Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Двух Фотон изображений микроглии процессов притяжения к СПС или серотонина в острой мозга фрагментов

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58788
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, *1,2,3, *1,2,3
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Микроглии, резидентов иммунных клеток головного мозга, быстро реагировать с морфологические изменения изменения окружающей их среды. Этот протокол описывает, как использовать двух Фотон микроскопии для изучения притяжения микроглии процессов к серотонина или АТФ в кусочки острый мозга мышей.

Abstract

Клетки микроглии являются резидентов врожденные иммунные клетки головного мозга, которые постоянно сканировать их окружающей среды с их длинные процессы и, после нарушения гомеостаза, претерпевают быстрое морфологические изменения. Например лазер поражением индуцирует в течение нескольких минут ориентированный рост микроглии процессов, также называется «направленного подвижности», к месту травмы. Подобный эффект можно получить путем предоставления локально АТФ или серотонина (5-гидрокситриптамин [5-HT]). В этой статье мы опишем протокол побудить направленный рост микроглии процессов к местного применения СПС или 5-HT в острой мозга ломтики молодых и взрослых мышей и образ этот аттракцион с течением времени путем multiphoton микроскопии. Предложен простой метод количественной оценки с бесплатным и открытым исходным кодом изображения анализа программного обеспечения. Задача, которая по-прежнему характеризует кусочки острый мозга является ограниченное время, уменьшается с возрастом, в ходе которой клетки остаются в состоянии физиологического. Этот протокол, таким образом, освещаются некоторые технические усовершенствования (средний, воздух жидкий интерфейс камеры, изображение камеры с двойной перфузии), направленные на оптимизацию жизнеспособность Микроглии клеток в течение нескольких часов, особенно в ломтики от взрослых мышей.

Introduction

Микроглии клетки мозга-резидентов макрофаги и играть определенную роль в обоих физиологических и патологических условиях1,2. Они имеют весьма разветвленная Словотолкование и постоянно расширяя и втягивания их процессы3,4. Это «сканирования» поведение считается соответствующие и необходимые для обследования их окружение. Морфологическая пластичность микроглии выражается в трех режимах. Во-первых, некоторые соединения быстро модулировать микроглии Морфология: ATP5,6 или NMDA5,7 в средне-купание кусочки острый мозга увеличивает сложность микроглии последствия, в то время как норадреналина уменьшает его6. Эти эффекты являются непосредственно при посредничестве микроглии рецепторов (для СПС и норадреналина) или требуют АТФ-релиз от нейронов (NMDA). Во-вторых скорость роста и втягивание микроглии процессов, называемый подвижности или «надзор», могут быть затронуты внеклеточных факторов8,9,нарушения гомеостаза10или мутации9, 10,11. В-третьих помимо эти изотропной изменения морфологии и моторики, микроглии имеют потенциал для расширения их процессы направленно к пипетки доставки СПС3,5,12, 13 , 14, в культуре, в острой мозга ломтиками или в естественных условиях, или доставки 5-HT в острой мозга ломтики15. Такой ориентированный рост микроглии процессов, также называемый направленного моторики, впервые был описан как ответ на местные лазерной поражения3,4. Таким образом, физиологически, он может быть связанных с ответ на травмы или необходимых для ориентации микроглии процессов к синапсов или регионах мозга, требующие обрезки во время развития15,16, или в физиологических17 ,18,19 или патологических ситуаций9,18,19,20 в зрелом возрасте. Три типа морфологических изменений полагаются на различных внутриклеточных механизмов11,13,20, и один из данного соединения не обязательно модулировать все из них (например, NMDA, который действует косвенно на Микроглии, имеет влияние на морфологию, но не побудить направленного моторики5,7). Поэтому когда целью охарактеризовать воздействие соединение, мутации или патологии на микроглии, важно характеризуют три составляющих их морфологическая пластичность. Здесь мы описываем метод для изучения направления роста микроглии процессов к локальный источник соединения, который находится, здесь, АТФ или 5-HT.

Существует несколько моделей для изучения процессов микроглии притяжения: основных культур в 3D среде6,18,19, острый мозга ломтиками6,13,15и в естественных условиях изображение3,13. В естественных условиях подход является лучшим для сохранения физиологического государств микроглии. Однако прижизненной визуализации глубоких регионов требует сложных хирургических процедур, и, таким образом, это часто ограничивается поверхностных корковых слоев. Использование основной культуры микроглии является простой способ проверить большое количество условий с ограниченным количество животных. Тем не менее это невозможно для получения же морфологии клеток как в естественных условиях, и клетки теряют их физиологические взаимодействия нейронов и астроциты. Острый мозга фрагменты представляют собой компромисс между этими двумя подходами. Эта модель позволяет исследователям для изучения структуры мозга, которые иначе трудно достичь и изображений с высоким разрешением в естественных условиях и расследовать кусочки от новорожденных этапах, тогда как транскраниальной микроскопии осуществляется главным образом в зрелом возрасте. Наконец он делает его возможным для наблюдения в режиме реального времени эффекты применения местных наркотиков и повторить эксперименты, используя ограниченное количество животных. Тем не менее проблема с ломтиками острой мозга является ограниченное время (несколько часов), во время которой клетки остаются живы, особенно для фрагментов от мышей, старше, чем две недели и потенциальные изменения морфологии микроглии течение времени21,22 .

Здесь мы описываем протокол подготовить острый мозга ломтики молодых и взрослых Cx3cr1GFP / + мышей до двух месяцев, с сохранением микроглии морфологии и подвижность на несколько часов. Затем, мы, описывают, как использовать эти фрагменты для изучения притяжения микроглии процессов к соединений, как АТФ или 5-HT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты были утверждены местным этическим Комитетом (Darwin Комитет, соглашений #1170 и #10921).

1. Подготовка стекла Micropipettes для местного применения соединений

  1. Подготовьте пипетки из боросиликатного стекла тонкостенных капилляров с съемника электродный. Отрегулируйте значения параметров для получения пипетки с диаметром 4-5 мкм на их конечности. 2D рисунок показывает один из пипетки в brightfield при низком увеличении.

2. решения

  1. Убедитесь, что только посуда, которая была очищена от автоклавный цикл, следуют промывки 2 x - 3 x с ультрачистая вода, будет использоваться. Никогда не используйте посуда, которая соприкасалась с параформальдегида.
  2. Готовить 2 mol· L-1 CaCl2 Стоковый раствор путем растворения 14,7 мг CaCl2·2H2O в 50 мл воды высокой чистоты (ультрачистая вода, сопротивление 18.2 MΩ; следы металла в дистиллированной или водопроводной воды может привести к неоптимальной ломтик качества из-за про окислительная эффекты).
    1. Храните этот раствор при комнатной температуре не более одного месяца.
  3. В день эксперимента Подготовьте 1 Л раствора холин Фаго (искусственные спинномозговой жидкости), состав которого является 110 mmol· L-1 холина Cl, 25 mmol· L-1 глюкозы, 25 mmol· L-1 NaHCO3, 7 mmol· L-1 MgCl2, 11,6 mmol· L-1 аскорбиновой кислоты, 3.1 mmol· L-1 пируват натрия, 2,5 mmol· L-1 KCl, 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4и 0,5 mmol· L-1 CaCl2, 0,5.
    1. Подготовить этот решение, добавить, в следующем порядке, чтобы флакон 1 Л закончил: 0,186 г KCl, 0,195 g NaH2PO4, 2.04 g кислота аскорбиновая, 2.1 g NaHCO3и 4,5 г глюкозы.
    2. Заполнить около половины окончательного объема сверхчистый водой и перемешать до полного растворения.
    3. Добавление 0,34 г пируват натрия и 15.36 g холина Cl.
      Примечание: Это удобно для первого растворить холина Cl с 5 до 10 мл раствора, подготовленную на этапе 2.3.2 перед его добавлением в целом решение.
    4. Добавление 7 мл 1 mol· L-1 MgCl2 и 250 мкл 2 mol· L-1 CaCl2 (подготовленных на шаге 2.2) в решение.
    5. Заполните окончил колбу до 1 L с ультрачистая вода.
    6. С давлением пара осмометре проверьте, что осмолярности между 300 и 310 mΩ. Если нет, то настроить его с глюкозой.
    7. Проверить рН после carbogenation (то есть пузырьков с «Карбоген», смесь 95% O2/5% CO2) и настроить его, при необходимости, 7.3-7.4 с 10 M NaOH.
    8. Передача решения в стеклянной бутылке для хранения. Держите бутылку в холодильник до использования (шаг 3.1).
      Примечание: Рекомендуется сделать свежий раствор в день эксперимента. Однако при необходимости, холин фаго может храниться до двух дней при 4 ° C.
  4. В день эксперимента Подготовьте 1 Л раствора фаго, состав которого является 124 mmol· L-1 NaCl, 26.2 mmol· L-1 NaHCO3, 25 mmol· L-1 глюкозы, 2,5 mmol· L-1 KCl, 2 mmol· L-1 CaCl2, 1 mmol· L-1 MgCl2и 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4.
    1. Подготовить этот решение, добавить, в следующем порядке, окончил колбу: 0.150 g NaH2PO4, 0,186 г KCl, 2,2 g NaHCO3, 4,5 г глюкозы и 7,3 г NaCl. Принести решение объемом 1 Л с ультрачистая вода и размешивать энергично на табличке, перемешать.
    2. Добавьте 1 mL 1 mol· L-1 MgCl2 и 1 мл 2 mol· L-1 CaCl2 решения и передачи решения фаго стеклянной бутылки для хранения.
    3. Проверьте, является ли осмолярности 300-310 mΩ· L-1 и если нет, измените его с глюкозой.
    4. Проверить рН после carbogenation (то есть пузырьков с «Карбоген») и настроить его, при необходимости, 7.3-7.4 с 10 M NaOH.
    5. Передача решения в стеклянной бутылке для хранения. Держите бутылку в холодильник до использования (шаг 3.1).
      Примечание: Рекомендуется сделать свежий раствор в день эксперимента. Однако в качестве альтернативы можно подготовить 10 x запасов раствор, содержащий NaCl, NaHCO3, KCl и NaH2PO4 10 x конечной концентрации, которые могут храниться в течение не более чем за одну неделю на 4 ° C. Сделайте окончательный фаго в день эксперимента разбавления 10 x Стоковый раствор с ультрачистая вода и добавляя глюкозы, CaCl2и MgCl2.
  5. Подготовка решений наркотиков в день эксперимента. Используйте фаго решение довести их до окончательного концентрации, которые здесь 500 µmol· L-1 для СПС и 5 µmol· L-1 для 5-HT.
    Примечание: Для ATP, может быть подготовлен Стоковый раствор (например, 50 мм АТФ в воде), хранится в aliquoted форме при-20 ° C и разбавляют фаго до конечной концентрации в день эксперимента. В противоположность этому решение 5-HT (серотонин HCl) должны готовится из порошка в день эксперимента, в 1 mg·mL-1 в воде, хранить при 4 ° C, чтобы избежать окисления 5-HT и разводят в фаго во время эксперимента.

3. подготовка мозга, острый ломтиками

  1. Подготовка области рассечение
    1. Подготовьте 70 мл ледяной холин фаго в 80 мл стакан, размещены на льду, использоваться для сердца перфузии, быстрого охлаждения мозга и нарезки. Подготовка 150 мл холин фаго в 200 мл кристаллизующийся блюдо, помещены в ванну с подогретой водой, поддерживается на 32 ° C. Место сетчатый нейлон в кристаллизации блюдо сохранить срезы. Это будет использоваться, чтобы восстановить за 10 мин после нарезки ломтиков.
    2. По крайней мере 30 минут до начала рассечение (статья 3.2), начало восходящей эти два решения (70 мл холин фаго на льду) и 150 мл холин фаго 32 ° c с Карбоген. Поддерживать постоянное carbogenation в течение всей процедуры.
    3. Подготовьте устройство камеры интерфейса (рис. 1 c), который будет использоваться для сохранения фрагментов до их использования.
      1. В запечатанных пищи поле (10 x 10 см или 10 см в диаметре, 8 см в высоту), установленных на магнитной мешалкой, место 200 мл кристаллизующийся блюдо с баром магнит.
      2. Добавить 200 мл фаго в этом кристаллизации блюдо и место держатель фрагмент 3D-печати интерфейс поверх него (интерфейс ломтик держатель состоит из двух совершенно установку частей, полиамид сеткой, натянутой между ними, Рисунок 1A, B).
      3. Удалите избыточный объем из кристаллизации блюдо держать только тонкая пленка решения, охватывающего сетки держателя фрагмент интерфейса. Позднее это создаст тонкой оправе раствора вокруг ломтики (но без покрытия их).
      4. Положите несколько миллиметров фаго в нижней части окна продовольствия и начать кипит Карбоген (при первом использовании, сделать небольшое отверстие в стене ящик запечатанных пищи чтобы убедиться, что трубы можно ввести поле).
      5. Закройте окно запечатанном при сохранении постоянной carbogenation. Это создаст увлажненные 95% O2/5% CO2 богатую среду в котором ломтики будут переведены после их восстановления в холин фаго и поддерживается до того, как они отражаются. Это устройство далее именуемые как «интерфейс палата» (рис. 1 c).
  2. Рассечение мозга и нарезки
    1. Анестезировать мыши с внутрибрюшинной инъекции-1 Пентобарбитал 50 mg·mL (0,15 мл/20 г веса тела мыши), обездвижить его, разоблачить сердце и выполнять сердечной перфузии с 10 мл ледяной, carbogenated, холин Фаго (см. шаг 3.1.1), с перистальтического насоса. Наблюдать за бледность печени как показатель хорошего перфузии. Перфузии длится менее чем за 5 мин.
    2. Обезглавить мыши и вырезать кожу подвергать черепа. С большой ножницами применяются два поперечных разрезов от большого отверстия и один длинный Сагиттальный разрез и, с помощью тонкой щипцы, удалите череп пластины.
    3. Быстро и аккуратно извлечь мозга (в менее 1 мин) и поместите его на 1 мин в стакан 80 мл, содержащий остальные (~ 60 мл) ледяной холин Фаго (все еще под постоянным carbogenation), для того чтобы охладить его.
    4. Передача мозг на фильтровальной бумаги, ранее промокните фаго.
    5. Вырежьте мозг мозга регионе интереса и нужного угла нарезки. Например для изображения таламуса или гиппокампа на корональные срезы, вырежьте с лезвием скальпеля мозжечка и, затем, примерно 2 мм от ростральной и хвостового конечностей, головного мозга.
      Примечание: Важно удалить части мозга, которые слишком ростральной или слишком хвостового потому что чем меньше региона обрезать до достижения области интересов, тем быстрее нарезки. Рекомендуется общее время для нарезки (шаг 3.2.7) менее чем за 20 мин.
    6. Для корональные срезы позиции и клей (с Цианакрилатный клей) хвостовой лицом мозга на 10 см Петри, наклеенных на режущий блок вибрирующий срез и расположите его в водохранилище палаты вибрирующий срез, который позиционируется в камере более заполненный льдом. Затем заполните чашку Петри с все оставшиеся ледяной холин фаго.
    7. При сохранении постоянной 95% O2/5% CO2 журчание ледяной холин фаго, вырезать 300 µm толщиной корональные срезы (скорость: 0.08 mm·s-1, лезвие вибрации: 60 Гц, амплитуда колебаний: 1 мм).
    8. Собирать фрагменты мозга с одноразовой передачи широкий рот (4 мм в диаметре) Пипетка, один за другим после каждого один проход ножа, чтобы избежать накопления токсичных компонентов, выпущенных на периферии ломтики. Позаботьтесь, чтобы избежать воздушных пузырей во время передачи и место каждый ломтик в холин фаго на 32 ° C около 10 минут для восстановления.
    9. С передачи пипетку, место ломтики на куски чистки объектива бумаги, увенчанный капля холин фаго. Аспирационная избыток холин фаго и шпателем, место ломтики, положил на объектив очистки ткани, сетки интерфейс камеры, содержащие carbogenated фаго при комнатной температуре (см. 3.1.3.5). Пусть срез восстановить в этой среде для по крайней мере 30 минут.
      Примечание: После этого ломтики готовы и могут использоваться для микроглии изображений для до 6 ч после извлечения мозг от молодых (меньш чем один месяц старый) мышах и до 4 ч после извлечения мозг от взрослых два месяца назад.

4. два Фотон микроскопии

  1. Настройка параметров
    1. Переключитесь на системе multiphoton (гибридный детекторы, лазер, сканер, электро оптического модулятора, Микроскоп).
    2. Настройка лазера на 920 Нм, проверьте, что лазер locked режиме и установить власть в 5% - 15% и увеличение на 10%. Это соответствует мощности 3-5 МВт в рамках задачи. Убедитесь, что занимаются nondescanned детекторы и установлены соответствующие фильтры выбросов и возбуждения.
    3. Задать параметры обработки изображений программное обеспечение на следующие значения: размер кадра, 1024 x 1024 пикселей, соответствующий области 295.07 x 295.07 мкм; для масштабирования, 2. Если сигнал очень шумно, примените линии в среднем 2. Для пикселей динамики установите изображений программное обеспечение в 12 бит или более.
      Примечание: Изображения с более высоким значением бит позволяют исследователям различать небольшие различия в интенсивности флуоресценции чем изображения с более низким значением бит: изменение одного серого значение в 8-битного изображения будет соответствовать изменения 16 серый ценностей в 12-bit и 256 серый значения i n 16-битные изображения. Таким образом выше битные изображения больше подходят для количественного анализа, но как их размер увеличивается с битовой глубиной, емкость и вычислительной мощности может стать ограничение.
    4. Выберите режим сканирования XYZT с диапазоном Z-интервал в 2 мкм и T-интервал 2 мин.
      Примечание: X, y и z резолюции определяются теоремой Найквиста выборки. Z-шаг размер около 0,8 будет оптимальным для решения микроглии процессы (с диаметром < 1 мкм), но ограничение оптическое разрешение multiphoton микроскопии (на 920 Нм с 0,95 цель NA, осевой резолюция является около 1 мкм). На вершине, что физический барьер, в эксперимент жить изображений, чувствительности или сигнал шум коэффициент, резолюции, скорость и время вопрос общего наблюдения. Принимая во внимание все эти параметры, z шаг 2 мкм (как и многочисленные исследования3,,1114), размер изображения 1024 x 1024 пикселей и высокоскоростного сбора данных с использованием резонансный сканер сочетании HyD детекторы (он занимает около 15 s, чтобы приобрести 50 z планов) были отобраны здесь. Частота поглощения является одной серии XYZT каждые 2 мин и общая продолжительность 30 мин. Если настройки не быстрый или достаточно чувствительным, это можно уменьшить латеральное разрешение (до 512 x 512) или количество z срезов (у Вообразимый исключительно в z глубина, которая exhibits сильные флуоресценции [т.е., не глубокие z ломтики где флуоресценции слабый]), или уменьшить скорость сканера. Осевой резолюции также может быть уменьшена путем увеличения z шаг до 3 мкм, но как это может повлиять на количественной оценке, все эксперименты для сравнения должно выполняться с такой же z шаг.
      Примечание: Это позволяет выполнять аналогичные эксперименты на ломтики CX3CR1creER-рекламы ЯФП мышей18, мыши линия используется для вызвать генетические удаления в микроглии только и в котором микроглии конститутивно Экспресс желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Однако, уровень экспрессии рекламы ЯФП является очень низким по сравнению с зеленого флуоресцентного белка (ГФП) в CX3CR1GFP / + мышей; Таким образом изображений можно, но сложной и требует оптимизации параметров их получения. Рекомендуется скорректировать их следующим образом.
    5. Настройка лазера на 970 нм (который лучше приспособлен для рекламы ЯФП возбуждения чем 920 Нм), мощность на 50% и увеличение на 50%, что соответствует мощности лазера в рамках цели 5-6 МВт.
    6. Установка линии в среднем 4 (или более), чтобы улучшить соотношение сигнал шум.
  2. Размещение фрагмента и микропипеткой стекла, и местного применения комплекса
    1. Подключите Перистальтический насос к записи камеры, 30 мин до начала записи. После очистки вся перфузии системы с 50 мл ультрачистая вода, начните с Фаго (50 мл), содержащихся в стеклянный стакан под постоянным carbogenation перфузии запись камеры. На протяжении всего эксперимента сохранить циркулирующей фаго до 32 ° C с inline microheater или Пельтье нагреватель.
      Примечание: Конкретные перфузии камеры с верхней и нижней перфузии предназначена для оптимизации оксигенации на обе стороны фрагмента. Перфузии Камера состоит из двух совершенно установку частей, полиамид сеткой, натянутой между ними (рис. 2а, Б). По сравнению с другими типами камер, где срез непосредственно лежит на coverslip стекла, эта камера снижает нейрональных смерти в нижней части диаграммы, повышает жизнеспособность и уменьшает срез движений, вызванных его отек.
    2. С пипеткой широкий рот одноразовой передачи передачи срез мозга к записи образа к фаго стакан удалить объектив бумагу, пусть он раковина (как доказательство того, что нет пузырьков воздуха прилагается) и передать его в палату записи (перфузии).
    3. Положение фрагмента держатель (шпильки, сделанные из платины с двумя ответвлениями, соединены параллельно Нейлоновая нить) на срез для сведения к минимуму движения фрагмента из-за потока перфузии.
    4. Используйте светлые области освещения для мозга регионе интереса (время экспозиции: 50-80 мс) с помощью малое увеличение цель (5 X-10 X). Перейти к более высокой цели погружения воды масштаб (25 x с объективом 0,35 x) и отрегулируйте положение.
      Примечание: Избегайте изображения поля недалеко от держателя срез Нейлоновая нить как они могут блокировать свет и локально деформировать срез. Убедитесь, что область интересов является плоской. При необходимости удалите фрагмент держатель для того, чтобы переместить фрагмент и/или держателя срез.
    5. Использовать для поиска флуоресцентные Микроглии клеток для отображаемого в поле флуоресцентной подсветки (время экспозиции: 250-500 мс).
      Примечание: Этот шаг позволяет исследователям проверять наличие клеток в регионе интересов и их интенсивности флуоресценции и контролировать на сумму сотовой мусора.
    6. Засыпки пипетку с 10 мкл фаго с СПС, 5-HT, или препарат интерес в его заключительном концентрации. Точка, наконечник вниз и осторожно встряхнуть наркотиков заполнены Пипетка Удалить все пузырьки воздуха, захваченных в кончик.
      Примечание: Если раствор для инъекций, как правило, в виде пузырьков, рассмотрите возможность использования боросиликатное пипетки с внутренней накаливания. Утечки АТФ из пипетки может привлечь микроглии процессы даже до инъекции (если это произойдет, она будет видна на этапе анализа). Хотя это должно быть умеренной концентрации ATP использовано (500 µmol· L-1), если это является проблемой, считают prefilling микропипеткой с 2 мл фаго перед добавлением АТФ (или другие соединения) решения на этапе 4.2.6.
    7. Смонтируйте заполненную пипетку в пипетку держатель, связанные с прозрачной трубки в шприц 5 мл, с поршень находится в положении 5 мл. Держатель пипетки, сам установлен на микроманипулятор 3 оси.
    8. Под ярко поле освещения используйте микроманипулятор для размещения пипеткой в центре поля. Для воспроизводимых и оптимальное центрирование, отображать и использовать правителей на изображении.
    9. Нижний пипеткой плавно спускающемся срез, управление и регулировка цели в то же время, до кончика пипетки слегка касается поверхности среза. Остановка происхождения пипеткой, сразу видно, что срез были затронуты позволяет наконечник пипетки проникнуть 80-100 мкм поверхности среза (см. рисунок 3B).
    10. Настроить лазер (см. параметры выше) и переключитесь multiphoton режим Микроскоп. Убедитесь, что камера изолированы от любого источника света (например, экран компьютера). Включите nondescanned детекторы и установить коэффициент усиления. Используйте таблицу подстановки (LUT) с цветом верхний предел, чтобы избежать насыщения пикселов в изображении.
    11. Определить толщину среза для записи образа (т.е., верхняя и Нижняя z позиции где флуоресценции обнаружению [обычно между 220 и 290 мкм в общей сложности]).
      Примечание: На поверхности среза есть увеличение плотности процессов и возможно микроглии, часто с необычным морфологии, по сравнению с внутри фрагмента. Это накопление будет более впечатляющим с течением времени (т.е.., более заметной в последние чем в первый срез мозга к записи образа). Таким образом z самолеты в первый ~ 30 мкм не должны использоваться для анализа и даже может быть пропущен для приобретения.
    12. Начать запись для общей продолжительностью 30 минут (или больше по желанию) и после 5 мин базовых, локально применить соединение для проверки (не прерывая воображения). Для этого, медленно нажать поршень шприца, подключенных к микропипеткой, от 5 мл в 1 мл положение (около 5 s). Сопротивление при нажатии на поршень должен ощущаться сразу. Если нет, то Совет может быть нарушена.
      Примечание: Для подготовленных экспериментатора инъекции с помощью этого метода являются воспроизводимость, но альтернативно для ручного манипулирования шприц, дозатор может быть связано с автоматизированной давление выброса системы позволяют лучше контролировать объем доставки. Инъекции создает физические искажения фрагмента в месте инъекции. Это искажение виден posteriori в первые два или три фото после инъекции, но не должно быть видно на четвертом изображении, (то есть 8 мин после инъекции). Если это повторится, рассмотрите возможность изменения параметров для подготовки пипеткой.
    13. В конце приобретения (30 мин) отменить микропипеткой и удалить фрагмент. При необходимости, исправьте фрагмент для дальнейшего immunolabeling. Например метод моментального СНИМКА оптимизирована для фиксации и окрашивание толстых ломтиков23.
    14. До начала нового фрагмента изображения, сделать 2D фильм (раздел 5.1) для того чтобы проверить что Микроглии есть нормальной морфологии и движемся и, таким образом, что фрагменты являются здоровыми.

5. анализ привлекательности микроглии процессов

  1. 2D-проекции и коррекции дрейф
    1. Откройте файл (. LIF) с Фиджи24.
    2. При необходимости, сделайте substack (Image/стеки/инструменты/сделать Substack) с только z самолеты интерес. Например, исключить z самолеты, соответствующие на поверхности среза, если они были приобретены, но они не должны использоваться для анализа (см. Примечание после шага 4.2.11) и глубокие z самолеты с не флуоресценции. Окончательный стека обычно содержит 90-110 z ломтики (180-220 мкм).
    3. Запустите функцию Z проекта (Image/стеки/Z проекта») и выберите тип проекции Макс интенсивности сделать прогнозы z стека, приобретенных в каждый момент времени.
    4. Запуск MultiStackReg плагин (Плагин/регистрация/MultiStackReg), выбор действий 1: выравнивание и преобразования: твердого тела исправить небольшие сугробы, которые могут произойти во время приобретения. Сохраните этот 2D фильм как новый файл (.tiff).
  2. Обработка данных
    1. Откройте новый файл с ледяной25.
    2. Нарисуйте круговой R1 региона интерес (ROI) 35 мкм в диаметре, сосредоточены на месте инъекции (выявленные особенности тени пипетки и искажения, созданные во время инъекции).
    3. Использовать плагин ROI интенсивности эволюции и измерения средней интенсивности с течением времени в R1.
    4. Сохранить результаты. XLS файла.
  3. Количественная оценка и представление результатов
    1. Для количественного определения микроглии ответ с течением времени, определите, в каждый момент времени
      Equation
      Here,'R1(0)-это среднее значение R1(t) перед инъекцией. Затем результаты могут быть представлены как кинетическая микроглии ответа, или в определенное время точки (см. Рисунок 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол описывает метод для того чтобы побудить, наблюдать и количественного определения ориентированных на рост микроглии процессов к локально прикладной соединения, например, АТФ или 5-HT, в острой мозга кусочки от молодых или взрослых (по крайней мере до двух месячного) мышах. Среди факторов, влияющих на поддержании срезы мозга от взрослых животных в здоровом состоянии для нескольких часов является использование двух инструментов, предназначенных для оптимизации выживаемость клеток в два этапа протокола. Во-первых держателя ломтик интерфейс интерфейс камеры (рис. 1) улучшает сохранение фрагментов после резки. Во-вторых запись камеры (рис. 2) имеет перфузии система, которая позволяет фаго для запуска как на верхней, так и в нижней части фрагмента во время визуализации. Размеры камеры записи, используемые здесь устанавливаются подходят стандартные Микроскопы, как они похожи на классическая ванна палата вставками (с 62 мм внешний диаметр), но как их модели загружаемые из Дополнительного материала, дизайн может быть адаптирован к вписывается в ломтик владельцев других размеров. Отметить, что каждая палата осуществляется Генеральной Ассамблеей, без клея, двух совершенно установку частей, с полиамида сетка, натянутая между ними.

Чтобы доставить СПС или 5-HT в небольшой области и побудить местные реакции микроглии, пипетки, содержащий соединение (видимый Рисунок 2 cD) помещается с его кончика поверх фрагмента. В первых экспериментах это может быть полезно добавить Люминесцентную краску в решение, чтобы визуализировать положение кончика пипетки на изображениях, которые приобретаются с двух Фотон микроскопа (рис. 3A). На рисунке 3Bвидно, что хотя экспериментатор остановил пипеткой происхождения как только его наконечник коснулся и деформации поверхности среза на ярко поле изображение экрана компьютера, его тонкие конечности вступил слегка в ткани, вплоть до 80- 100 мкм от поверхности. Важно, что пипетки не слишком поверхностны, потому что он не может доставить решения правильно на клетки, не вводите слишком глубоко, потому что она может достигать региона, где флуоресценции сигнала слишком низкий. Параметры, которые могут повлиять на глубину, достиг кончиком пипетки являются угол пипетку, которая может быть скорректирована с тремя осями микроманипулятор и диаметр рот пипеткой.

Обратите внимание, что, с проекцией вдоль оси y (рисунок 3B), это можно наблюдать, которая флюоресценция быть сильнее в верхнем чем в нижней части диаграммы. Это объясняется как прогрессивный притупления сигнала внутри фрагмента и тот факт, что процессы микроглии поверхностных слоев срез, а некоторые клетки тела, как правило, мигрируют к поверхности. В результате микроглии в самых поверхностных слоях фрагмента может показать различные морфология чем те внутри фрагмента, указав, что они не находятся в том же состоянии и могут по-разному реагируют на стимуляцию. Таким образом поверхностные микроглии активации может маскировать в z проекции, ответ микроглии ниже. Кроме того поверхность часто наклонена, и первые z изображения стеков пятнистый. Поэтому мы рекомендуем для улучшения точности, чтобы исключить самое поверхностное z самолеты из z проекции и анализа. Однако, как изменена микроглии морфологии и наличие мусора в поверхностные слои являются индикаторами состояния фрагмента, это может быть интересно для изображения всю глубину среза проверить его статус апостериори. Это может быть особенно полезным для новых экспериментаторов, которые не могут легко признать аномальные микроглии или мусора от одного z самолеты. Z самолеты в первых 30 мкм затем будут исключаться на z проекция шаг (шаг 5.1.2 протокола).

После того, как лечение с соединения интереса и Записанная срез серии z самолеты (за исключением первых 30 мкм, как обсуждалось выше) образы на каждом точки проецируются вдоль оси z, чтобы сделать 2D фильм z проекция изображений. Отметить, что в протоколе, представленные здесь, толщина, используемые для Макс z проекция охватывает все z ломтики где флуоресценции видимых (обычно 180-220 мкм, шаг 5.1.2 протокола). Таким образом изменения в абсолютное количество z ломтики не влияют количественная оценка ответа. Напротив некоторые исследования используют тоньше z стеки (40-60 мкм) для z проекция6,7,11,27. Это еще один вариант, который приходит с риском для исключения некоторых z фрагменты, которые exhibit ответ, как мы отметил, что эффект приманки было видно насколько 70 мкм (z) от кончика пипетки в некоторых экспериментах. Если параметр тоньше является предпочтительным, это, таким образом, решающее значение для центра, z укладывают на дозатор подсказка в z и главное, только z прогнозы сделали таким же образом (т.е., с использованием всех флуоресцентные z ломтики или тонкий z стека) можно сравнить.

Для количественного анализа определяется областью R1 интерес. Рисунок 4 показывает ROI на z проекции. Красные пунктирные линии представляют собой предполагаемые позиции пипеткой. Желтый круг — R1, обращается с ледяной и сосредоточена на предполагаемый кончиком пипетки. Важно отметить, что мы наблюдали, что заметно изменчивость возникли в ходе количественного определения от локализации R1 ROI, чьи неправильного приводит к недооценке ответа. Чтобы помочь позиционирование ROI на сайте доставки, мы рекомендуем, отображение правителей в приобретении программного обеспечения при позиционировании пипетку в brightfield, чтобы наконечник пипетки всегда в той же позиции Центральной XY в поле для записи образа. Это дает представление о где позиции, позднее, ROI в Z-проекция изображения флуоресценции. Однако последний совет позиции и, таким образом, фактические сайт доставки будет слегка смещается от этой центральной позиции, в зависимости от глубины, достиг кончиком пипетки. По этой причине положение R1, мы учитываем три другие критерии: (i) R1 должны быть на кончике пипетку, положение которых выводится из темного фона в правом нижнем углу, (ii) она должна соответствовать области, где переходный искажение ткани происходит, когда вводят соединения, и (ii) она должна соответствовать области, где местные реакции (если таковые имеются) наблюдается. Если это не достаточно, чтобы найти с хорошей точностью точку доставки, заполнение пипеткой с флуоресцентные соединения поможет. После оформив R1, мы проводим фильм снова, чтобы проверить, что он хорошо подходит для всех точек времени и что не существует никаких аберрантных дрейф, искажения или артефакт флуоресценции в любой момент времени, который может исказить количественная оценка. Фильм, соответствующий Рисунок 4и иллюстрирующих эффект применения СПС, можно найти в дополнительном материале (Фильм S1).

Мы первоначально учился притяжения микроглии процессов к СПС или 5-HT в таламусе P11 мышей15. Совсем недавно, эти эксперименты были повторены в ломтики от четырех дней двух месячного мышей и в различных регионах (например, на рисунке 3 соответствует записи в гиппокампе). Мы в основном используется три для четырех week-old мышей, который сочетает в себе преимущества наличия зрелой мозга с развитой и разветвленной микроглии-с хороший кусок жизнеспособности. Важно отметить, что представитель нормального состояния микроглии характеризуются небольшой сома, длинные процессов с небольших терминалов и постоянно движущихся процессов в исходное состояние. Как правило в ломтики от 18 до 30 дней old мышей, морфология микроглии остается главным образом неизменными до 6 ч после подготовки фрагмента. Для фрагментов от старых мышей (два месяца) способность поддерживать ломтика в состоянии физиологического является снижение (~ 4 h). Микроглии направлении подвижности в таламус, в ответ на 5-HT в интервале от 20-дневного возраста мыши и АТФ в кусочек от двух месячного мыши, приведены на рисунке 5. Фильм, соответствующий приложению 5-HT на рисунке 5 можно найти в дополнительном материале (Фильм S2).

Рисунок 6 представляет два субоптимальные эксперименты на ломтики, хранится дольше, чем 6 ч в фаго, прежде чем они были imaged (только раз показали 0). В рисунке 6Aотметить присутствие микроглии с нескольких коротких процессов или расширенного терминалы напоминает neurite роста шишки и присутствие многих люминесцентные клеток мусора или частиц. Эти очень флуоресцентные элементы остаются неподвижными или двигаться случайно во время визуализации, указав, что они не принадлежат к «живой» микроглии (см. Фильм S3 в дополнительном материале). Отметить, что в данном конкретном примере, микроглии постоянно сканирование их окружающей среды, но их морфология настолько изменился, что они не могут рассматриваться как находящаяся в состоянии физиологического. Кроме того большое количество мусора сделали бы флуоресцентный анализ недостаточно надежной. Рисунок 6B показывает наличие микроглии с большим и плоским клеток органов или выступов, которые иногда могут быть найдены в поверхностных слоях фрагментов, которые держали несколько часов, прежде чем они были образы. Только поверхностные z позиции использовались для сделать это z проекции. Рисунок 6 c является substack, глубже z-позиции, же срез мозга как показано на рисунке 6B. Хотя они расположены не на поверхности, эти Микроглии есть аномальные «пушистый» аспект. Благодаря аспект микроглии фильмы, соответствующий эти два кусочка не были использованы для количественной оценки.

После извлечения данных из 2D-фильмов, могут быть представлены результаты построения нормализованных R(t) флуоресценции со временем. Граф, резюмируя несколько экспериментов представлены в Рисунок 7а, чтобы показать изменчивость ответов. Обратите внимание, что флюоресценция уменьшается сразу, но временно (в первых трех изображений) после инъекций из-за искажения ткани (то есть, впрыска жидкости с пипеткой временно толкает ткани прочь и затем увеличивается). Изменчивость в ответ на СПС иллюстрирует тот факт, что даже когда фрагменты выглядят аналогично здоровыми, с подвижной и разветвленной микроглии, они не отвечают таким же образом (но все из них ответить). На вершине неоднородность встроенный образец есть некоторые раскованность в позиционировании R1, как упоминалось выше, и мы также нельзя исключать воздействие, например, различия в объеме раствора, который доставляется. Таким образом чтобы обнаружить небольшие эффекты или вариации, может быть интересно использовать автоматическое устройство для инъекций подворье.

Рисунок 7B показывает, как размер Руа также влияет количественной оценки, здесь роста АТФ индуцированной процессов. Увеличение диаметра от 35 ( рис. 7A и для всех анализов, представленные здесь диаметр) до 50 или 70 мкм снижает изменчивость среди экспериментов (фрагменты), подавляя вопрос о малых позиционирования R1. Однако он также снижает точность и масштабы обнаруженные связи. Действительно с большей трансформирования, существует больше фона из-за процессов или клеток тела, не пострадавших от лечения, и рост процессов может быть частично притупила сочетанной Ретракция микроглии филиалов, более отдаленные от пипетки но тем не менее внутри ROI. В заключение она может иметь отношение к использовать ROIs с различного диаметра круга чем одно это 35 мкм, но она является основополагающим, что рентабельность инвестиций является всегда то же самое во всех наборах данных для сравнения.

На рисунке 7 c показывает среднее ± SEM для нескольких экспериментов с фаго, СПС или 5-HT. СПС действует в том же диапазоне, как полученные другими группами с помощью аналогичного метода в естественных условиях (0,5 согласно Давалос et al.3 и 0,4 согласно Хейнс et al.13) и ломтиками (0,8, если нормализованы, как это делается здесь Согласно Диссинг Олесен et al.5и 0,6 согласно Pagani соавт.28). С одной стороны, различия могут поступать из биологических параметров, например метод подготовки срез, количество АТФ, вводят, возраст мыши, или мозг региона используется и с другой стороны, от анализа параметров, таких как диаметр ROI и Толщина в z стеки для z проекции (то есть, вся толщина, где обнаруживается флуоресценции или только 40-60 мкм вокруг кончика пипетки, где ожидается максимальная ответ).

В рисунке 7 cфаго инъекции является отрицательный контроль, необходимо проверить, что местные инъекции и давление пипетки не вызывают травмы, которые могут привлечь микроглии процессов. Кроме того элемент управления фаго позволяет исследователям проверить, что со временем не Фотообесцвечивание. Действительно Фотообесцвечивание, фотон индуцированной уничтожение флуоресцентные белки или флуорофоров, побудили бы постепенное уменьшение флуоресценции со временем. Как это может исказить измерений, важно тщательно проверить, что это не Фотообесцвечивание в экспериментальных условиях. Чтобы сделать это, рекомендуется приобрести XYZT серии на интервале с GFP-выражая микроглии, за 30 мин (фаго может быть введен, но на самом деле, требуется не стимуляции), с возбуждением и приобретения параметры, заданные как в экспериментальных условиях. Затем количественная мера флуоресценции со временем в различных регионах, представляющих интерес, включая Микроглии клеток органов или процессов, покажет, если есть постепенная потеря интенсивности выбросов, обычно экспоненциального распада, указывающее Фотообесцвечивание. Если это так, некоторые изменения могут быть выполнены: перераспределение лазер, сокращение мощности лазера и увеличение детектора получить, сокращение числа z самолеты и увеличение интервала между ними ограничить освещение. Фотообесцвечивание благоволят мощных или длинные (ex: повторил освещения для линии в среднем) возбуждение; Таким образом исследователи должны обратить внимание на это, если устойчивый освещение используется для изображения клетки с низкой флуоресценции.

После местных инъекций АТФ или 5-HT является увеличение флуоресценции в R1, который достигает плато (рис. 7 c). В дополнение к кинетики это может быть интересно сравнить привлекательность в стабильной конечной точке. Здесь, мы решили представлять ответ микроглии при t = 26 мин (т.е., 20 мин после инъекции) в рисунке 7 d. Это полезно для статистически сравнивать соединений, или для проверки эффекта антагонистами, которые могут быть добавлены в ванне (то есть, в решении перфузии, или вместе с смеси в пипетку [не показано]).

Figure 1
Рисунок 1: интерфейс камеры детали. (A) наброски для 3D печати держателя срез. Внешний диаметр держателя — 7 cm. (B) интерфейс ломтик держатель с нейлоновая сетка (стрелка), что позволяет исследователям держать ломтики на интерфейсе жидкости воздух. (C) интерфейс камеры устройства, что делает его возможным поддерживать ломтики в carbogenated (стрелка указывает труб для барботирования) и увлажненной среде, прежде чем они отражаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: детали камеры перфузии. (A) наброски для 3D печати. Внешний диаметр перфузии камеры составляет 5,9 см. (B) в перфузии камеру с нейлоновая сетка (стрелка), поддерживает срез, предотвращает его от прикосновения слайд ниже и позволяет фаго течь над и под его. (C) фотография Ассамблеи на два Фотон микроскопа. Микропипеткой, который будет доставлять соединения локально виден справа (звездочка). (D) пипетки, отображаемого в brightfield. В баре шкалы = 60 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: положение микропипеткой в срез. Пример приобретения стек изображений (в гиппокампе 30 день старого животного) с микропипеткой, наполненный флюоресцеином (1 мкм). Флуоресцеин делает возможным найти пипетки (звездочка) в Макс прогнозы вдоль (A) оси z или (B) по оси y. Обратите внимание, что в группе B , что, хотя в флуоресцировании слабее, есть также микроглии ниже кончика пипетки. В этом примере иллюстрируется полный стек, включая снимки, сделанные в самое поверхностное частью фрагмента, был использован для прогнозов. Шкалы бар = 30 мкм в группе A и как указано (каждой выпускной = 50 мкм) в группе B. Z толщина стек = 220 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: позиционирование R1, ROI используется для квантификации. Эта цифра показывает три точки экспериментальной время эксперимента применения СПС на интервале (от таламуса 20 дневного возраста животного), с рисунками предполагаемого расположения пипетки (красная пунктирная линия на первом этапе) и разграничения R1 ROI. Шкалы бар = 30 мкм. Примечание темные области в правом нижнем углу, соответствующий оттенок дозатор, который мешает с подсветкой и изображений. Обратите внимание, Кроме того, небольшой регион интенсивной флуоресценции в 25 мин, который указывает расположение кончика пипетки. Z толщина стек = 220 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: микроглии ответы. Ответы на местном применении 5-HT (5 мкм) на мозг кусочек от 20-дневного возраста мыши (слева; z толшины = 220 мкм) и АТФ (500 мкм) на интервале от двух месячного мышь (право; z толшины = 220 мкм). Красные пунктирные линии представляют позицию пипеткой. Обе записи были сделаны в таламус, и верхний 30 мкм ломтики были исключены. Фотографии принимаются до (верхняя строка) и 25 минут после (нижний ряд) инъекции. Шкалы бар = 30 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: примеры субоптимальные экспериментов. Эти фрагменты ждали более 6 ч до изображений и были образы с их верхней поверхности. (A) пример z-стека с большим количеством мусора (примерно раунд, флуоресцентные частицы, но с неправильной границ; звездочки) и «пушистый» микроглии (стрелки), то есть, с многочисленными но короткие процессов. Обратите внимание на терминалы расширенного процесса (стрелок), которые выглядят как конусы аксональное роста. Z толщина стек = 220 мкм. Другие две панели показывают два подпункта стеки же фрагмента с (B) 1-30 z самолеты (z толщина = 59 мкм) и (C) 30-120 z самолеты (z толщина = 180 мкм). На плоскости верхней (показан на панели B), в дополнение к большой процесс терминалы и мусора как в группе Aесть микроглии с необычными большой плоский органов или выступов (звезды). На плоскости глубже (показан на панели C), нет никакого мусора не плоских объектов, но клетки являются густые (стрелки) и плотность является необычно высоким. Вообще эти наблюдения показывают, что Микроглии являются не в обычном состоянии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: количественная оценка привлекательности процессов микроглии. (A) пример серию экспериментов с СПС, чтобы проиллюстрировать изменчивости. (B) влияние размера ROI на количественной оценке. Каждый эксперимент, отображаемые в панели (ATP инъекций) была проанализирована с Руа, 35, 50 или 70 мкм диаметром. Для различных ROIs отображается среднее ± SEM thefluorescence в каждый момент времени. (C) краткое изложение экспериментов с фаго, 5-HT и СПС. Фаго инъекции не влияет на расположение микроглии процессов. СПС и 5-HT вызвать локализованных рост микроглии процессов к пипетку, измеряется с местными рост флуоресценции. Среднее ± SEM указаны. (D) резюме ответов микроглии при t = 20 мин postinjection (26 мин от начала записи). Среднее ± SEM указаны. Односторонний дисперсионный анализ с Дуннетт пост Специального теста используется. p < 0.01, *** p < 0,001 по сравнению с фаго инъекций. Для фаго, n = 7; для ATP, n = 8; для 5-HT, n = 6. Все эти эксперименты были проведены в таламус, однако аналогичные результаты могут быть получены из гиппокампа или коры. Z толщина стеки для z прогнозы и количественная оценка = 180-220 мкм. Все меры, за исключением тех, в группе B было сделано с 35 мкм диаметр ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Movie 1
Фильм S1: пример эффект применения местных АТП-(500 µM). Этот эксперимент выступал в таламус 20-дневного возраста животного. Изображения из этого фильма были использованы для Рисунок 4. Шкалы бар = 30 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Movie 2
Фильм S2: Пример эффекта местного применения (5 мкм) 5-HT. Этот эксперимент выступал в таламус 20-дневного возраста животного. Изображения из этого фильма были использованы для рис (слева). Шкалы бар = 30 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Movie 3
Фильм S3: пример субоптимальные эксперимента в кусочек, подождав для более чем 6 ч до изображений. Обратите внимание, наличие многочисленных мусора, который движется случайно, с течением времени и необычные морфология микроглии. Изображение из этого фильма используется как Рисунок 6A. Шкалы бар = 30 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Дополнительных файлов: изображений камеры и камеры Холдинг интерфейса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поддерживая, в отличие от в отрыве или organotypic срез культуры, структурной целостности с ограниченной сети корректировок, острый мозга фрагменты позволяют исследователям изучить микроглии в их физиологической среде. Однако один из основных недостатков является тот факт, что нарезки процедура создает травм, которые могут быстро подорвать жизнеспособность нейронов, особенно в мозге взрослого. Как особенно реагирует на повреждение клетки микроглии, важно ограничить смерти нейрональных клеток, насколько это возможно сохранить микроглии недалеко от их физиологическое состояние. Это, в свою очередь, способствует через добродетельный круг для улучшения общего состояния фрагмента.

Протокол, описанные в этой статье применяется несколько улучшений в литературе по электрофизиологии эксперименты, направленные на получение лучше жизнеспособность ломтики в течение нескольких часов, особенно от взрослых мышей. Чтобы преодолеть возрастные различия в ломтик жизнеспособности, мы замещенных натрия с холином и используется этот холин фаго средних этапах сердечной перфузии, нарезки и восстановления. Это приносит Эксайтотоксичность клетки к минимальной29,30. Следует отметить, что, помимо холин фаго, существует много других альтернативных фаго рецепты, которые являются весьма эффективными для сохранения нейронов, как N-метил D-glucamine (NMDG)-фаго31, который также может быть интересно для микроглии исследования но здесь не были протестированы. Еще один важный шаг в этой процедуре является сердечная перфузии. Perfusing животное с холодной холин фаго раствор, содержащий низкой Na+, низкий Ca2 +и высокой мг2 +, индуцируется быстрое снижение температуры тела и метаболической активности клеток в головном мозге уменьшается, тем самым снижая клеточного стресса, вызванного резки. Действительно мы отметили, что этот подход предоставляет большую защиту, чем просто удалив весь мозг и погружаясь в растворе фаго. Вдохновленный протокол, оптимизированный для патч зажим и optogenetic исследования29, мы также использовали «защитные восстановления» период, сразу же после физической нарезки, позволяя фрагментов, чтобы оправиться от травмы нарезки за 10 мин в холин фаго 32 ° C. Потом ломтики были переведены в интерфейсе, держа камеру для восстановления для дополнительного минимальное время 30 мин. Продолжительность этого второго периода восстановления может быть оптимизированы в соответствии мозга области интереса, Na+ замену и возраста животного, и она должна продолжаться по крайней мере 1 h если электрофизиологии должен осуществляться параллельно с работой с образами.

Сохранение фрагмента в исправном состоянии перед использованием и перфузии во время визуализации также являются важными параметрами. Интерфейс и двойной перфузионный камеры являются широко установленным инструментами электрофизиологии. Например для повышения жизнеспособности гиппокампа ломтики начиная с 1995 года26использовался метод интерфейса. Устройства похож на камеры, используемые здесь предложенный несколько компаний, но обычно еще не используется для визуализации микроглии. Мы разработали интерфейс держа камеру, где ломтики лежал на сеть и на интерфейсе с большой резервуар фаго, задерживая сотовой ухудшения ломтики длительный инкубационный период. В тепловизионной камере мы использовали разработанные двухсторонний перфузии камеры, что позволяет увеличение оксигенации острый срез препаратов, поддержания клеток в здоровом состоянии во время multiphoton микроскопии. В отличие от единого перфузии двойной перфузии погруженной ломтиков увеличивается жизнеспособность клеток, поскольку кислород, а также другие материалы, могут свободно и эффективно диффузный с высоким расходом от обеих сторон значительно толстых ломтиков.

Этот протокол направлен на количественной оценки глобальной аттрактанта эффект АТФ или других соединений на микроглии процессы, и его метод количественной оценки основана на используемый в Давалос et al.3. Это позволяет выполнять другие виды анализа. Например альтернативный метод, который не зависит от уровня флуоресценции микроглии процессов, но требует больше действий экспериментатора, для анализа изображений, необходимо измерить сокращение пустого пространства вокруг кончика пипетки после соединения Приложение11,32. Это также позволяет отслеживать движение кончик отдельных микроглии процессы15,28.

Кроме того изотропным подвижности или наблюдения микроглии может также быть зарегистрированы в базальной состоянии или ходатайству Ванна соединений интерес на ломтики, приготовленные настоящим Протоколом. Однако для количественного определения быстрыми темпами расширения и втягивание микроглии процессов и выявления возможных отклонений, целесообразно увеличить частоту приобретения. Например, Pagani et al. использовать частоту одного изображения каждые 10 s28.

Наконец последние публикации описаны методы для количественного определения морфологических изменений или подвижности отдельных процессов в трех измерениях. Для такого анализа хотя интервале z шаг 2 мкм достаточно для некоторых программы27, другие требуют более осевой резолюции (то есть, z шаг 0,4 мкм согласно Heindl et al.33.

Здесь, мы показали эксперименты на мышах одичал типа с выражением эндогенного GFP в Микроглия и с применением механических соединений, но этот протокол может быть адаптирована к другим флуоресцентные репортер белков в микроглии, как рекламы ЯФП18, или экзогенные маркировки микроглии с флуоресцентной isolectin11,34. Наконец, мы изучили нарост микроглии процессов к местного применения СПС или 5-HT в нормальной среде одичал тип, но этот протокол может использоваться для тестирования других соединений, другие виды стимуляции (например, клетке соединений) и проверить как направленного подвижности зависит от мутаций, фармакологических агентов или патологических контекстах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим клеток и тканей Imaging Institut du Fer à Мулен, где были выполнены все изображения сбора и анализа данных. Эта работа частично поддержали центр Национальной де ла Recherche Scientifique, Институт национального de la Santé et de la Recherche сообщала, наук университета Сорбонна и грантов университеты-Пьер Sorbonne et Мари Кюри университета ( Emergence-UPMC программа 2011-2014), Фонд pour la исследований sur le мозг, Фонд-де-Франс, Фонд pour la Recherche сообщала «Реактор FRM DEQ2014039529», Министерство научных исследований (Agence Nationale pour la исследований Франции Программа «Био-ПСИ Labex» АНР-11-IDEX-0004-02 ANR-17-CE16-0008 и будущее Investissements) и совместных исследований в программе вычислительных нейронаук, национальной науки фонд/французский Национальное агентство для исследований (число: 1515686). Все авторы связаны в исследовательских групп, которые являются членами Парижской школы нейронаук (ENP) и био-ПСИ Labex. Отвязка является аспирантом, аффилированным с Sorbonne Université Collège докторские, F-75005 Париж, Франция и финансируется био-ПСИ-Labex. В.м. является членом после защиты докторской диссертации, финансируемых совместных исследований в программе вычислительных нейронаук, национальной науки фонд/французский Национальное агентство для исследований (число: 1515686). Авторы благодарят Marta Kolodziejczak, которые участвовали в начало проекта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
for pipettes preparation
Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries Harvard Apparatus 30-0065 Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225
DMZ Universal Puller Zeitz Instrumente
Name Company Catalog Number Comments
for solutions
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
D-(+)-Glucose Sigma G8270
L-Ascorbic acid Sigma A5960
Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2) Sigma 63020
Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl) Sigma P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium Chloride (NaCl) Sigma S5886
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011
Sodium pyruvate Sigma P2256
Ultrapure water MilliQ for all the solutions
Name Company Catalog Number Comments
for slice preparation
2x 200 mL crystalizing dishes
80 mL Pyrex beaker
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie
Dolethal Vetoquinol Dolethal 50 mg/mL
Filter papers (Whatman) Sigma WHA1001042 Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM)
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-60
Food box 10 cm diameter, 8 cm Height
glue (ethyl cyanoacrylate) Loctite super glue 3 power flex
Hippocampal Tool (spatula) Fine Science Tools 10099-15 The largest extremity has to be angled at 90°
Ice
Iris Forceps (curved) Moria MC31
Lens cleaning tissue THOR LABS
Nylon mesh strainer diameter 7 cm
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 For the slicer
scalpel blade
Slice interface holder home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
Surgical Scissors - Sharp Fine Science Tools 14002-14
Vibrating slicer Thermo Scientific 720-2709 Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)
Water bath Set at 32 °C (first recovery step)
Name Company Catalog Number Comments
for slice imaging
× 25 0.95 NA water-immersion objective Leica Microsystems (Germany) HCX Irapo
2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors Leica Microsystems (Germany)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For 2-photon chamber perfusion with aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie I1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser Coherent (Germany)
disposable transfer pipettes , wide mouth ThermoFischer scientific for example : 232-11 5.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth
emission filter SP680 Leica Microsystems (Germany)
fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) Leica Microsystems (Germany)
glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice
Heating system Warner Instrument Corporation Automatic Heater Controller TC-324B to maintain perfusion solution at 32 °C
perfusion chamber home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
slice holder ("harp") home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads
Name Company Catalog Number Comments
for slice stimulation
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A-26209 to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use
Fluorescein (optional) Sigma F-6377 use at 1 µM final
Micromanipulator Luigs and Neumann SM7 connected to the micropipette holde
Micropipette holder same as for eletrophysiology
Serotonin hydrochloride Sigma H-9523 aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment.
Syringe 5 mL (without needle) Terumo medical products SS+05S1
Transparent tubing Fischer Scientific 11750105 Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
Name Company Catalog Number Comments
for image analysis
Fiji https://fiji.sc Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
Icy Institut Pasteur http://icy.bioimageanalysis.org de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)
Name Company Catalog Number Comments
mice
CX3CR1-GFP mice Jung et al, 2000 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.
CX3CR1creER-YFP mice Parkhurst et al 2013 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
  2. Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
  6. Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
  7. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  8. Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
  9. Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
  10. Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
  11. Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  12. Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
  13. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  14. Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
  15. Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
  16. Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  17. Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
  18. Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  19. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  20. Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
  21. Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
  22. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  23. Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  26. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  27. Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
  28. Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
  29. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
  30. Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), San Diego, CA. 231-239 (1999).
  31. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  32. Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
  33. Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
  34. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).

Tags

Нейронауки выпуск 143 микроглии мульти Фотон микроскопии кусочки острый мозга chemoattraction моторику морфология серотонина АТФ живые изображения промежуток времени изображений
Двух Фотон изображений микроглии процессов притяжения к СПС или серотонина в острой мозга фрагментов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Etienne, F., Mastrolia, V.,… More

Etienne, F., Mastrolia, V., Maroteaux, L., Girault, J. A., Gervasi, N., Roumier, A. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (143), e58788, doi:10.3791/58788 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter