmHg) 2.8 2.0 3.0 7.6 7.0 8.0 0.013
養豚/LVSP 0.22 0.15 0.27 0.52 0.54 0.60 0.021
推定ラ圧力 (mmHg) 7.9 6.8 8.4 28.1 22.8 27.0 < 0.01

表 1: 手術や心臓カテーテル検査パラメーターと sham 対照群と左心房狭窄群で推定左心房圧。略語: SOC = 偽作動制御;ラス = 左心房狭窄;デュラセル四分位範囲を =BW = 体重;養豚 = 右心室収縮期血圧;還流 = 右心室拡張末期圧;LVSP = 左の心室のシストリック圧力;LVEDP = 左心室拡張末期圧;ラ = 左心房です。このテーブルを再現、藤本から変更11権限を持つ。

補足図 1: クリップの配置とクリップの閉鎖の堅さのランドマーク。肺動脈の基部の横にクリップの (A) 1 つの端を置きます。クリップのもう一つの端 (B) は冠静脈洞の真上に配置左心室全体。クリップ (C) ようにしてください途中で閉じ、両端だけ互いに接触します。この図をダウンロードするここをクリックしてください

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Discussion

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ラスのラットは、既にフィールド12,13の研究者から大きな関心を受けた新規グループ 2 PH モデルです。2 つの既存グループ 2 モデル、すなわち、肺静脈狭窄 (PVS) モデル14豚と supracoronary 大動脈バンディング (SAB) ラット モデル8,を使用すると比較する9,10、ラス ラット モデルにはいくつか利点。PVS ピグレット モデルと比較して、ラスベガスのラットモデルを生成する以下のコストし、ラットの手術は子豚でないほど複雑です。最もよく使用されるグループ 2 PH 動物モデル、グループ 2 の病態である SAB ラット モデルに比べて PH ラスベガス モデルでは以下の SAB モデルのより複雑な大動脈バンディングまず肺を開発する前の左心室障害を原因として渋滞や PH。そうだラスと SAB モデル齧歯動物では、グループ 2 の病因を理解するための補助ツールになります PH。

ラス手術の 2 つの最も重要な手順は、宿泊縫合の配置と金属製のクリップのアプリケーションです。宿泊縫合の配置に関する選択肢縫合は重要です。切削針で縫合を避けてください。それを生成する以下のドラッグと摩擦左心室を通過するときは、モノフィラメント縫合糸を使用します。金属製のクリップのアプリケーションに関する表面のランドマークを識別することが重要です。クリップの一方の端は理想的に肺トランクと LV (補足図 1) 全体中間冠状静脈洞の真上に配置その他の最後のベースの横に配置されます。クリップする必要があります途中で閉じ、両端だけお互い (補助図 1 C) に触れるので。

ラス ラットのモデルには、いくつかの制限があります。まず、ラスベガス モデルは 40 mmHg に11PASP 適度な PH を生成することだけです。厳しい心房クリップを使用してきましたが、手術死亡率は結果として有意に増加しました。第二に、高速鼓動した希望のランドマークでクリップを正確に配置することは困難。その結果、成功率は約緩いバンドまたは不適切なクリップの配置のための 50% です。ストッパーを変更されたクリッププライヤ クリップ圧迫感の一貫性を向上させるでしょう。第三に、現在利用可能な技術では、まだ直接肺動脈圧と肺毛細管楔入ラットモデルでの圧測定を得ることが困難です。最後に、人間の PH を PH ラットモデルの分子メカニズムの忠実度は、疑問が残ると活発な調査の領域。

これらの制限にもかかわらずラス ラットは臨床的に関連する、経済的なおよび再現可能な小さな動物モデル病態とグループ 2 の分子機構を研究するために適している PH および肺静脈動脈化術。それはまたグループ 2 を治療するために開発した新規治療法の臨床試験のため主力として使用できます PH。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、科学振興 (JSPS) サマー プログラム Mitacs 日本社会を認めます。熊イク Ping は、東京慈恵会医科大学医学部を訪問する、Mitacs JSPS サマー ・ プログラムからの資金によって支えられました。博士南沢は、日本の技術 (スウェン) 戦略研究財団でプライベート大学 (スウェン)、自動車レースの記念のための MEXT-Supported プログラム科学の一部サポートされて財団 (スウェン) し、東京慈恵会医科大学大学院研究基金 (スウェン) このプロジェクトを支援します。アーチャー博士は米国国立衛生研究の健康 (NIH) の助成金 NIH 1R01HL113003 01A1 (S.L.A.) と NIH は革新のためのカナダの基盤、層 1 カナダ ミトコンドリア動態と臨床リサーチ チェア (S.L.A.) を 2R01HL071115-08 で一部サポートされて医学 (S.L.A.)、ウィリアム j. ヘンダーソン財団、カナダの血管ネットワーク、および女王の心肺装置 (QCPU)。

著者は、氏忠小久保、チーフの学術情報センター、東京慈恵会医科大学医学部、ビデオの撮影のための写真サービスをご了承ください。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 Prolene Suture Johnson & Johnson - Ethicon 8725H Polypropylene suture with HEMO-SEAL Technology
Anaesthesia Machine Wakenyaku Co., Ltd. BRTK-100A Air pump and anaethesia machine
Angiocatheter guidewire Self-made 10 cm guidewire glued to a 1 cc syringe 
Chest retractor Natsume Seisakusho Co., Ltd. F-2
Chest tube 23G Self-made 10 cc syringe attached to a 23G needle plus plastic tube
Curved forceps Natsume Seisakusho Co., Ltd. A-14
Heating pad Vivaria MP-916-NV Keep body temperature at 37 degree celsius
Horizon Ligating Clips Teleflex REF 003200 Size Medium-Large
Horizon Manual-Load Ligating Clip Applier For Medium-Large Size Horizon Teleflex REF 337085 Ligation Clips Angled Jaw, (20cm)
Needle holder Natsume Seisakusho Co., Ltd. MC-40
Rodent Respirator CWE Inc SAR-830/P Small animal ventilator
Scissors Natsume Seisakusho Co., Ltd. B-12 Straight scissors ideally with round tips
Straight forceps Natsume Seisakusho Co., Ltd. A-7
Tongue depressor Uchida Yoko Co., Ltd. 8-615-2417 Use the wide end

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References

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左心房狭窄による肺静脈動脈化術とグループ 2 肺高血圧症ラット
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Cite this Article

Xiong, P. Y., Baba, S., Nishioka, N., Fujimoto, Y., Archer, S. L., Minamisawa, S. Left Atrial Stenosis Induced Pulmonary Venous Arterialization and Group 2 Pulmonary Hypertension in Rat. J. Vis. Exp. (141), e58787, doi:10.3791/58787 (2018).More

Xiong, P. Y., Baba, S., Nishioka, N., Fujimoto, Y., Archer, S. L., Minamisawa, S. Left Atrial Stenosis Induced Pulmonary Venous Arterialization and Group 2 Pulmonary Hypertension in Rat. J. Vis. Exp. (141), e58787, doi:10.3791/58787 (2018).

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