Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以生成包含 ms2 序列标记在单个亚端粒的癌细胞克隆。这种方法, 依靠 ms2-gfp 系统, 实现了端粒重复 rna (terra) 的内源性转录记录的可视化表达从一个端粒表达在活细胞中。
Abstract
端粒被转录, 导致端粒重复编码 rna (terra), 这已被建议在端粒生物学中发挥重要作用, 包括异染色质的形成和端粒长度的稳态。最近的发现表明, terra 分子也与内部染色体区域相互作用, 以调节小鼠胚胎干细胞 (es) 细胞的基因表达。根据这一证据, rna 荧光原位杂交 (rnaa-fish) 分析表明, 只有一部分 terra 转录记录定位在染色体末端。更好地了解 terra 分子的动力学将有助于确定其功能和作用机制。在这里, 我们描述了一种方法, 标签和可视化单端粒 terra 转录在癌细胞使用 ms2-gfp 系统。为此, 我们提出了一个协议, 以产生稳定的克隆, 使用 ags 人类胃癌细胞系, 包含 ms2 序列集成在一个单一的亚端粒。从 ms2 标记的端粒中转录 terra 的结果是 ms2 标记的 terra 分子的表达, 这些分子在 ms2 rna 结合蛋白融合蛋白与 gfp (ms2-gfp) 共表达后, 通过活细胞荧光显微镜进行了可视化。这种方法使研究人员能够研究癌细胞中单端粒 terra 分子的动力学, 并可应用于其他细胞系。
Introduction
长非编码 rna terra 从染色体的亚端粒区域转录, 其转录向染色体末端进行, 在端粒重复道1,2内终止。因此, terra 记录由 5 ' 端的亚端粒衍生序列组成, 并以端粒重复终止 (脊椎动物中的 uuaggg)3。提出了 terra 的重要作用, 包括端粒4、5、dna 复制 6的异染色质形成, 促进染色体末端 7,8 的同源重组,9、调节端粒结构10和端粒长度稳态2,11,12,13。此外, terra 转录与许多体外位点相互作用, 以调节小鼠胚胎干细胞 (es) 中广泛的基因表达。根据这些证据, rna荧光原位杂交 (rna-fish) 分析表明, 只有一部分 terra 转录记录定位端粒1,2,15。此外, 据报道, terra 在小鼠细胞2,16的 x 和 y 染色体处形成核聚集物。这些发现表明, terra 记录在细胞核内经历了复杂的动态。了解 terra 分子的动力学将有助于确定其功能和作用机制。
ms2-gfp 系统已被广泛用于可视化来自不同生物体的活细胞中的 rna 分子 17,18.该系统以前曾被用来标记和可视化单端粒 terra 分子在酿酒师12,19。利用该系统, 最近显示酵母 terra 转录转录位在细胞质内的后二氧化转变阶段, 这表明 terra 可能会发挥核外功能20。我们最近使用 ms2-gfp 系统研究癌细胞21中的单端粒 terra 转录.为此, 我们使用 crispr/cas9 基因组编辑工具将 ms2 序列集成在单个端粒 (端粒 15q, 以下为 telq 15q) 上, 并获得了表示 ms2 标记内生 t15q terra (terra-ms2 克隆) 的克隆。gfp 熔融 ms2 rna 结合蛋白 (ms2-gfp) 的共表达, 可识别并结合 ms2 rna 序列, 从而实现活细胞21中单端粒 terra 转录的可视化.本文所述协议的目的是详细描述生成 terra-ms2 克隆所需的步骤。
为了生成 terra-ms2 克隆, ms2 盒被集成在端粒15q 的亚端粒区域内, 位于 terra 启动子区域和转录起始位点的下游。ms2 盒式磁带含有由 lox-p 位点两侧的新霉素耐药基因, 其在近端粒15q 上的整合是使用 crispr/cas9 系统22进行的。经转染 ms2 盒后, 选择单克隆, 用 pcr、dna 测序和南方印迹验证盒的亚端粒积分。阳性克隆感染了表达 crec 的腺病毒, 以便删除盒式磁带中的选择标记, 只在近端粒15q 留下一个 ms2 序列和一个 lox-p 位点。通过 rt-qpcr 验证了 tel15q 中 ms2 标记的 terra 转录的表达。最后, ms2-gfp 融合蛋白通过逆转录病毒感染在 terra-ms2 克隆中表达, 以便用荧光显微镜显示 ms2-terra 转录。使用端粒重复特异性探针 1、2、15、23可通过 rna-fish 和活细胞成像快速检测 terra 记录。这些方法提供了关于 terra 分子在单个细胞分辨率下的总种群定位的重要信息。在单个亚端粒生成含有 ms2 序列的克隆, 将使研究人员能够研究活细胞中单端粒 terra 转录的动力学, 这将有助于确定 terra 的功能和作用机制。
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Protocol
(一)新霉素耐药克隆的选择
- 在哈姆赫-12k (kaighn) 培养基中生长 ags 细胞, 辅以10% 的胎儿牛血清 (fbs)、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基每毫升0.5 单位) 和链霉素 (每毫升介质 0.2μg) 和 5% co2.将细胞与 sgrnams9 表达载体和 ms2 盒式磁带以50-60 的融合方式转染, 以1:10 摩尔比21。
注: 在并行实验中, 通过转染 transfection 表达向量 (即cas9-gfp 矢量) 来验证转染效率。应达到至少60-70% 的转染效率。 - 第二天, 以含有新霉素的培养基 (选择性培养基) 取代培养培养基。
注: 在转染后的第二天, 将细胞拆分并在选择性培养基中播种, 将加快选择过程。所有未转染的细胞将立即死亡。如果转染在6个井板中进行, 在这种情况下, 60% 汇流处的每口井都含有大约 0.7 x10 6 个细胞, 第二天就可以将细胞从一口井分成10厘米的含有选择性介质的盘子。 - 将细胞保持在选择性培养基中 7-10, 每一两天改变介质, 直到单个克隆可见。
- 细胞克隆的拾取
- 准备一个96孔板, 每口井中含有 10μl 0.25% 的胰蛋白酶。
注: 准备两个96孔板, 以防超过96个克隆, 预计将被挑选。 - 使用显微镜, 用标记在盘子底部做一个点, 标记每个在 1 0 厘米长的盘子中可见的克隆位置。每个点将对应于要选取的群体。
- 用足够的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 取代培养培养基, 在克隆体上形成一层薄薄的液体膜, 而不是让细胞在克隆采摘过程中干燥。
- 使用10μl 移液器选择单个菌落。将含有5μl 胰蛋白酶的尖端连接到菌落, 并慢慢释放将保留在菌落上的胰蛋白酶。允许胰蛋白酶分离细胞 1分钟, 然后用尖端刮伤菌落并将其吸进尖端。
注: 在此过程中, 翻转菜的一侧, 以减少 pbs 的体积周围被挑选将有助于采摘过程中, 避免稀释周围的菌落周围的胰蛋白酶。使用克隆环也可以帮助拾取单个克隆。 - 将菌落中的细胞放入含有 10μl 0.25% 胰蛋白酶的96井板的井中。
- 在室温下孵化 5分钟, 然后用150μl 的选择性培养基 (ham 的 f-12k (kaighn) 培养基补充10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基0.5 单位)、链霉素 (每毫升介质0.2 微克), 并含有新霉素, 并含有新霉素, 在浓度为0.7μgml。
注: 在孵化期间, 可以选择其他克隆。建议选择尽可能多的克隆。选择的克隆越多, 识别阳性克隆的可能性就越大。 - 一旦所有克隆被采摘并转移到96井板中, 允许细胞在选择性培养基火腿的 f-12k (kaighn) 介质中生长几天, 辅以10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (每 mM 0.5 单位, 培养基)、链霉素 (0.2 微克/毫升在37°c 和 5% co2 浓度为0.7μgml 时含有新霉素, 直至达到90% 的汇合点。
- 准备一个96孔板, 每口井中含有 10μl 0.25% 的胰蛋白酶。
- 克隆的拆分
- 每口井加入100μl 明胶, 制备三个96孔板涂上明胶, 在室温下孵育 30分钟, 然后用 pbs 清洗两次。这些板将用于 dna 提取 (dna 板) 和克隆冷冻 (冷冻板)。
注: 明胶将促进细胞和 dna 与油井的附着。特别是, 明胶涂层将允许 dna 粘在井底的 dna 提取和洗涤过程 (讨论如下)。在拆分过程中, 建议使用多通道移液器。 - 一旦克隆达到90% 的融合, 从96孔板的每一口抽吸培养基, 用 pbs 清洗, 每口井加入 30μl 0.25% 的胰蛋白酶, 并在37°c 孵育5分钟。
注: 克隆将以不同的速度增长, 这也将取决于每个克隆选择的细胞数量。因此, 这一步将在不同克隆达到90% 融合的几天内执行。 - 每口井加入70μl 的选择性培养基, 通过在井内上下移液来破坏细胞团块, 然后将100μl 的30μl 转移到涂布的 dna 板上, 上面装满120μl 的选择性培养基, 将30μl 转移到每口井的糊化冷冻板上h 50μl 介质 (无选择)。
- 将 dna 板放入孵化器中, 使细胞在37°c 和 5% co2 下生长, 直到 90%的融合。
- 在冻结板的每口井中加入80μl 的冰凉新鲜冷冻介质 (80% fbs 和20% 二甲基亚硫酸 (dmso)), 在板材顶部加入副底 (喷上70% 乙醇), 以便将每个井封好, 将盖子盖在上面, 并用铝箔包裹板材。 将冻结板放置在-80°c。
- 在原96井板上加入90μl 选择性培养基, 其中含有已被分裂的克隆体, 并将其保存在培养中, 直至 pcr 筛选结果。这个板块将被用作备用板。
- 每口井加入100μl 明胶, 制备三个96孔板涂上明胶, 在室温下孵育 30分钟, 然后用 pbs 清洗两次。这些板将用于 dna 提取 (dna 板) 和克隆冷冻 (冷冻板)。
2. 新霉素耐药克隆的筛选
- 从96口井 dna 板中提取 dna
- 一旦在 dna 板中培养的克隆体达到90% 的融合度, 用 pbs 清洗 2次, 然后用50μl 裂解缓冲液裂解2次 (10 mm tris ph 7.5, 10 mm edta, 10 mm 氯化萘, 0.5% sds 和 1 mgml 蛋白酶 k) 裂解。用护栏覆盖板, 密封每口井, 盖上盖子, 用沙兰包裹盖上盖子, 并在37°c 放置一夜。
- 在每口井中加入100μl 冷乙醇 (et-oh)/氯化钠溶液 (100% 乙醇中的 0.75 m 氯化碳), 并在室温下沉淀6小时或过夜。
注: 协议可以在此处暂停。 - 通过倒置板, 去除 et-oh/ncl 溶液, 用每口700% 乙醇200μl 清洗3次。
- 在蒸馏水中加入 25μl rnse a 溶液, 在37°c 孵育1小时。
- 使用3μl 的基因组 dna 进行 pcr 扩增。利用新霉素耐药基因和近端粒15q 内的引物退火对选定的克隆进行 pcr 筛选。pcr 扩增是使用标准聚合酶和 pcr 协议21进行的。
注: ms2 引物 (ms2-近15q 引物和 ms2 引物 as) 和 ctr 引物 (ctr 素数 s 和 ctr 引物 as) 的 pcr 条件如下: 98°c 为变性步骤 20秒, 然后在 98°c 10秒时进行34个循环, 58°C 20秒, 72°c 15 s, 在25μl 反应混合物中使用聚合酶酶 (见材料表)。引物序列如表 1所示。 - 在琼脂糖凝胶上运行 pcr 反应, 并使用标准凝胶提取程序提取从阳性克隆中获得的 pcr 带 (见凝胶提取试剂材料表)。
- 对凝胶提取的 pcr 产物进行 dna 测序分析, 以确认 ms2 序列21的存在。
注: 测序分析可以使用用于 pcr 筛选的引物进行。 - pcr 阳性克隆的南方印迹筛选
- 在 pcr 和测序筛选中, 从原来的96孔板 (备用板) 增长到 ham f-12k (kaighn ' s) 培养基中的6个井板, 辅以10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基为0.5 单位)、链霉素 (0.2 微克/小时)培养基中的 ml), 并在 37°c 5% co 2 的浓度为0.7μgml 时含有新霉素.
注: 或者, 如果其中一些克隆丢失, 则从其中一个冻结板上解冻 (见议定书 2.6)。 - 一旦克隆在6井板中的90% 汇流处, 用 pbs 清洗细胞, 并添加250微米的裂解缓冲液, 每口井含有0.5 微克蛋白酶 k。
- 使用细胞刮刀刮除细胞, 并将裂解液转移到 1.5 ml 管中。
- 在37°c 下孵化16小时。
- 加入1毫升的100% 乙醇, 用力摇晃, 并让 dna 在-20°c 下沉淀至少2小时或夜间。
注: 协议可以在此处暂停。 - 在4°c 下以 13 400 x g 的速度旋转 10分钟, 丢弃上清液, 用70% 乙醇清洗颗粒。让颗粒在室温下干燥。或者, 使用真空集中器。
- 将 dna 颗粒在含有 rnse a 的50μl 蒸馏水中再循环, 在37°c 下孵育1小时。
- 在100μl 反应体积内使用 ncoi 和 bamhi 限制性酶 (两个独立消化酶), 在37°c 的情况下通过在37°c 的消化反应中进行5-10 微克的基因组 dna。
- 在琼脂糖凝胶 (0.8% 琼脂糖) 上运行4μl 的消化, 以进行完全消化确认。
- 在限制性消化反应中加入半体积的醋酸钠3m 溶液 ph 5.2 和2体积100% 乙醇, 并在-20°C 孵育至少2小时或一夜以沉淀 dna。
注: 协议可以在此处暂停。 - 在4°c 条件下以 13 400 x 克离心 20分钟, 丢弃上清液, 并用70% 乙醇清洗颗粒。让颗粒在室温下风干。或者, 使用真空集中器。
- 在20μl 的蒸馏水中重新获得颗粒, 并将消化后的 dna 加载到0.8% 的琼脂糖凝胶上。
注: 为了更好地解决消化 dna 的分辨率, 请制备长度至少为15厘米的凝胶, 并在低电压 (̴30伏) 下连夜运行。建立的电泳应进行优化。 - 第二天, 用 dna 标记剂 (如 1μl/10 ml 最终浓度下的溴化乙酯) 染色凝胶 30分钟, 并在室温下用靠近凝胶的标尺拍摄照片。
- 设置 dna 转移到尼龙膜, 并使用标准程序21与 ms2 序列特异性探针进行膜杂交。
- 从两个冷冻板中的一个中解冻 pcr、dna 测序和南方印迹呈阳性的克隆体 (见下一步)。
- 在 pcr 和测序筛选中, 从原来的96孔板 (备用板) 增长到 ham f-12k (kaighn ' s) 培养基中的6个井板, 辅以10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基为0.5 单位)、链霉素 (0.2 微克/小时)培养基中的 ml), 并在 37°c 5% co 2 的浓度为0.7μgml 时含有新霉素.
- 克隆体的解冻
- 准备一个含有5毫升预热火腿 f-12k (kaighn) 介质的 15 ml 管, 辅以10% 的 fbs、2 mL l-谷氨酰胺、青霉素 (每毫升0.5个单位) 和链霉素 (每毫升介质 0.2μg), 使每个克隆人都能解冻。
- 从-80°取出其中一个冷冻板, 并在含有正克隆的井中加入100μl 的预热 f12k 完整介质。
注: 此过程应快速执行, 96 井板应放置在干冰上, 每次克隆解冻后, 以允许其他克隆保持冻结。如果需要从同一个96孔板上解冻多个克隆, 这一点尤其重要。 - 将细胞转移到含有5毫升介质的15毫升管, 并在室温下以 800 x g 的速度将离心机转移5分钟。
- 吸吸培养基, 在预热前的 f12k 介质500μl 中重新悬浮细胞, 并将每个克隆转移到12孔板的一口井中。
- 从亚端粒15q 整合的 ms2 盒中消除新霉素耐药基因。
- 允许克隆从一个12井盘成长为一个10厘米的盘子在完整的 f12k 介质。
注: 除非另有说明, 否则不应将新霉素列入培养基。 - 将表达 cres 的腺病毒添加到10厘米的培养物中, 在70% 的融合中, 在10毫升的完整 f12k 培养基中培养。
注: 使用 cr-gfp 表示腺病毒将允许评估感染的效率, 这应该接近100%。复制缺陷腺病毒将在培养中的几个通道后丢失。 - 感染48小时后, 将细胞分成3个10厘米的盘子。两个菜将用于验证新霉素基因去除的负选择, 生长细胞中的新霉素含有培养基 (第一盘), 并由南方印迹 (第二盘)。
- 培养含有克隆的第三道菜, 用于细胞冷冻和 rna 提取。
- 允许克隆从一个12井盘成长为一个10厘米的盘子在完整的 f12k 介质。
3. rt-qpcr 验证 terra-ms2 成绩单的表达
- 在确认新霉素基因去除后, 使用有机溶剂 (苯酚和鸟嘌呤异硫氰酸溶液)从terra-ms2 克隆中提取总 rna 21。
- 在100μl 的碳酸二乙酯 (depc) 水中, 将从10厘米的盘中提取的 rna 重新利用。
- 在变性 (含有1% 甲醛) 1x 3-(n-morpholino) 丙磺酸 (mops) 凝胶上运行 3μl rna, 以验证 rna 的浓度和完整性。也使用分光光度计分析 rna 浓度。
- 用10μl 最终反应体积中的 1个 dnse i 酶单位, 用 dnasse i 治疗 3μg rna。
- 在37°c 下将反应培养1小时。
- 逆转录酶和 qpcr 分析
- 在无核酸酶微离心管中加入以下成分: 1μm terra 特异性引物的2μl、1μl 的 dntp 混合 (每个 10 mm)、6μl 的 dNTPs i 处理 rna (对应̴300ng rna)。使用4μl 的 depc 水将体积调整为13μl。
注: 对于要分析的每个 rna, 应准备一个包含相同试剂但具有参考的特定引物的第二管, 而不是 terra 特定引物。 - 将混合物加热至 65°c 5分钟, 在冰中孵育至少1分钟。
- 通过短暂离心收集管的含量, 并添加4μl 的 5x rt 酶缓冲液、1μl 0.1 m 二硫醇 (dtt)、1μl (4 单位) 的 rnse 抑制剂和1μl 的逆转录酶 (见《材料表》)。
- 将样品在42°c 下培养 60分钟, 然后使用2μl 的 rt 反应进行 qpcr 分析。
- 在无核酸酶微离心管中加入以下成分: 1μm terra 特异性引物的2μl、1μl 的 dntp 混合 (每个 10 mm)、6μl 的 dNTPs i 处理 rna (对应̴300ng rna)。使用4μl 的 depc 水将体积调整为13μl。
- 在20μl 的最终体积内制备 qpcr 反应混合物, 包括10μl 的 2x qpcr 主混合物、2μl 的 cdna 模板、1μl 的正向底漆 (10μm)、1μl 的反向底漆 (10μm) 和6μl 的水。
- 使用标准协议21在热环素中进行 qpcr 反应。
4. 生产表达逆转录酶病毒的 ms2-gfp
- 要产生 ms2-gfp 表达逆转录酶病毒, 用 ms2-gfp 融合蛋白 (pbbe-ms2-gfp pBabe-) 和使用摩尔比4:1 的env基因表达载体 (如 pcmv-vvvvg) 转染80% 的融合凤凰包装细胞。两个向量。
- 第二天, 将培养基 (dmem 补充 10% fbs、2mm l-谷氨酰胺和 penn-strep) 替换为含有10mm 丁酸钠的新鲜培养基。
- 在37°c 下培养 8小时, 5% 二氧化碳,然后用新鲜的培养基取代培养基, 从其中收集病毒。
- 48小时后, 从凤凰细胞中取出含有逆转录病毒的培养基。这种介质可直接用于感染 terra-ms2 克隆, 在这种情况下, 通过0.45μm 过滤器过滤培养基, 添加聚乙烯 (30μgl 最终浓度) 并将其添加到细胞中 (在这种情况下, 协议将在步骤5中继续进行)。或者, 可以在50毫升猎鹰管中沉淀逆转录酶病毒, 加入 50% peg-8000/900 mm ncl 溶液, 并在4°c 的旋转轮上孵育.
- 第二天, 通过离心在 2, 000 x 克的情况下离心, 30分钟内的颗粒逆转录病毒颗粒, 去除上清液, 并在没有血清的 f12k 培养基中重新悬浮颗粒。
注: 病毒颗粒可以在原始上清液体积的百分之一重新悬浮。应进行感染测试, 以验证有效感染细胞所需的逆转录酶病毒的最小体积。
5. 活细胞中 terra-ms2 转录的可视化
- 玻璃底盘中的板 terra-ms2 克隆和 wt ags 细胞。在感染当天, 在培养基 (30μgml 最终浓度) 和表达逆转录酶病毒的 ms2-gfp 中加入聚乙烯。
- 24小时后, 丢弃含病毒培养基, 加入不含酚红色的新鲜培养基。
- 使用适当的显微镜设置在倒置显微镜下分析细胞。用 100 x 或60x 目标将细胞与大的数值孔径 (1.4 x) 和敏感相机 (emccd) 进行成像。在成像过程中, 使用环境控制系统将样品保持在37°c 和5% 二氧化碳.
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Representative Results
图 11表示实验策略的概述。该协议的主要步骤和在 ags 单元中生成 terra-ms2 克隆的指示性时间表如下图所示 (图 1a)。在第1天, 用 ms2 盒式磁带和 sgrna/cas9 表示向量转染6孔的多个井 (如图 1b 所示)。在 cas9 nickase 表示 px335 载体中克隆了两个不同的近端粒15q 特异性引导 rna 序列, 生成了两个 sgrna-px335 载体, 与 ms2 盒式磁带共同转染。其中一口井可以用 transfected 表示向量进行转染, 以验证转染效率。第2天, 细胞被胰蛋白酶化, 并从一口井转移到含有选择性培养基的10厘米盘。在第3天, 介质应该改变, 因为大多数未转染的细胞都会死亡。细胞在选择中生长, 直到克隆可见并准备被选择。在此期间, 细胞不应被胰蛋白酶化, 培养培养基应在第一周每1-2天更换一次, 然后在一周后每2-3天更换一次。一旦可以看到单个克隆, 它们就会被采摘并转移到一个96井板中, 在那里它们可以生长到达到80-90% 的汇合点。此时, 克隆被拆分为4个不同的96孔板, 这些板在图 1中用颜色代码标记。一旦在 dna 片 (绿色) 中培养的克隆体达到80% 的融合, 就会被裂解并提取基因组 dna 进行 pcr 筛选;备份板 (蓝色) 中的克隆体将保存在培养中, 直到 pcr 筛选结果出来, 而红色的冷冻板则冻结在-80°C。图 12b显示了抗霉素克隆的 pcr 筛选的代表性结果。在这种筛选中, 使用了两套引物: 一对引物 (ms2 引物) 在新霉素基因内退火, 并使用近端粒15q 序列来验证 ms2 盒的存在 (引物定位的代表性图像显示在图 2a)。第二引物对 (ctr 引物) 在内部染色体区域退火用于验证是否存在假阴性克隆 (引物序列如表 1所示)。用于集成盒式磁带的负克隆对 ms2 引物的放大应为负离子, 对 ctr 引物的扩增呈正相关。基因组 dna 提取中的技术问题导致没有基因组 dna 或其污染, 这将阻止 ms2 和 ctr 引物反应的 pcr 扩增。在这些情况下, 所涉及的克隆可以通过 pcr 从备用板中提取基因组 dna 后重新筛选。利用 ms2 引物可以提取和测序从 ms2 引物放大阳性克隆中获得的带, 以确认 10个 ms2 序列的存在。
在 pcr 筛选中呈阳性的克隆体从96孔备份板 (图 1中的蓝色板) 培养到6个井板, 然后裂解进行基因组 dna 提取和南方印迹分析。图 12d显示了一种有代表性的图像, 即在 pcr 阳性克隆的南方印迹筛选中, 用放射性标记的 ms2 序列特异性探针 (右) 混合的凝胶 (左) 和膜混合。为了确认 ms2 序列在近端粒15q 的整合, 从每个克隆中提取的基因组 dna 应在两种不同的消化反应中使用两种不同的限制性酶 (ncoi 和 bamhi) 进行消化。ncoi 和 bomhi 限制性酶适用于在近端粒15q 上验证 ms2 盒式磁带的集成。其他酶也可以使用。这种凝胶显示了使用 bamhi 限制性酶完全消化基因组 dna 的情况, 如涂片的存在所示。南方印迹的结果表明, 一个克隆对在近端粒15q 处的 ms2 盒式磁带的集成是肯定的, 而几个克隆则显示盒式磁带的多个集成事件, 这表现在多个波段的存在上。阳性克隆应通过对 ncoi 基因组 dna 21 的消化进行第二次南方印迹分析.图 2c 显示了含有 ms2 盒磁带的亚端粒15q 的代表性图像以及 bami 和 ncoi 限制性酶位点的位置。
pcr 和南方印迹分析阳性克隆体感染了表达腺病毒的 cre-gfp, 以去除 ms2 盒磁带中存在的新霉素基因。图 13 个a描述了 cre 表达前后 ms2 标记的近端粒15q。图 3b 显示了感染了表达腺病毒的 cre-gfp 病毒的 ss2 盒式磁带在15q 亚端粒整合的克隆阳性图像。要完全切除所有细胞中的新霉素基因, 感染效率应达到约100%。如图 3c 所示, 为了验证新霉素基因的消除, cre-gfp 感染的细胞在感染48小时后被分成三个板块。在新霉素存在的情况下, 将培养一个盘子。这个盘子里的所有细胞都应该在6-7 内死亡。在第二个板块中, 细胞将被允许在完全的介质中生长, 而不需要选择高达80-90% 的融合。在这一点上, 基因组 dna 提取和分析南方的污点。在完整的培养基中培养第三个板, 用于制备克隆的冷冻库存, 以及 rna 提取和 terra-ms2 转录表达的 rt-qpcr 分析。图 13 个d显示了在 cre-gfp 感染前后对阳性克隆进行南方印迹分析的代表性图像。dna 琼脂糖凝胶 (左图) 证实了基因组 dna 的完全消化使用 ncoi 限制酶。南方印迹分析是使用放射性标记的 ms2 序列特定探针 (右图) 进行的。这一分析证实了新霉素基因的去除。cre-gfp 感染样本中存在涂片, 证实了 ms2 序列的端粒整合。ncoi 限制站点在亚端粒15q 中的位置如图 3a所示。
一旦新霉素耐药基因的消除得到证实, 克隆可以测试 terra-ms2 转录体的表达。为此, 从每个克隆中提取总 rna, 并在变性的 mops 凝胶上运行, 以确认其完整性 (图 4a)。核糖体 rRNA 带应该是可见的 4, 700个碱基 (rrna 28s) 和 1, 900个碱基 (rrna 18 s)。逆转录酶反应使用端粒重复特异性引物和参考基因特异性引物 (图 4b,上图) 进行, 而 qpcr 分析的 terra 表达是使用两套引物: 一对引物ms2 序列和亚端粒15q 序列内的对退火;在亚端粒15q 内退火的第二对引物。引物序列如表 1所示。图 4b 中的图显示了从 ags wt 细胞和两个不同的 terra-ms2 克隆中对 terra 表达的 rt-qpcr 分析。这些分析证实了 terra-m2 文字记录在两个克隆中的表达水平与 wt 细胞中的 terra 转录量15q 所表达的水平相当。这些数据表明, 所选择的两个 terra-ms2 克隆体适用于活细胞成像分析 terra-ms2 记录。
为了在活细胞中显示 terra-ms2 转录, 所选择的克隆体感染了表达 ms2-gfp 融合蛋白的逆转录酶病毒。图 15a显示了生成 ms2-gfp 表达逆转录酶病毒的过程, 如协议步骤4中所述。ags wt 细胞和 terra-ms2 克隆体在玻璃底的盘子中被感染。感染24小时后, 用荧光显微镜对细胞进行分析。信号的特雷-ms2-gfp 病灶的存在证实了信号的特雷-ms2-gfp 病灶的存在, 而不是在 ags wt 细胞中检测到的病灶 (图 5b)。在 ms2-gfp 表达细胞的群体中, 预计细胞间的 ms2-gfp 水平会异质性, 并应选择表达低水平的细胞进行成像分析。或者, ms2-gfp 表达细胞可以通过流式细胞仪的前显微镜分析进行排序, 以收集表达 gfp 水平较低的细胞亚群。我们以前在 ags terra-ms2 克隆21的40% 至60% 的细胞中检测到了 terra-ms2-gfp 病灶.在这些细胞中, 每个细胞被成像1至 4个 terra-ms2-gfp 焦点。terra-ms2-gfp 焦点显示不同的大小和动态可被检测到21。terra-ms2 克隆可用于研究活细胞中单端粒 terra 转录的动力学。作为这种应用的一个例子,图 5c显示了来自一个 terra-ms2 克隆的显微镜分析的代表性图像, 该克隆表达了 ms2-gfp 融合蛋白和与 mcherry 融合的端粒结合蛋白 trf2, 以便可视化 ms2 标记的 terra 转录和活细胞中的端粒。使用这种方法, 我们以前观察到, terra-ms2-gfp 病灶与端粒在44% 的细胞中共同定位, 这表明 terra 转录只与 ags细胞 21中的染色体末端短暂共存。
图 11.在 ags 细胞中生成 terra-ms 2 克隆的实验策略和指示性时间表 概述。a)显示了协议中描述的步骤以及选择 terra-ms2 克隆的指示性时间线。细胞转染在6孔板与线性化 ms2 盒和 sgrnas9 表达向量。使用颜色代码来区分协议部分中指示的 dna 板、备份板和冻结板。b) ms2 盒式磁带由800米长的端粒15q 序列组成, 然后是10次重复的 ms2 序列和一个新霉素耐药基因, 由 lox-p 位点侧边, 并在其 3 ' 端端端部重复道终止。sgrnas9 表达载体是通过克隆 px335 载体中的近端粒15q 特异性指导 rna 序列而产生的, 使用 bbsi 限制站点21,22。生成了两个不同的 sgrna-px335 向量, 并使用了两个向量的1:1 混合进行转染。sgrna 的序列如表 1所示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12.具有代表性的新霉素耐药无性系 pcr 和南方印迹筛选的图像.a)含有 ms2 盒式磁带的亚端粒15q 的代表性图像。指出了用于 pcr 筛选的 ms2 引物 (ms2-近15q 引物和 ms2 引物 as) 的位置。盒式磁带中的 loxp 站点显示为红色。b)使用两套引物 ms2 引物和 ctr 引物 (ctr 原体 s 和 ctr 引物 as) 对耐新霉素克隆进行 pcr 筛选的代表性图像。c) 含有ms2 盒式磁带的亚端粒15q 的代表性图像。显示了 bamhi 和 ncoi 限制点以及用于南方印迹筛选的 ms2 探测器。d)左: 用 bamhi 消化每个克隆的10微克基因组 dna, 并在琼脂糖凝胶上运行。这张图片是在以 3 0 伏的速度连夜运行后获得的。正确: 用 bamhi 限制性酶消化的基因组 dna 被转移到带正电荷的尼龙膜中, 并与放射性标记的 ms2 序列特异性探针杂交。红色框指示正带的预期大小。红色箭头表示一个正克隆。请点击这里查看此图的较大版本.
图 13 个.消除新霉素耐药基因并进行验证实验。a) cre表达前后含有 ms2 盒式磁带的亚端粒15q 的代表性图像。显示了用于南方印迹分析和 ncoi 限制性酶位点的 ms2 特异性探针。盒式磁带中的 loxp 站点显示为红色。b)荧光显微镜分析感染了表达腺病毒的 crra-ms2 克隆。显示了在单个焦平面上获得的代表性图像。moi 是感染的多样性, 是用于感染的病毒数量与宿主细胞数量之间的比率。标度条: 30μm c)用于验证新霉素基因消除的实验策略概述。cre-gfp 感染的细胞在感染48小时后被分成三个板块进行负选择, 二) 南方印迹分析和 (iii) 冷冻细胞库存的制备和 rna 提取。d) 神经微博分析了 cre-gfp 腺病毒感染前后的 terra-ms2 克隆。用限制性酶 ncoi 消化10μg 的基因组 dna。琼脂糖凝胶证实, 完全消化是在两个克隆 (左) 实现。消化后的基因组 dna 被转移到带正电荷的尼龙膜, 并使用 ms2 序列特异性探针进行杂交。新霉素基因的完全消除是由没有特定的带证实的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 14 个.rt-qpcr 分析tel 15 q-terra 和 tel15q-terra-ms2 文字表达。a)显示从 ags wt 细胞和 terra-ms2 克隆中提取的总 rna 的 mops 凝胶的代表性图像。指出了与核糖体 rna 28s 和18s 相对应的带。b)顶部: ms2 标记的亚端粒15q 的示意图, 表达 terra 的成绩单。显示了用于 tel15q-terra (蓝色) 和 tel15q-ms2 terra (红色) 的 terra 逆转录酶和 qpcr 分析的引物。loxp 站点显示为红色。底部: 对 ags wt 细胞和 terra-ms2 克隆中 tel15q-terra 和 tel15q-ms2 terra 转录表达的 rt-qpcr 进行分析。*p < 0.05, 未配对t-测试。请点击这里查看此图的较大版本.
图 15.terra-ms 2 克隆的活细胞成像分析 。a)生成 ms2-gfp 表达逆转录酶病毒的过程概述, 如协议步骤4中所述。右图显示了 ms2 标记的亚端粒15q 和 ms2-gfp 融合蛋白识别的 terra 转录的示意图。b) 代表性荧光显微镜图像的 ags wt 和两个 terra-ms2 克隆表示 ms2-gfp。terra-ms2-gfp 焦点由箭头表示。图像是使用配备 emccd 摄像机的旋转圆盘共聚焦显微镜获得的。这些图像是在37°c 保持在37°c 的成像室中使用 100 x 1.46 消光剂目标拍摄的, 具有 5%的 co2。使用488激光作为光源。刻度条: 5μm . c) terra-ms2-gfp 病灶和 trf2-mcherry 标记端粒的活细胞成像分析。显示了 terra-ms2-gfp 焦点与单个端粒之间的协同本地化事件。图像与b一样, 使用488和520激光作为光源。给出了在延时成像实验的单时间点进行的 z 堆栈实验的最大投影。刻度栏: 5μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 底漆名称 | 底漆序列 | 应用 |
| ms2-近 15q-primer-s | tgcattaagggccattg | ms2 引物前置技术在新霉素耐药无性系 pcr 筛选中的应用 |
| ms2 底漆 as | ccatacacacacacacacacacaga | ms2 引物反向检测新霉素耐药无性系的 pcr |
| ctr 底漆 s | TGT ACG CCA CAG TGC TGC TGG | ctr 引物前置技术在新霉素耐药无性系 pcr 筛选中的应用 |
| ctr 引物 as | GCT GGA AGG TGG ACG A | ctr 引物反向检测新霉素耐药无性系的 pcr |
| tel15q-s1 | ggagagatcccacagc | 用 qpcr 检测 tel15q 和 tel15q-ms2 terra 表达的感官引物 |
| htel15q-as | taacacagaggagggggg | 用 qpcr 检测 tel15q 和 tel15q-ms2 terra 表达的反义引物 |
| tel15q-ms2-as | attttctgatcatgagcattagg | qpcr 检测 tel15-g-ms2 terra 表达的反义引物 |
| terra-rt 底漆 | cctaacccactactacca | 用于 terra 转录的逆转录酶 |
| sgRNA1 | ttggagagacctcgcgccc | 在 px335 载体中克隆的短导 rna 1 序列, 用于将 cas9 镍酶酶活性定向到近端粒15q |
| sgrna2 | tgcattaagggccattg | 在 px335 载体中克隆的短导 rna 2 序列, 用于将 cas9 镍酶酶活性定向到近端粒15q |
工作台1: 本研究中使用的引物列表.提供了本协议中使用的引物和 sgrna 序列的列表。序列为 5 ' 到 3 '。
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Discussion
在本文中, 我们提出了一种方法来生成人类癌症细胞克隆包含 ms2 序列集成在亚端粒15q。利用这些克隆体, 用荧光显微镜通过 ms2-gfp 融合蛋白的共表达检测从近端粒15q 转录的 ms2 标记的 terra 分子。这种方法使研究人员能够研究在活细胞21中的单个端粒表达的 terra 的动力学。在该协议中, 在 ags 细胞系中选择 terra-ms2 克隆, 这代表了一个有趣的模型系统来研究 terra, 因为 terra 表达在人类胃癌样本24 中被放大。但是, 这里描述的协议可以适应其他细胞系中 terra-ms2 克隆的选择。通过使用特定的 ms2 盒式磁带和 crispr 策略, 可以在不同于端粒15q 的亚端粒上促进 ms2 序列的集成。在本文提出的方法中, 采用了 cas9 镍酶和双导 rna, 以提高积分22的特异性.使用这一策略, 预计在 ags 细胞中将发现总共2% 的阳性克隆。其他版本的 cas9 酶可以测试, 试图提高克隆选择25的成功率.此外, 要最大限度地提高克隆选择的效率, 需要考虑协议的以下步骤如下:
i) 为了增加选择 terra-ms2 克隆的机会, 重要的是要实现 ms2 盒式磁带和 crispr 向量的高转染效率。转染不良的细胞系很可能需要几轮转染、克隆选择和筛选, 才能选择阳性克隆。
ii) 重要的是要确定新霉素的确切浓度, 用于选择克隆。事实上, 使用低浓度的药物会导致假阳性克隆, 而高浓度可能会阻止确定阳性克隆。本协议中指出的新霉素浓度在培养培养基添加后6-7 内对 ags 细胞是致命的。
iii) 挑选克隆是关键的一步。事实上, 在这一过程中, 只需要选择单个克隆。因此, 应避免彼此距离太近的菌落, 以防止来自不同克隆的混合细胞, 从而选择可能含有 ms2 序列的混合克隆群, 这些克隆体可能包含整合在多个基因组位点的 ms2 序列。这些事件应在南方印迹筛查期间确定。
iv) 从96井 dna 片 (第2议定书) 中提取的基因组 dna 量估计在5微克左右, 只要用单一的限制性酶消化技术通过 pcr 和南方印迹来筛选每一个克隆体就足够了。然而, 为了确认盒式磁带在预期端粒的整合, 用两种不同的限制性酶消化基因组 dna, 通过南方印迹筛选每个克隆将是非常重要的。为此, 如议定书所述, pcr 筛选中阳性的克隆应在6个井板中培养。从6井板的井中提取的基因组 dna 量将足以满足南方印迹分析所需的至少两个限制消化。
在这里描述的协议中, ms2 序列被集成在亚端粒15q 中, 原因有很多: i) 在这个亚端粒 26, 27 上已经确定了 terra 区域和terra转录起始位点;ii) 利用体外技术4、27、28、29、30验证了亚端粒15q 的 terra表达;iii) 对15q 染色体的亚端体区域进行了测序, 它包含一个与端粒重复道相邻的独特区域, 可用于 ms2 盒式磁带21的集成。pcr 和南方印迹方法的开发是为了确认在 terra-ms2 克隆中的亚端粒15q 内的 ms2 序列的单一集成。这将是有趣的, 在染色体传播进行 dna-fish 实验, 以可视化的染色体定位的 ms2 序列在固定中期染色体。然而, 10xms2 序列的长度 (450 bp) 要求使用非常短的探针, 而 dna-fish 实验中通常使用的探针是染色体传播 (细菌人工染色体 (bp)、宇宙或质粒)31。这一技术挑战使我们无法将染色体传播上的 ms2 序列可视化, 而这代表了协议的局限性。该方法的另一个限制是选择 terra-ms2 克隆所需的时间和工作量。此外, 还需要专门的实验室设置和使用病毒的设备、放射性物质和显微镜分析。
这里描述的方法可以实现在不同细胞系的 terra-ms2 克隆的生成, 以定义 terra 在各种生物环境中的动态, 如在端粒功能障碍或细胞衰老期间, 帮助我们了解terra 在这些过程中的功能。这种方法的一个有趣的发展将是生成包含 teto 重复的 terra-ms2 克隆, 这些克隆集成在特定的亚端粒上, 包括 ms2 标记的端粒。与荧光蛋白 (即mcherry) 融合的 tetr 蛋白的表达将使这种特殊的端粒在活细胞32 中的可视化。这种方法将有助于调查人类 terra 转录是否定位和行动在 cis 在 terra转录端粒和染色体, 或通过转移到其他染色体。terra 生物学中的这个问题还有待澄清。
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Disclosures
提交人声明没有相互竞争的经济利益
Acknowledgments
我们感谢特伦托大学 ciboi 先进成像设施的工作人员和维也纳 max f. perutz 实验室 (mfpl) 的生物光学光学显微镜设施的工作人员。导致这些成果的研究得到了 Mahlke-Obermann 基金会和欧洲联盟根据609431欧盟赠款协议进行的第七个研究、技术开发和示范框架方案的资助。欧共体得到意大利教育大学和研究部 (miur) 的 rita levi montalcini 研究金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGS cells | - | - | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
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