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Genetics

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

doi: 10.3791/58790 Published: January 17, 2019

Summary

ここでは、単一 subtelomere で MS2 シーケンス タグを含む癌細胞のクローンを生成するためのプロトコルを提案する.MS2 GFP システムに依存して、このアプローチは、内因性の転写産物のテロメア繰り返し含む RNA (テラ) 生きている細胞の単一テロメアから表現の可視化を実現。 にします。

Abstract

テロメアは、転写、テロメア長鎖非コード Rna (テラ) の繰り返しを含むに上昇を与えるテロメア生物学、ヘテロクロマチン形成とテロメアの長さの恒常性などで重要な役割を果たしているが提案されています。最近の知見では、テラの分子はまたマウス胚性幹 (ES) 細胞における遺伝子発現を調整するために内部の染色体領域と対話することを明らかにしました。この証拠に沿った RNA 蛍光の in situハイブリダイゼーション (RNA 魚) 分析サブセットのみが示されている染色体の両端にテラのトラン スクリプトをローカライズします。テラ分子のダイナミクスの理解は、彼らの機能と作用機構を定義に役立ちます。ここでは、ラベルし、MS2 GFP を用いた癌細胞の単一テロメア テラ転写物を可視化する手法について述べる。この目的に単一の subtelomere で統合 MS2 シーケンスを含んでいる AGS ヒト胃がん細胞ラインを使用して安定したクローンを生成するプロトコルを提案します。MS2 タグ テロメアからテラの転写は、GFP (MS2 GFP) を融合した MS2 RNA 結合タンパク質の共発現時に生細胞の蛍光顕微鏡による可視化 MS2 タグ テラ分子の発現の結果します。このアプローチにより、癌細胞の単一テロメア テラ分子のダイナミクスを研究する研究者とその他の細胞に適用できます。

Introduction

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染色体の subtelomeric 領域から長鎖非コード RNA テラを転写し、その転写染色体はテロメアの繰り返し管1,2内終了終了へ向かって。このため、テラの成績証明書は 5' 端に subtelomeric の派生シーケンスから成り、テロメアの繰り返し (脊椎動物の UUAGGG)3で終了します。重要な役割は、テロメア4,5, DNA 複製6、染色体の間での相同組換えの促進のヘテロクロマチン形成を含む終了する7,8テラ、提案されています。,9、テロメア構造10およびテロメアの長さの恒常性2,11,12,13を規制します。さらに、テラの成績証明書は、マウス胚性幹 (ES) 細胞14における広範な遺伝子発現を調節する多数の extratelomeric サイトと対話します。これらに伴い、RNA 蛍光性の現場の交配 (RNA 魚) 解析はテラ成績のサブセットのみを示している証拠はテロメア1,2,15ローカライズします。さらには、テラはマウス細胞2,16の X および Y 染色体でローカライズする原子集合体を形成する報告されています。テラ成績が核内の複雑なダイナミクスを受けることが示唆されました。テラ分子のダイナミクスを理解し彼らの機能と作用機構を定義するのに役立ちます。

MS2 GFP システムは、広く様々 な生物17,18から細胞内 RNA 分子を可視化するために使用されています。このシステムは、タグを出芽酵母12,19のシングル テロメア テラ分子を可視化する以前使用されています。このシステムを使用すると、最近、酵母テラ成績証明書をポスト発酵から呼吸へシフト フェーズでローカライズ細胞質内テラ可能性がありますにおける核外機能20を及ぼすことを示唆しているが示されました。最近がん細胞21シングル テロメア テラ トラン スクリプトを勉強する MS2 GFP システムを使いました。この目的には、MS2 単一テロメア (テロメア 15q、以下 Tel15q) でシーケンスを統合する CRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを採用し、MS2 タグ内因性 Tel15q テラ (テラ MS2 クローン) の表現のクローンを得た。認識し、生活で単一テロメア テラ成績の MS2 RNA シーケンスにより可視化を結合する GFP 融合 MS2 RNA 結合タンパク質 (MS2 GFP) の共発現細胞21です。ここに示されているプロトコルの目的は、テラ MS2 クローンの生成のために必要な手順の詳細に説明することです。

テロメア 15q、subtelomeric 地域で統合され、MS2 カセット テラ MS2 のクローンを生成するテラ プロモーター領域と転写開始部位の下流。MS2 カセットには lox p サイトに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が含まれています、subtelomere 15q での統合は、CRISPR/Cas9 システム22を使用して実行されます。カセット、単一クローン MS2 のトランスフェクションが選択され PCR によってカセットの subtelomeric 統合が確認されたら、DNA 配列と南部のしみ。肯定的なクローンは、subtelomere 15q で単一 lox p サイト MS2 シーケンスだけを残して、カセットの選択マーカーを除去するために Cre を発現アデノ ウイルスに感染しています。RT qPCR により Tel15q からタグ付きの MS2 のテラの式を確認すると.最後に、MS2 GFP の融合蛋白質を表現に蛍光顕微鏡による MS2 テラ成績を視覚化するためにレトロ ウイルス感染テラ MS2 クローンで。RNA 魚でテラの成績証明書を容易に検出できるし、テロメア繰り返し固有を使用して生細胞イメージング プローブ1,2,15,23。これらのアプローチは、単一セルの解像度でテラ分子の総人口の局在に関する重要な情報を提供します。単一 subtelomere で MS2 シーケンスを含んでいるクローンの生成には、関数とテラの作用のメカニズムを定義する生きた細胞の単一テロメア テラ転写物のダイナミクスを研究する研究者が有効になります。

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Protocol

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1。ネオマイシン耐性クローンの選択

  1. 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、2 mM L グルタミン、ペニシリン (媒体の mL あたり 0.5 単位)、37 ° C、5% CO2でストレプトマイシン (媒体の mL あたり 0.2 μ g) とハムの F-12_K (Kaighn) 培の AGS セルを育てます。SgRNA/Cas9、1:10 でベクトルと MS2 カセットを表現すると 50-60% の合流点で細胞を transfect モル比21
    注: 並列実験 gfp 発現するベクトル (すなわち、 Cas9 GFP のベクトル) を株で遺伝子導入効率を確認します。少なくともトランスフェクション効率は 60-70% を達成する必要があります。
  2. 次の日は、ネオマイシン 0.7 μ g/mL 最終濃度 (選択培地) を含む培地で培養培地を置き換えます。
    注: セルを分割、トランスフェクションは、選択プロセスをスピードアップする翌日の選択培地でそれらを播きます。すべての非トランスフェクト細胞がすぐに死んでしまいます。6 ウェル プレートでトランスフェクションを実行、する場合、その場合 60% で合流含まれます約 0.7 x 10 の6セル 10 cm 皿含む選択培地に単一の井戸からセルを分割することができます次の日に。
  3. 媒体ごとに 1 つの変更 7-10 日間、選択培地で細胞を維持または 2 日間、単一のクローンを作成するまでが表示されます。
  4. 細胞クローンのピッキング
    1. 各ウェルに 0.25% トリプシンの 10 μ L を含む 96 ウェルのプレートを準備します。
      注: 準備 2 96 ディープウェル プレートの場合よりも 96 クローンが選ばれると予想されます。
    2. 顕微鏡を使って、各クローンの位置表示でマーク 10 cm 皿ドット マーカーを使用して皿の下部にすることによって。各ドットは、選ばれるコロニーに対応します。
    3. 交換して養殖中とだけで十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) クローンの液体の薄いフィルムを形成し、細胞クローン選択時に乾燥をさせてください。
    4. 10 μ L ピペットを使用して単一コロニーを拾います。植民地にトリプシンの 5 μ L を含むヒントを添付し、植民地にローカライズされた残りますトリプシンをゆっくりと解放します。1 分のセルをデタッチし、先端でコロニーをこすりし、先端にそれを吸うにトリプシンを許可します。
      注: この手順中に選ばれているコロニーのまわりの PBS の容積を減少する植民地周りトリプシンを希釈を避けることによってピッキング処理を助ける 1 つの側面で少し料理を反転しています。クローンのリングの使用はまた単一クローンを拾うを助けるかもしれない。
    5. 植民地から 0.25% トリプシンの 10 μ L を含む 96 well プレートのウェルにセルを配置します。
    6. 室温で 5 分間インキュベートし、150 μ L の選択培地 (ハムの F-12 K (Kaighn) 中 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 mL 中の単位)、ストレプトマイシン (媒体の mL あたり 0.2 μ g) で補われ、含む、ネオマイシンと井戸を埋める0.7 μ g/mL の濃度です。
      注: 培養時間の間に他のクローンを選ばれることができます。可能な限りとして多くのクローンを選択することをお勧めします。多くのクローンを選んだほどチャンスは肯定的なものを識別するでしょう。
    7. すべてのクローンが選ばれ、96 well プレートに転送、選択培地 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 mL 中の単位)、ストレプトマイシン (1 mL あたり 0.2 μ g のハムの F-12 K (Kaighn) 培で数日間、成長する細胞を許可します。媒体) の 90% の合流点に到達するまでの 37 ° C、5% CO2で 0.7 μ g/mL の濃度でネオマイシンを含んでいます。
  5. クローンの分割
    1. 3 つの準備追加 100 μ L/ウェル、ゼラチンのゼラチンでコーティング 96 ウェル プレートは、室温で 30 分間インキュベートし、PBS で 2 回を洗浄します。これらのプレートは、クローン (凍結板) を凍結、DNA 抽出 (DNA プレート) のために使用されます。
      注: ゼラチン添付ファイル、細胞や DNA の井戸を推進していきます。特にゼラチン コーティングは、DNA 抽出中に井戸の下部に固執し、手順 (後述) を洗浄する DNA になります。クローン分割処理中にマルチ チャンネル ピペットを使用することをお勧めします。
    2. クローンが 90% の合流点に達すれば、96 well プレートの各ウェルから培地を吸引、PBS で洗浄、好評につき、0.25% トリプシンの 30 μ L を追加し、37 ° C で 5 分間インキュベート
      注: クローンはクローンあたり選んだセルの数に依存、また異なる速度で成長します。したがって、このステップを異なるクローンが 90% の合流点に達するといくつかの日の間に行います。
    3. 70 μ L/ウェル選択培地を追加し、井戸の中を上下にピペッティングにより細胞を混乱させる、120 μ 糊凍結板事前ウィットによく、30 μ L あたり選択培地が充填された糊の DNA プレートに 100 μ L の 30 μ L を転送h 50 μ L 中、選択。
    4. インキュベーターで DNA のプレートを置き、細胞は、37 ° C、5% CO2 90% の合流点までいく。
    5. 凍結プレートの各ウェルに冷たいの 80 μ L たて凍結中 (80 %fbs と 20% ジメチルスルホキシド (DMSO)) x 2 を追加、各ウェルのシール、上に蓋を置き、アルミホイルでプレートをラップするので板の上にパラフィルム (70% エタノールを散布) を追加します。 -80 ° C で凍結のプレートを配置します。
    6. 分割されてくださいが、PCR のスクリーニング結果まで文化おいてクローンを含む元の 96 ウェル プレートに 90 μ L/ウェル選択培地を追加します。このプレートは、プレートのバックアップとして使用されます。

2. ネオマイシン耐性クローンのスクリーニング

  1. 96 ウェル DNA プレートからの DNA の抽出。
    1. DNA プレートで培養したクローンが 90% の合流点に達すれば、PBS で 2 回を洗浄し、50 μ L 換散バッファー (10 mM Tris pH 7.5、10 ミリメートルの EDTA、10 mM の NaCl、0.5 %sds および 1 mg/mL, プロテイナーゼ K) で溶解します。パラフィルム プレート カバー、シールふた、各ウェルに、サランラップでカバー、37 ° C で一晩します。
    2. 冷たいエタノール (エ-オハイオ州) を 100 μ l 添加/食塩 (100% エタノールで 0.75 M の NaCl) それぞれによく、6 時間または一晩室温を沈殿させます。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    3. プレートを反転エ-オ/食塩を削除し、ウェルあたり 70% エタノール 200 μ L で 3 回を洗浄します。
    4. 蒸留水で RNAse A 溶液の 25 μ L を追加し、37 ° C 1 時間インキュベートします。
  2. PCR の拡大のため、ゲノム DNA の 3 μ L を使用します。ネオマイシン耐性遺伝子と subtelomere 15q 内アニールするプライマーを使用して選択されたクローンの PCR のスクリーニングを実行します。標準のポリメラーゼの酵素と PCR プロトコル21を使って PCR 増幅を行います。
    注: MS2 プライマー (MS2-subtel15q-プライマー-S および MS2 としてプライマー) とプライマーのクリック率 (CTR プライム S と CTR プライマーとして) のための PCR 条件は、次のよう: 98 ° C、20 変性のステップと、98 ° C 10 s、58 ° C 20 s 72 ° C 15 s、34 サイクル s、ポリメラーゼの酵素を 25 μ L で反応ミックス (材料の表を参照してください)。プライマー シーケンスは、表 1に示されます。
  3. Agarose のゲルの PCR の反作用を実行し、標準的なゲル抽出プロシージャ (ゲル抽出試薬、材料表を参照) を使用して肯定的なクローンから得られる PCR バンドを抽出します。
  4. MS2 シーケンス21の存在の確認のためゲル抽出 PCR の製品の DNA シーケンス解析を実行します。
    注: シーケンス解析は PCR のスクリーニング用プライマーを使用して実行できます。
  5. 南しみ PCR 陽性クローンのスクリーニング
    1. クローンを PCR とシーケンス スクリーニング元 96 well プレート (バックアップ プレート) から 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 mL 中の単位)、ストレプトマイシン (あたり 0.2 μ g を添加したハムの F-12 K (Kaighn) 中 6 ウェル プレートを肯定的な成長します。媒体の mL)、37 ° C 5% CO2で 0.7 μ g/mL の濃度でネオマイシンを含みます。
      注: また、これらのクローンのいくつかが失われている場合それらを解凍凍結板 (プロトコル 2.6 を参照) のいずれかから。
    2. クローンは、90% 合流 6 ウェル プレート、PBS のセルを洗浄して、まあ当たり 0.5 μ g, プロテイナーゼ K を含む換散バッファーの 250 μ L を追加します。
    3. 細胞スクレーパーを使用して細胞をこすりし、1.5 mL チューブのライセートを転送します。
    4. 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    5. 100% エタノール 1 mL を追加し、積極的に振るし、沈殿する少なくとも 2 時間または-20 ° C で一晩に DNA を許可します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    6. 13,400 x g で 10 分間の 4 ° C で回転、上澄みを廃棄し、70% エタノールでペレットを洗浄します。常温乾燥ペレット空気をみましょう。また、真空濃縮を使用します。
    7. RNAse A を含む蒸留水 50 μ L の DNA ペレットを再懸濁します、37 ° C で 1 時間インキュベート
    8. 37 ° C で分解反応を一晩インキュベートし 100 μ L 反応体積に NcoI および病原の制限酵素 (2 つの独立した消化力) を用いたゲノム DNA の 5-10 μ g を消化します。
    9. 完全な消化力確認のための agarose のゲル (0.8% の agarose) の消化の 4 μ L を実行します。
    10. 制限消化反応するナトリウム酢酸 3 M ソリューション pH 5.2 と 2 100% エタノール量の 1/10 ボリュームを追加および少なくとも 2 時間孵化させなさいまたは DNA を沈殿させる-20 ° C で一晩します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    11. 20 分の 4 ° C で 13,400 × g で遠心分離、培養上清を破棄し、70% エタノールでペレットを洗浄します。室温で空気ペレット乾燥を許可します。また、真空濃縮を使用します。
    12. 20 μ L の蒸留水でペレットを再懸濁します、0.8% の agarose のゲルの消化の DNA を読み込みます。
      注: 消化の DNA に優れた解像度のゲル、少なくとも 15 cm を長い準備し、低電圧 (̴30 ボルト) で一晩を実行します。電気泳動の設定を最適化してください。
    13. 次の日、室温で 30 分間、1 μ L/10 mL 最終濃度でエチジウム ブロマイドなどの DNA ラベリング剤ゲルを染色し、イメージング計測器ゲルのゲルに近い支配者と写真を撮る。
    14. ナイロン膜に DNA の転送を設定し、シーケンス固有の MS2 プローブ標準手順21を使用して膜の交配を実行します。
    15. 雪解けの PCR、DNA 配列と南部で肯定的なクローン (次のステップを参照)、2 つの凍結プレートの 1 つからのしみ。
  6. クローンの融解
    1. 5 mL に予め温めておいたハム F の - 12 K を含む 1 つの 15 mL チューブを準備 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 単位中の mL) 解凍する各クローンのストレプトマイシン (媒体の mL あたり 0.2 μ g) と培 (Kaighn)。
    2. -80 ° の冷凍プレートの 1 つを削除し、よく解凍する肯定的なクローンを含んでいる、予め温めておいた F12K 完全培地の 100 μ L を追加します。
      注: この手順をすぐに実行する必要があります、96 well プレートは、冷凍のままに他のクローンを許可するために、各クローンを解凍後ドライアイスに配置必要があります。これは複数のクローンが同じ 96 well プレートから解凍する必要がある場合に特に重要です。
    3. 5 mL 中、室温で 5 分間 800 × g で遠心分離を含む 15 mL チューブにセルを転送します。
    4. 培地を吸引、予め温めておいた完全 F12K 培地の 500 μ L の細胞を再懸濁し、各クローンを 12 ウェル プレートの単一の井戸に転送します。
  7. MS2 カセットからネオマイシン耐性遺伝子の除去は、subtelomere 15q で統合されています。
    1. 12 ウェル プレートから完全 F12K 培地に 10 cm 皿に成長するクローンを許可します。
      注: ネオマイシンは、特に明記しない限り、メディアに含まれませんください。
    2. 70% 完全 F12K 培地 10 mL に合流で 10 センチメートルの皿で培養細胞に Cre を発現アデノ ウイルスを追加します。
      注: Cre GFP 発現アデノ ウイルスを使用すると、100% に近づく必要があります感染効率の評価ができます。文化のいくつかの文章の後、レプリケーション欠陥アデノ ウイルスは失われます。
    3. 感染後 48 時間は、3品 10 cm のセルを分割します。ネオマイシン含有細胞の成長、負の淘汰によるネオマイシン遺伝子除去の検証のため 2 つの料理をされる媒体 (最初の皿)、および南によるしみ (2 番目の料理)。
    4. 細胞凍結および RNA の抽出のためのクローンを含む 3 番目の料理を文化します。

3. RT qPCR でテラ MS2 転写式の検証

  1. ネオマイシン遺伝子除去の検証時に有機溶剤 (フェノール及びグアニジン isothiocynate ソリューション)21を使用してテラ MS2 クローンからの総 RNA の抽出を実行します。
    1. ジエチル pyrocarbonate (DEPC) 水の 100 μ L の 10 cm 皿から抽出した RNA を再懸濁します。
    2. 3 μ L の RNA を濃度分配 (1% ホルムアルデヒドを含む) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic 酸 (モップ) ゲルの濃度および RNA の整合性を検証するために実行します。また、分光光度計を用いた RNA 濃度を分析します。
    3. 私は DNAse の 1 単位を使用して DNAse で RNA の 3 μ g を扱う私 60 μ L 反応量の酵素。
    4. 37 ° C で 1 時間反応を孵化させなさい
  2. 逆に転写反応と qPCR 解析
    1. ヌクレアーゼ フリー微量遠心チューブに次のコンポーネントを追加: 1 μ M テラ プライマー、dNTPs ミックス (10 mM) の 1 μ L、6 μ L (̴300ng RNA に対応する) DNAse I 処理した RNA の 2 μ L。4 μ L の DEPC 水 13 μ L にボリュームを調整します。
      注: 各 Rna 分析するのに、同じ試薬がテラ プライマーの代わりに、参照特定のプライマーを含む 2 番目の管が準備されるべき。
    2. 65 ° C 5 分の混合物を加熱し、少なくとも 1 分氷で孵化させなさい。
    3. 簡単なの遠心分離によって管のコンテンツを収集し、5 X RT 酵素バッファー、1 μ L 0.1 M ジチオトレイトール (DTT) 1 μ L (4 単位) の RNAse 阻害剤と逆転写酵素の 1 μ L の 4 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。
    4. 60 分、42 ° C でサンプルをインキュベートし、qPCR 解析の RT の反作用の 2 μ L を使用します。
  3. 2 x qPCR マスター ミックス、cDNA テンプレート 2 μ、1 μ L 前方プライマー (10 μ M)、逆プライマー (10 μ M) の 1 μ L と水の 6 μ L の 10 μ L の 20 μ L の最終巻の qPCR 反応混合物を準備します。
  4. 21標準のプロトコルを使用してたちの qPCR 反応を実行します。

4. MS2 GFP 表現するレトロ ウイルスの生産

  1. レトロ ウイルスというベクター (pBabe MS2 GFP プーロ) とモル比の 4:1 を使用して (pCMV VSVG) などのベクトルを表現するenv遺伝子を表現する MS2 GFP の融合蛋白質の 80% コンフルエント フェニックス パッケージング細胞を transfect MS2 GFP 発現するレトロ ウイルスを生成するには2 つのベクトル。
  2. 次の日に新鮮な媒体含む 10 mM ナトリウム酪で、培養培 (DMEM 10 %fbs、2 mM L グルタミンとペン/連鎖球菌) を置き換えます。
  3. 37 ° c、5% CO2、8 時間インキュベートし、そこからウイルスが収集されます新鮮な培養培地で媒体を交換します。
  4. 48 時間後に、フェニックス細胞からレトロ ウイルス含有培地を削除します。この媒体テラ MS2 クローンの感染に直接使用することができます、その場合 0.45 μ m のフィルターを通してメディアをフィルター、polybrene (30 μ g/mL 最終濃度) を追加、(この場合はプロトコルはステップ 5 に引き続き) のセルに追加。また、レトロ ウイルスは、回転ホイールに 4 ° C で一晩インキュベートを 50 %peg-8000/900 mM の NaCl 水溶液の 1/5番目のボリュームを追加して 50 mL の隼のチューブで沈殿できます。
  5. 次の日、30 分間 2,000 × g で遠心分離によるペレット レトロ ウイルス粒子に培養上清を取り外して血清なし F12K 中でペレットを再懸濁します。
    注: ウイルス粒子は元の培養上清中のボリュームの 1/100thで再停止することができます。レトロ ウイルスが細胞を効率的に感染するために必要な最小限の量を確認するために感染実験を行わなければなりません。

5. 生きている細胞のテラ MS2 転写物の可視化

  1. テラ MS2 クローンとガラス底の料理の WT AGS 細胞をプレートします。感染日中 (30 μ g/mL 最終濃度) ・ MS2 GFP 発現するレトロ ウイルスに polybrene を追加します。
  2. 24 時間後にウイルスを含んだ培地を除去し、新鮮な培地 - フェノールレッドなしを追加します。
  3. 適切な顕微鏡の設定を使用して倒立顕微鏡で細胞を分析します。100 X のセルや大開口 (1.4 倍) と敏感なカメラ (EMCCD) を使用して 60 の X 目的をイメージします。イメージング中に 37 ° C および 5% の CO2のサンプルを維持するのに環境制御システムを使用します。

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Representative Results

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1は、実験的戦略の概要を表します。プロトコルとテラ MS2 AGS 細胞クローンの生成を示すタイムラインの主な手順 ( 1A) のとおりです。1 日で 6 ウェル プレートの複数の井戸が MS2 カセット、sgRNA/Cas9 ( 1Bに示すように) ベクトルを表現するをトランスフェクトしました。2 つの異なる subtelomere 15q 固有ガイド RNA シーケンス Cas9 nickase 表現のクローンを作成 pX335 ベクトル、cotransfected MS2 カセットでは、2 つの sgRNA pX335 ベクトルを生成します。プレートの 1 つの井戸は、トランスフェクション効率を確認するベクトルを表現する GFP をトランスフェクションすることができます。2 日で細胞がトリプシン、単一の井戸から選択培地を含む 10 cm 皿に転送。3 日目で、最も融合細胞は死んでいるだろうはメディアを変更してください。セルは、選択でクローン表示され、収穫できるまでに育ちます。この時間の間に細胞がトリプシンないと培養培地はすべて 1-2 日を変更する必要が最初の週とし、2-3 日後。単一のクローンが表示されたら、彼らが選ばれ、合流の 80-90% に到達するまで成長する許可されている 96 well プレートに転送。この時点でクローン 4 異なる 96 ウェル プレート、色コードと 1にマークされている分割されています。DNA プレート (グリーン) で培養したクローンが 80% の合流点に達すれば、彼らの服従分離してゲノム DNA 抽出 PCR スクリーニング;バックアップ プレート (ブルー) のクローンは、検診の結果、PCR、赤い凍結プレートは-80 ° C で凍結されている間まで文化に保存されます。2Bは、ネオマイシン耐性クローンの PCR のスクリーニングの代表の結果を示しています。このスクリーニングのためのプライマーの 2 つのセットが使用される: 1 つのプライマー ペア (MS2 プライマー) ネオマイシン遺伝子と subtelomere 15q シーケンス内で焼鈍を使用 (プライマー ローカリゼーションの代表画像はで表示されます MS2 カセットの存在を確認して図 2A)。(プライマー シーケンスは 1に示される) 偽否定的なクローンの存在を確認する内部の染色体領域で焼鈍プライマー 2 番目 (CTR プライマー) のペアが使用されます。カセットの統合のための否定的なクローンが MS2 プライマーの増幅に負率プライマーの増幅に肯定的な必要があります。ゲノム DNA 抽出 DNA やその汚染の不在の結果の技術的な問題は、MS2 とクリック率のプライマー反応からの PCR 増幅を排除でしょう。これらのケースで関与のクローンを再検査する PCR によるバックアップ プレートからゲノム DNA の抽出時に。ゲル抽出と 10 MS2 シーケンスの存在を確認するために MS2 プライマーを使用してシーケンスされた肯定的なクローンの MS2 プライマー増幅から得られたバンドがすることができます。

ゲノム DNA の抽出およびサザンブロット解析によって PCR のスクリーニングで陽性クローンが 6 ウェル プレートに 96 のもバックアップ プレート ( 1の青いプレート) から培養。2Dは、ゲル (左) と交配放射能標識 MS2 シーケンス特定のプローブ (右) PCR 陽性クローンのサザンブロット スクリーニングの膜の代表的なイメージを示しています。Subtelomere 15q MS2 シーケンス統合の確認、各クローンから抽出したゲノム DNA は、2 つの独立した消化反応で (NcoI と病原) 2 つの異なる制限の酵素と消化される必要があります。NcoI および病原の制限酵素 subtelomere 15q MS2 カセット統合の検証に適しています。他の酵素を使用もできます。ゲルは、ゲノム DNA の完全な消化力病原制限酵素を用いた塗抹標本の存在によって示されます。南しみからの結果は、その 1 つのクローンが subtelomere 15q で MS2 カセットの統合のための肯定的な複数のバンドの存在によって示されるように、いくつかのクローン表示、カセットの複数の統合イベントを示します。肯定的なクローン ゲノム DNA21NcoI 消化時に第 2 南しみ分析する必要があります。Subtelomere 15q、MS2 を含むカセット テープの代表的な画像と病原と NcoI の制限酵素サイトの位置は、 2Cに表示されます。

クローン陽性ネオマイシン遺伝子 MS2 カセットの存在を削除するための Cre GFP 発現アデノ ウイルスに感染している解析 PCR および南しみに。3Aは Cre 式の前後にタグ付きの MS2 subtelomere 15q を示しています。Subtelomere 15q MS2 カセット統合の陽性クローンのイメージは Cre GFP の発現アデノ ウイルスは 3Bに示すように、感染しています。すべてのセルにおけるネオマイシン遺伝子の完全な除去のため感染効率がほぼ 100% に達する必要があります。 3Cのように、ネオマイシン遺伝子の除去を確認するためにでは、Cre GFP 感染細胞は 3 つのプレートの感染から 48 時間後に分割されます。1 つのプレートは、ネオマイシンの存在下で培養されます。この板のすべてのセルは 6-7 日以内に死ぬべきです。2 番目のプレートの 80-90% の合流選択せず完全培地に成長する細胞が許可されます。この時点で、ゲノム DNA は抽出、南しみ分析します。3 番目のプレートは RNA の抽出、クローンの凍結する在庫の準備と Rt-qpcr テラ MS2 転写産物発現の分析を許可する完全な培地で培養しました。3Dは、前に、Cre GFP 感染後肯定的なクローンの南しみ分析の代表的なイメージを示しています。DNA の agarose のゲル (左の画像) は、NcoI 制限酵素を用いた DNA の完全な消化力を確認します。放射能によって分類される MS2 シーケンス特定プローブ (右の画像) を用いたサザンブロット解析を行った。この分析では、ネオマイシン遺伝子の削除を確認します。Cre GFP 感染サンプルの汚れの存在は、MS2 シーケンスのテロメアの統合を確認します。Subtelomere 15q 内 NcoI 制限のサイトの位置を 3に示します。

ネオマイシン耐性遺伝子の除去が確認されればテラ MS2 の転写産物の発現はクローンを調べることができます。この目的総 RNA は各クローンから抽出し、濃度分配モップ ゲル ( 4A) の整合性を確認するために実行します。1,900 拠点 (18 s rRNA)、リボソーム RNA バンドは 4,700 拠点 (28 s rRNA) で表示されているはずです。Retrotranscription 反応がテロメア繰り返し特定のプライマーを使用して実行され、参照の遺伝子特定のプライマー ( 4B上) テラ式の qPCR 解析中、2 組のプライマーを使用して実行: 1 つのプライマーペア アニール MS2 シーケンスと subtelomere 15q シーケンス内にあります。subtelomere 15q 内アニールするプライマーの 2 番目のペア。プライマー シーケンスは、 1で示されます。 4B Rt-qpcr AGS WT 細胞および 2 つの異なるテラ MS2 クローンからテラ発現解析を示しています。これらの分析は、テラ成績証明書 subtelomere 15q WT 細胞から表現に匹敵するレベルで 2 つのクローンのテラ MS2 転写物の式を確認します。これらのデータは、選択された 2 つのテラ MS2 クローンが生細胞イメージングによるテラ MS2 の分析に適していることを示します。

生きている細胞でテラ MS2 の成績証明書を視覚化するために選択されたクローンは MS2 GFP の融合蛋白質を表現するレトロ ウイルスに感染しています。5プロトコル手順 4 の説明に従って、 Aはレトロ MS2 GFP 発現ウイルスを生成する手順を示しています。AGS WT 細胞とテラ MS2 クローンは、ガラス底皿に感染しています。感染から 24 時間後の細胞は蛍光顕微鏡によって分析されます。検出されたテラ MS2 クローンの核と AGS WT 細胞 ( 5B) ではテラ MS2 GFP 巣の有無による信号の特異性を確認します。MS2 GFP の人口で発現細胞、細胞間 MS2 GFP レベルの面で不均一性が期待され、画像解析の低レベルを発現する細胞を選択必要があります。また、MS2 GFP 発現細胞を FACS 前顕微鏡解析による低レベルの GFP を発現する細胞の亜集団を収集するためにソートできます。以前テラ MS2 GFP 巣 40 ~ 60% セルの AGS テラ-MS2 の21のクローンを検出しました。これらのセルでセルあたり 1 ~ 4 テラ MS2 GFP 巣をイメージしました。異なるサイズとダイナミクスを示すテラ MS2 GFP 巣は、検出された21をすることができます。テラ MS2 クローンは、生きている細胞の単一テロメア テラ転写物のダイナミクスを研究する使用できます。このアプリケーションの例として、 5Cは MS2 GFP 融合タンパク質と TRF2 融合するために mCherry にテロメア結合蛋白質を表現するテラ MS2 クローンの顕微鏡分析から代表的なイメージを示しています。MS2 タグ テラ成績証明書と生きている細胞のテロメアを視覚化します。このアプローチを使用すると、私たち以前に観察したテラ MS2 GFP 巣が 44%、細胞のテロメアと共同ローカライズ、テラの成績証明書のみ一過性共同でローカライズ AGS 細胞21染色体の端を示します。

Figure 1
1.実験的戦略とテラ MS の世代を示すタイムラインの概要2 の AGS 細胞のクローンを作成します。A)テラ MS2 の選択クローンのプロトコルを示すタイムラインで説明する手順が表示されます。セルは線形 MS2 カセットと sgRNA/Cas9 のベクトルを表現する 6 ウェル プレートで導入しました。色コードは、バックアップ プレートと凍結板プロトコルのセクションで示した DNA プレートを区別するために使用されます。B) MS2 シーケンスの 10 の繰り返しが続く 800 nt 長い subtelomere 15q シーケンスで構成され、MS2 カセット、lox p に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子のサイト、その 3' 末端に、300 の nt 長いテロメア繰り返し管で終わります。sgRNA/Cas9 表現するベクトルは、BbsI 制限サイト21,22を使用して pX335 ベクトルで subtelomere 15q 固有ガイド RNA シーケンスを複製することによって生成されました。2 つの異なる sgRNA pX335 ベクトルが生成された、2 つのベクトルの 1:1 の混合は、トランスフェクションに使用されました。 1に、sgRNAs のシーケンスが示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
2.PCR と南部の代表的なイメージのネオマイシン抵抗性クローンのスクリーニングのしみA) subtelomere 15q MS2 カセットを含むの代表的なイメージ。PCR のスクリーニングのために使用される MS2 プライマー (MS2-subtel15q-プライマー-S および MS2 としてプライマー) の位置が示されます。LoxP サイト カセット内に存在は、赤で表示されます。B) PCR プライマーのクリック率 (CTR プライム S と CTR プライマーとして)、MS2 プライマー プライマーの 2 つのセットを使用してネオマイシン耐性クローンのスクリーニングの代表的なイメージ。C) subtelomere 15q MS2 カセットを含むの代表的なイメージ。病原 NcoI 制限サイトやサザンブロット スクリーニングに使用 MS2 プローブが表示されます。D)左: ゲノム DNA クローンごとの 10 μ g が病原と agarose のゲルの実行で消化されました。画像は、一晩 30 ボルトで実行後に買収されました。右: 病原の制限の酵素と消化されるゲノム DNA に正荷電のナイロン膜に転送され放射能によって分類される MS2 シーケンス固有プローブとハイブリダイズします。赤いボックスは、肯定的なバンドの予想サイズを示します。赤い矢印は、1 つの肯定的なクローンを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
3.ネオマイシン耐性遺伝子と検証実験を撤廃。A) subtelomere 15q MS2 カセットを含む Cre 式前後の代表的なイメージ。南しみ分析と NcoI 制限酵素サイトの MS2 特定プローブが表示されます。LoxP サイト カセット内に存在は、赤で表示されます。B)蛍光顕微鏡による Cre GFP 発現アデノ ウイルスに感染しているテラ MS2 クローンの解析。1 つの焦点面で代表的な画像が表示されます。MOI、感染症の多様性は、ウイルス感染症の使用数と宿主細胞の数の比率です。スケール バー: 30 μ m C)ネオマイシン遺伝子の除去を確認するために使用する実験的戦略の概要。感染 Cre-GFP セルは、i) 負の淘汰、ii) 南しみ分析 iii) 凍結細胞株および RNA の抽出の準備に感染から 48 時間後 3枚のプレートに分割されます。D) テラ MS2 のサザンブロット前に、と Cre GFP アデノ ウイルス感染症後のクローンを作成します。ゲノム DNA の 10 μ g あった NcoI 制限の酵素と消化されます。Agarose のゲルは、両方のクローン (左) における完全な消化力を引き出せることを確認します。消化のゲノム DNA は正荷電のナイロン膜に移され、MS2 シーケンス固有のプローブを用いた交配します。ネオマイシン遺伝子の完全な除去は、特定のバンドの不在によって確認されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
4.Tel の RT qPCR 解析15q テラほけん15q テラ MS2 転写式。A) AGS WT 細胞とテラ MS2 クローンから抽出されたトータル RNA を示すモップ ゲルの代表的なイメージ。対応するバンド リボソーム Rna に 28 秒と 18 歳未満が示されます。B)トップ: テラ成績を表現する MS2 タグ subtelomere 15q の模式図。テラ retrotranscription (黄色) および Tel15q テラ (ブルー)、Tel15q MS2 テラ (赤) の qPCR の分析に使用するプライマーのとおりです。LoxP サイトは赤で表示されます。下: Rt-qpcr AGS WT 細胞とテラ MS2 Tel15q テラと Tel15q MS2 テラの転写産物発現解析を複製します。p < 0.05、対になっていないt-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
5.ライブセル イメージング テラ MS の解析2 のクローンを作成します。A)プロトコル手順 4 で説明した MS2 GFP の表現するレトロ ウイルスを生成する手順の概要です。MS2 タグ subtelomere 15q および MS2 GFP 融合タンパク質によって認識されるテラ成績の概略図は、右側に表示されます。B) MS2 gfp AGS WT および 2 テラ MS2 の代表的な蛍光顕微鏡画像のクローンを作成します。テラ MS2 GFP 巣は、矢印で示されます。画像は、EMCCD カメラ搭載回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた買収されました。画像は 100 X を使用してキャプチャされた/イメージング室で 1.46 アポクロマート目的 5% CO2と 37 ° C で維持します。488 レーザー光源として使用されました。スケール バー: 5 μ m. C)ライブセル イメージング解析テラ MS2 GFP 巣と TRF2 mCherry ラベル テロメア。テラ MS2 GFP フォーカスと単一テロメア間の共局在のイベントが表示されます。画像はB、光源として 488 と 520 のレーザーを使用してのように買収されました。Z スタック実験タイムラプス イメージング実験のポイントが表示されます 1 つの時間での最大投影。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

プライマー名 プライマー シーケンス アプリケーション
MS2-subtel15q-プライマー-S TGCATTAAAGGGTCCAGTTG ネオマイシン耐性クローンの PCR のスクリーニング用前方 MS2 プライマー
MS2 プライマーとして CCTAACTGACACACATTCCACAGA MS2 プライマー逆ネオマイシン耐性クローンの PCR のスクリーニングに使用
CTR プライマー S TGT ACG CCA ACA CAG TGC TG ネオマイシン耐性クローンの PCR のスクリーニングで使用される転送率プライマー
CTR プライマーとして GCT GGA AGG TGG ACA: GCG-A ネオマイシン耐性クローンの PCR のスクリーニングで使用されるクリック率プライマー リバース
Tel15q S1 GCAGCGAGATTCTCCCAAGC QPCR による Tel15q と Tel15q MS2 テラの表現を検出するために使用感覚プライマー
hTel15q-として TAACCACATGAGCAATGTGGGTG QPCR による Tel15q と Tel15q MS2 テラの表現を検出するために使用 antisense プライマー
--として Tel15q MS2 ATGTTTCTGCATCGAAGGCATTAGG QPCR による Tel15q MS2 テラ表現を検出するために使用 antisense プライマー
テラ RT プライマー CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA テラのトラン スクリプトの retrotranscription 用プライマー
sgRNA1 TTGGGAGAATCTCGCTGGCC 短いガイド RNA 1 のシーケンス pX335 ベクトルでクローンし、Cas9 nickase subtelomere 15q に酵素活性を直接するために使用
sgRNA2 TGCATTAAAGGGTCCAGTTG 一連の短いガイド RNA 2 pX335 ベクトルでクローンとして作らし、Cas9 nickase subtelomere 15q に酵素活性を直接するために使用

テーブル1: 本研究で使用されるプライマーの一覧。プライマーとこのプロトコルで使われる sgRNAs のシーケンスのリストが提供されます。シーケンスは、5' 3'。

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Discussion

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この記事では MS2 シーケンス subtelomere 15q 内に統合を含むひと癌細胞のクローンを生成する手法を提案します。これらのクローンを使用して、subtelomere 15q から転写 MS2 タグ テラ分子は、MS2 GFP 融合タンパク質の共発現による蛍光顕微鏡で検出されます。このアプローチにより、単一から表明したテラのダイナミクスを研究する研究者生活のテロメア細胞21。このプロトコルでは AGS のセルライン テラ式はヒトの胃がんサンプル24で亢進なので、テラを研究に興味深いモデル システムを表すテラ MS2 クローンが選択されます。ただし、ここで説明されているプロトコルは他の細胞内のテラ MS2 のクローンの選択の合わせることができます。MS2 シーケンスの統合原理で昇格できますテロメア 15q から別の subtelomere で特定の MS2 カセットと CRISPR 戦略を使用しています。今回紹介した方法で Cas9 nickase 酵素と二重ガイド Rna は統合22の特異性を高めるために採用されています。この戦略を使用すると、肯定的なクローンの全体の 2% は AGS 細胞で識別されると期待されます。Cas9 酵素の他のバージョンは、クローン選択25の成功率を高めるための試みでテストできます。さらに、プロトコルの次の手順は、クローンの選択の効率を最大限に考慮する重要なものが。

I) テラ MS2 クローンを選択する可能性を高めるための MS2 カセット、CRISPR ベクトル高いトランスフェクション効率を達成するために重要です。悪い細胞はほとんど肯定的なクローンを選択するためにスクリーニング、クローン選択トランスフェクションのいくつかのラウンドを必要があります。

II) クローンの選択に使用するネオマイシンの正確な濃度を決定することが重要です。確かに、低濃度の薬剤を使用中になります偽肯定的なクローンの高濃度は、肯定的なクローンの識別を妨げることがあります。このプロトコルに示されたネオマイシン濃度は致死 AGS のセルに 6-7 日以内培養培地に添加から。

III) クローン ピッキングが重要です。確かに、このプロシージャの間にそれは必要なだけ単一クローンを選んだという。この理由は、近くにあまりにもお互いの混合を防ぐために避けるべきであるある植民地に異なるクローンからの細胞、ゲノム複数のサイトで統合 MS2 シーケンスを含めることができますクローンの混合された人口の選択の結果します。これらのイベントは、南しみスクリーニング中に識別必要があります。

IV) 合流 96 ウェル DNA プレート (プロトコル 2) から抽出したゲノム DNA の量は約 5 μ g と推定されている、PCR および単一の制限の酵素の消化力と南しみが付くことによってすべてのクローンを画面にとどめてください。ただし、予想されるテロメアでカセットの統合を確認するために 2 つの異なる制限酵素で DNA を消化してサザンブロットによる各クローンを選別することが重要ででしょう。この目的では、プロトコルでは、示される PCR のスクリーニングで陽性クローン必要があります 6 ウェル プレートで培養しました。6 ウェル プレートの井戸から抽出したゲノム DNA の量はサザンブロット解析に必要な少なくとも 2 つの制限の消化力のために十分になります。

ここで説明されているプロトコル、MS2 シーケンスをいくつかの理由のため subtelomere 15q 内統合: 私) テラ プロモーターとテラ転写開始部位は、この subtelomere26,27には; で識別されています。subtelomere 15q からテラ ii) 式は、体外のテクニック4,27,28,29,30; を使用してによって検証されています。iii) 15q 染色体の subtelomeric 領域が配列されているし、MS2 カセット21の統合の対象とすることができますテロメア繰り返し管に隣接するユニークな地域が含まれています。PCR や南しみのアプローチは、テラ MS2 クローンの subtelomere 15q 内 MS2 のシーケンスの 1 つの統合を確認するために開発されました。それはまた MS2 シーケンス固定中期の染色体の染色体の局在化を視覚化するために染色体スプレッドの DNA 魚実験を行うは興味深いでしょう。しかし、10xMS2 の長さのシーケンス (450 bp) 通常染色体 (細菌の人工的な染色体 (Bac)、cosmids またはプラスミド) のスプレッド31DNA 魚実験で使用するプローブと比較して非常に短いプローブの使用を課します。この技術的な課題は、プロトコルの制限を表す染色体スプレッドの MS2 シーケンスを視覚化するから私たちを妨げています。メソッドの 1 つのさらに制限は時間とテラ MS2 クローンを選択するために必要な労力です。さらに、特定研究室とウイルス、放射性物質および顕微鏡分析の使用のための機器が必要です。

理解する助けテロメア機能不全や細胞の老化にともなう様々 な生物学的文脈でテラのダイナミクスを定義するためにテラ MS2 クローン細胞の生成のためここで説明されているメソッドを実装できます。これらのプロセスでテラの機能。このアプローチの興味深い開発は、重音テトを含むテラ MS2 クローンの生成を繰り返す MS2 タグ テロメアを含む、特定の subtelomere に統合されます。蛍光蛋白質 (すなわちmCherry) に溶ける TetR 蛋白質の表現は、この可視化の生活の特定のテロメア細胞32。このアプローチには、かどうか人間テラ トラン スクリプトをローカライズし、 cis 諸国におけるテロメアと染色体、またはトランスを他の染色体に移動することにより転写テラで行動の調査が可能になります。テラの生物学のこの質問は、明らかに残ります。

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Disclosures

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

Acknowledgments

CIBIO トレント大学での高度なイメージング機能、ウィーンの BioOptics 光顕微鏡施設 Max F. ペルーツ研究所 (MFPL) でのスタッフに感謝しております。これらの結果につながる研究資金を受けている Mahlke-谷、同財団、研究、技術開発およびデモンストレーションのため欧州連合の第 7 フレームワーク プログラムから付与契約の下でない 609431 ecEC は、大学教育と研究 (MIUR) のイタリア省からリタ レヴィ モンタルチーニ交わりによってサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGS cells - - Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成
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Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).More

Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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