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Neuroscience

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794
Automatic Translation
1,2, 1
1Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ トトで有毛細胞の形づくりとシナプス前機能の両方を試金するため使用することができます。

Abstract

有毛細胞の感覚は、内耳の聴力と平衡感覚に必要な受容です。有毛細胞は、機械的に髪束と呼ばれる根尖部の突起をそらす感覚刺激への応答でアクティブ化されます。たわみは、カルシウムを含む陽イオンの流入につながる髪束のメカノトランスダクション (MET) チャンネルを開けます。この陽イオンの流入はセルを脱分極し、有毛細胞のシナプスにおいて基肥に位置する電位依存性カルシウム チャネルを開きます。哺乳類で、有毛細胞、骨に収められて、機能的に生体内でこれらの活動を評価するために困難です。対照的に、ゼブラフィッシュ稚魚は透過的であり、有毛細胞を含む外部に配置されて - 側線器官を所有しています。これらの有毛細胞は哺乳類の有毛細胞に機能的、構造的に類似しているし、機能的生体内で評価することができます。ゼブラフィッシュ側線有毛細胞の信号刺激誘発カルシウムを測定する GCaMP6s の遺伝的コード化カルシウム インジケーター (GECI) を利用する方法を説明します。GCaMP6s 使用できます、共焦点イメージングと一緒に頂点で横ラインの有毛細胞の生体内でのカルシウム信号を測定します。これらの信号は、これらの有毛細胞内カルシウム活動を長らく謎とシナプスに依存両方リアルタイムで定量化可能な読み出しを提供します。これらのカルシウム信号も有毛細胞を検出し、感覚的な刺激を送信する方法に関する重要な機能情報を提供します。この手法がカルシウム活動の相対的変化について有用なデータを生成します全体的に、生体内で。カルシウム変化の絶対的な大きさの定量化はあまり適してです。この生体内の技法は、体動に敏感です。適度な練習と能力が必要適切な位置、固定、および幼虫の刺激です。最終的には、正しく実行されると、この資料で説明されているプロトコルは生きている動物内の自然な完全に統合された状態で有毛細胞の活動に関する貴重な情報を収集するために強力な方法を提供します。

Introduction

機能カルシウム イメージングは、多くの活動を監視するための強力なツール細胞同時に1です。特に、遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) を用いたカルシウム イメージング GECIs が特定の細胞型で表現できる、ローカライズ subcellularly2ので有利である示されています。神経科学研究では、これらの機能したカルシウム イメージング GECIs 両方神経回路網内の活動のパターンを定義し、個々 のシナプス3,4カルシウム流入を測定する強力な方法。これらの機能を活かし、最近の研究は感覚毛の細胞5のコレクション内で細胞の活動を監視する共焦点顕微鏡と GECIs が使用されます。

有毛細胞は、内耳とローカル水の動きで水生 vetebrates6、7の横ライン システムでサウンドと前庭刺激を検出するメカノレセプターです。有毛細胞の損傷や感音性難聴の損失8,9として知られている人間の難聴の最も一般的な形式は、遺伝子の突然変異のターゲットが多い。したがって、治療や難聴を予防する方法を理解するためにどのようにこれらの細胞の機能を理解する重要です。正しく機能するには、有毛細胞利用機械刺激受容髪束と検出し、それぞれの刺激を伝達するシナプス リボンと呼ばれる 2 つの特殊な構造です。髪束は有毛細胞の頂点にあり、不動 (図 1A) として知られている、毛のような突起から主に成っています。前庭と横ラインの有毛細胞の各毛束があります、単一長い運動毛 (セルの唯一の真の繊毛)、不動 (図 1A) 上記まで拡張することができます。機械刺激受容刺激髪束をそらすため、たわみが連携「先端リンク「不動10を相互接続すると呼ばれる緊張を置きます。この緊張感は、陽イオン、カルシウム11,12を含む腔流入の結果、不動である明らかでない (MET) チャンネルを開けます。この根尖部の活動は最終的に有毛細胞を脱分極し、電位依存性カルシウム チャネル (Cav1.3) セルの基地でを開きます。Cav1.3 チャネルがシナプス リボン、テザーにアクティブなゾーンで小胞シナプス構造に隣接してあります。Cav1.3 チャネルを介して基底のカルシウム流入は求心性ニューロン13,14の活性化、神経伝達、小胞融合に必要です。

長年にわたり全細胞パッチクなどの電気生理学的手法は、ゼブラフィッシュ15,16,17,を含む多くの種の有毛細胞の機能特性をプローブに使用されている18,,1920。これらの電気生理学的記録は聴力と平衡感覚のフィールドで特に貴重なされている上非常に高速の刺激をエンコードすることを目的、個々 の感覚的な細胞から非常に敏感な測定値を得ることができるため、周波数と強度21,22の広い範囲。残念ながら、全セルの録音は、有毛細胞の集団の活動を測定できません。ゼブラフィッシュの側線で細胞の集団の活動を研究するには、スペクトラムの電位と求心性活動電位を合計機械受容と個々 のオイカワ23 のシナプス応答特性を測定する使用されています。 ,24。残念ながら、全セルの録音もローカル フィールド電位測定は、特定活動が個々 の細胞内で発生する、または、人口内の各セルの活性を測定する空間解像度を持っています。最近では、カルシウム染料と GECIs これら課題25,26をバイパスするために採用されています。

ゼブラフィッシュ GECIs トランスジェニックゼブラフィッシュと幼虫27の光学的透明度を作成する相対的な容易さのための有毛細胞の機能を検査する強力なアプローチであると証明しました。ゼブラフィッシュ幼虫で横ライン システムと同様に、内耳の有毛細胞があります。側線はロゼットのようなクラスターの有毛細胞の水の動き (図 1) のローカルの変更を検出するために使用、オイカワと呼ばれる成っています。側線は魚の表面に沿って外部にあるため便利です。このアクセスは、有毛細胞を刺激し、そのまま幼虫における光学的カルシウム信号を計測可能になりました。全体的に、遺伝子導入、幼虫の透明性と横ラインの有毛細胞の比類のないアクセスの容易さが有毛細胞の生体内での活動を研究する非常に貴重なモデル ゼブラフィッシュを作った。これは、有毛細胞が内耳の骨構造に囲まれている哺乳類のシステムと比較して重要な利点です。アクセスのこの欠乏は、哺乳類の有毛細胞の機能の in vivo 測定を取得する非常に困難になっています。

ここで説明したプロトコルでは、MET ゼブラフィッシュ稚魚におけるオイカワ内のセルの間で個々 の有毛細胞内のカルシウム チャネル、シナプス依存変化を監視する方法について説明します。このプロトコルは、有毛細胞の特定のmyosin6bプロモーター28の制御の下で膜のローカライズされた GCaMP6s を表す確立したトランスジェニックゼブラフィッシュ線を利用しています。この膜のローカリゼーションは、有毛細胞機能にとって重要な細胞膜にあるイオン チャネルを介してカルシウム流入を検出する GCaMP6s を配置します。たとえば、GCaMP6s の膜局在がカルシウムを検出できます MET を通じて流入チャンネル頂髪束および CaVセルの基地でのシナプス リボン近く 1.3 チャンネル。これは細胞質に局在 GECIs を使用してゾル性細胞質 GECIs が他のソースからのカルシウムの貢献と同様、MET と Ca のV1.3 チャネル活動の組み合わせをしているカルシウム信号を検出と対照的 (例えば、ストアのリリース)。このプロトコルでは、固定し、イメージ作成前 GCaMP6s トランスジェニック幼虫を麻痺させる方法について説明します。その後、準備および制御で再現可能な方法で横ラインの有毛細胞を刺激するために髪の束をそらすために流体ジェットを使用する方法について説明します。このプロトコルを使用して達成することができる代表的なデータが掲載されています。運動の成果物を表すデータの紹介も。結果を確認し、成果物を除外する使用される制御実験を説明しています。最後に、フィジー ソフトウェアにおける空間カルシウム シグナルを可視化する方法を説明します。このフィジーの解析が MATLAB5を使用して以前に確立された可視化手法から適応です。全体的に、このプロトコルは、ゼブラフィッシュ稚魚の GECIs を使用して計測し、生体内の有毛細胞のカルシウム動態を可視化する強力な手法を説明します。

Protocol

すべての動物の仕事は、動物実験議定書 #1362 13 国立衛生研究所動物の使用委員会によって承認されました。

注: このプロトコル ソリューションおよび装置を準備し、事前に設定して場合に中断と完了する約 0.5 を 1 h になります。このプロトコルは、3-7 日後受精 (dpf) で Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29ゼブラフィッシュ幼虫に最適です。この形質転換線表現膜局在 GCaMP6s (ゼブラフィッシュ コドン最適化) すべてのゼブラフィッシュの有毛細胞で特に。画像、前に幼虫が標準的な条件下で胚バッファー (E3) で発生します。すべての機器とこのプロトコルを実行するために必要な薬のカタログ番号は、材料表を参照してください。

1. 溶液の調製

  1. Α-ブンガロトキシン (125 μ M)、ゼブラフィッシュ幼虫を麻痺させる機能イメージ投射の間に使用されるの 1 つの mL を準備します。
    1. Α-ブンガロトキシン部位 (全体のボトル) の 1 mg に 968.6 μ L 滅菌超純水とフェノールレッドの 33.4 μ L を追加します。100 μ 因数を作るし、-20 ° C で保存
      注意:手袋を着用し、α-ブンガロトキシン部位粉体を処理するとき、フードの準備を行います。手袋は、α-ブンガロトキシン部位ソリューションを処理する場合にも推奨されます。
  2. 60 x 胚バッファー (E3) の 1 リットルを準備します。
    1. 954.4 mL 純水に 17.2 g NaCl と KCl 粉末 0.76 g を追加します。
    2. 1 M CaCl219.8 mL、1 M MgSO4、19.8 mL と HEPES 緩衝液 1 M の 6 mL をソリューションに追加します。最大 6 ヶ月の 4 ° C で 60 x E3 原液を格納します。
  3. 1 の 10 L を準備 x E3 (5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4、pH 7.2)、機能的画像前で幼虫は反映されソリューションであります。
    1. 167 mL 60 x E3 原液を 10 L の純水 1 x E3 ソリューションを作るに追加します。最大 6 ヶ月間常温 (RT) 1 x E3 ソリューションを格納します。
  4. 機能イメージング中に幼虫を浸漬するものです (NB) (140 mM の NaCl 2 mM KCl 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES 緩衝液, pH 7.3)、神経のバッファーを準備します。
    注: 1 x E3 は、機能イメージングのためにも使用できますが、応答より堅牢で信頼性の高い注意
    1. 5 M の NaCl の 28 mL、1 M の KCl の 2 mL、2 mL 1 M CaCl2 1 の 1 mL を組み合わせる M MgCl2、および 957 ml の純水 1 M HEPES 緩衝液 10 mL。7.3 1 M NaOH で pH をもたらします。
    2. フィルター滅菌します。1 ヶ月 4 ° C で保存します。
      注: は、ソリューションを使用する前に RT にもたらします。
  5. 幼虫の麻酔に使用される MS 222 株式 (tricaine、0.4%) を準備します。
    1. エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩と 100 mL の蒸留水に Na2HPO4 800 mg 400 mg を溶解します。7 の pH を調整します。4 ° C でのストア
    2. 0.04% を使用して MS-222 の固定化と α-ブンガロトキシン部位注入中に幼虫を麻酔します。

2. イメージング商工会議所とピンの準備

  1. イメージングの商工会議所 (図 2A) を準備します。Coverslip が付着する正方形のエッジに沿って灌流チャンバーの下部に高真空のシリコン グリスの薄層を適用されます。グリースのギャップを放置しないでください。しっかりと、イメージングの商工会議所にそれを密封する、coverslip の周囲押し下げます。離れて余分なグリースを拭いてください。
    注:グリス塗布には 5 mL シリンジ 200 μ L ピペット チップ付きをお勧めします。
  2. 部屋を満たすようシリコーン封止材を準備します。硬化剤ベースの (量り売り) 10:1 の比率をミックスします。ミックス徹底的にでもやさしく、マイクロ ピペット チップを使用して最小限の泡を作成します。
    1. 商工会議所の表面レベルにある貼付 coverslip にシリコーン封止材を注ぐ。封止材の約 3 g が箱をいっぱいにします。
    2. 慎重にそれを水平に保ちながら平らな面に対して商工会議所をタップまたは (顕微鏡) の下でマイクロ ピペット チップを使用して削除または商工会議所の端に泡をプルします。
    3. 60-70 ° C で一晩研究所オーブンでチャンバーを配置します。熱い空気がその波紋を作成を回避する封止材に直接吹いていないように換気ボックスの内側のチャンバーを配置します。
  3. ファッションのピンの頭と尾 (図 2B1) で幼虫を固定するのにために使用するのに硬化封止材に微細鉗子とタングステン ワイヤを使用します。
    1. 頭のピンを作成するには、顕微鏡下で 1 つの手で 0.035 mm タングステン線の部分を押し。微細鉗子を使用すると、他の一方で、90 ° の最後の線を 1 mm を曲げます。高級はさみ鉗子を交換し、ピンを作成するベンド後 1 mm にカットします。
    2. 2.3.1 尾ピンが曲げのどちら側にワイヤー 0.5 mm を残して 0.025 mm の線を使用して手順を繰り返します。(ストレージ) のチャンバーの硬化封止材にピンを挿入するのに鉗子を使用します。

3. 針の麻痺そして刺激のための準備

  1. ガラス管のフィラメントを用いた心臓注射針を準備します。内側先端直径 1-3 μ m (図 2C) に針を引き出します。
  2. フィラメントのないガラス管を使用して流体ジェットの針を準備します。正しい先端径に分けることができます細長い先端針を引き出します。
    1. 別の液体ジェット針やセラミック タイルの内側先端直径 30-50 μ m を作成する針の先端を曲げることができるすぐ上に垂直にそれをこすりつける液ジェット針の細長い先端を断つ [図 2C (中央の図)、図 3A2]。確認休憩はヒント (図 2C、中央の画像) であっても、ギザギザにならずまたは大きすぎる (図 2C、右の画像) を保証するためにも有毛細胞の刺激の間の正確な流れ。
      注:針研磨機は、ギザギザの改行を修正する使用できます。

4. 固定とチャンバーをイメージングに幼虫を固定

  1. 約 1 mL の 0.04% を含む E3 バッファーの Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) の幼虫を入浴 MS-222 イメージング室タッチ応答しなくなったり動かない幼虫になるまでのシリコーン封止材の表面上で 1-2 分間。
    1. 、顕微鏡下で灌流チェンバの中心に幼虫の位置、それはシリコーン封止材に対して横向きにきっかりあります。
      注:一貫性を保つのため常に同じ側 (例えば、右側を左下) に幼虫をマウント (図 2B1)。
  2. 微細鉗子を使用すると、幼虫と商工会議所に垂直下 0.035 mm 頭ピンをもたらします。眼と耳胞の間頭のピンを挿入 (2B2 数字 2B1 ・封止材へといった。固定しながらその背側または腹側に沿って幼虫を安定させるために鉗子の 2 番目のセットを使用します。ピンの水平部分幼虫の連絡先、封入材料に押しつけるのではことを確認します。腹側ピンを角度 (図 2B1)、またはそれに続く中心の注入と有毛細胞イメージングとの干渉を避けるために魚の前方に向かって少し指摘します。
    1. 鉗子を使用すると、(図 2B1) の尾の端にできるだけ近い脊索に 0.025 mm 尾ピンを挿入します。
      注:幼虫を伸ばすことを避けるように注意します。ピン フラットの幼虫。目をする必要があります (図 2B1) を重ね合わせた。これは心臓注入の容易にするため非常に重要です (図 2B2 B2'、手順 5)、望ましい画像面を促進する (図 1B1 B2 '、手順 8 および 9)、(流体噴流刺激の強度を定量化し、図 3A3ステップ 7)。

5. 幼虫を麻痺させる中心部の空洞に α-ブンガロトキシン部位の注入

注:Α-ブンガロトキシン部位を処理するときは、手袋を着用します。

  1. 心注射針の目詰まりを防ぐために使用する前に簡潔に α-ブンガロトキシン部位因数を遠心します。
    1. バックフィル 3 μ L ピペット チップを読み込むゲルを用いた心臓注射針に α-ブンガロトキシン部位ソリューションの。気泡なしで先端に均等にソリューションを読み込みます。
    2. 手動マイクロマニピュレーターに取り付けてピペット ホルダーに心注射針を挿入します。だから、麻酔をかけられた幼虫は、〜 30 ° の角度で下向きの A P 軸に垂直に配向、顕微鏡下で針を配置します。
    3. ピペット ホルダーを圧インジェクターに接続します。次の推奨設定を適用: Pinjection = 100 hPa、tinjection = 0.5 s、および Pcompensation = 5 hPa。ボーラス注入針の先端が特許かどうかをテストするためのソリューション。
    4. 針の先端を残して (フェノールレッド) から赤色の溶液の小さいパフを探します。赤い色を見てない場合非常に優しくピンのエッジに対して針の先端をこすりし、針が特許になるまでもう一度試してください。また、大きな先端開口部に針を引き出します。
  2. 心 (図 2B2) 外肌に触れるまでは、心臓に向かって針を進めます。幼虫に針を押して、幼虫に対する正しい面で針が通るようにする心の前に皮膚の色素細胞のインデントを探します (図 2B2')。
    1. それは皮膚を貫通し、中心部の空洞に入るまでは、さらに針を進めます。少し戻ってに針を引きます。Α-ブンガロトキシン部位のボーラスを中心部の空洞に注入します。中心部の空洞のインフレ、キャビティに入る赤い染料を見てください。
  3. 残留 MS 222 を削除する NB の 1 mL に幼虫を 3 回を軽くすすいでください。すべての流体を取り外さないでください。約 1 mL の灌流チェンバの NB の幼虫を維持します。
    注:その仔心拍数を確保して血流の堅牢なまま固定と心注入後や、全体のイメージング実験中。

6. 顕微鏡と流体ジェットのセットアップの準備

  1. 材料の表に記載されているコンポーネントを使用して直立した共焦点顕微鏡を組み立てる: 488 と共焦点顕微鏡 nm レーザーと適切なフィルター、顕微鏡を制御し、イメージングと刺激、10 x のエアを調整するソフトウェア目標、60 x 水目的、ピエゾ Z (z スタック) の客観的スキャナー、高速カメラ、円筒アダプター、電動ステージとステージ挿入アダプター。追加のオプションや顕微鏡のセットアップについて張ら29を参照してください。
  2. 組み立てる流体ジェットの 3 つの主要なコンポーネントから成っている: 真空と圧力ポンプ、高速圧クランプ ヘッド ステージ (材料の表も記載)。タイミングとヘッド ステージと流体ジェット ピペットに圧力または真空放電の持続期間を制御するのに高速圧力クランプを使用します。
    1. 肉厚のシリコン チューブを介して流体ジェット ピペット ホルダーに頭] ステージの出力を接続します。

7. 幼虫と流体ジェットの配置

注:各 neuromast 内の 3 機がある: (1) 髪束のヒント (図 3A3: 刺激強度を測定するために使用, kinocilia);(2) の髪束 MET 飛行機 (図 1B1 B1': MET チャネル依存カルシウム信号が検出された頂髪束のベース);(3) とシナプスの平面 (図 1B2 B2': シナプス前のカルシウム信号を検出しては有毛細胞ベースで)。これらの平面の図 1のとおりです。

  1. (ステップ 3.2) から正しく壊れた流体ジェット針に NB のバックフィル 10 μ L チップを読み込むゲルを使用して。気泡なしで先端に均等にソリューションを読み込みます。電動マイクロマニピュレーターに取り付けてピペット ホルダーに針を挿入します。
  2. 顕微鏡ステージ上には、円筒アダプターに灌流チェンバを配置します。
    注:一貫性を保つのため常に同じ向きで幼虫の位置 (流体ジェットと腹側に向かってその後幼虫を含む室内楽などに向けて、実験者側)。
    1. 幼虫は視野の中心部で電動ステージを移動します。幼虫の A P 軸が液ジェット針の弾道で大体揃うように円筒アダプターをオンにします。
    2. 透過光と差動干渉の対照 (DIC) を使用して、幼虫が持ち込むと 10 × 対物下センターします。10 × 対物を上げます。
  3. 電動マイクロマニピュレーターを使用して、針をもたらす流体ジェット視野の中心に NB ソリューションに触れる、透過光によって、ほとんどが点灯するので。
    1. 10 × 対物を下げます。その場所を確認する幼虫に焦点を当てます。流体ジェットの針を見つけることに焦点を当てます。流体ジェットの針を移動マニピュレーターに x 軸と y 軸でそれが魚の背側に平行位置になるまで。
    2. 幼虫に焦点を当てます。Z 軸に針を倒します。魚と体 (図 3A1) から 〜 1 mm の背側に沿って針を配置します。
    3. 慎重に円筒アダプター (必要に応じて) に移動流体ジェット針が幼虫 (図 3A1) の A P 正中線に沿って整列されていることを確認します。
    4. 視野の中心の興味の neuromast を配置する電動ステージを移動します。魚の背側に沿って流体ジェットの針の先端を維持します。幼虫または商工会議所表面液ジェット針の先端に触れないでください。
  4. 水目的 x 60 に切り替えます。目的が NB ソリューションに没頭していることを確認します。使用 neuromast を使用して検索するファインフォーカス送信光と DIC 光学系。
    注:この設定は、プライマリの後部側線に沿ってオイカワを刺激するために設計されています。これらのオイカワ内有毛細胞は、前部または後部監督流体に対応します。孤蝶ら31横ライン システム内 neuromast 流体感度の正確な地図を参照してください。
    1. マニピュレーターに流体ジェットの針の位置を neuromast (図 3A2) の外側のエッジから 100 μ m です。
      注:明確なトップダウン ビューを提供するオイカワを選択 (数字 1B1'-B2'と図 3A3) 側斜めビュー (図 1C1 C2) ではなく。明確なトップダウン ビュー同時光一面すべて頂髪束のイメージングや少ない光飛行機 (図 3A3) のシナプス部イメージング可能.
    2. 頂の髪束 (kinocilia) (図 1A図 3 a 2 、 3A3) のヒントまでに集中します。流体ジェット針の下は、この飛行機でフォーカスする必要があります。
  5. マニュアルから高速圧力クランプをイメージング ソフトウェアから入力を受け取る外部モードに設定します。
    1. 「ゼロ」ボタンを押して、高速圧クランプを、ゼロします。安静時の圧力は若干のプラス (~ 2 mmHg) を設定するのにはセット ポイントのノブを使用します。ヘッド ステージ出力に接続されている PSI の圧力計を使用して高速圧力クランプの安静時の出力を確認します。
      注:時間をかけて液ジェット針への流体の漸進的な吸収を避けるために残りの部分に少し正圧を設定します。流体流体ジェットに接続されているチューブに入るし、頭の段階に達すると、機器を損傷することができますそれ。
    2. 髪束を刺激するために必要な圧力を決定します。入力を使用、0.125、0.25 V (6.25 と 12.5 mmHg) 200-500 ms のテスト刺激を適用する (図 3A3 A3 ')。
      注:高速圧クランプ ヘッド ステージと最終的には、流体ジェット針から排出される圧力に (ソフトウェアまたは BNC ポート高速圧力クランプ コマンド ポートに接続する他のデバイス) からの入力電圧を変換します (1.0 V = 50-1.0 V ながら mmHg =-50 mmHg)。この構成 (手順 7.2 参照) 肯定的な圧力 (プッシュ)、前方に向かって髪束を逸らす負圧 (プル) 偏向後方に向かって髪の束と。
    3. 6.25 と 12.5 mmHg 刺激、kinocilia、髪束の先端のたわみの距離を測る透過光と DIC 光学スケール バーと共に使用して、(図 1Aと3A3 3 の数字 ')。(1 の凝集の単位) としてバンドルを移動する圧力を選択約 5 μ m の距離 (図 3A3 ')。フォーカスに残っている、kinocilia のヒントが、全体の時間を使用することを確認します。
    4. 距離と偏向 kinocilia 5 μ m の先端圧力を見つけるに幼虫の A P 軸に沿って流体噴流 ± 25 μ m を移動します。
      注:幼虫で 3-7 dpf の GCaMP6s を使用して、5 μ m 変位 GCaMP6s カルシウム信号の飽和近く達成すべき、頂髪束構造を破損しないでください (図 3A3 ')。非飽和の刺激を提供するより小さい変位距離を使用できます (図 3A3')。変位距離 > 10 μ m、推定するは難しい (図 3A3 '') と時間をかけて損傷することができます。信号彩度は neuromast (と kinocilial 高さ) の年齢に依存して使用されるインジケーターだけでなく。イメージング中に定期的に各方向 (圧力/プッシュおよびプル/真空) 流体ジェット針の開存を確認します。流体ジェット針簡単に詰まらせるし、真空の開存性を失うが、彼らは残圧の開存性を維持します。流体ジェットの開存性を確認する各方向に DIC 光学と短いテスト刺激を使用します。
    5. サンプル興味 (例えば、ベース頂髪束または、ベース有毛細胞のシナプスの平面の面に焦点を当てる図 1B1 B2')。

8. 画像取得プロシージャ オプション 1: 単一平面買収

注:このプロトコルで説明されているすべての画像はルートで実行されます。

  1. 10 Hz のフレーム レートを達成するためにキャプチャ 100 ms 毎のストリーミングまたは連続 80 フレーム取得を取得するには、イメージング ソフトウェアを設定します。
  2. ゲイン、絞り値、および信号検出の最適化が退色、彩度、ノイズを避けるのためのレーザー出力を設定します。Opterra/SFC の設定例は次のとおりです: 488 nm レーザー力: 50 (髪束 MET 平面)、75 (シナプス平面);35 μ m スリット。利得 = 2.7;EM ゲイン = 3900。
    注:信号が余りに弱いまたは騒々しい、または過剰な退色のビニング X 2 を適用します。ビニングは x 2 は、空間分解能を犠牲にして信号検出を強化します。
  3. 80 枠の中を提供する刺激を選択 (8 s) 習得するフレーム 30 後、3 秒。
    注:いくつかの例の刺激は、次のとおり: 200 ms (+ または - 0.25 V) まで 2 s (+ または - 0.25 V) 各髪セルの方向の感度を識別するために前部または後部方向への一歩2 s、5 Hz の方形波 (0.25 V 200 ms、200 ms の-0.25 V の繰り返し 5 回) すべての髪を刺激する細胞同時に。肯定的な圧力 (前方刺激) は、有毛細胞の半分をアクティブになります。負圧 (後部刺激) は、他に有毛細胞の半分を起動します。刺激が完了したら刺激ソフトウェアまたはデバイスを返す 0 V に戻る圧力クランプを確認します。
  4. 機械刺激感受性カルシウム応答を測定します。頂髪束のベースに焦点を当てる (図 1 aと1B1 B1') と画像の取得を開始。
    注:ダウン、上から、neuromast が明確に表示された場合 (図 1B1 B1')、頂髪のすべてのバンドルは単一の平面を同時にイメージできます。
  5. シナプス前のカルシウム応答を測定します。有毛細胞のベースにフォーカス (図 1 aと1B2 B2') と画像の取得を開始。
    注:かどうか、neuromast は明らかに上から見た下 (図 1B2 B2')、すべての有毛細胞のシナプス前撮像面は 2-3 機セット 2 μ m 離れて得ることができます。Tg [myo6b:ribeye-mcherry]遺伝子導入魚をシナプス前リボンやカルシウム エントリ29のサイト識別および検索に使用できます。

9. 画像取得プロシージャ オプション 2: 多平面の取得

  1. 高速買収 (12-18 ミリ秒) の 60 倍目標に接続されているピエゾ Z を調整します。Max スピードの設定が選択されていることを確認します。
  2. ピエゾ Z を使用して z 集録を作成します。取得は、0.5 μ m のステップ サイズの 5 面で髪束 MET 活動ステップ サイズ 1 μ m の 5 面のシナプス前の信号を集録します。
  3. フレーム レートを 10 Hz に設定します。各フレームになります 20 ms 毎、各 Z スタックのすべての 100 ms を捕獲します。
  4. 8 400 フレームまたは 10 Hz で 80 Z スタックの取得を設定データ集録 s。
  5. レーザー パワー、絞り値、および信号検出の最適化が、退色、彩度、ノイズを避けるためにゲインを設定します。Opterra/SFC システムの設定例は次のとおりです: 488 nm レーザー力: 75 (髪束 MET 平面)、125 (シナプス平面);35 μ m スリット。利得 = 2.7;EM ゲイン = 3900。
    注:信号が弱すぎる場合のビニング X 2 を適用騒々しい、過剰な退色があったり。ビニングは x 2 は、空間分解能を犠牲にして信号検出を強化します。
  6. 3 後フレーム 150、最低取得中を提供する刺激を選択 s。
  7. 単一平面獲得のため上記のようにプロトコルを続けるが頂または基底の平面 (8.4 と 8.5 の手順) で z を中心します。

10. 制御: すべて誘発カルシウム信号の薬理学的ブロック

注: これら (1, 2-bis(o-aminophenoxy) エタン-N, N, n ′、n ′ 四酢酸) 治療は、最初にこのプロトコルを確立する重要な制御。

  1. 8 または 9 の手順を完了すると、NB ニオブ添加 5 mM 髪束にある頂の MET チャネルをゲートに必要なヒントのリンクを切断するこれらの 1 mL と交換してください。
  2. 室温 10-20 分間インキュベートします。
  3. これら 3 回の注意 1 ml を洗浄します。
  4. 8 または 9 の手順を繰り返します。これらの治療後は、頂髪束またはシナプスの平面で流体噴流刺激による GCaMP6s の蛍光変化がない必要があります。GCaMP6s 蛍光の変化が持続する場合これらが真のカルシウム信号と運動成果物になる可能性があります。

11. コントロール: シナプス前のカルシウム信号 (オプション) の薬理学的ブロック

  1. 8 または 9 の手順を完了すると、有毛細胞のシナプスにおいて L 型カルシウム チャネルをブロックする 0.1% ジメチルスルホキシド (DMSO) で 10 μ M の isradipine を含む NB で NB を置き換えます。
  2. 室温 10 分間インキュベートします。
  3. 洗浄を行わずには、ステップ 8 または 9 を繰り返します。治療後、まだ GCaMP6s の蛍光変化にあります流体噴流刺激による頂髪束がシナプスの平面ではないです。GCaMP6s 蛍光の変化がシナプスの平面で持続する場合これら真のカルシウム信号は、運動の成果物になる可能性があります。

12. 画像データの処理、グラフィカルな表現

注:ステップ 12 でフィジー (手順 12.1-12.1.5) とグラフ作成プログラム (ステップ 12.2-12.2.3) を使用します。StackReg、TurboReg (ステップ 12.1.3)、時間シリーズ アナライザー V3 (手順 12.1.4–12.1.6)、フィジーのプラグインも必要 (材料の表を参照してください)。

  1. フィジー、単一平面時系列 (80 フレーム単一平面) または Z スタック タイム シリーズ (400 フレーム マルチ プレーン) で画像を開きます。クリックして「ファイル」のドロップ ダウン メニューから「インポート」を選択、「イメージ シーケンス」をクリックして
    1. Z スタック タイム シリーズの Z - たびにポイントをプロジェクト (timepoint あたり 5 面) 80 フレーム イメージ シーケンスを作成します。クリックして「画像」ドロップ ダウン メニューから「スタック」を選択、ドロップダウン ・ メニューから「ツール」を選択、「グループ化された Z-プロジェクト」をクリックして投影法として「平均強度」を選択し「グループ サイズ」の「5」を入力します。
      注:Z スタック内で各平面は、空間について個別に分析できます。
    2. 削除最初の 1 s (10 フレーム) 8 から画像取得の s (80 フレーム)。クリックして「画像」ドロップ ダウン メニューから「スタック」を選択、ドロップダウン ・ メニューから「ツール」を選択、"を Substack"をクリックして「スライス」の「11 80」を入力します。
      注:この substack stk1と呼ばれるでしょう。
    3. StackReg プラグイン32を使用してイメージ シーケンス (stk1) を登録します。クリックして「プラグインは、」["StackReg"を選択し、70 フレーム時間シリーズのための登録方法として「翻訳」を選択します。
      注:この登録 substack stk2と呼ばれるが。
    4. 回シリーズ アナライザー V3 プラグインを使用すると、GCaMP6 (F) の強度測定を抽出できます。頂髪束またはstk2のシナプス前のサイトに利益 (率 ROI) の領域を配置します。ImageJ のウェブサイトを参照してください (リンクの材料表を参照してください) 時間シリーズ アナライザー V3 を使用する方法について。
      注:頂髪束とシナプスの平面 (数字 4A1と4 a 2) の円形の 3-5 μ m の投資収益率の循環 1-2 μ m の投資収益率を使用します。
    5. 測定パラメーターを選択します。クリックして"Analyze"を「設定測定,」を選択し、唯一の「平均グレー値」が選択されていることを確認します。
    6. ROI マネージャーですべての Roi を選択し、マルチ測定機能を使用して、時系列の各 roi (F) 強度値を生成します。ROI マネージャー内では"より >>、"をクリックし、ドロップ ダウン メニューから「マルチ メジャー」を選択します。
  2. (F) 値をプロットします。X と Y のグラフを作成するグラフ作成プログラム「マルチ メジャー」結果から値 (F) を貼り付ける (図 4A1 'と 4 a 2 』)。
    注:(X) を作成するメタデータからタイムスタンプを使用して、または値を手動で。
    1. 前刺激フレーム 1-20 からグラフ作成プログラムで (F) 値を平均することによってそれぞれの投資収益率のベースライン (Fo) を定量化します。
    2. 各投資収益率 ΔF (F Fo) 値を作成する各の timepoint で (F) 値から (Fo) を減算します。Replot、希望する場合。
    3. 計算し、プロットの ΔF/Fo。(Fo) による ΔF 測定と replot を分割の各 ROI (数字 4A1 'と4 a 2')。

13 画像処理し時空のカルシウム信号の熱マップの表現

注:ゼブラフィッシュの側線有毛細胞カルシウム信号の空間の熱マップの表現を作成する前の仕事は、Matlab5,28で書かれたカスタム ソフトウェアを使用しています。この分析は、オープン ソースの解析ソフトウェア フィジー33の適応されています。以下のすべての手順にフィジーを使用します。StackReg および TurboReg フィージーのプラグイン必須 (材料の表を参照) があります。

  1. 12.1-12.1.3 個々 の Z スタックまたは単一平面時系列stk2と呼ばれる登録済みの substack を作成するための手順に従います。
  2. Stk2を使用すると、ベースライン イメージを作成できます。クリックして「画像」ドロップ ダウン メニューから「スタック」を選択し、「Z プロジェクト」を選択します。「投影型」の「平均強度」を選択し、、「開始スライス」と「20」「停止スライス」の「1」を入力します。
    注:この Z 投影がbaselineIMGと呼ばれます。
    1. 14 0.5 s ビン ビン 70 フレーム (F) 像 (stk2) が一時的。クリックして「画像」ドロップ ダウン メニューから「スタック」を選択、ドロップダウン ・ メニューから「ツール」を選択、「Z プロジェクトのグループ化」をクリックします。「投影法」として「平均強度」を選択し、「グループ サイズ」の 5 を入力
      注: このグループ化された Z 投影法があると呼ばれ、 stk2bin 図5 F。
    2. ΔF イメージ シーケンスを作成するビン分割 (F) イメージ シーケンス (stk2bin) から基準 (baselineIMG) のピクセル値を減算します。「プロセス」をクリックし、ドロップ ダウン メニューから「イメージ計算」を選択します。「Image2」として"Image1"としてstk2binとbaselineIMGを選択します。「操作」の「引く」を選択します。
      注:Stk2binBLと F BL と呼ばれますこの基準減算 Z-投影図5 ΔF を =。
  3. ΔF 動画像 (stk2binBL) を表示する選択したルックアップ テーブル (LUT) を選択します。クリックして「画像」ドロップ ダウン メニューから「参照テーブル」を選択、選択の LUT をクリックします。
    注:「赤ホット」は図 5で使用される LUT です。この基準減算 Z 投影 LUT とは、 stk2binBL LUTと ΔF図 5に LUT と呼ばれます。
    1. 最小 (min) とstk2binBL, LUTの最大 (max) の明るさの値を設定します。クリックして「画像」、「調整、」を選択し、「明るさ/コントラスト」をクリックします。Stk2binBL LUTからバック グラウンド ノイズを削除するための最小値を設定します。興味の信号を保持するが、信号の飽和を避けるために最大値を設定 [例えば、200 〜 1600 (12 ビットの画像強度範囲 = 0 に 4095)]。
      注:視覚的な比較や表現の際は、同じの最小値と最大値を使用します。ΔF 校正 LUT バーは、各 LUT イメージ シーケンス (例えば、 stk2binBL LUT) フィジーで生成できます。クリックして"Analyze"を「ツール」を選択し、、「校正バー」をクリックします。参考のため LUT 校正バーと独立した個々 のイメージを生成する「オーバーレイ」アイコンをクリックします。
    2. 両方の ΔF (stk2binBL, LUT) を変換LUTand 一時的ビン分割 (F) のイメージと (stk2bin) RGB のシーケンス。クリックして「イメージ」の「型」を選択し、、「RGB カラー」をクリックして
      注:Z 予測を RGB 変換があると呼ばれ、 stk2binBL LUT RGB stk2bin RGB、それぞれ。
  4. ビン分割 (F) 画像 (RGB stk2bin) の上に ΔF LUT 画像 (stk2binBL LUT RGB) をオーバーレイします。「プロセス」をクリックし、「イメージ計算」をクリックします。Image1 と Image2 としてstk2binBL LUT RGB stk2bin RGBを選択します。「操作」の「透明なゼロ」を選択します。
    注:あまりにも多くのノイズや ΔF LUT オーバーレイの背景がある、手順 13.3 分価値を増加します。彩度がある場合手順 13.3 と、最大値を増やします。

14. 画像フィジー マクロを使用して処理し時空の熱マップの表現

注:次のセクションは、GCaMP6s 信号の空間の熱マップの表現を自動的に作成する手順 13 に基づく LUToverlay と呼ばれるフィジー マクロを指します。この分析には、オープン ソースの解析ソフトウェア フィジー33と (材料の表を参照してください) StackReg および TurboReg フィージーのプラグインが必要です。

  1. このプロトコルを伴うフィジー LUT オーバーレイ マクロ (LUToverlay.ijm) をダウンロード (符号化する補足のファイルを参照してください)。
  2. 多面時系列または単一平面時系列 (手順 12.1 参照) を開きます。
  3. 「プラグイン」選択をクリックして「マクロ」"実行"をクリックして、LUToverlay マクロを選択します。テキストで、「教えて」画像の取得について] ダイアログ ボックスが表示されます。
    注:ダイアログ ボックスで、現在の数字は推奨値であり、実験者によって使用される設定に従って変更することができます。値は、ボックスに表示、以下 400 枚の画像と timepoint (手順 9) あたり 5 面多面時系列に対して設定されます。
  4. 「Timepoint あたり面の数」、後 timepoint あたり面の数を入力 (例えば、ステップ 12.1.1 複数面を使用して timepoint、あたり 5 面と 400 の時系列入力「5」)。単一の平面の取得 (例えば、手順 8)「1」を入力します。
    メモ: 投影 Z スタックで番号のイメージを参照する「縦長」多平面の時系列のため、残りのダイアログ ボックスで (例えば、これは 80 の縦長、ステップ 12.1.1)。
    1. 「を分析する範囲を定義」オプションを使用して、最初の 1 を削除画像シーケンスの s (例えば、ステップ 12.1.2 選択"11-80" の最初 10 のフレームと最初の 1 を削除する s)。
    2. ベースライン イメージを作成に使用する画像の番号を入力後「定義」を縦長のベースラインに、[例えば、ステップ 13.2。、"20"と入力前刺激画像 (11-30) を使用する]。
    3. 「一時的な bin ごと縦長」後画像をオーバーレイ bin 数を入力します。(例えば、ステップ 13.2.2。 14 0.5 s ビンを作成する選択"5")。
    4. 後「分強度」及び「最大強度」(最小) のバック グラウンド ノイズを削除し、彩度 (最大) を回避しながら興味の信号を保持する最小値と最大の明るさの値を入力します。
    5. 後「参照テーブルを選択」、オーバーレイの必要な LUT を選択します。「OK」をクリックします。
      注: マクロは 13 の手順で表示される指示に従って画像の分析を完了します。手順 13 で指示に従って名前もマクロによって生成された画像になります。
  5. 新しいイメージ シーケンスを処理する前に解析のすべてのウィンドウを閉じます。

Representative Results

Myo6b:GCaMP6s 後-・ カァシュ トランスジェニック魚が適切と流体ジェットの刺激が横ラインの有毛細胞に配信される、堅牢なカルシウム シグナル可視化することができます(図 4と5、ビニング X 2 で撮影) を測定します。流体噴流刺激中にカルシウム信号の MET チャンネルが刺激、または有毛細胞、シナプス前 Cav1.3 カルシウム チャネルが神経伝達をトリガー ベース応答で開く、頂髪束のいずれかを測定できます。個々 の neuromast にこれらの地域でのカルシウム応答の代表的な例は、図 4に示すA1 ・ A2 '。この例では、2 s 5 Hz 流体噴流刺激は代表的な neuromast 内のすべての有毛細胞をアクティブにするのに配信されました。髪束で刺激、中に堅牢なカルシウム シグナルを検出できる (図 4A1 A1 '、8 の髪束からの応答が表示されます)。このシステムでは、ほぼすべて成熟した有毛細胞はカルシウム5のこの根尖部の流入を表示します。対照的に、同じ neuromast 内検出カルシウム信号、シナプス基底面内にある有毛細胞のサブセット (~ 30%) のみ (図 4A2 A2 '、シナプス応答と 4 セルが表示されて)5。4 グリーン ・ ロワを細胞のない重要なシナプス カルシウム信号 (図 4A2 A2 ') 堅牢な頂カルシウム信号にもかかわらず (図 4A1 A1')。この代表的な例では (図 4A1 ・ A2 ')、色・ ロワ頂メトロポリタン面 (図 4A1) 髪束シナプス底面 (図 4A2) での細胞体と一致します。この例では、個々 の有毛細胞内外有毛細胞の集団の中で MET 依存とシナプス カルシウム信号のどのように両方を測定ことができますを強調表示します。

生 (F) GCaMP6s 強度または ΔF/Fo GCaMP6s 強度として両方の髪束と、前シナプスでカルシウム信号をグラフィカルにプロットできます (ステップ 12 を参照してくださいの数字 4A1'-A1 'と4 a 2'-A2 ')。(F) GaMP6s グラフをセルごとにベースラインの蛍光強度が異なることができます強調表示 (数字 4A1'と4 a 2 ')。ΔF/Fo GCaMP6s グラフで各セルがその基準値に正規化し、ベースラインからの相対強度変化のプロット (数字 4A1 'と4 a 2')。(F) で、ΔF/Fo GCaMP6s のプロット、頂髪束とシナプス前底面カルシウム信号刺激 (グレーのボックス) の発症を開始し、刺激終了後に指数関数的に減少します。刺激の中に毛束でカルシウム信号急速に上昇し、たわみ強度が変化しない場合を飽和させる (図 4A1 A1 ')。一方、シナプスの平面で検出可能なカルシウム シグナルと有毛細胞のサブセット内でカルシウム信号より徐々 に増加し、飽和の傾向が少ない (図 4A2 A2 ')。シナプス カルシウム信号 (緑 ROIs) なし有毛細胞のカルシウム信号のベースライン近くまま。

これらのグラフィカルな表現 (図 4)、に加えてカルシウム信号で視覚化できること空間的全体の neuromast 録音の時間のコースの中に。時空間表現の例、neuromast の底面にシナプス前の GCaMP6s 信号を図 5に示します。図 5、空間の可視化イメージ シーケンスを処理するための主な手順の手順 13 に記載されたとおりです。最初に、(F) GCaMP6s の raw 画像は、ビニング一時的 [図 5: 行 1 (14 箱の 5 が表示されます)。 ステップ 13.2.1]。前のフレーム (ステップ 13.2) から計算されるベースライン イメージを ΔF のイメージを取得する (F) GCaMP6s 蛍光信号から減算する、(図 5: 行 2; ステップ 13.2.2)。ΔF グレースケール画像、カラー LUT に変換されます次に、(図 5: 行 3、赤ホット LUT; ステップ 13.3)。刺激の間に、neuromast 内で時空間信号を明らかにするため一時的にビン分割 (F) 画像 (図 5、最初の行) に LUT 変換 ΔF 画像をオーバーレイする最後に、(図 5: 行 4; ステップ 13.4)。ΔF GCaMP6s 信号のヒート マップは、シングル ・ ロワ図 4のグラフからを解析するは容易ではない両方の貴重なの空間的で、一時的な情報を提供します。ヒート マップは、発症および全体の内部の有毛細胞の間でのタイミングと強度の差と同様に、各有毛細胞内カルシウム信号の期間に関する細胞内の情報を含む、重要な時空間情報の視覚化を助けることができます。neuromast。

グラフと空間の熱マップ真カルシウム信号を表すし、運動による成果物ではないことを確認することが重要です。このプロトコルでは運動の成果物は過剰なドリフトや幼虫や流体噴流刺激による運動の動きの結果をすることができます。すべてのこれらの成果物は、この体内の準備で完全に除去するために挑戦しています。像 (ステップ 12.1.3) の登録を修正することができます z 軸の過剰な運動に x 軸と y 軸、動画像の動きの大半を識別および分析から削除する必要があります。運動成果物がカルシウム信号をグラフを識別する最も簡単です。頂点での成果物を真の GCaMP6s 信号ではない GCaMP6s 強度の変更の例を観察できる (図 4B1'-B1 ') とベース (図 4C1'-C1') 有毛細胞の。

流体ジェットの刺激が強すぎると頂髪束で体動が一般的 (図 3A3 '')。これらの過度に強い刺激の中に頂髪束面は流体噴流刺激によるピント移動して刺激終了後元の焦点面に戻ることができます (図 4B1'-B ')。頂の MET 依存型カルシウム信号を正確に測定するは困難します。髪束運動の成果物の例は、図 4に見ることができるB1'-B1 '。ここでは、グラフが示すように刺激 (グレーのボックス) の中に GCaMP6s 信号の減少、髪束がアウト フォーカス。髪束元の位置に戻り、フォーカスに戻るとして刺激終了後 GCaMP6s 信号は急速に増加します。これは、図 4の例と対照的A1'-A1 '頂カルシウム信号が刺激の発症で増加し、減少刺激が終了したとき。

過剰な流体噴流刺激による運動は、ピント シナプスの平面を移動することも、モーションアーチファクトのこのタイプはこの面でより少なく共通。代わりに、動きや幼虫のドリフトによる z 軸の焦点の変化、動きの人工物の最も一般的な原因です。幼虫の動きやドリフトは、アペックスと有毛細胞のベースの両方で GCaMP6s の測定に影響を与えます。刺激の中に、シナプス基底面内 GCaMP6s が増加幼虫の運動の一例は図 4に示すC'-C '。成果物の動き (図 4C1'-C1 ') 真のシナプス前信号から識別することができます (図 4A2'-A2') GCaMP6s 信号の時間的経過を調べることによって。増加と刺激と指数関数的に減少させるのではなく (図 4A2'-A2 ')、GCaMP6s 信号の動きによる増加がある正方形の形状し上昇、発症と刺激、(それぞれのオフセットが急激に低下図 4C1'-C1 ')。

GCaMP6s 信号の時間的経過の注意深い考察の結果に加えて薬理学を用いた制御実験は運動の成果物から真の GCaMP6s 信号を区別するために使用できます。たとえば、これら (手順 10) は、毛束の MET チャネル機能に必要なヒント リンクを切断に適用できます。これらは、Cav1.3 チャネルを介して後続の基底、シナプス前のカルシウム流入と同様、両方の頂 MET チャネル依存性カルシウム流入の流体ジェット誘発を排除する必要があります。真の刺激誘発カルシウム信号の代表的な例では (図 4A1 ・ A2 ') 流体噴流刺激時 GCaMP6s 蛍光樹状突起と基底の両方の面でのすべての変更は、これら治療後ふるい落とされるでしょう。対照的に示すようなモーションによる GCaMP6s 蛍光の変化の数字・ 4b1 型 '-B1'と4 C 1' C1 'これら治療しても消えないでしょう。

すべての刺激誘発 GCaMP6s 信号を除去するためにこれらを使用して、に加えて isradipine を適用ことができます (手順 11) 特に頂 MET-チャンネル依存性カルシウムを残しながらシナプス底面で Cav1.3 依存性カルシウム流入をブロックするには流入そのまま5。頂髪束 GCaMP6s 蛍光性のない運動の成果物との個々 の neuromast の isradipine のアプリケーションを変更した後 (図 4A1'-A1 ') 流体ジェットの刺激の間になる変更された、すべてのシナプス GCaMP6s 中基地での蛍光変化がふるい落とされるでしょう (図 4A2'-A2 ')。Isradipine アプリケーションの後シナプスの平面における GCaMP6s 信号の変更 (例えば,図 4C1 C1 ') 運動の成果物に対応する可能性が高い。

Figure 1
図 1: 横ライン neuromast と機能イメージング平面の概要。(A)左図 4 有毛細胞体 (ブラック) 接触求心性ニューロンはシナプス (青) と neuromast の側面図を示しています。リボン (緑) は、各セル内のシナプス前のアクティブなサイトで小胞をテザーします。根尖部各細胞体からは、MET のチャンネルが含まれる不動 (1 μ m) のバンドルです。各毛束が 1 つの運動毛の髪束のベースに水の動きの機械力を転送します。右の図は、上から見下ろすビューの同じモデルを示しています。このトップダウン ビューで黒を使用して、左側の図の 4 つのセルを指定し、グレーは、neuromast の他のセルを示すために使用します。このモデルとこれらの 2 つのビューは、3 つの重要な面が強調表示されます: (1) 髪の束 (kinocilia) 髪束たわみ、カルシウムが細胞に入る毛束の根元 (2) 頂 MET 平面の大きさを定量化するために使用のヒント刺激と (3) の間にシナプス シナプス リボンの近くにカルシウムが入っているセルの基地で飛行機。(B1 B1')MET 形づくり依存性カルシウム信号を記録できる、髪束の基地で飛行機の DIC と GCaMP6s トップダウンの画像。(B2 B2')B1 B1 と同じ neuromast から DIC と GCaMP6s のトップダウンの画像 '、前シナプス カルシウム信号を検出できるシナプス面内 neuromast のベースで。(C1 C2)幼虫が正しくマウントされている GCaMP6s を表現する neuromast の画像。この例では、頂の MET 平面 (C1) とシナプス平面 (C2) セルの基地では最適な角度で配置されます。この位置が単一の平面にイメージを作成するすべての髪束を許可せず、多くより撮像面はすべてシナプス B1 B2 と比較してこの neuromast 内でアクティビティをキャプチャに必要な '。画像は、5 dpf の幼虫です。C2 のスケール バーは、B1 C2 のすべての画像に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 商工会議所、ゼブラフィッシュの取り付けと心注入のプロシージャ、および針をイメージングします。(A)表示はシリコーン封止材の上にセンターに固定 (破線の四角形で記載) 幼虫とイメージング室。(B1)示されている 5 dpf 幼虫は 2 つのピンで固定します。大きい頭ピン目にちょうど後部ボディに垂直に表示されます。2 つ目は底目完全上部の目によって隠されているので完全に重ね合わせます。小さな尾のピンには、尾の脊索が交差しています。幼虫が平らでなくツイストです。(B2)幼虫を麻痺させる心の注射針は体に対して垂直に配向させ、中心部に隣接します。心の注射針は、色素細胞、心の前にお問い合わせください。(B2')皮膚に針のうつ病の原因、心の前に色素細胞のインデント。(C)左から右へ順に針: 約 3 μ m の開口部をもつ心注射針の例約 50 μ m の開口部をもつ良い流体ジェット針の例悪い壊れた流体ジェット針が大きくてギザギザと可能性が生産過剰と不規則な刺激の例です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 流体ジェットの位置合わせ、配置、および刺激の校正。(A1)表示は左にヘッドの向きと右に尾を持つ指向幼虫で、流体ジェット針指向ゼブラフィッシュ体 A P 軸に平行に。オイカワ前方 (プッシュ/圧力) に応答を刺激するためにこの液ジェット針を配置、後方 (プル/真空) 監督流体。(A2)表示です (白の破線で記載) neuromast と左側に頂髪束 (kinocilia) のヒント、パネルとパネルの右側にある流体ジェット針流体ジェットは、neuromast の端から約 100 μ m 位置指定です。(A3 ・ A3 ' ')頂髪束 (kinocilia) のヒントは、流体噴流刺激の圧力を変化させることにより偏向距離別です。1.5 μ m の単一 kinocilial 先端の軌道が表示されます (A3') と 5 μ m (A3 ') 偏向距離。黒い円は、毛の安静時の位置を示します。Kinocilia はあまり偏向しない、それ以外の場合刺激強度は確実に定量化することはできません、有害になることが重要だ (A3 ' ')。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 頂に会ったと横ラインの有毛細胞の流体噴流刺激中に基底のシナプス前 GCaMP6s 信号。(A1 ・ A2 ')代表 neuromast 内流体噴流刺激時の GCaMP6s の強度の変化。左上の画像は、頂の MET 平面 (A1) と同じ neuromast 内の基底のシナプス平面 (A2) を表示します。A1 と A2 の Roi 色分けは、(F) の時間経過と各画像の右に ΔF/F GCaMP6s 強度グラフのプロットに使用されました。(B1 B1 ')流体ジェットの刺激の間の余分な動きを頂の MET 画像シーケンスの例です。(B1) 左の画像は、(F) のプロットと右側に ΔF/F GCaMP6s 強度グラフに使用・ ロワを示しています。(C1 C1 ')シナプス底面の画像シーケンスの GCaMP6s ショー アーチファクト信号真のカルシウムではない変更の例を示します。(C1) 左の画像は、(F) のプロットと右側に ΔF/F GCaMP6s 強度グラフに使用・ ロワを示しています。各グラフの灰色のボックスは、各画像のシーケンス中に流体ジェットの刺激の持続時間を表します。2 s 5 Hz 流体噴流刺激は A1 ・ A2 の例で使用された「と B1 B1」.C1 C1 で '、2 s 前方ステップ刺激が使用されました。(F) GCaMP6s グラフの Y 軸は、フィジーのイメージの強度の測定から得られる任意の単位 (A.U.) を示しています。すべての例は、4-5 dpf で幼虫からです。スケール バーすべてのイメージの 5 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 流体噴流刺激中のシナプス前の GCaMP6s 信号の時空間可視化。Neuromast 内で GCaMP6s の強度の刺激の中に時空の変化を可視化するための手順のとおりです。時間は、画像の上部にタイムスタンプに従って右に左から表されます。一番上の行は、70 フレーム GCaMP6s (F) の像 (ステップ 13.2.1) から 14 時間箱の 5 を示しています。2 番目の行では、ベースライン (ステップ 13.2) ΔF 画像 (ステップ 13.2.2) を作成するそれぞれの (F) GCaMP6s ビン分割イメージから取り外されました。3 番目の行で ΔF イメージは、グレースケールから変換されている (2 列目) 赤ホット LUT (ステップ 13.3) します。Min と max のこれらの LUT のイメージは、ΔF の相対的な強度 (A.U.) (ステップ 13.3.1) 右側の赤いホット LUT ヒート マップに従って設定されます。最下行の 3 番目の行を (ステップ 13.4) の最上位の行 (F) 画像にオーバーレイされています。図の上部にある灰色のバーは、2 s 5 Hz 流体噴流刺激のタイミングを示します。例 5 dpf 幼虫からです。ΔF の相対的な強度 (A.U.) の赤ホット LUT ヒート マップの凡例が右に表示されます。スケール バーすべてのイメージの 5 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

そのまま動物の生体内イメージングは本質的に困難です。この方法のいくつかの手順は、信頼性の高い体内側線有毛細胞からのカルシウム測定値を得る重要なです。たとえば、幼虫を固定するか、イメージング画像中の動きを最小限にする前に適切に麻痺して、非常に重要です。真の信号ではなく、カルシウム レベルの変化に対応していない GCaMP6s 蛍光イメージング中に過剰な運動できます変更につながる (例えば、数字・ 4b1 型 '-B1'と4 C 1' C1 ')。これより後方のオイカワにアクセスできなく可能性があります、動きを最小限に抑えるために、前方から詳細尾ピンを配置できます。さらに、心臓注入後ピンを回転ピンの水平部分の向こう、卵黄、できます。ピンの位置の変更、に加えてそれはまた幼虫34を固定するピンの代わりに脳スライスのハープを使用することが可能。幼虫を適切に配置するハープが追加、潜在的に幼虫を固定の侵襲的な方法以下です。重要な動きは不十分な固定から発生する可能性、α-ブンガロトキシン部位を提供し幼虫を麻痺させる心注入を正しく実行する失敗が不完全な麻痺、運動で起因し、最終的に成果物を運動します。ゼブラフィッシュの有毛細胞の興奮性に影響を与える一般的に使用される麻酔薬が示されているが、最近の仕事は麻酔ベンゾカインが有毛細胞の活動の多くの側面に干渉しないを示しています。同様に、よく使われる麻酔薬 MS 222 有毛細胞活動15の特定の側面と干渉します。したがって、α-ブンガロトキシン部位注入の挑戦的な性質のためベンゾカインまたは MS 222 アプリケーションになるかもしれない機能カルシウム イメージング中に幼虫の動きを防ぐために麻痺の有用な代替方法です。

このプロトコルに関連する技術的な課題に加えても完全にマウントされたサンプルは幼虫と有毛細胞は、前に、各イメージング実験中に健康ではない場合は無意味です。幼虫と有毛細胞が正常であることを確認、絨毛 (卵の殻)、廃棄物、微生物などの破片の自由である E3 バッファーの幼虫が維持されていることが重要です。横ラインの有毛細胞の表面的な位置はイメージングのため有利であるが、この場所それらが細胞の損傷を受けやすい場合 E3 バッファーをファウルします。きれいな水環境が若齢幼虫 (2-4 dpf) にとって特に重要なまたは直立したスイミングを維持できない変異体を置き、主にペトリ皿の底に横たわる。これらの状況で、横ラインの有毛細胞と髪束を囲む保護クプラ簡単に妥協になることができます。健康的な幼虫と各実験の過程での有毛細胞で始まる場合でも、幼虫がハートビートおよび急速な血流であることを確認する重要です。血流が低下または停止する有毛細胞の健康が危険にさらさなっています。不健康な幼虫や血流の損失を含む妥協の準備、有毛細胞を死を識別するいくつかの方法: まず、病変が拡がったまたは DIC 光学素子の下のセル内のバブルとして現れる核凝縮の出現によって第二に、セルの縮小と高速移動; 細胞質内粒子の存在でそして第三に、kinocilia のヒントが異なる方向35で腰掛けるとき。、毛束が中断されたとき、スプレイ kinocilia が刺激の中にまとめて一緒に移動しません。

この準備は、1 つは、準備だけが堅調が確立された後の 1-3 時間のいくつかのマイナーな制限をしています。幼虫を動けなくハープの小さいピンまたは脳スライスを使用してなどの変更とこの体内準備の有効期限の延長が灌流システムを追加します。別の制限は、退色、光毒性は、イメージング試験を繰り返した後に発生する可能性が。このような課題を克服するために 1 つのエキサイティングな方法は、光シート顕微鏡のこのプロトコルを適応することです。光シート顕微鏡は、36以下の退色、光毒性につながる焦点光を軽減する強力な方法です。一緒に、穏やかな固定化と以下の写真の露出を助けるかもしれない各撮像セッションを延長します。もはやイメージング セッションを使用して、開発および基本的な有毛細胞のクリアランスと損傷後の再生プロセスに伴う機能変化の全期間を確認できます。それは、光シート顕微鏡に加えてこのプロトコルに適合できる他型共焦点システム (ポイントのスキャン、2 光子とスピニング ディスク) だけでなく、比較的簡単な広視野システム28,34 を指摘することが重要.全体的にみて、その多様性は、このプロトコルの適応および複数の撮像システムで使用できる貴重なツールになります。

このプロトコルの適応および多くのイメージング システムを使用できますが、このプロトコルの部分も適応し、(1) GCaMP6s のほか、(2) 他の感覚的な細胞およびゼブラフィッシュ稚魚内のニューロンのイメージ活動に、他のインジケーターと共に使用できます。たとえば、以前の研究では、膜、膜電位 (Bongwoori)、小胞の融合 (SypHy) ゾル性細胞質カルシウム (RGECO1) を検出する側線有毛細胞内複数の遺伝的コード化の指標を使用してイメージの活動にこのプロトコルが使用(jRCaMP1a ・ カァシュと GCaMP6s ・ カァシュ) カルシウムと膜カルシウム (GCaMP6s ・ カァシュ)5を検出する側線求心性プロセス内で。これらの指標を使用して我々 の経験に基づいて、Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) はこのプロトコルで記述されている形質転換線は側線オイカワのイメージングのための素晴らしいスタートをご利用いただけます。すべての指標は、上記の我々 は GCaMP6s が最も敏感なあることを発見しました。2 つの測定値に使用できるため、これらの機能に加えて、我々 は Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) トランスジェニック行を強調表示: 有毛細胞の形づくりとトランスジェニック一行内のシナプス前のカルシウム。

この資料に記載されているテクニックは、ゼブラフィッシュの側線でカルシウム イメージングがネイティブな環境で有毛細胞がどの機能を研究する強力な方法をすることができますどのようにについて説明します。このアプローチは、有毛細胞の機能がex vivo植で勉強現在の哺乳類の研究を補完するものです。さらに、ゼブラフィッシュ モデルは哺乳類の有毛細胞の活動を調べるに適用することができます遺伝的コード化の指標の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用する続行できます。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、NIH/NIDCD 学内研究資金 1ZIADC000085-01 (K.S.K.) によって支えられました。フィジー マクロを記述で彼女の援助のキャンディ ウォンを認識したいと思います。プロトコルとその有用な提案のドリス ・呉とキャンディ ・ ウォンに感謝したいと思いますも。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

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References

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神経科学、問題 141、ゼブラフィッシュ、カルシウム イメージング、共焦点レーザー顕微鏡、生体内イメージング、有毛細胞、感覚神経、側線、遺伝的指標、GCaMP をエンコード
ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング
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Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

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