Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58790
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتولد السرطان استنساخ الخلية التي تحتوي على علامة تسلسل MS2 في سوبتيلوميري واحد. ويمكن هذا النهج، الاعتماد على نظام MS2-التجارة والنقل، والتصور النصوص الذاتية من تيلوميريك التي تحتوي على تكرار "الحمض النووي الريبي" (TERRA) أعرب من telomere واحدة في الخلايا الحية.

Abstract

التيلومير يتم نسخها، مما أدى إلى تيلوميريك المحتوية على تكرار الكشف فضله منذ فترة طويلة (TERRA)، التي اقترحت أن تلعب أدواراً هامة في علم الأحياء telomere، بما في ذلك تشكيل هيتيروتشروماتين والتوازن طول telomere. وأظهرت النتائج الأخيرة أن جزيئات تيرا تتفاعل أيضا مع المناطق الكروموسومات الداخلية لتنظيم التعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الماوس. وتمشيا مع هذه الأدلة، أظهرت الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التحليلات التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) فقط مجموعة فرعية من تيرا ترجمة النصوص في نهايات الكروموسومات. سوف تساعد على فهم أفضل لديناميات الجزيئات تيرا تحديد وظيفتها والآليات من العمل. هنا، نحن تصف طريقة للتسمية، وتصور telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا السرطانية باستخدام نظام MS2-التجارة والنقل. لتحقيق هذا الهدف، نقدم بروتوكولا لإنشاء استنساخ مستقرة، باستخدام خط خلية سرطان المعدة البشرية AGS، تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة في سوبتيلوميري واحد. يؤدي النسخ تيرا من telomere MS2 معلم في التعبير عن جزيئات تيرا MS2 المعلمة التي يتم تصور بالفحص المجهري خلية يعيش الأسفار عند التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر للتجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل). هذا النهج يتيح للباحثين لدراسة ديناميات telomere واحد تيرا الجزيئات في الخلايا السرطانية، ويمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الأخرى.

Introduction

تيرا الحمض النووي الريبي فضله طويلة يتم نسخها من منطقة سوبتيلوميريك في الكروموسومات والنسخ العائدات نحو نهايات الكروموسومات، تنتهي داخل المسالك تكرار تيلوميريك1،2. لهذا السبب، تتكون من تسلسل المستمدة من سوبتيلوميريك في نهايتها 5 ' تيرا النصوص وإنهاء مع تكرار تيلوميريك (أوواجج في الفقاريات)3. أهمية الأدوار قد اقترحت للأرض، بما في ذلك تشكيل heterochromatin التيلومير4،5، الحمض النووي النسخ المتماثل6، تشجيع جزئ مثلى بين كروموسوم ينتهي7،8 , 9تنظيم هيكل telomere10و telomere طول التوازن2،11،،من1213. وعلاوة على ذلك، محاضر تيرا التفاعل مع العديد من المواقع اكستراتيلوميريك لتنظيم التعبير الجيني على نطاق واسع في الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ES)14. تمشيا مع هذه الأدلة، الأسفار الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين وأظهرت تحاليل الحمض النووي الريبي (الأسماك) أن فقط مجموعة فرعية نصوص تيرا المعربة في التيلومير1،2،15. وباﻹضافة إلى ذلك، أبلغ تيرا على شكل مجاميع النووية إضفاء الطابع المحلي على الكروموسومات X و Y في الماوس الخلايا2،16. تشير هذه النتائج إلى أن النصوص تيرا الخضوع للديناميات المعقدة داخل النواة. فهم ديناميات الجزيئات تيرا سيساعد على تحديد مهمتها والآليات من العمل.

وقد استخدمت نظام MS2-التجارة والنقل على نطاق واسع لتصور جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية من مختلف الكائنات17،18. وقد استخدمت هذا النظام سابقا الوسم ووضع تصور لجزيئات تيرا telomere واحد في12، S. cerevisiae19. باستخدام هذا النظام، فقد ظهر مؤخرا أن الخميرة تيرا النصوص المعربة داخل السيتوبلازم خلال مرحلة التحول دياوكسيك بوست، مما يوحي بأن الأرض قد تمارس مهام اكسترانوكلير20. أننا استخدمت مؤخرا نظام MS2-التجارة والنقل لدراسة النصوص تيرا telomere واحد في خلايا السرطان21. لتحقيق هذا الهدف، ونحن استخدمت أداة التحرير الجينوم كريسبر/Cas9 لدمج تسلسلات MS2 في telomere واحد (telomere 15q، يشار إليها فيما بعد Tel15q) والحصول على استنساخ معربا عن معلم MS2 تيرا Tel15q الذاتية (استنساخ تيرا-MS2). التعبير المشارك بروتين ملزمة رنا MS2 تنصهر فيها التجارة والنقل (MS2-التجارة والنقل) التي تعترف ويربط التصور تمكن تسلسل الحمض النووي الريبي MS2 telomere واحد تيرا النصوص في المعيشة الخلايا21. وغرض البروتوكول هو موضح هنا أن يصف بالتفصيل الخطوات اللازمة لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2.

لتوليد الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2، تم دمج كاسيت MS2 داخل منطقة سوبتيلوميريك telomere 15q، المصب تيرا مروج المنطقة والنسخ الموقع ابدأ. كاسيت MS2 يحتوي على مورثة مقاومة النيوميسين محاط بمواقع لوكس-p، وإدماجه في سوبتيلوميري 15q تتم باستخدام نظام Cas9 كريسبر/22. بعد أن يتم تحديد تعداء MS2 استنساخ الكاسيت، واحد ويتم التحقق من التكامل سوبتيلوميريك للكاسيت ببكر، لطخة الحمض النووي تتابعها والجنوب. استنساخ إيجابية مصابون إتش معربا عن لجنة المساواة العرقية بغية إزالة علامة الاختيار في الكاسيت، تاركاً فقط MS2 متواليات وموقع واحد لوكس-ف في سوبتيلوميري 15q. يمكن التحقق منه التعبير عن النصوص تيرا MS2 معلم من Tel15q ب RT-قبكر. وأخيراً، يتم التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل في استنساخ تيرا-MS2 عبر عدوى الفيروسات الرجعية من أجل تصور النصوص تيرا MS2 بالفحص المجهري الأسفار. يمكن اكتشاف النصوص تيرا سهولة بالجيش الملكي النيبالي-الأسماك وخلية يعيش التصوير باستخدام تيلوميريك الخاصة بتكرار يسبر1،2،،من1523. هذه النهج معلومات هامة عن التعريب من مجموع السكان من جزيئات تيرا في قرار وحيد الخلية. الجيل من الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على تسلسلات MS2 في سوبتيلوميري واحد سوف تمكن الباحثين من دراسة ديناميات telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا الحية، التي تساعد في تعريف الدالة وآليات عمل تيرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحديد من الحيوانات المستنسخة مقاومة النيوميسين

  1. تنمو خلايا AGS في المتوسط F-12_K في لحم الخنزير (كين) تستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين والبنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة) ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسطة) في 37 درجة مئوية و 5% CO2. ترانسفيكت الخلايا في التقاء 50-60 في المائة مع سجرنا/Cas9 التعبير عن المتجهات وكاسيت MS2 في 01:10 نسبة المولى21.
    ملاحظة: في تجربة موازية، التحقق من كفاءة تعداء ترانسفيكتينج ناقل التعبير عن التجارة والنقل (أي، Cas9-بروتينات فلورية خضراء متجه). على الأقل ينبغي أن تتحقق الكفاءة تعداء 60-70%.
  2. في اليوم التالي، استبدال وسيلة تثقيف المتوسطة التي تحتوي على النيوميسين 0.7 ميكروغرام/مل تركيز النهائي (المتوسطة الانتقائي).
    ملاحظة: تقسيم الخلايا وبذر منهم في المتوسط انتقائية اليوم بعد تعداء سوف تسرع في عملية الاختيار. كافة الخلايا غير ترانسفيكتيد سوف يموت فورا. إذا كان يتم إجراء تعداء في 6 لوحات جيدا، في هذه الحالة كل بئر في 60% التقاء سيتضمن حوالي 0.7 × 106 خلايا، اليوم التالي يمكن تقسيم الخلايا من بئر واحدة إلى 10 سم صحن تحتوي على متوسط انتقائية.
  3. إبقاء الخلايا في المتوسط الانتقائي لمدة 7-10 أيام، تغيير المتوسطة كل واحد أو يومين، حتى استنساخ واحدة مرئية.
  4. الانتقاء لاستنساخ الخلايا
    1. إعداد لوحة جيدا 96 التي تحتوي على 10 ميليلتر من التربسين 0.25% في كل بئر.
      ملاحظة: إعداد اثنين 96 ألواح جيدا في حال استنساخ أكثر من 96 من المتوقع أن يتم انتقاؤها.
    2. مع استخدام المجهر، وضع علامة على موضع كل استنساخ مرئية في الطبق 10 سم بجعل نقطة في الجزء السفلي من الطبق باستخدام علامة. سوف تتوافق مع كل نقطة إلى مستعمرة التقاطها.
    3. استبدال وسيلة تثقيف بما يكفي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تشكل طبقة رقيقة من السائل على استنساخ وعدم السماح للخلايا الجافة خلال عملية الانتقاء استنساخ.
    4. اختيار المستعمرات مفرد باستخدام ماصة 10 ميليلتر. إرفاق تلميح يحتوي على 5 ميليلتر من التربسين إلى المستعمرة وبطء الإفراج عن التربسين التي ستبقى المترجمة في المستعمرة. السماح التربسين لفصل الخلايا لمدة 1 دقيقة، ثم تتخلص من المستعمرة بالتلميح وتمتص منه إلى الحافة.
      ملاحظة: أثناء هذا الإجراء، التقليب الطبق قليلاً على جانب واحد حتى إنقاص حجم برنامج تلفزيوني حول مستعمرة اختياره سوف تساعد عملية الانتقاء بتجنب إضعاف التربسين حول المستعمرة. قد يساعد استخدام حزام استنساخ أيضا التقاط استنساخ واحدة.
    5. ضع الخلايا من المستعمرة إلى بئر لصفيحة جيدا 96 التي تحتوي على 10 ميليلتر من 0.25% التربسين.
    6. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم سد البئر مع 150 ميليلتر من انتقائية المتوسطة (المتوسطة و 12 ك في لحم الخنزير (كين) وتستكمل مع 10% FBS، 2 مم ل الجلوتامين، البنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة)، ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسطة) والتي تحتوي على النيوميسين في بتركيز 0.7 ميكروغرام/مل.
      ملاحظة: خلال فترة حضانة المرض يمكن انتقاء الحيوانات المستنسخة الأخرى. من المستحسن اختيار استنساخ أكبر عدد ممكن. يتم انتقاؤها المستنسخين أكثر كلما زادت الفرص سيكون تحديد الإيجابية منها.
    7. بمجرد انتقاء جميع المستنسخين ونقلها في لوحة جيدا 96، تسمح للخلايا لتنمو لبضعة أيام في المتوسطة انتقائية و 12 ك في لحم الخنزير (كايغن) المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS، 2 مم ل الجلوتامين، البنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة)، ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام في المتر المسطح متوسطة) والتي تحتوي على النيوميسين بتركيز 0.7 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية و 5% CO2، حتى وصلت إلى التقاء 90%.
  5. تقسيم الحيوانات المستنسخة
    1. إعداد ثلاث لوحات جيدا 96 المغلفة مع الجيلاتين بإضافة ميليلتر 100 من الجيلاتين الواحد جيدا، احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. سيتم استخدام هذه اللوحات لاستخراج الحمض النووي (DNA لوحة) واستنساخ التجميد (تجميد الألواح).
      ملاحظة: سوف تعزز الجيلاتين المرفق للخلايا والحمض النووي للآبار. على وجه الخصوص، سيسمح طلاء الجيلاتين الحمض النووي عصا في الجزء السفلي من الآبار أثناء استخراج الحمض النووي، وتغسل الإجراءات (مناقشتها أدناه). أثناء إجراء تقسيم استنساخ، فإنه من المستحسن استخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. نضح المتوسطة من كل بئر من لوحة جيدا 96 مجرد استنساخ التوصل إلى التقاء 90%، وتغسل ببرنامج تلفزيوني وإضافة 30 ميليلتر من التربسين 0.25% من كل بئر واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استنساخ سوف تنمو بمعدلات مختلفة، الذي سوف يعتمد أيضا على عدد الخلايا التي التقطت كل استنساخ. وهكذا، سيتم تنفيذ هذه الخطوة خلال عدة أيام عندما المستنسخين مختلفة تصل إلى التقاء 90%.
    3. إضافة ميليلتر 70 من انتقائية المتوسطة الواحدة وكذلك، وتعطيل كتل الخلايا عن طريق بيبيتينج أعلى وأسفل داخل الآبار، ثم نقل 30 ميليلتر من ميليلتر 100 لوحة الحمض النووي جيلاتينيزيد المعبأة مع 120 ميليلتر من المتوسطة انتقائية كل ميليلتر جيدا و 30 إلى لوحات تجميد gelatinized فيت المعبأة ح 50 ميليلتر المتوسطة (دون تحديد).
    4. ضع لوحة الحمض النووي في الحاضنة وتسمح للخلايا لتنمو في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى التقاء 90%.
    5. إضافة ميليلتر 80 من المثلج الطازج 2 × تجميد المتوسطة (80% FBS و 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) لكل بئر من لوحة التجميد، إضافة بارافيلم (رش مع الإيثانول 70 في المائة) أعلى لوحة حتى ختم كل بئر ووضع الغطاء في الأعلى والتفاف اللوحة مع رقائق الألومنيوم. وضع لوحات التجميد في-80 درجة مئوية.
    6. إضافة ميليلتر 90 من انتقائية المتوسطة الواحدة وكذلك إلى لوحة جيدا 96 الأصلي الذي يحتوي على النسخ التي قد تم تقسيمها ويبقيه في الثقافة حتى بكر فرز النتائج. سيتم استخدام هذه اللوحة كلوحة النسخ الاحتياطي.

2-فرز لاستنساخ مقاومة النيوميسين

  1. استخراج الحمض النووي من 96 لوحة الحمض النووي جيدا.
    1. وبمجرد استنساخ مثقف في لوحة الحمض النووي التوصل إلى التقاء 90%، يغسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم مع 50 المخزن المؤقت من تحلل ميليلتر (10 ملم تريس درجة الحموضة 7.5، 10 مم يدتا، 10 مم كلوريد الصوديوم، والحزب الديمقراطي الصربي 0.5%، والبروتيناز 1 ملغ/مل ك). تغطية اللوحة مع بارافيلم، وختم كل بئر، وضع الغطاء، مع التفاف ساران تغطية، ووضع في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. إضافة 100 ميليلتر من الإيثانول البارد (وأوه)/محلول كلوريد الصوديوم (0.75 متر كلوريد الصوديوم في الإيثانول 100 ٪) لكل خير ويعجل ح 6 أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
    3. إزالة الحل Et-أوه/كلوريد الصوديوم بعكس اللوحة ويغسل 3 مرات مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70% من كل بئر.
    4. إضافة 25 ميليلتر من حل رناسي A في الماء المقطر واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
  2. استخدم 3 ميليلتر من الحمض النووي للتضخيم PCR. إجراء فحص PCR من استنساخ المحدد باستخدام كبسولة تفجير الصلب داخل الجينات المقاومة النيوميسين وسوبتيلوميري 15q. [بكر] تضخيم تتم باستخدام الإنزيمات بوليميريز القياسية و بروتوكولات بكر21.
    ملاحظة: شروط بكر MS2 الإشعال (MS2-subtel15q-التمهيدي-S و MS2 التمهيدي ك) والإشعال إلى الظهور (رئيس الوزراء إلى الظهور ثانية والتمهيدي إلى الظهور ك) هي التالية: 98 درجة مئوية 20 s كخطوة تمسخ وثم 34 دورات في s 98 درجة مئوية 10، 58 درجة مئوية 20 ق، ق 72 درجة مئوية 15 ، باستخدام إنزيم بوليميراز في 25 ميليلتر مزيج رد فعل (انظر الجدول للمواد). وترد في الجدول 1متواليات التمهيدي.
  3. تشغيل PCR ردود الفعل على [اغروس] هلام واستخراج PCR العصابات التي تم الحصول عليها من الحيوانات المستنسخة إيجابية باستخدام إجراءات استخراج هلام القياسية (انظر الجدول للمواد لجل استخراج المواد الكاشفة).
  4. إجراء تحليلات تسلسل الحمض النووي المنتج استخراج هلام PCR لتأكيد وجود تسلسل MS221.
    ملاحظة: يمكن إجراء تحاليل تسلسل باستخدام أجهزة الإشعال المستخدمة لفحص PCR.
  5. الفحص جنوب وصمة عار لاستنساخ إيجابية PCR
    1. تنمو المستنسخين الإيجابية في بكر وفرز تسلسل من لوحة جيدا 96 الأصلي (لوحة النسخ الاحتياطي) إلى 6 اللوحات جيدا في المتوسط و 12 ك في لحم الخنزير (كايغن) وتستكمل مع 10% FBS، 2 مم ل الجلوتامين، البنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة)، ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسطة) والتي تحتوي على النيوميسين بتركيز 0.7 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية 5% أول أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، إذا كان قد تم فقدان بعض من هذه الحيوانات المستنسخة، ذوبان الجليد لهم من إحدى لوحات تجميد (انظر البروتوكول 2.6).
    2. بمجرد استنساخ في التقاء 90% في لوحة جيدا 6، تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام بروتيناز ك كل بئر.
    3. تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة خلية ونقل في أنبوب 1.5 مل.
    4. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
    5. أضف 1 مل إيثانول 100% واهتز بشدة، والسماح للحمض النووي يعجل على الأقل 2 ح أو بين ليلة وضحاها في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
    6. تدور في س 13,400 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية، وتغسل الكريات مع الإيثانول 70%. واسمحوا الكريات الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، استخدم مركز فراغ.
    7. ريسوسبيند الكريات الحمض النووي في 50 ميليلتر من الماء المقطر الذي يحتوي على رناسي أ واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
    8. هضم 5-10 ميكروغرام للحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد نكوي وبامهي (ديجيسشنز المستقلة اثنين) في حجم رد فعل ميليلتر 100 التي تفرخ ردود فعل الهضم عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    9. تشغيل 4 ميليلتر من الهضم على [اغروس] هلام ([اغروس] 0.8 في المائة) لتأكيد إكمال الهضم.
    10. إضافة إلى حجم 1/10 من الحل م 3 خلات الصوديوم درجة الحموضة 5-2 و 2 كميات الإيثانول 100% إلى ردود فعل الهضم التقييد واحتضان على الأقل 2 ح أو بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية يعجل بالحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
    11. الطرد المركزي في 13,400 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وتجاهل في supernatants، وتغسل الكريات مع الإيثانول 70%. تسمح الكريات إلى الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، استخدم مركز فراغ.
    12. ريسوسبيند الكريات في 20 ميليلتر من الماء المقطر وتحميل الحمض النووي هضمها على 0.8% [اغروس] هلام.
      ملاحظة: للحصول على حل أفضل لهضم الحمض النووي، إعداد جل مالا يقل عن 15 سم طويلة وتشغيل بين عشية وضحاها في الجهد المنخفض (فور ثري زيرو فولت). ينبغي أن يكون الأمثل التفريد إعداد.
    13. في اليوم التالي، وصمة عار الهلام مع عامل التوسيم الحمض النووي، مثل بروميد اثيديوم بتركيز نهائي 1 ميليلتر/10 مل، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتقاط صورة مع مسطرة قريبة من الجل على جل التصوير الصك.
    14. تعيين نقل الحمض النووي لغشاء نايلون وأداء الغشاء التهجين مع تحقيق خاصة بتسلسل MS2 استخدام إجراءات معيارية21.
    15. ذوبان الجليد المستنسخين الإيجابية في بكر، الحمض النووي تتابعها والجنوب وصمة عار من واحدة من لوحات تجميد اثنين (انظر الخطوة التالية).
  6. ذوبان الجليد من الحيوانات المستنسخة
    1. إعداد أنبوب 15 مل واحد يحتوي على 5 مل من و-12 ك قبل حرارة حم المتوسطة (كين) وتستكمل مع 10% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين والبنسلين (0.5 وحدة لكل مل متوسطة) ستربتوميسين (0.2 ميكروغرام كل مل متوسط) لكل استنساخ يكون مذاب.
    2. إزالة أحد لوحات التجميد من درجة-80 وإضافة 100 ميليلتر من قبل حرارة متوسطة كاملة F12K لتتضمن أيضا استنساخ إيجابية يكون مذاب.
      ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء بسرعة، وينبغي أن توضع لوحة جيدا 96 على الثلج الجاف بعد هو إذابة كل استنساخ، بغية السماح باستنساخ أخرى أن تظل مجمدة. هذا مهم خاصة إذا كان استنساخ متعددة تحتاج إلى يكون مذاب من نفس اللوحة جيدا 96.
    3. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 5 مل من المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. نضح المتوسطة، ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من قبل حرارة متوسطة F12K كاملة، ونقل كل استنساخ لبئر واحدة من 12 لوحة جيدا.
  7. القضاء على الجينات المقاومة النيوميسين من الكاسيت MS2 المتكاملة في سوبتيلوميري 15q.
    1. السماح باستنساخ تنمو من 12 لوحة جيدا لطبق 10 سم في كامل F12K المتوسطة.
      ملاحظة: النيوميسين أن لا يدرج في الأجل المتوسط ما لم يتبين خلاف ذلك.
    2. إضافة إتش معربا عن لجنة المساواة العرقية إلى الخلايا المستزرعة في طبق 10 سم في التقاء 70% في 10 مل من إكمال F12K المتوسطة.
      ملاحظة: استخدام إتش وإذ تعرب عن لجنة المساواة العرقية-التجارة والنقل سيسمح تقييم كفاءة العدوى، الذي ينبغي أن الاقتراب من نسبة 100%. سيتم فقدان إتش معيبة النسخ المتماثل بعد بضع فقرات في الثقافة.
    3. 48 ساعة بعد الإصابة، تقسيم الخلايا في ثلاثة أطباق 10 سم. سيتم استخدام الأطباق اثنين لتحقق إزالة الجينات النيوميسين بالانتقاء السلبي، تنمو خلايا تحتوي على النيوميسين المتوسطة (طبق أولاً)، ومن الجنوب لطخة (الطبق الثاني).
    4. الثقافة الطبق الثالث الذي يحتوي على النسخة لتجميد الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي.

3-تحقق إعراب تيرا-MS2 نسخة RT-قبكر

  1. عند تحقق إزالة الجينات النيوميسين، أداء مجموع استخراج الحمض النووي الريبي من تيرا-MS2 الحيوانات المستنسخة باستخدام المذيبات العضوية (حل إيسوثيوسيناتي الفينول وغوانيدين)21.
    1. ريسوسبيند الحمض النووي الريبي المستخرج من طبق 10 سم في 100 ميليلتر من الماء بيروكاربوناتي (ديبك) إثيل.
    2. تشغيل 3 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي على جل حمض (والمماسح) بروبانيسولفونيك 3-(N-Morpholino) ديناتوراتينج (1% فورمالدهايد تتضمن) 1 x بغية التحقق من تركيز ووحدة من الجيش الملكي النيبالي. كما يحلل تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    3. علاج 3 ميكروغرام للجيش الملكي النيبالي مع الدناز أنا استخدام الوحدة 1 من الدناز أنا الإنزيم في 60 حجم الرد النهائي ميليلتر.
    4. تبني رد فعل ح 1 في 37 درجة مئوية.
  2. عكس رد فعل النسخ وتحليﻻت qPCR
    1. أضف المكونات التالية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي خالية من نوكلاس: ميليلتر 2 تيرا 1 ميكرومتر محددة تمهيدي، 1 ميليلتر من دنتبس ميكس (10 ملم في كل)، 6 ميليلتر من الدناز أنا-معاملة الحمض النووي الريبي (المقابلة للجيش الملكي النيبالي ̴300ng). ضبط حجم الصوت إلى ميليلتر 13 مع 4 ميليلتر من الماء ديبك.
      ملاحظة: لكل الجيش الملكي النيبالي تحليلها، أنبوب ثان يحتوي على الكواشف نفس ولكن تمهيدي إشارة محددة، بدلاً من تيرا التمهيدي محددة، ينبغي أن تعد.
    2. تسخين المزيج إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق واحتضان في الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
    3. جمع محتويات الأنابيب بالطرد المركزي قصيرة وإضافة 4 ميليلتر من 5 X RT الإنزيم المخزن المؤقت، ديثيوثريتول م 0.1 1 ميليلتر (DTT)، 1 ميليلتر (4 وحدات) من رناسي المانع، و 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية (انظر الجدول للمواد).
    4. احتضان هذه العينات في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، ثم استخدم 2 ميليلتر من رد فعل RT لتحليلات qPCR.
  3. إعداد مزيج رد فعل قبكر بحجم نهائي في 20 ميليلتر تتألف من 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي x qPCR 2، 2 ميليلتر من قالب كدنا، 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 1 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، و 6 ميليلتر من الماء.
  4. القيام برد فعل قبكر في ثيرموسيكلير استخدام البروتوكولات القياسية21.

4-إنتاج لفي معربا عن MS2-بروتينات فلورية خضراء

  1. لتوليد لفي تعرب عن MS2-التجارة والنقل، ترانسفيكت 80% فينيكس المتلاقية تغليف الخلايا مع بروتين انصهار MS2-بروتينات فلورية خضراء الإعراب لفي المتجهات (بورو ببابي-MS2-التجارة والنقل) وجينات الحياة الفطرية التعبير عن المتجهات (مثل بكمف-فسفج) باستخدام نسبة 4:1 للمولى موجهات اثنين.
  2. اليوم التالي، استبدال وسيلة تثقيف (دميم تكملة مع 10% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين والقلم/بكتيريا) تحتوي على المتوسط الطازجة 10 ملم الصوديوم بوتيرات.
  3. احتضانها ح 8 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، ثم استبدال المتوسطة مع المتوسط تثقيف الطازجة التي ستجمع الفيروس.
  4. بعد 48 ساعة، إزالة المتوسطة المحتوية على لفي من الخلايا فينيكس. هذه الوسيلة يمكن استخدامها مباشرة للعدوى من الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2، وفي هذه الحالة تصفية المتوسطة من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر، إضافة بوليبريني (30 ميكروغرام/مل تركيز النهائية) وإضافتها إلى الخلايا (في هذه الحالة ما زالت البروتوكول في الخطوة 5). وبدلاً من ذلك، يمكن عجلت لفي في أنبوب فالكون 50 مل بإضافة 1/5 حجمال 50% شماعة-8000/900 ملم محلول كلوريد الصوديوم وتفرخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة المدورة.
  5. اليوم التالي، بيليه لفي الجسيمات باستخدام الطرد المركزي في 2,000 ز س لمدة 30 دقيقة، إزالة المادة طافية، وريسوسبيند بيليه في المتوسط F12K دون المصل.
    ملاحظة: يمكن حراكه جزيئات الفيروس في 1/100th حجم طافية الأصلي. ينبغي أن يقوم اختبار إصابة بغية التحقق من حجم الحد الأدنى لفي اللازمة لكفاءة تصيب الخلايا.

5-التصور النصوص تيرا-MS2 في الخلايا الحية

  1. لوحة استنساخ تيرا-MS2 ووزن AGS الخلايا في أطباق زجاجية. اليوم من الإصابة، إضافة بوليبريني إلى المتوسطة (30 ميكروغرام/مل تركيز النهائية) ولفي تعرب عن MS2-التجارة والنقل.
  2. بعد 24 ساعة، تجاهل المتوسطة التي تحتوي على الفيروسات وإضافة متوسطة جديدة دون الحمراء الفينول.
  3. تحليل الخلايا في مجهر مقلوب استخدام الإعداد المناسب المجهر. الصورة في الخلايا التي تحتوي 100 X أو 60 X الهدف مع فتحه عددية كبيرة (1.4 X) واستخدام كاميرا حساسة (امككد). استخدام نظام مراقبة البيئة للحفاظ على العينات في شركة 37 درجة مئوية و 5%2 أثناء التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الرقم 1 يمثل نظرة استراتيجية تجريبية. تظهر الخطوات الرئيسية للبروتوكول ومخطط زمني إرشادي للجيل من الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2 في الخلايا AGS (الشكل 1أ). في اليوم الأول، هي transfected آبار متعددة للوحة جيدا 6 مع كاسيت MS2 وسجرنا/Cas9 التعبير عن المتجهات (كما هو مبين في الشكل 1ب). يتم استنساخ تسلسلين 15q-خاصة بدليل الحمض النووي الريبي سوبتيلوميري مختلفة في Cas9 نيكس-الإعراب عن ناقل pX335، وتوليد بين الموجهات سجرنا-pX335 التي شارك transfected مع كاسيت MS2. يمكن transfected من اللوحة واحدة جيدا مع بروتينات فلورية خضراء معربا عن ناقلات للتحقق من كفاءة تعداء. في يوم 2، تريبسينيزيد الخلايا ونقلها من بئر واحدة لطبق 10 سم تحتوي على المتوسط انتقائية. في يوم 3، ينبغي تغيير المتوسطة كما سيكون الأكثر أونترانسفيكتيد خلايا ميتة. خلايا تزرع في التحديد حتى الحيوانات المستنسخة مرئية وجاهزة ليتم انتقاؤها. وينبغي أن لا تريبسينيزيد الخلايا أثناء هذا الوقت، وتثقيف المتوسطة يجب تغيير كل يوم 1-2 للأسبوع الأول و 2-3 ثم كل يوم بعد ذلك. مجرد استنساخ واحدة مرئية، فهي التقطت ونقلت في صفيحة جيدا 96 حيث يسمح لهم بالنمو حتى تصل إلى 80-90% التقاء. عند هذه النقطة، يتم تقسيم الحيوانات المستنسخة في 4 مختلفة 96 جيدا لوحات، والتي تم وضع علامة عليها في الشكل 1 مع رمز لون. بمجرد استنساخ مثقف في لوحة الحمض النووي (الأخضر) التوصل إلى التقاء 80%، يتم تفكيك واستخراج الحمض النووي لبكر الفحص؛ استنساخ في لوحة النسخ الاحتياطي (أزرق) ستبقى في الثقافة حتى نتائج بكر الفحص، بينما يتم تجميد ألواح التجميد أحمر في-80 درجة مئوية. الرقم 2 ب يبين نتائج تمثيلية لفحص PCR لاستنساخ النيوميسين المقاوم. لهذا الفحص، يتم استخدام مجموعتين من الإشعال: التمهيدي واحد زوج (MS2 كبسولة تفجير) الصلب داخل تسلسل 15q النيوميسين الجينات وسوبتيلوميري يستخدم للتحقق من وجود كاسيت MS2 (صورة تمثيلية للتعريب الإشعال هو مبين في الرقم 2أ). الثاني التمهيدي زوج (للحد من الخطر كبسولة تفجير) الصلب في منطقة الكروموسومات داخلية يستخدم للتحقق من وجود استنساخ سلبية كاذبة (تسلسل التمهيدي مبينة في الجدول 1). ينبغي أن تكون النسخ السلبية لإدماج الكاسيت السلبية إلى التضخيم MS2 الإشعال وإيجابية إلى التضخيم الإشعال إلى الظهور. المشاكل التقنية في استخراج الحمض النووي الجينومي أسفر عن عدم وجود الحمض النووي أو التلوث من شأنها الحيلولة دون [بكر] تضخيم ردود التمهيدي MS2 والحد من الخطر. في هذه الحالات، يمكن أن يكون فحص PCR المستنسخين المعنية إعادة عند استخراج الحمض النووي من لوحة النسخ الاحتياطي. العصابات التي تم الحصول عليها من MS2 كبسولة تفجير التضخيم من الحيوانات المستنسخة إيجابية يمكن استخراج هلام والتسلسل باستخدام الإشعال MS2، بغية التأكد من وجود تسلسل MS2 عشرة.

المستنسخين الإيجابية في فحص PCR مثقف من لوحة النسخ الاحتياطي أيضا 96 (اللوحة الزرقاء في الشكل رقم 1) إلى لوحة جيدا 6، ثم تفكيك لاستخراج الحمض النووي الجينومي والتحليلات الجنوب وصمة عار. الرقم 2 ويبين د الصور التمثيلية هلام (يسار) والغشاء المهجنة مع الموسومة إشعاعيا MS2 تسلسل محددة تحقيق (يمين) لفحص جنوب وصمة عار لاستنساخ PCR إيجابيا. لتأكيد تكامل متواليات MS2 في سوبتيلوميري 15q، ينبغي أن يكون يهضم المستخرجة من كل استنساخ الحمض النووي مع اثنين من الإنزيمات تقييد مختلفة (نكوي وبامهي) في ردود فعل الهضم منفصلة اثنين. إنزيمات التقييد نكوي وبامهي مناسبة لتحقق تكامل كاسيت MS2 في سوبتيلوميري 15q. يمكن أيضا استخدام الإنزيمات الأخرى. يظهر الجل هضم كامل للحمض النووي استخدام إنزيم التقييد بامهي، كما يتضح من وجود تشويه. وتبين النتائج من الجنوب وصمة عار أن استنساخ واحد إيجابي لإدماج كاسيت MS2 في سوبتيلوميري 15q حين استنساخ عدة تظهر أحداث التكامل متعددة للكاسيت، كما أشارت إلى وجود نطاقات متعددة. يجب أن يتم تحليل استنساخ إيجابية بوصمة عار جنوب ثانية عند الهضم نكوي المجينية الحمض الخلوي الصبغي21. صورة تمثيلية لكاسيت سوبتيلوميري 15q المتضمن في MS2 وموقف بامهي ونكوي إنزيم التقييد المواقع يظهر في الشكل 2ج.

الإيجابية استنساخ بكر ووصمة عار جنوب مصابون التحليلات إتش وإذ تعرب عن لجنة المساواة العرقية-التجارة والنقل بغية إزالة الجين النيوميسين موجودة في كاسيت MS2. الرقم 3 أ يصور سوبتيلوميري معلم MS2 15q قبل وبعد تعبير لجنة المساواة العرقية. صورة لاستنساخ الإيجابية للتكامل كاسيت MS2 في سوبتيلوميري 15q المصابة مع لجنة المساواة العرقية-بروتينات فلورية خضراء ويبين الشكل 3بإتش إذ تعرب عن. لإزالة كاملة من الجينات النيوميسين في كافة الخلايا، كفاءة الإصابة ينبغي أن تصل إلى ما يقرب من 100 ٪. كما هو موضح في الشكل 3جيم، بغية التحقق من القضاء على الجين النيوميسين، لجنة المساواة العرقية-بروتينات فلورية خضراء المصابة هي تقسيم خلايا في ثلاث لوحات بعد 48 ساعة من الإصابة. وسوف يكون مثقف لوح واحد حضور النيوميسين. ينبغي أن يموت كل الخلايا في هذه اللوحة خلال 6-7-يوما. في لوحة ثانية، سيسمح الخلايا لتنمو في المتوسط كاملة دون التحديد لالتقاء 80-90%. عند هذه النقطة، استخراج الحمض النووي وتحليلها من قبل الجنوب وصمة عار. هو مثقف اللوحة الثالثة في المتوسط كاملة للسماح بإعداد الأرصدة المجمدة للاستنساخ واستخراج الحمض النووي الريبي وتحليلات RT-qPCR MS2 تيرا نسخة التعبير. الرقم 3 ويبين د الصور التمثيلية التحليلات الجنوب وصمة عار لاستنساخ إيجابية قبل وبعد الإصابة Cre-التجارة والنقل. ويؤكد الحمض النووي [اغروس] هلام (الصورة على اليسار) هضم الحمض النووي الجينومي استخدام إنزيم التقييد نكوي كاملة. تم إجراء تحليل لطخة الجنوبية استخدام تسلسل MS2 المسمى بالاشعاع تحقيق محددة (الصورة على اليمين). ويؤكد هذا التحليل إزالة الجين النيوميسين. يؤكد وجود تشويه في العينة المصابة Cre-بروتينات فلورية خضراء التكامل تيلوميريك تسلسل MS2. يبين الشكل 3ألفموقف مواقع التقييد نكوي داخل سوبتيلوميري 15q.

حالما يتم التأكد من القضاء على الجينات المقاومة النيوميسين يمكن اختبارها المستنسخين للتعبير عن النصوص تيرا-MS2. لتحقيق هذا الهدف، المستخرجة من كل استنساخ مجموع الجيش الملكي النيبالي وتشغيلها على جل الممسحات ديناتوراتينج للتأكد من سلامتها (الشكل 4أ). الحمض النووي الريبي الريباسي عصابات يجب أن تكون مرئية في قواعد 4,700 (الرنا الريباسي 28S) وقواعد 1,900 (الرنا الريباسي 18S). ريتروترانسكريبشن رد الفعل تتم باستخدام تيلوميريك الخاصة بتكرار تمهيدي والمرجعية الخاصة بالجينات التمهيدي (الشكل 4باء، أعلى) بينما تحليلات qPCR للتعبير تيرا تتم باستخدام مجموعتين من الإشعال: أول كتاب واحد زوج الصلب داخل تسلسل MS2 وتسلسل سوبتيلوميري 15q؛ زوج ثاني من الصلب داخل سوبتيلوميري 15q كبسولة تفجير. وترد في الجدول 1تسلسل التمهيدي. يبين الرسم البياني في الشكل 4ب تحليلات RT-qPCR التعبير تيرا من الخلايا AGS WT واثنين من الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2 مختلفة. وتؤكد هذه التحليلات التعبير عن المحاضر تيرا-MS2 في استنساخ اثنين على المستويات التي تكون قابلة للمقارنة للنصوص تيرا أعرب من سوبتيلوميري 15q في الخلايا WT. هذه البيانات تشير إلى أن المستنسخين تيرا-MS2 هما تحديد مناسبة لتحليل النصوص تيرا-MS2 بتصوير الخلايا الحية.

من أجل تصور النصوص تيرا-MS2 في الخلايا الحية، مصابون المستنسخين المحدد لفي معربا عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل. الرقم 5 أ يظهر الإجراء لتوليد لفي تعرب عن MS2-التجارة والنقل، كما هو موضح في الخطوة 4 من البروتوكول. خلايا وزن AGS واستنساخ تيرا-MS2 مصابون في أطباق زجاجية. بعد 24 ساعة من العدوى، ويتم تحليل الخلايا بالميكروسكوب الأسفار. ويؤكد خصوصية الإشارة وجود البؤر تيرا-MS2-التجارة والنقل التي اكتشفت في نواة لاستنساخ تيرا-MS2 وليس في وزن AGS الخلايا (الشكل 5ب). الإعراب عن الخلايا، عدم التجانس من حيث مستويات MS2-التجارة والنقل بين الخلايا من المتوقع في عدد سكان من MS2-التجارة والنقل وينبغي اختيار الخلايا معربا عن المستويات المنخفضة للتحليلات التصوير. وبدلاً من ذلك، يمكن فرز الخلايا MS2 التجارة والنقل وإذ يعرب عن تحليلات مجهرية السابقة نظام مراقبة الأصول الميدانية بغية جمع يتدنى الخلايا معربا عن المستويات المنخفضة للتجارة والنقل. سابقا اكتشفنا البؤر تيرا-MS2-التجارة والنقل في 40% إلى 60% خلايا من AGS تيرا-MS2 استنساخ21. في هذه الخلايا، تم تصويرها واحد إلى أربعة تيرا-MS2-بروتينات فلورية خضراء البؤر كل خلية. يمكن أن تكون بؤر تيرا-MS2-التجارة والنقل تبين أحجام متميزة وديناميات المكتشفة21. يمكن استخدام استنساخ تيرا-MS2 لدراسة ديناميات telomere واحد تيرا المحاضر في الخلايا الحية. وكمثال لهذا التطبيق، يظهر الشكل 5ج صور تمثيلية من تحليلات مجهرية لاستنساخ تيرا-MS2 الإعراب عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل والبروتين ملزمة telomere تنصهر TRF2 إلى متشيري من أجل تصور النصوص تيرا معلم MS2 و telomeres في الخلايا الحية. باستخدام هذا النهج، سبق لاحظنا أن البؤر تيرا-MS2-التجارة والنقل المشترك تعريب مع التيلومير في 44% الخلايا، مما يشير إلى أن النصوص تيرا فقط عابر شارك تعريب مع نهايات الكروموسومات في الخلايا AGS21.

Figure 1
الرقم 1 . نظرة عامة على استراتيجية تجريبية والجدول الزمني الإرشادي لتوليد تيرا-MS2 استنساخ في الخلايا AGS. A) تظهر الخطوات المذكورة في البروتوكول والجدول الزمني إرشادي لاستنساخ اختيار تيرا-MS2. هي transfected الخلايا في صفيحة جيدا 6 مع خطية MS2 كاسيت والإعراب عن ناقلات سجرنا/Cas9. يتم استخدام رمز لون للتمييز لوحة الحمض النووي، لوحة النسخ الاحتياطي ولوحات التجميد المشار إليه في المقطع بروتوكول. ب) كاسيت MS2 يتكون من تسلسل طويلة سوبتيلوميري 15q nt 800 متبوعاً بالتكرار 10 تسلسل MS2 وجينات مقاومة النيوميسين يحف به ف لوكس مواقع وينهي مع nt 300 طويلة تيلوميريك المسالك تكرار في نهايته 3 '. سجرنا/Cas9 وإذ تعرب عن ناقلات تم إنشاؤها بواسطة الاستنساخ متواليات محددة 15q دليل الحمض النووي الريبي سوبتيلوميري في ناقلات pX335 استخدام التقييد بسي الموقع21،22. موجهات pX335 سجرنا مختلفة اثنين تم إنشاؤها وكان يستخدم مزيج 1:1 من موجهات اثنين تعداء. تسلسل سجرناس مبينة في الجدول 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الرقم 2 . صور الممثل بكر وجنوب لطخة الفرز لاستنساخ مقاومة النيوميسين. A) صورة تمثيلية سوبتيلوميري 15q تحتوي على الكاسيت MS2. تتم الإشارة إلى موقف MS2 كبسولة تفجير (MS2-subtel15q-التمهيدي-S و MS2 التمهيدي ك) المستخدمة لفحص PCR. مواقع لوكسب موجودة داخل الكاسيت تظهر باللون الأحمر. ب) صورة تمثيلية لفحص PCR لمقاومة النيوميسين الحيوانات المستنسخة باستخدام اثنين من مجموعة الإشعال والإشعال MS2 والإشعال إلى الظهور (رئيس الوزراء إلى الظهور ثانية والتمهيدي إلى الظهور ك). ج) صورة تمثيلية سوبتيلوميري 15q تحتوي على الكاسيت MS2. تظهر مواقع التقييد بامهي ونكوي والمسبار MS2 المستخدمة لفحص جنوب وصمة عار. د) اليسار: 10 ميكروغرام لكل استنساخ الحمض النووي تم هضمها مع بامهي وتشغيل على [اغروس] هلام. الصورة حصل بعد ليلة أمس بتشغيل 30 فولت. الحق: نقلت إلى غشاء نايلون إيجابيا يحمل الحمض النووي يهضم مع إنزيم التقييد بامهي وتهجين مع تحقيق خاصة بتسلسل MS2 المسمى إشعاعيا. يشير المربع الأحمر إلى الحجم المتوقع للفرقة إيجابية. يشير السهم الأحمر إلى استنساخ إيجابية واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الرقم 3 . القضاء على المقاومة النيوميسين تجارب الجينات والتحقق من الصحة. A) صورة تمثيلية سوبتيلوميري 15q تحتوي على الكاسيت MS2 قبل وبعد تعبير لجنة المساواة العرقية. يتم إظهار MS2 التحقيق المحددة المستخدمة في التحليلات الجنوب وصمة عار ونكوي إنزيم التقييد المواقع. مواقع لوكسب موجودة داخل الكاسيت تظهر باللون الأحمر. ب) Fluorescence الفحص المجهري التحليل لاستنساخ تيرا-MS2 المصابين إتش Cre بروتينات فلورية خضراء وإذ يعرب عن. تظهر صورة تمثيلية المكتسبة في طائرة تنسيق واحد. وزارة الداخلية، وتعدد الإصابة، وهو النسبة بين عدد الفيروسات المستخدمة للعدوى وعدد الخلايا المضيفة. شريط الحجم: 30 ميكرون ج) لمحة عامة عن استراتيجية تجريبية تستخدم للتحقق من القضاء على الجين النيوميسين. يتم تقسيم خلايا كريجفب المصابة في ثلاث لوحات بعد 48 ساعة من العدوى لاختيار ط) السلبية ووصمة عار الجنوبية ثانيا) تحليلات وثالثاً) إعداد الأرصدة المجمدة الخلية واستخراج الحمض النووي الريبي. د) تحليلات وصمة عار جنوب تيرا-MS2 استنساخ قبل وبعد الإصابة إتش Cre-التجارة والنقل. وقد يهضم 10 ميكروغرام للحمض النووي مع إنزيم التقييد نكوي. ويؤكد [اغروس] هلام أن الهضم الكامل يتحقق في كل النسخ (يسار). نقلت إلى غشاء نايلون مشحونة بشكل إيجابي هضم الحمض النووي وتهجين استخدام تحقيق خاصة بتسلسل MS2. ويؤكد القضاء التام على الجين النيوميسين غياب الفرقة محددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الرقم 4 . تحليلات RT-qPCR لتل15س-تيرا وتل15س-تيرا--مرض التصلب العصبي المتعدد2 التعبير النصوص. A) صورة تمثيلية من جل والمماسح عرض مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا AGS WT واستنساخ تيرا-MS2. الفرق المقابلة يشار إلى الكشف الريباسي 28S و 18S. ب) أعلى: تخطيطي من سوبتيلوميري معلم MS2 15q معربا عن النصوص تيرا. يتم إظهار الإشعال المستخدمة ريتروترانسكريبشن تيرا (أصفر) والتحليلات قبكر Tel15q-تيرا (أزرق) و Tel15q-MS2 "تيرا" (أحمر). ويرد في موقع لوكسب باللون الأحمر. أسفل: استنساخ تحليلات RT-qPCR التعبير المستنسخات تيرا Tel15q و Tel15q-MS2 تيرا في الخلايا AGS WT وتيرا-MS2. ف < 0.05، مزاوج تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5 . خلية يعيش التصوير تحاليل لمرض التصلب العصبي المتعدد-تيرااستنساخ2 . أ) لمحة عامة عن الإجراءات التي تنتج لفي تعرب عن MS2-التجارة والنقل، كما هو موضح في الخطوة 4 من البروتوكول. ويرد تخطيطي سوبتيلوميري معلم MS2 15q والمستنسخات تيرا المعترف بها البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل على اليمين. ب) استنساخ صورة مجهرية fluorescence الممثل AGS WT واثنين تيرا-MS2 الإعراب عن MS2-التجارة والنقل. يتم الإشارة إلى البؤر تيرا-MS2-التجارة والنقل بالأسهم. الصور تم الحصول عليها استخدام مجهر [كنفوكل] قرص غزل مزودة كاميرا امككد. الصور تم التقاطها باستخدام 100 X/1.46 الهدف أبوتشرومات في دائرة تصوير للحفاظ على 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. ليزر 488 كمصدر الضوء. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. ج) الخلية الحية التصوير تحليلات البؤر تيرا-MS2-التجارة والنقل و TRF2-مشري المسمى telomeres. يظهر حدث تعريب المشارك بين تركيز تيرا-MS2-التجارة والنقل و telomere واحد. الصور تم الحصول عليها كما هو الحال في ب، باستخدام أشعة الليزر 488 و 520 كمصدر الضوء. إسقاطات قصوى لتجربة المكدس z يؤديها في وقت واحد تظهر نقطة من الوقت الفاصل بين تجربة التصوير. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

اسم الدليل تسلسل التمهيدي التطبيق
MS2-subtel15q-التمهيدي-S تجكاتااججتككاجتج MS2 التمهيدي إلى الأمام المستخدمة لفحص PCR لاستنساخ مقاومة النيوميسين
التمهيدي MS2 ككتاكتجاكاكاكاتككاكاجا التمهيدي MS2 عكس المستخدمة لفحص PCR لاستنساخ مقاومة النيوميسين
التمهيدي إلى الظهور ثانية TGT ACG التقييم القطري المشترك هيئة مكافحة الفساد كاج TGC تيراغرام التمهيدي للحد من الخطر إلى الأمام المستخدمة في فحص PCR لاستنساخ مقاومة النيوميسين
التمهيدي إلى الظهور فريق هيئة مكافحة الفساد تج AGG GGA بنا A التمهيدي إلى الظهور عكس المستخدمة في فحص PCR لاستنساخ مقاومة النيوميسين
Tel15q-S1 جكاجكجاجاتكتكككاجك التمهيدي الشعور يستخدمها qPCR للكشف عن التعبير Tel15q والأرض Tel15q-MS2
hTel15q-ك تاككاكاتجاجكاتجتججتج التمهيدي العقاقير التي يستخدمها qPCR للكشف عن التعبير Tel15q والأرض Tel15q-MS2
Tel15q-MS2-كما أتجتتكتجكاتكجاجكاتاج التمهيدي العقاقير التي يستخدمها qPCR للكشف عن التعبير "تيرا" Tel15q-MS2
تيرا--الرايت--التمهيدي كككتاكككتاكككتاكككتاكككتا التمهيدي تستخدم ريتروترانسكريبشن النصوص تيرا
sgRNA1 تججاجاتكتكجكتجكك التسلسل دليل قصيرة 1 الجيش الملكي النيبالي المستنسخة في ناقلات pX335 ويستخدم لتوجيه النشاط الأنزيمي نيكس Cas9 سوبتيلوميري 15q
sgRNA2 تجكاتااججتككاجتج التسلسل دليل قصيرة 2 الجيش الملكي النيبالي المستنسخة في ناقلات pX335 ويستخدم لتوجيه النشاط الأنزيمي نيكس Cas9 سوبتيلوميري 15q

الجدول 1 : قائمة بأجهزة الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة. وترد قائمة الإشعال وتسلسل سجرناس المستخدمة في هذا البروتوكول. تسلسل من 5 'إلى 3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا المقال نقدم وسيلة لتوليد السرطان البشرية استنساخ الخلية التي تحتوي على تسلسلات MS2 المتكاملة داخل سوبتيلوميري 15q. استخدام هذه الحيوانات المستنسخة، الجزيئات تيرا MS2 معلم نسخها من سوبتيلوميري 15q اكتشاف بالفحص المجهري fluorescence المشارك التعبير عن البروتين الانصهار MS2-التجارة والنقل. هذا النهج يتيح للباحثين لدراسة ديناميات تيرا أعربت واحدة من الخلايا telomere في المعيشة21. في هذا البروتوكول، ويتم تحديد تيرا-MS2 الحيوانات المستنسخة في خط الخلية AGS، الذي يمثل نظام نموذجية مثيرة لاهتمام لدراسة الأرض، ونظرا للتعبير تيرا أوبريجولاتيد في عينات سرطان المعدة البشرية24. ومع ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا يمكن تكييفها لاختيار استنساخ تيرا-MS2 في خطوط الخلايا الأخرى. تكامل تسلسل MS2 يمكن من حيث المبدأ النهوض في سوبتيلوميري مختلفة من telomere 15q باستخدام محدد MS2 كاسيت واستراتيجية كريسبر. في أسلوب عرض هنا، يعملون إنزيم نيكس Cas9 ودليل ضعف الكشف بغية زيادة خصوصية التكامل22. باستخدام هذه الاستراتيجية، يتوقع العام 2 في المائة من الحيوانات المستنسخة إيجابية يمكن تحديدها في الخلايا AGS. ويمكن اختبار إصدارات أخرى من الإنزيم Cas9 في محاولة لزيادة معدل النجاح ل انتقاء الحيوانات المستنسخة25. وبالإضافة إلى ذلك، الخطوات التالية للبروتوكول هي الحاسمة تأخذ في الاعتبار لتحقيق أقصى قدر من كفاءة التحديد استنساخ:

ط) بغية زيادة فرص اختيار المستنسخين تيرا-MS2، من المهم تحقيق كفاءة عالية تعداء كاسيت MS2 ومتجهات كريسبر. خطوط الخلية transfected سيئة سيتطلب على الأرجح عدة جولات من تعداء واستنساخ الاختيار والفرز بغية تحديد النسخ الإيجابية.

ثانيا) من المهم تحديد دقة تركيز النيوميسين ﻻستخدام لاختيار المستنسخين. في الواقع، تستخدم تركيز منخفض من المخدرات سيؤدي إلى استنساخ الإيجابية الكاذبة بينما تركيز عال قد يحول دون تحديد النسخ الإيجابية. تركيز النيوميسين المشار إليها في هذا البروتوكول قاتلة للخلايا AGS داخل 6-7 أيام من الإضافة إلى وسيلة تثقيف.

ثالثا) استنساخ الانتقاء خطوة حاسمة. في الواقع، أثناء هذا الإجراء مطلوب أن يتم انتقاؤها استنساخ واحدة فقط. لهذا السبب، المستعمرات التي قريبة جداً من بعضها البعض وينبغي تجنب منعا لخلط الخلايا من الحيوانات المستنسخة مختلفة، أسفرت عن اختيار السكان مختلطة من الحيوانات المستنسخة التي قد تحتوي على تسلسلات MS2 متكاملة في عدة مواقع الجينوم. وينبغي تحديد هذه الأحداث أثناء الفحص جنوب وصمة عار.

رابعا) كمية الحمض النووي المستخرج من صفيحة الحمض النووي جيدا روافد 96 (بروتوكول 2) يقدر بحوالي 5 ميكروغرام وينبغي أن يكون كافياً للشاشة كل استنساخ بكر والنشاف الجنوبي مع واحد تقييد إنزيم هضم. ومع ذلك، بغية التأكد من تكامل الكاسيت في telomere المتوقعة، سيكون من المهم على الشاشة كل استنساخ من الجنوب وصمة عار بهضم الحمض النووي الجينوم مع اثنين من الإنزيمات قيود مختلفة. كما ورد في البروتوكول، وتحقيقا لهذا الهدف، ينبغي أن يكون المستنسخين الإيجابية في فحص PCR المستزرعة في 6 لوحات جيدا. كمية الحمض النووي المستخرج من بئر للوحة جيدا 6 سيكون كافياً لاثنين على الأقل تقييد ديجيستيونس المطلوبة للتحليلات الجنوب وصمة عار.

البروتوكول هو موضح هنا، تتكامل في تسلسل MS2 داخل سوبتيلوميري 15q لعدد من الأسباب: أنا) تم تحديد منطقة المروج تيرا ومواقع بدء النسخ تيرا على هذا سوبتيلوميري26،27؛ الثاني) وقد تم التحقق من صحة التعبير تيرا من سوبتيلوميري 15q باستخدام في المختبر تقنيات4،،من2728،،من2930؛ الثالث) وقد تم التسلسل منطقة سوبتيلوميريك 15q الكروموسوم وأنه يحتوي على منطقة فريدة المتاخمة للمسالك تكرار تيلوميريك التي يمكن أن تكون مستهدفة لإدماج MS2-كاسيت21. وضعت بكر والنهج وصمة عار الجنوبي بغية التأكد من تكامل واحد تسلسل MS2 داخل سوبتيلوميري 15q في استنساخ تيرا-MS2. سيكون من المثير للاهتمام أن أيضا القيام بتجارب الحمض النووي-الأسماك على حيزات كروموسوم من أجل تصور التعريب الصبغية التسلسلات MS2 في الكروموسومات الطورية الثابتة. غير أن طول 10xMS2 تسلسل (450 bp) يفرض استخدام المسابير قصيرة جداً مقارنة بالمسابير تستخدم عادة في تجارب الحمض النووي-الأسماك على كروموسوم الحيزات (الصبغيات الاصطناعية البكتيرية (Bac)، كوسميدس أو والبلازميدات)31. هذا التحدي التقني قد منعتنا من تصور تسلسل MS2 على حيزات الكروموسوم الذي يمثل قيداً للبروتوكول. واحد الحد المزيد من الأسلوب هو الوقت والجهد المطلوب لتحديد النسخ تيرا-MS2. وباﻹضافة إلى ذلك، مختبر محددة إعداد ومعدات للاستخدام الفيروسات والمواد المشعة وتحاليل مجهرية مطلوبة.

يمكن تنفيذ الطريقة الموضحة هنا للجيل من الحيوانات المستنسخة تيرا-MS2 في خطوط الخلايا المختلفة بغية تحديد القوى المحركة للأرض في مختلف السياقات البيولوجية، مثل أثناء الشيخوخة telomere خلل وظيفي أو الخلوية، تساعدنا على فهم وظيفة تيرا في هذه العمليات. مثيرة لاهتمام تطوير هذا النهج سيكون جيل استنساخ تيرا-MS2 المحتوية على تيتو يكرر المتكاملة في سوبتيلوميري محددة، بما في ذلك telomere MS2 معلم. التعبير عن البروتين تت تنصهر فيها بروتين فلوري (أي مشري) سوف يسمح التصور هذه الخلايا telomere خاصة في المعيشة32. وسيمكن هذا النهج التحقيق ما إذا كانت البشرية تيرا النصوص المعربة والتصرف في رابطة الدول المستقلة في تيرا تدوين telomere والكروموسوم أو في ترانس قبل الانتقال إلى أخرى الكروموزومات. وتظل هذه المسألة في علم الأحياء للأرض إلى توضيح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية

Acknowledgments

ونحن ممتنون لموظفي مرفق التصوير المتقدم من سيبيو في بجامعة ترنتو ومرفق "بيوبتيكس الخفيفة الميكروسكوب" في واو ماكس بيروتس المختبرات (مفبل) في فيينا. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من ستيفتونغ اوبرمان مالك والبرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتنمية التكنولوجية ومظاهره تحت المنحة من لا 609431 للجماعة الأوروبية. تدعمه المفوضية الأوروبية على زمالة ريتا ليفي مونتالشيني من الوزارة الإيطالية للتعليم الجامعي والبحوث (وزارة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGS cells - - Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Tags

علم الوراثة، العدد 143، طويلة فضله الجيش الملكي النيبالي، والأرض، telomere، والسرطان، كريسبر/Cas9 MS2-التجارة والنقل، تصوير خلية يعيش.
جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Avogaro, L., Oss Pegorar, C.,… More

Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter