Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В естественных условиях кальция изображений боковой линии клетки волос в личиночной данио рерио

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794
Automatic Translation
1,2, 1
1Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

Данио рерио является модель системы, которая имеет множество ценных функций, включая оптической прозрачностью, быстрое развитие внешних и особое значение в области слуха и равновесия, внешне расположен Сензорные клетки волос. Эта статья конспектирует как трансгенных у рыбок данио могут использоваться для анализа волос клеточной mechanosensation и Пресинаптический функции в полном объеме.

Abstract

Сензорные клетки волос являются механорецепторов в внутреннего уха, которые требуются для слуха и равновесия. Волосковые клетки активируются в ответ на сензорных стимулах, которые механически отвлечь апикальной выступы под названием пучки волос. Прогиб открывает mechanotransduction (МЭТ) каналы в пучки волос, привело к притоку катионов, включая кальция. Этот приток катион depolarizes ячейку и открывает напряжения закрытый кальциевых каналов, basally расположен в presynapse волос клеток. В млекопитающих клетки волос помещены в кости, и это сложно оценить функционально эти мероприятия в естественных условиях. В отличие от личинок данио рерио являются прозрачными и обладают внешне находится орган боковой линии, содержащий волосковых клеток. Эти клетки волос структурно и функционально похожи на млекопитающих волосковых клеток и могут быть оценены функционально в естественных условиях. Эта статья конспектирует техника, которая использует генетически закодированный кальция индикатор (ГЕЧИ), GCaMP6s, чтобы измерить стимул вызвала кальция сигналов в zebrafish боковой линии волосковых клеток. GCaMP6s может использоваться, наряду с конфокальный изображений, для измерения сигналов в естественных условиях кальция на вершине и базы боковой линии волосковых клеток. Эти сигналы обеспечивают в реальном времени, количественной индикации обеих mechanosensation - и presynapse зависимой кальция мероприятий в рамках этих волосковых клеток. Эти сигналы кальция также обеспечить важную функциональную информацию о как клетки волос обнаруживать и передавать сенсорные стимулы. В целом, этот метод создает полезные данные о относительные изменения в активности кальция в естественных условиях. Это менее хорошо подходит для количественного определения масштабов абсолютной кальция изменений. Эта техника в естественных условиях чувствителен к артефакты движения. Разумное количество практики и навыки требуются для правильного позиционирования, иммобилизации и стимуляции личинок. В конечном итоге когда должным образом выполнены, протокола, изложенные в этой статье предоставляет мощный способ собрать ценную информацию о деятельности клетки волос в их естественной, полностью интегрированный государствах в рамках живое животное.

Introduction

Функциональные кальция изображений является мощным инструментом, который может использоваться для мониторинга активности многих клеток одновременно1. В частности кальция изображений с использованием показателей генетически закодированный кальция (GECIs) было показано, быть выгодно, потому что GECIs может быть выражен в конкретных клеток и локализованные subcellularly2. В неврологии исследования эти функции сделали кальция изображений с помощью GECIs мощный метод определения активности шаблонов в нейрональных сетей и измерить приток кальция в отдельных синапсы3,4. Воспользовавшись этими функциями, недавнее исследование используется confocal микроскопии и GECIs для мониторинга субцеллюлярные деятельность в пределах коллекции Сензорные клетки волос5.

Волосковые клетки являются механорецепторов, которые обнаруживают звука и вестибулярные раздражителей в местные воды движения и внутреннего уха в системе боковой линии в водной vetebrates6,7. Клетки волос часто являются объектом повреждения или генетических мутаций, которые приводят к наиболее распространенной формой потери слуха у людей, известный как Нейросенсорная слуха потери8,9. Таким образом важно, чтобы понять, как эти клетки функции для того, чтобы понять, как для лечения и предотвращения потери слуха. Чтобы правильно функционировать, клетки волос используют две специализированные структуры под названием mechanosensory волосы связок и синаптической ленты для выявления и передачи раздражители, соответственно. Пучки волос расположены на вершине волосковых клеток и состоят главным образом из тонкой, волос как выступы, известный как stereocilia (рис. 1А). В вестибулярных и боковой линии клетки волос каждый пучок волос также имеет один длинный kinocilium (клетки только истинный ресничку), который может длиться намного выше stereocilia (рис. 1А). Mechanosensory раздражителей отклоняют пучки волос, и прогиб ставит напряженность на связях, под названием «Совет ссылки», что соединительный stereocilia10. Эта напряженность открывает каналы mechanotransduction (МЭТ), расположенный в stereocilia, что приводит к апикальной приток катионов, включая кальция11,12. Эта апикальной деятельность в конечном итоге depolarizes клетки волос и открывает напряжения закрытый кальциевых каналов (Cav1.3) на базе ячейки. CAv1.3 каналы находятся рядом с синаптической ленты, структуру Пресинаптический тросов везикулы в активных зон. Базальные кальция приток через каналыv1.3 Ca является обязательным для сплавливание vesicle, синапсах и активации афферентные нейроны13,14.

На протяжении многих лет, электрофизиологические методы, такие как поклеточного патч зажима были использованы для зонда функциональные свойства волосковых клеток многих видов, в том числе данио рерио15,16,17, 18,19,20. Эти электрофизиологических записи были особенно ценным в полях слуха и равновесия, потому что они могут использоваться для получения чрезвычайно чувствительных измерения от отдельных Сензорные клетки, целью которых является кодирования очень быстро раздражителей над широкий спектр частоты и интенсивности21,22. К сожалению записей поклеточного нельзя измерить активность населения волосковых клеток. Для изучения деятельности популяции клеток в боковой линии данио рерио, микрофонной потенциалов и афферентные потенциалы действия были использованы для измерения суммарного mechanosensitive и постсинаптического ответа свойства отдельных neuromasts23 ,24. К сожалению записей поклеточного ни потенциал местных полевых измерений имеют пространственное разрешение, чтобы определить, где происходит в отдельных ячейках или измерить активность каждой ячейки в рамках населения деятельность. Совсем недавно чтобы обойти эти проблемы25,26были использованы кальция красителей и GECIs.

В данио рерио GECIs доказали мощный подход для изучения функции волос клеток за счет относительной легкости создания трансгенных данио рерио и оптической прозрачностью личинки27. В zebrafish личинки волосковые клетки присутствуют в внутреннего уха, а также системы боковой линии. Боковая линия состоит из розетки как кластеры волосы клеток, называемых neuromasts, которые используются для выявления местных изменений в движение воды (рис. 1). Боковая линия особенно полезен, так как он расположен снаружи вдоль поверхности рыбы. Этот доступ позволило стимулировать клетки волос и измерения сигналов кальция оптически в неповрежденной личинки. В целом простота трансгенез, прозрачность личинок и беспрецедентный доступ к боковой линии клетки волос сделали данио рерио бесценный модель для изучения активности клетки волос в естественных условиях. Это значительное преимущество по сравнению с mammalian системами, в которых клетки волос окружены костных структур внутреннего уха. Это отсутствие доступа сделал очень трудно приобрести функциональные в естественных условиях измерений mammalian клеток волос.

Протокол, изложенные здесь описывается контролировать изменения канала - и presynapse зависимой встретился в кальция в отдельные клетки волос и среди клеток в neuromasts в личиночной данио рерио. Этот протокол использует установленные трансгенных данио рерио линии, которая выражает мембраны локализованных GCaMP6s под контролем волос клеток конкретных myosin6b промоутер28. Эта мембрана локализации позиции GCaMP6s для обнаружения приток кальция через каналы иона расположен в плазматической мембраны, которые являются критическими для волос клеточной функции. Например, локализованные мембраны GCaMP6s можно обнаружить кальция приток через ВСТРЕТИЛ каналы в апикальной волосы связок и через CaV1.3 возле синаптических ленты на базе ячейки. Это контрастирует с использованием GECIs, локализованные в цитозоле, как цитозольной GECIs обнаружить сигналы кальция, которые являются сочетанием встретились и CaV1.3 канала активности, а также кальция взносы из других источников (например,, магазин релиз). Этот протокол описывается иммобилизации и парализовать трансгенных личинки GCaMP6s до изображений. Он затем описывается, как подготовить и использовать жидкость jet отвлечь пучки волос для стимулирования боковой линии клетки волос в основе управляемой и воспроизводимость. Представлены репрезентативных данных, которые могут быть достигнуты с помощью этого протокола. Также представлены примеры данных, которые представляют собой движение артефакты. Описаны управления экспериментов, которые используются для проверки результатов и исключить артефакты. И наконец описан метод для визуализации пространственных кальция сигналов в Фиджи программного обеспечения. Этот анализ Фиджи приспособлен от ранее установленных визуализации методов, разработанных с использованием MATLAB5. В целом этот протокол описывает мощный подготовка техника, которая использует GECIs в личиночной данио рерио измерения и визуализации динамики кальция волос клеток в естественных условиях.

Protocol

Все животные работы был одобрен Комитетом использования животных в национальных институтов здравоохранения протоколом исследования животных #1362-13.

Примечание: Этот протокол занимает приблизительно 0,5 – 1 h завершить без перерывов, если решения и оборудование готовятся и настроить заранее. Этот протокол оптимизирован для Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 данио рерио личинок на 3-7 дней после оплодотворения (dpf). Это трансгенные линии выражает GCaMP6s мембраны локализованы (кодон оптимизированный данио рерио) конкретно во всех клетках данио рерио волос. До обработки изображений, личинки выращиваются в буфере эмбриона (E3), при стандартных условиях. Обратитесь к Таблице материалы для чисел каталог всего оборудования и лекарств, необходимых для выполнения этого протокола.

1. Подготовка решений

  1. Готовим 1 мл α-bungarotoxin (125 мкм), который используется для парализовать данио рерио личинки во время функционального изображений.
    1. Добавьте 968.6 мкл сверхчистого стерильной водой и 33.4 мкл фенола красного до 1 мг α-bungarotoxin (вся бутылка). Сделать 100 мкл аликвоты и хранить их при-20 ° C.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Надевайте перчатки и подготовку в капюшоне при обработке α-bungarotoxin порошок. Перчатки, также рекомендуется при обработке α-bungarotoxin раствор.
  2. Подготовка 1 Л 60 x эмбриона буфера (E3).
    1. Добавьте 17,2 г NaCl и 0.76 г KCl порошка 954.4 мл ультрачистая вода.
    2. Добавьте в решение 19,8 мл CaCl 1 М2, 19,8 мл 1 М MgSO4и 6 мл 1 М HEPES буфера. Магазин 60 x E3 Стоковый раствор при температуре 4 ° C на срок до 6 месяцев.
  3. Подготовка 10 L 1 x E3 (5 мм NaCl; 0.17 мм KCl; 0,33 мм CaCl20,33 мм MgSO4, рН 7,2), которая представляет собой решение, личинки распространяются в до функциональной томографии.
    1. Добавьте 167 мл 60 x E3 Стоковый раствор до 10 Л ультрачистая вода для получения 1 x E3 решения. Хранение 1 x E3 раствора при комнатной температуре (RT) на срок до 6 месяцев.
  4. Подготовьте нейрональных буфера (NB) (140 мм NaCl; 2 мм KCl 2 мм CaCl2; 1 мм MgCl2; 10 мм HEPES буфера, рН 7.3), который используется для погружать личинки во время функционального изображений.
    Примечание: 1 x E3 может также использоваться для функциональной томографии, но ответы более прочной и надежной в NB.
    1. Объединить 28 мл 5 М NaCl, 2 мл 1 м KCl, 2 мл, 1 мл 1 1 М CaCl2, M MgCl2и 10 мл с 957 мл ультрачистая вода 1 M HEPES буфера. Принести рН 7.3 с 1 M NaOH.
    2. Фильтр стерилизовать. Хранить при 4 ° C до 1 месяца.
      Примечание: Принести RT перед использованием решения.
  5. Подготовьте складе MS-222 (tricaine, 0,4%), который используется для анестезировать личинки.
    1. Растворите 400 мг, 3-аминобензоат этиловый метансульфонат соли и 800 мг Na2HPO4 в 100 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7. Хранить при 4 ° C.
    2. Используйте 0,04% MS-222 чтобы анестезировать личинки во время инъекции иммобилизации и α-bungarotoxin.

2. Подготовка изображений камеры и контакты

  1. Подготовьте тепловизионные камеры(рис. 2). Нанесите тонкий слой высокого вакуума Силиконовая смазка в нижней части камеры перфузии по краям площади, к которому присоединятся coverslip. Не оставляйте пробелы в смазку. Твердо надавите по краям coverslip для герметизации тепловизионной камере. Протрите от избыточного жира.
    Примечание: Для смазки приложения рекомендуется 5 мл шприц с наконечником микропипеткой 200 мкл.
  2. Подготовьте силиконовым герметиком для заполнения камеры. Соотношение 10:1 (по весу) базы отвердителя. Смесь тщательно, но осторожно, используя кончик микропипеткой для создания минимальной пузыри.
    1. Залейте силиконовым герметиком на крепятся coverslip, так что это уровне с поверхностью камеры. Приблизительно 3 g герметиком будет заполнить камеры.
    2. Тщательно коснитесь палата по ровной поверхности, сохраняя горизонтальные, или использовать кончик микропипеткой (под стереомикроскопом) для удаления или тянут пузырьков на край камеры.
    3. Место палата в лаборатории печь на ночь в 60-70 ° C. Место камеры внутри коробки вентилируемом, чтобы обеспечить, что горячий воздух не дует прямо на герметиком, чтобы избежать, создавая рябь.
  3. Используйте тонкой щипцы и Вольфрам проволока моды ПИН, используемый для иммобилизации личинок через голову и хвост (Рисунок 2В1) на взрывозащищенные герметиком.
    1. Чтобы сделать голову булавки, держите кусок 0,035 мм Вольфрамные проволоки в одной руке под стереомикроскопом. С помощью тонкой щипцы с другой стороны, согните проволоку 1 мм до конца на 90°. Обмен щипцы для тонкой ножницы и вырезать 1 мм после изгиба для создания ПИН-кода.
    2. Повторите шаг 2.3.1, используя 0,025 мм проволоки сделать хвост булавки, но оставить 0,5 мм проволоки по обе стороны от сгиба. Используйте щипцы для вставки булавки в закаленной герметиком на камеру (для хранения).

3. Подготовка игл паралич и стимуляции

  1. Подготовка сердца инъекций иглами с использованием стеклянных капилляров с нити. Вытяните иглы с внутренний наконечник диаметром 1-3 мкм (рис. 2C).
  2. Подготовьте жидкость Джет иглы с помощью стеклянных капилляров без нити накала. Вытащите иголки с тонкие, длинные кончиком, что может быть нарушена правильный наконечник диаметром.
    1. Отломить кончик тонкие, длинные иглы жидкость Джет, потерев его перпендикулярно против другой жидкости Джет иглы или керамическая плитка чуть выше где кончик иглы могут быть согнуты создать внутренний наконечник диаметром 30-50 мкм [Рисунок 2C (средний изображение) и Рисунок 3 A2]. Убедитесь, что перерыв даже через наконечник (рис. 2C, среднего изображения) и не зазубренные или даже слишком большой (рис. 2C, правое изображение) чтобы гарантировать и точной жидкости потока во время стимуляции волос клеток.
      Примечание: Полировщик игла может использоваться для Исправление зазубренных перерывы.

4. закрепление и иммобилизирующие личинок для изображений камеры

  1. Искупайте Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) личинка в приблизительно 1 мл E3 буфер, содержащий 0,04% MS-222 для 1 – 2 мин на поверхности силиконовым герметиком тепловизионные камеры до тех пор, пока личинка становится неподвижным или не отвечает на ощупь.
    1. Под стереомикроскопом положение личинка в центре камеры перфузии, так что он лежит плашмя на его стороне против силиконовым герметиком.
      Примечание: Для обеспечения согласованности всегда монтировать личинок на той же стороне (например, правая сторона вниз, слева вверх) (B1Рисунок 2).
  2. С помощью тонкой щипцы, принести 0,035 мм Глава pin вниз перпендикуляр личинка и камеры. Вставьте штырь голову между глазом и слуховой пузырек и вниз в герметиком (цифры 2Б1 и 2B2). Используйте второй набор щипцов для стабилизации личинка вдоль его дорсальной и вентральной стороне во время закрепления. Обеспечить горизонтальную частью pin контакты личинка и всю дорогу не надавите герметиком. Вентрально, угол pin (B1Рисунок 2) или слегка указывающую передней рыбы, чтобы избежать вмешательства с последующим сердца инъекций и волос-клеток.
    1. С помощью щипцов, вставьте штифт хвост 0,025 мм в хорда как можно ближе к концу хвоста (B1Рисунок 2).
      Примечание: Будьте осторожны избежать растяжения личинка. PIN-код плоская личинка. Глаза должны быть наложены (B1Рисунок 2). Это очень важно для удобства сердце инъекции (Рисунок 2B2-B2', шаг 5), содействия желательным изображений плоскости (рис. 1B1-B2'', шаги 8 и 9) и количественного определения интенсивности стимула жидкость jet ( Рисунок 3A3, шаг 7).

5. инъекции α-Bungarotoxin в полость сердца, чтобы парализовать личинка

Примечание: Надевайте перчатки при обращении с α-bungarotoxin.

  1. Центрифуга Алиготе α-bungarotoxin, кратко перед использованием для предотвращения засорения сердце инъекционной иглы.
    1. Засыпки 3 мкл раствора α-bungarotoxin в сердце инъекционной иглы с помощью геля загрузки наконечник пипетки. Загрузите решение равномерно до кончика без пузырей.
    2. Вставьте иглу сердце в пипетку держатель придает ручной микроманипулятор. Под стереомикроскопом положение иглы, так это соответствие перпендикулярно оси A-P закрепленного и осознающие личинок, указывая вниз под углом 30°.
    3. Подключите держателя пипеткой инжектор давление. Применить следующие предлагаемые параметры: Pinjection = 100 гПа, tinjection = 0,5 s и Pcompensation = 5 гПа. Inject болюс в решение проверить кончик иглы патент.
    4. Ищите небольшой дымок Красного раствора (от фенола красного) оставить кончик иглы. Если видели не красный цвет, очень мягко скрести кончик иглы против краю PIN-код и попробуйте снова до тех пор, пока игла патент. Кроме того Вытащите иглу с более крупное отверстие подсказка.
  2. Заранее иглу к сердцу, до тех пор, пока он касается кожи вне сердца (Рисунок 2B2). Вставьте иглу в личинка и искать отступы ячейки пигмент на коже перед сердца, чтобы обеспечить, что игла располагается в правильные плоскости относительно личинка (Рисунок 2B2').
    1. Заранее иглу далее, до тех пор, пока он пронзает кожу и входит в полости сердца. Вытяните иглу обратно слегка. Inject болюс α-bungarotoxin в полости сердца. Посмотрите на инфляцию в полость сердца или для красного красителя, проникновения в полость.
  3. Осторожно промывайте личинка 3 раза с 1 мл раствора NB для удаления остаточного MS-222. Никогда не удаляйте все жидкости. Поддерживать личинка в приблизительно 1 мл NB в камере перфузии.
    Примечание: Убедитесь, что личиночной сердцебиение и потока крови остаются надежные после закрепления и сердце инъекции и на протяжении всего эксперимента изображений.

6. Подготовка микроскоп и жидкости реактивные установки

  1. Соберите вертикально конфокального микроскопа, с использованием компонентов, описанных в Таблице материалы: конфокального микроскопа с 488 нм лазер и соответствующие фильтры, Микроскоп программное обеспечение для контроля и координации изображений и стимуляции, 10 x воздуха Цель, 60 x воды цель, цель сканера пьезо Z (для z стеки), высокоскоростной камеры, круговой камере адаптер, моторизованные стадии и стадии вставить адаптер. Обратитесь к Zhang et al.29 для дополнительных опций и указания на Микроскоп установок.
  2. Соберите жидкости струя, состоящий из 3 основных компонентов: вакуум и давление насоса, высокоскоростной давления зажима и главный этап (также описаны в таблице материалов). Используйте зажим высокоскоростной давления для контролировать сроки и продолжительность разгрузки давления или вакуума из стадии головы и в дозатор жидкости jet.
    1. Соедините выход этапа головки дозаторов жидкости Джет держателя через трубы толстостенные силиконовые.

7. Выравнивание личинки и жидкости jet

Примечание: Есть 3 самолетов интерес внутри каждого neuromast: (1) советы пучки волос (Рисунок 3A3: kinocilia, используется для измерения интенсивности стимула); (2) плоскости ВСТРЕТИЛ волос пакет (Рисунок 1B1-B1': база апикальной волосы связок, где ВСТРЕТИЛ канал зависимой кальция сигналы обнаружены); и (3) синаптических плоскости (рис. 1B2-B2': где Пресинаптический кальция сигналы обнаруживаются на базе клетки волос). Эти самолеты изложены в Рисунок 1A.

  1. Засыпки 10 мкл NB в правильно сломанной жидкости Джет иглы (от шага 3.2) с использованием геля загрузки подсказки. Загрузите решение равномерно до кончика без пузырей. Вставьте иглу в пипетку держатель придает моторизованных микроманипулятор.
  2. Поместите камеру перфузии в круговой камере адаптер на микроскопа.
    Примечание: Для обеспечения согласованности, всегда устанавливайте личинка в ту же ориентацию (например, камеру, содержащую личинка с его задней к жидкости jet и вентральной стороне, обращенной к экспериментатору).
    1. Переместите моторизованного столика, так что личинка в центре поля зрения. Покрутить круговой камере таким образом, чтобы оси A-P личинка примерно выравнивается с траекторией жидкость Джет иглы.
    2. С помощью передаваемого света и дифференцированного вмешательства контраст (ОПК), принести личинка в фокус и его центр под задачей 10 x. Поднимите цель 10 x.
  3. С помощью моторизованных микроманипулятор, сбить жидкость Джет иглы в центре поля зрения так он подсвечивается пропускаемого света и едва касаясь NB решения.
    1. Нижняя цель 10 x. Сосредоточиться на личинки для подтверждения его местоположение. Фокус вверх чтобы найти жидкость Джет иглы. Перемещение жидкости Джет игла с микроманипулятор в x - и y - оси до тех пор, пока он находится в положении параллельно спинной стороне рыбы.
    2. Фокус на личинки. Сбить иглы в оси z. Поместите иглу вдоль спинной стороне рыбы и ~ 1 мм от тела (рис. 3А1).
    3. Тщательно перемещать круговой камере адаптер (при необходимости) для обеспечения, что жидкость Джет иглы выравнивается вдоль средней линии A-P личинка (Рисунок 3A1).
    4. Переместите моторизованного столика поставить neuromast интерес в центре поля зрения. Держите кончик иглы жидкость Джет вдоль наспинная стороны рыбы. Не прикасайтесь кончик иглы жидкость Джет личинка или поверхности камеры.
  4. Переключитесь на 60 x воды цели. Убедитесь, что цель погружен в раствор NB. Использование тонкой фокус найти neuromast использованием переданы свет и оптика DIC.
    Примечание: Эта установка предназначена для стимулирования neuromasts вдоль основного заднего боковой линии. Клетки волос в этих neuromasts реагировать на передней или задней направленного потока жидкости. 31 см Чжоу et al. для точной карты neuromast жидкости чувствительности в пределах системы боковой линии.
    1. Положение струи жидкости иглой с микроманипулятор, так что это 100 мкм от внешнего края neuromast (Рисунок 3A2).
      Примечание: Выберите neuromasts, которые предлагают четкие сверху вниз вид (цифры 1B1'-B2' и Рисунок 3A3) вместо того, чтобы стороны угловой просмотров (C1-C2рис. 1). Представление четко сверху вниз позволяет одновременных изображений всех апикальной волосы связок в одной плоскости оптической или изображений синаптических областей в меньшее количество оптических плоскостях (A3Рисунок 3).
    2. Фокус до советы апикальной волос связки (kinocilia) (рис. 1A, 3A2 цифры и 3A3). В нижней части жидкости Джет иглы должны быть в центре внимания в этой плоскости.
  5. Установите высокоскоростной давления зажима от руководства внешней режим для получения входных данных от визуализации программного обеспечения.
    1. Нулевой высокоскоростной давление прижима, нажав кнопку «нулевой». Используйте ручку уставка для задания покоя давление слегка позитивные (~ 2 mmHg). Подтвердите покоя выходных высокоскоростной давления зажима с помощью PSI манометр, прилагается к выходу головы стадии.
      Примечание: Установите немного положительное давление в состоянии покоя, чтобы избежать постепенного поглощения жидкости в жидкость Джет иглу со временем. Если жидкость входит трубки подключены к жидкости jet и достигает стадии головы, это может повредить оборудование.
    2. Определите давление, необходимое для стимулирования пучки волос. Используйте 0,125 и 0,25 V вход (6,25 и 12,5 mmHg) для 200 – 500 мс, чтобы применить тестового стимула (рис. 3A3-A3'').
      Примечание: Высокоскоростной давление прижима преобразует напряжение ввода (от программного обеспечения или других устройств, которые подключаются к разъему BNC на высокоскоростной давления зажима командный порт) в давление, которое освобождается от стадии головы и в конечном счете, жидкость Джет иглы (1.0 V = 50 мм рт.ст., а -1,0 V =-50 мм рт.ст.). В этой конфигурации (см. шаг 7.2) положительное давление (push) отклоняет пучки волос к передней, и отрицательного давления (тянуть) отклоняет пучки волос направлении кзади.
    3. С помощью света и DIC оптики наряду с линейки шкалы, измерить расстояние отклонения по 6,25 и 12,5 мм рт.ст стимулы кончики волос связки, kinocilia (рис. 1A и цифры 3A3-3''). Выберите давление, которое перемещает пакеты (как 1 единое целое) на расстояние около 5 мкм (рис. 3A3''). Убедитесь, что советы kinocilia остаются в центре внимания все время.
    4. Перемещение жидкости Джет ± 25 мкм вдоль оси A-P личинка найти расстояние и давление, которое отклоняет советы kinocilia 5 мкм.
      Примечание: С помощью GCaMP6s в личинки dpf 3 – 7, 5 мкм прогиб должен достичь вблизи насыщения GCaMP6s кальция сигналов и следует не повредить апикальной волосы в пучок структуры (рис. 3A3''). Меньше расстояния перемещения может использоваться для доставки не насыщая раздражители (рис. 3A3'). Перемещения расстояний > 10 мкм трудно оценить ( рис. 3A3'' ') и может нанести ущерб течением времени. Насыщение сигнала зависит от возраста и neuromast (высота kinocilial) а также используемого индикатора. Проверьте проходимость жидкости Джет иглы в каждом направлении (давление/push и вакуума/Толкай) периодически во время визуализации. Жидкости Джет иглы легко засорить и потерять вакуумные проходимость, но они сохраняют остаточное давление проходимость. Использование DIC Оптика и короткий тест стимул в каждом направлении, чтобы проверить проходимость жидкости Джет.
    5. Фокус образца в плоскость интерес (например, база апикальной волосы связок или база клетки волос в синаптических плоскости; Рисунок 1 B1-B2').

8. Визуализация процедуры приобретения вариант 1: Приобретения сингл самолет

Примечание: Все изображения, изложенные в настоящем Протоколе выполняется на RT.

  1. Набор изображений программное обеспечение для получения потокового или непрерывное приобретение 80-рамка с захватом каждые 100 мс для достижения частота 10 Гц.
  2. Установите увеличение, диафрагма и мощность лазера для оптимизации сигнала, но избежать насыщения, Фотообесцвечивание и шум. Пример настройки для Opterra/SFC заключаются в следующем: 488 нм мощность лазера: 50 (волосы расслоение ВСТРЕТИЛ плоскость), 75 (синаптических плоскость); щелевой 35 мкм; получить = 2,7; ЕТ прибыль = 3900.
    Примечание: Примените 2 X биннинга если сигналы слишком слабы или шумные или чрезмерного Фотообесцвечивание. 2 x биннинга волю усилить сигнал обнаружения за счет пространственным разрешением.
  3. Выберите стимулом для доставки во время 80-кадр (8 s) приобретение после кадра 30, 3 s.
    Примечание: Некоторые стимулы пример заключаются в следующем: 200 мс (+ или - 0,25 V) до 2 s (+ или - 0,25 V) шаг в направлении передней или задней для определения направленности чувствительности каждой клетки волос; 2 s, 5 Гц прямоугольная волна (0.25 V для 200 мс, -0,25 V для 200 мс, повторяется 5 раз) стимулирования всех волос клеток одновременно. Положительное давление (передней стимул) будет активировать половину волосковых клеток. Отрицательное давление (задняя стимул) будет активировать другой половины волосковых клеток. Убедитесь, что стимул программного обеспечения или устройства возвращает давление прижима обратно на 0 V после завершения стимул.
  4. Мера mechanosensitive кальция ответы. Сосредоточиться на базе апикальной волосы связок (цифры 1A и 1B1-B1') и начать получение изображения.
    Примечание: Если neuromast четко просматривается сверху вниз (рис. 1B1-B1'), все пучки апикальной волос может быть imaged одновременно в одной плоскости.
  5. Мера Пресинаптический кальция ответы. Фокус на базе волосковых клеток (цифры 1A и 1B2-B2') и начать получение изображения.
    Примечание: Если neuromast четко рассматривается сверху вниз (рис. 1B2-B2'), Пресинаптический изображений самолетов всех волосковых клеток могут быть приобретены в 2 – 3 самолетов набор 2 мкм друг от друга. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] трансгенной рыбы может использоваться для идентификации и обнаружения Пресинаптический ленты и сайты кальция вступление29.

9. Визуализация процедуры приобретения вариант 2: Мульти плоскости приобретение

  1. Настройка пьезо Z придает до 60 x целей для быстрого поглощения (12 – 18 мс). Убедитесь, что выбраны параметры Макс скорость.
  2. Создайте Z-стек приобретение с помощью пьезо Z. Приобрести волос расслоение ВСТРЕТИЛ деятельность в 5 самолетов с шагом размером 0,5 µm. приобретать Пресинаптический сигналов в 5 самолетов с размер шага 1 мкм.
  3. Задайте частоту до 10 Гц. Каждый кадр будет захвачен каждые 20 мс и каждый Z-стек каждые 100 мс.
  4. Настройка на приобретение для 400 кадров или 80 Z-стеки на 10 Гц 8 s потокового приобретения.
  5. Установить мощность лазера, диафрагмы и выгоды для оптимизации сигнала, но избежать насыщения, Фотообесцвечивание и шум. Пример настройки для Opterra/SFC системы являются следующие: 488 нм мощность лазера: 75 (волосы расслоение ВСТРЕТИЛ плоскость), 125 (синаптических плоскость); щелевой 35 мкм; получить = 2,7; ЕТ прибыль = 3900.
    Примечание: Применять 2 X биннинга если сигналы слишком слабы,шумные, или чрезмерной Фотообесцвечивание. 2 x биннинга волю усилить сигнал обнаружения за счет пространственным разрешением.
  6. Выберите стимулом для доставки во время приобретения, начиная с кадра 150, после 3 s.
  7. Продолжайте протокол, как описано выше для приобретения одной плоскости, но центр Z-стека в апикальной или базальный плоскостях (шаги 8.4 и 8.5).

10. контроль: Фармакологические блок сигналов всех вызвала кальция

Примечание: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) этан N, N, N′, N′-tetraacetic кислота) лечение является критическим управления впервые устанавливая этот протокол.

  1. После завершения шагов, 8 или 9, замените NB 1 мл NB, содержащих 5 мм BAPTA к расщеплять кончик ссылки, необходимые для ворот апикального ВСТРЕТИЛ каналы, расположенные в пучки волос.
  2. Инкубируйте на 10-20 мин на RT.
  3. Смыть BAPTA 3 раза с 1 мл раствора NB.
  4. Повторите шаг 8 или 9. После BAPTA лечения должно быть никаких изменений в GCaMP6s флуоресценции в ответ на стимуляцию струи жидкости в апикальной волосы связок или синаптических плоскости. Если сохраняются изменения в GCaMP6s флуоресценции, эти сигналы не верно кальция и может быть артефакты движения.

11. контроль: Фармакологические блок Пресинаптический кальция сигналов (опционально)

  1. После завершения шагов, 8 или 9, замените NB NB, содержащие 10 мкм исрадипина с 0.1% диметилсульфоксида (ДМСО) для блокировки кальциевых каналов L-типа на волосы клеточной presynapse.
  2. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
  3. Не выполняя мыть, повторите шаг 8 или 9. После лечения по-прежнему следует GCaMP6s флуоресценции изменения в ответ на стимуляцию струи жидкости в апикальной волос связки, но не плоскости синаптических. Если изменения в флуоресцировании GCaMP6s сохраняются в синаптических плоскости, эти сигналы не верно кальция и может быть артефакты движения.

12. Обработка изображения и графическое представление данных

Примечание: Используете программу построения (шаги 12.2 – 12.2.3) и Фиджи (шаги 12.1 – 12.1.5) для шаг 12. StackReg, TurboReg (шаг 12.1.3), время серии анализатор V3 (шаги 12.1.4–12.1.6), и Фиджи плагины также требуется (см. Таблицу материалы).

  1. Откройте последовательность изображений в Фиджи, или в одной плоскости рядов (80-кадр один самолет) Z-стек временных рядов (400-кадр multi самолет). Нажмите на «Файл» выберите «Импорт» из раскрывающегося меню и нажмите на «Последовательность изображений».
    1. Для серии раз Z-стека Z-проект каждый раз точки (5 самолетов в timepoint) для создания последовательности 80-кадра изображения. Нажмите кнопку «Изображения», выберите «Стеки» из раскрывающегося меню, выберите «Инструменты» в раскрывающемся меню и нажмите на «Группировка Z-проект». Выберите «Средней интенсивности» как метод проекции и введите «5» «Размер группы».
      Примечание: Каждый самолет в Z-стека могут быть проанализированы отдельно для дополнительных пространственной информации.
    2. S (10 кадров) удалить первый 1 из 8 s (80 кадров) захвата изображений. Нажмите кнопку «Изображения», выберите «Стеки» из раскрывающегося меню, выберите «Инструменты» в раскрывающемся меню и нажмите на «Make Substack.» Введите «11-80», «Фрагментов».
      Примечание: Этот substack будет называться stk1.
    3. Регистрация последовательности изображений (stk1) с использованием плагина StackReg32. Нажмите на «Плагины», выберите «StackReg» и выберите «Перевод» как метод регистрации серии 70-сроки.
      Примечание: Это зарегистрированные substack будет называться stk2.
    4. Используйте плагин раз серии анализатор V3 для извлечения измерения интенсивности (F) GCaMP6. Место региона интерес (ROI) на апикальной волосы связок или Пресинаптический сайтов в stk2. Обратитесь к веб-сайту ImageJ (см. Таблицу материалов для ссылки) для получения инструкций о том, как использовать время серии анализатор V3.
      Примечание: Использование круговой 1 – 2 мкм ROI для апикальной волосы связок и циркулярный 3 – 5 мкм ROI для синаптических плоскости (фигуры 4A1 и 4A2).
    5. Выберите измерение параметров. Нажмите кнопку «Анализировать», выберите «Задать измерение» и убедитесь, что выбран параметр только «означает значение серого».
    6. В менеджере ROI выберите все трансформирования и использовать функцию мульти мера для создания значения интенсивности (F) для каждого ROI в временных рядов. В ROI Manager, нажмите кнопку «Больше >>» и выберите «Multi меру» из раскрывающегося меню.
  2. Участок (F) значения. Вставить значения (F) из результатов «Multi меру» в программу построения диаграмм для создания графа X-Y (цифры 4A1 «и 4A2»).
    Примечание: Создание (X) значения вручную или использовать отметку времени из метаданных.
    1. Количественную оценку исходных (oF) для каждого ROI путем усреднения значений (F) в программе построения из предварительно стимул кадров 1 – 20.
    2. Для каждого ROI вычтите из значения (F) в каждом timepoint для создания значения ΔF (oF-F) (Fo). Replot, при желании.
    3. Рассчитать и участок ΔF/Fo. Для каждого ROI, делят ΔF измерения (Fo) и replot (4A1 цифры '' и 4A2'').

13. обработка изображений и тепла Карта представленности кальция пространственно временных сигналов

Примечание: Предыдущая работа для создания пространственных тепла карта представления сигналов кальция в данио рерио боковой линии клетки волос использовали заказного программного обеспечения, написанных Matlab5,28. Этот анализ был адаптирован для открытого программного обеспечения анализа Фиджи33. Используйте Фиджи для всех шагов, изложенных ниже. StackReg и TurboReg Фиджи плагины являются также требуется (см. Таблицу материалы).

  1. Выполните шаги 12.1 – 12.1.3 для каждого Z-стека или одной плоскости временных рядов для создания зарегистрированных substack, называется stk2.
  2. Используйте stk2 для создания базового образа. Нажмите кнопку «Изображения», выберите «Стеки» из раскрывающегося меню и выберите «Проект Z». Выберите «Средней интенсивности» для «Тип проекции» и введите «1» для «Начало фрагмента» и «20», «Стоп фрагмента».
    Примечание: Это Z-проекция будет называться baselineIMG.
    1. Височно бин 70-кадр последовательности изображений (F) (stk2) в 14 0,5 s бункеров. Нажмите на «Изображения», выберите «Стеки» из раскрывающегося меню, выберите «Инструменты» в раскрывающемся меню и нажмите на «Сгруппированных Z проект». Выберите «Средней интенсивности» как «метод проекции» и введите 5 для «Размер группы».
      Примечание: Эта группировкой Z-проекция будет именоваться stk2bin и F на рис. 5.
    2. Вычтите значение пикселя базовой линии (baselineIMG) с сегментированием последовательности изображений (F) (stk2bin) для создания последовательности изображений ΔF. Нажмите на «Процесс» и выберите «Изображение калькулятор» из раскрывающегося меню. Выберите stk2bin как «Image1» и baselineIMG как«Image2.» Выберите «Вычесть» для «Операции».
      Примечание: Этот базовый вычитается Z-проекция называется stk2binBL и F-BL = ΔF, на рисунке 5.
  3. Выберите таблицу подстановки (LUT) выбора для отображения последовательности изображений ΔF (stk2binBL). Нажмите на «Изображения», выберите «Поиск таблицы» из раскрывающегося меню и нажмите на LUT выбора.
    Примечание: «Red Hot» является LUT, используемые на рисунке 5. Этот базовый вычитается Z-проекции с LUT называется stk2binBL-LUT и ΔF LUT на рисунке 5.
    1. Установка минимума (мин) и значения максимальной яркости (Макс) для stk2binBL-LUT. Нажмите кнопку «Изображения», выберите «Настроить» и нажмите кнопку «Яркость/контрастность». Значение min, чтобы удалить фоновый шум от stk2binBL-LUT. Установите максимальные значения сохранять сигналы интереса, но избежать насыщения сигнала [например, от 200 до 1600 (12-битные изображения диапазон интенсивности = 0 до 4095)].
      Примечание: Используйте те же значения min и max, при принятии визуального сравнения или представлений. ΔF калибровка LUT бар могут создаваться в Фиджи для каждой последовательности образ LUT (например, stk2binBL-LUT). Нажмите на «Анализировать», выберите «Инструменты» и нажмите на «Калибровка Bar». Снимите «Overlay» для создания отдельной, отдельные изображения с панели калибровки LUT для справки.
    2. Преобразовать оба ΔF (stk2binBL-LUT)с нужное изображение LUTand височно сегментированием (F) (stk2bin) последовательности в RGB. Нажмите кнопку «Изображения», выберите «Тип» и нажмите на «RGB цвет».
      Примечание: RGB-преобразованы Z-прогнозы будут называться stk2binBL-LUT-RGB и stk2bin-RGB, соответственно.
  4. Наложение изображений ΔF LUT (stk2binBL-LUT-RGB) на сегментированием изображения (F) (stk2bin-RGB). Нажмите на «Процесс» и затем «Изображение калькулятор». Выберите stk2bin-RGB Image1 и stk2binBL-LUT-RGB как Image2. Выберите «Прозрачный ноль» для «Операции».
    Примечание: Если есть слишком много шума или фон в ΔF LUT оверлея, повторите шаг 13.3 увеличить значение min. Если есть насыщенность, повторите шаг 13.3 и увеличить значение max.

14. Обработка изображения и пространственно временных тепла карта представление с помощью макроса Фиджи

Примечание: Следующем разделе относится к Фиджи макрос называется LUToverlay, основанные на шаге 13, которое автоматически создаст представление пространственных тепла карта GCaMP6s сигналов. Такой анализ требует открытым исходным анализа программного обеспечения Фиджи33 и StackReg и TurboReg Фиджи плагинов (см. Таблицу материалы).

  1. Скачать макрос оверлея LUT Фиджи (LUToverlay.ijm), сопровождающих этот протокол (см. Дополнительное кодирование файла).
  2. Откройте несколько плоскости временных рядов или одной плоскости рядов (см. шаг 12.1).
  3. Нажмите на «Плагины», выберите «Макросы», нажмите кнопку «Выполнить» и выберите макрос LUToverlay. Появится диалоговое окно, с текстом, «расскажите мне о вашей загрузки изображений».
    Примечание: Для диалогового окна нынешнего числа являются предлагаемые значения и может быть изменена согласно установки, используемые экспериментатора. Значения, перечисленные в окне и ниже установленных для мульти плоскости временных рядов с 400 изображений и 5 самолетов в timepoint (шаг 9).
  4. После «Число самолетов в timepoint» введите количество самолетов в timepoint (например, для шага 12.1.1 с использованием мульти плоскости 400 временных рядов с 5 самолетов в timepoint, введите «5»). Для приобретения одной плоскости (например, шаг 8) введите «1».
    Примечание: В остальных диалоговых окнах, мульти плоскости временных рядов, «Timepoints» относится к число изображений в стеке прогнозируемых Z (например, для шага 12.1.1 это 80 timepoints).
    1. Используйте параметр «Определить диапазон для анализа» чтобы удалить первый 1 s последовательности изображений (например, для шаг 12.1.2 Выберите «11-80» чтобы удалить первые 10 кадров и первый 1 s).
    2. После «определить timepoints в базовой линии», введите количество изображений, которые будут использоваться для создания базового образа [например, для шага 13.2., введите «20» использовать предварительно стимул изображения (11-30)].
    3. После «Timepoints за временной бин» введите количество изображений для Бен для наложения. (например, для шага 13.2.2. Выберите «5» для создания 14 контейнеры 0.5-s).
    4. После того, как «Мин интенсивности» и «Макс» введите значения минимальной и максимальной яркости, которые будет удалить фоновый шум (минимум) и сохранять сигналы интереса избегая насыщения (максимум).
    5. После «выбрать таблицу подстановки», выберите LUT, требуемой для наложения. Нажмите кнопку «ОК».
      Примечание: Макрос закончит анализ изображений в соответствии с инструкциями на шаге 13. Образы, созданные макрос будет называться также согласно инструкциям в шаге 13.
  5. Закройте все окна анализ перед обработкой новой последовательности изображений.

Representative Results

После myo6b:GCaMP6s-caax трансгенной рыбы должным образом иммобилизованных и жидкость Джет стимула доставляется к боковой линии клетки волос, надежные кальция сигналы могут быть визуализированы и измеряется (рисунки 4 и 5, принятым на 2 X биннинга). Во время стимуляции жидкости Джет кальция сигналы, либо может быть измерена в апикальной волос связки, где ВСТРЕТИЛ каналы открытыми в ответ на раздражители, или на базе волосковых клеток, где Пресинаптический Cav1.3 кальциевых каналов вызвать синапсах. Репрезентативного примера кальция ответов в этих регионах с отдельными neuromast показано на рисунке 4A1-A2''. В этом примере 2-s 5 Гц жидкости Джет стимул был доставлен в активировать все клетки волос в пределах представитель neuromast. Во время стимул, надежные кальция сигналы могут быть обнаружены в пучки волос (рис. 4A1-A1'', показаны ответы от 8 пучки волос). В этой системе почти все зрелые клетки волос отображения этого Апикальная приток кальция5. В отличие от этого, в том же neuromast, есть обнаружению кальция сигналов в плоскости базальной, синаптических в только подмножество (~ 30%) клетки волос (рис. 4A2-A2'', 4 клетки с пресинаптической ответы показываются)5. 4 зеленый ROIs шоу клетки с сигналы не значительных Пресинаптический кальция (Рисунок 4A2-A2'') Несмотря на надежные апикальной кальция сигналов (Рисунок 4A1-A1''). В этот пример (рис. 4A1-A2''), цветные ROIs матч до пучки волос в апикальной ВСТРЕТИЛ плоскости (рис. 4А1) с их телами клеток базальной синаптических плоскости (рис. 4А2). В этом примере подчеркивает, как оба встретились зависимых и Пресинаптический кальция сигналы могут быть измерены в отдельные клетки волос и среди населения волосковых клеток.

Кальция сигналы мотками волос и на presynapse можно изобразить графически как сырые интенсивности (F) GCaMP6s или ΔF/Fo GCaMP6s интенсивности (см. шаг 12, цифры 4A1'-A1'' и 4A2'-A2''). Графики (F) GaMP6s подчеркнуть, что интенсивность флуоресценции базовой линии для каждой ячейки может отличаться (цифры 4A1' и 4A2'). В ΔF/Fo GCaMP6s графики, каждая ячейка нормализуется к значению базового и относительную интенсивность изменения от базовой строится (цифры 4A1'' и 4A2''). В обоих (F) и ΔF/Fo GCaMP6s участков, кальция сигналов в апикальной волос пучок и базальная плоскость Пресинаптический инициировать с наступлением стимул (серый прямоугольник) и снижение экспоненциально после окончания стимул. В ходе стимул, кальция сигналов в пучки волос расти быстро и насыщают если сила прогиб не меняется (рис. 4A1-A1''). В отличие от в пределах подмножество волосковых клеток с обнаруживаемыми кальция сигналов в синаптических плоскости, кальция сигналы более постепенно увеличивать и менее склонны к насыщенности (рис. 4A2-A2''). В клетки волос без сигналов Пресинаптический кальция (зеленый трансформирования) кальция сигналы остаются рядом базовых.

В дополнение к эти графические представления (рис. 4) кальция сигналы могут быть визуализированы пространственно в пределах всей neuromast в течение времени записи. На рис. 5 приведен пример пространственно-временных представительства Пресинаптический GCaMP6s сигналов в базальная плоскость neuromast. На рисунке 5основные шаги для обработки последовательности изображений для визуализации пространственных изложены как описано в шаге 13. Во-первых, raw изображений (F) GCaMP6s височно сегментирования [Рисунок 5: строка 1 (показаны 5 из 14 бункеров); шаг 13.2.1]. Затем, базового образа, рассчитывается от рамы (шаг 13.2), предварительное стимулом вычитается из сигналов флуоресцирования (F) GCaMP6s для получения ΔF изображения (Рисунок 5: строки 2; шаг 13.2.2). Далее, ΔF серого изображения преобразуются в цвета LUT (Рисунок 5: строка 3, Red Hot LUT; шаг 13.3). Наконец, ΔF изображений с преобразованием LUT накладываются на височно сегментированием изображения (F) (Рисунок 5, первая строка) для выявления пространственно-временных сигналов в neuromast во время стимуляции (рис. 5: строка 4; шаг 13.4). Тепло карт ΔF GCaMP6s сигналов обеспечивают как ценную пространственных и временных информацию, которая не является легко разобрать из одного трансформирования и графиков, используются на рисунке 4. Тепло карт могут помочь визуализировать критических пространственно-временных информацию, включая субцеллюлярные информацию относительно начала и продолжительности кальция сигналов внутри каждой клетки волос, а также сроков и интенсивности различия между клетки волос в пределах всего neuromast.

Важно, чтобы убедиться, что графики и пространственной тепловые карты представляют истинное кальция сигналы и не артефакты из-за движения. В этом протоколе артефакты движения может быть результатом чрезмерного дрейф или движение личинок или движения жидкости Джет раздражения. Все эти артефакты являются сложными, чтобы полностью устранить в этом препарате в естественных условиях. Хотя регистрация последовательности изображений (шаг 12.1.3) можно исправить большинство движения в x и оси y, последовательности изображений с чрезмерным движением в оси z должны выявлять и устранять из анализа. Движение артефакты проще всего определить, графические сигналы кальция. Примеры изменения интенсивности GCaMP6s артефакты и не являются истинно GCaMP6s сигналы может наблюдаться на вершине (рис. 4B1'-B1'') и базовые (Рисунок 4C1'-C1'') из клетки волос.

В апикальной волосы связок, артефакты движения являются общими, когда жидкость Джет стимулом является слишком сильным (рис. 3A3'' '). Во время этих чрезмерно сильных раздражителей, плоскости апикальной волосы в пучок может переместить фокус во время стимуляции жидкости Джет затем вернуться к оригинальной фокальной плоскости после стимул (рис. 4B1'-B''). Это делает его трудно точно измерить апикальной MET-зависимых кальция сигналов. На рисунке 4можно увидеть пример артефактов движения волос пакетB1'-B1''. Здесь, на графиках показано снижение GCaMP6s сигналов во время стимул (серый прямоугольник) когда пучки волос вне фокуса. После того, как стимул заканчивается, GCaMP6s сигналы быстро увеличить как пучки волос в их исходное положение и вернуться в центр внимания. Это контрастирует с примера на рис. 4A1'-A1'' в котором сигналы апикальной кальция увеличения в начале стимул и уменьшаться, когда стимул заканчивается.

В то время как движение из-за чрезмерной жидкости Джет стимулы можно также переместить плоскости синаптических вне фокуса, этот тип артефакта движения менее распространены в этой плоскости. Вместо этого изменения в фокусе в оси z из-за движения или дрейфа личинки являются наиболее распространенными причинами артефакты движения. Личинок движения или дрейф может повлиять на GCaMP6s измерений на вершине и база волосковых клеток. На рисунке 4приведен пример личиночной движения, что увеличивает GCaMP6s в плоскости базальной, синаптических во время стимулC'-C''. Движение артефакты (рис. 4C1'-C1'') можно отличить от истинной Пресинаптический сигналов (Рисунок 4A2'-A2'') путем изучения время курс GCaMP6s сигналов. Вместо увеличения и уменьшения экспоненциально с стимул (рис. 4A2'-A2''), движения индуцированной увеличение сигнала GCaMP6s имеют квадратные формы и взлет и падение резко с начала и смещение стимула, соответственно () Рисунок 4 C1'-C1'').

Помимо тщательного изучения время курс GCaMP6s сигналов управления эксперименты с использованием фармакологии может использоваться для дифференцировать истинный GCaMP6s сигналов от артефакты движения. К примеру BAPTA (шаг 10) может применяться к расщеплять наконечник ссылки, которые требуются для MET-каналов в пучки волос. BAPTA следует исключить как жидкость Джет вызвала приток кальция апикальной MET-канал зависимой, так и последующих базальной, Пресинаптический кальция приток через каналыv1.3 Ca. В пример истинной стимул вызвала кальция сигналов (рис. 4A1-A2'') во время стимуляции жидкости Джет, все изменения в GCaMP6s флуоресценции в апикальной и базальной самолеты будут устранены после BAPTA лечения. В отличие от этого, изменения в GCaMP6s флуоресценции вследствие движения, как показано в цифры 4Б1 '-B1'' и 4 C 1'-C1'' не будут устранены, BAPTA лечение.

В дополнение к ликвидации всех стимул вызвала GCaMP6s сигналов с помощью BAPTA, может применяться исрадипина (шаг 11) специально блокировать Cav1.3-зависимых кальция приток в плоскости базальной синаптических оставляя апикальной MET-канал зависимой кальция приток нетронутыми5. После того, как применение исрадипина, в отдельные neuromast с никаких артефактов движения, изменения в GCaMP6s флуоресценции в апикальной волос связки (рис. 4A1'-A1'') во время стимуляции жидкости jet будет неизменным, при этом все синаптической GCaMP6s флуоресценции изменения на базе будет ликвидирована (рис. 4A2'-A2''). Любое изменение в GCaMP6s сигнал в синаптических плоскости после исрадипина приложения (например,Рисунок 4C1-C1'') скорее всего будет соответствовать артефакты движения.

Figure 1
Рисунок 1 : Обзор боковой линии neuromast и функциональных изображений самолетов. (A) схема слева изображает вид сбоку-neuromast с четырех волос клеток органов (черный) связаться постсинаптических афферентных нейронов (синий). Ленты (зеленый) троса везикулы в пресинаптическом активных сайтов в каждой ячейке. Верхушечный для каждой клетки тела представляет собой комплект из stereocilia (1 мкм), которые содержат НМП каналы. Каждый пучок волос имеет одно kinocilium, который передает механической силы движения воды к основанию волос пучок. Схеме справа изображает той же модели в представлении сверху вниз. В этом представлении сверху вниз черный используется для обозначения четыре клетки, изображенные на рисунке слева, и серый используется для обозначения других клеток в neuromast. В этой модели и эти 2 просмотров, выделяются три важных плоскостях: (1) кончики волос связки (kinocilia) используется для количественного определения величины прогиба пучок волос, (2) апикальной ВСТРЕТИЛ плоскости на базе пучки волос, где кальция попадает в камеру во время стимуляции и (3) плоскости синаптических на базе ячейки, где кальция вступает вблизи синаптических ленты. (B1-B1') DIC и GCaMP6s сверху вниз изображения плоскости встретились на базе пучки волос, где кальция mechanosensation зависимых сигналы могут быть записаны. (B2-B2') DIC и GCaMP6s изображения сверху вниз от же neuromast как B1-B1', но на базе neuromast в синаптических плоскости, где могут быть обнаружены сигналы Пресинаптический кальция. (C1-C2) Изображения neuromast, выражая GCaMP6s, где личинки неправильно установлена. В этом примере верхушечный ВСТРЕТИЛ плоскости (C1) и синаптическую плоскости (С2) на базе ячейки расположены под оптимальным углом. Это положение не допускает все пучки волос для отображаемого в одной плоскости, и многие больше изображений самолеты необходимы для захвата деятельности на всех синапсов в этот neuromast, по сравнению с B1-B2'. Изображения являются личинки на 5 dpf. Линейки в C2 соответствует ко всем изображениям в B1-C2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Изображений камеры, данио рерио монтажа и сердце процедуры инъекции и иглы. (A) показано это тепловизионные камеры с личинки (изложенные пунктирный прямоугольник) закреплен в центр на вершине силиконовым герметиком. (B1) Показано 5 личинка dpf иммобилизованных на две булавки. Большая голова pin находится перпендикулярно к телу просто задняя для глаз. Два глаза полностью накладываются так снизу глаз полностью заслонен верхней глаз. PIN-код небольшой хвост пересекается хорда в хвост. Личинка является плоской и не скручен. (B2) Чтобы парализовать личинка, сердце инъекционной иглы ориентирована перпендикулярно к телу и прилегающих к сердцу. Сердце иглу следует обратиться пигмент клеток перед сердцем. (B2') Депрессии иглы в кожу вызывает отступы ячейки пигмента перед сердцем. (C) иглы в порядке слева направо: пример сердце иглу с отверстием приблизительно 3 мкм; Пример хорошей жидкости Джет иглы с отверстием приблизительно 50 мкм; Пример плохо сломанной жидкости Джет иглы, что большие и неровными и будет скорее всего производят чрезмерное и нерегулярных раздражителей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Выравнивание жидкости Джет, позиционирование и стимул калибровки. (A1) Показано это личинка ориентированные с головы облицовки слева и хвост справа, и жидкость Джет иглы ориентированной параллельно оси A-P данио рерио тела. Эта жидкость Джет иглы выравнивается для стимулирования neuromasts, что реагировать на передней (push/давление) и задний (тянуть/вакуум) направлены потока жидкости. (А2) Показана neuromast (изложенные пунктирной белой линии) и советы апикальной волос связки (kinocilia) с левой стороны панели и жидкость Джет иглы на правой стороне панели. Жидкости jet является положение примерно 100 мкм от края neuromast. (A3-A3'' ') Советы апикальной волос связки (kinocilia) являются деформированного различных расстояниях, изменяя давление жидкости Джет стимул. Траектория одного kinocilial подсказка отображается для 1,5 мкм (A3') и 5 мкм (A3'') отклонения расстояния. Черный круг указывает положение покоя kinocilium. Важно, что kinocilia не отклоняются слишком далеко, иначе не могут быть количественно надежно интенсивности стимула и может стать вредным (A3'' '). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Верхушечный встретились и базальной Пресинаптический GCaMP6s сигналов во время стимуляции струи жидкости в клетках боковой линии волос. (A1-A2'') GCaMP6s изменения интенсивности во время стимуляции струи жидкости в пределах представитель neuromast. Изображения слева показывают апикальной ВСТРЕТИЛ плоскости (A1) и базальной синаптических плоскости (А2) в том же neuromast. ROIs цветом в А1 и А2 были использованы для печати время курс (F) и ΔF/F GCaMP6s интенсивности графики в правой части каждого изображения. (B1-B1'') Пример последовательности изображений апикальной встретился с избыток движения во время стимуляции жидкости Джет. На рисунке слева (B1) трансформирования, используется для печати (F) и ΔF/F GCaMP6s интенсивности графики справа. (C1-C1'') Пример последовательности изображений в плоскости базальной синаптических показывает движение артефакты и GCaMP6s сигнал изменения, которые не являются действительно кальция сигналов. На рисунке слева (C1) трансформирования, используется для печати (F) и ΔF/F GCaMP6s интенсивности графики справа. Серое поле в каждом графике представляет длительность жидкость Джет стимул во время каждого изображения последовательности. 2-х 5 Гц жидкости Джет стимул был использован для примера в A1-A2'' и B1-В1 ''. В C1-C1'', 2 передних ступенчатого s был использован. Ось Y для графов GCaMP6s (F) изображает условные единицы (а.е.), полученных в результате измерений интенсивности изображения Фиджи. Все примеры из личинки в 4-5 dpf. Шкалы бар = 5 мкм для всех изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Пространственно-временных визуализация Пресинаптический GCaMP6s сигналов во время стимуляции жидкости Джет. Изложены шаги, чтобы визуализировать пространственно-временных изменений в интенсивности GCaMP6s в neuromast во время стимул. Время представлена слева направо в соответствии с отметкой времени в верхней части изображения. Верхней строке показывает 5 14 временных ячеек от 70-кадр последовательности изображений GCaMP6s (F) (шаг 13.2.1). Во втором ряду базовой (шаг 13.2) был удален из каждого сегментированием изображения (F) GCaMP6s для создания ΔF изображения (шаг 13.2.2). В третьей строке, ΔF изображения были преобразованы из серого (вторая строка) для Red Hot LUT (шаг 13.3). Min и max этих изображений LUT устанавливаются согласно тепла карта Red Hot LUT относительной ΔF интенсивности (а.е.) справа (шаг 13.3.1). В нижней строке третья строка была накладывается на изображения (F) в верхнем ряду (шаг 13.4). На серой панели в верхней части цифра указывает сроки 2-s 5 Гц жидкости Джет стимул. Пример взят из 5 dpf личинки. Легенда карты тепла Red Hot LUT относительной ΔF интенсивности (а.е.) показано справа. Шкалы бар = 5 мкм для всех изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

В естественных условиях изображений в интактных животных является по сути своей сложной. Несколько шагов в этом методе имеют решающее значение для получения надежного в естественных условиях измерения кальция от боковой линии клетки волос. Например очень важно, что личинка удержал и должным образом парализована до визуализации к минимуму движение во время визуализации. Избыток движения во время обработки изображений может привести к изменениям в флуоресцировании GCaMP6s, что сигналы не верно и не соответствуют изменения уровня кальция (например, 4Б1 цифры '-B1'' и 4 C 1'-C1''). Хвост булавки могут быть размещены более кпереди, чтобы помочь свести к минимуму движения, хотя это может сделать больше заднего neuromasts недоступными. Кроме того после инъекции сердце, голова булавки можно вращать так, что горизонтальная часть pin лежит через желток. В дополнение к изменяя положение булавки, это также можно использовать арфы мозга фрагмент вместо булавки для иммобилизации личинки34. При наведении личинки должным образом, арфа является дополнительным, потенциально менее инвазивный метод иммобилизации личинки. В то время как значительное движение может быть результатом недостаточно закрепления, неспособность правильно выполнять инъекции сердце доставить α-bungarotoxin и парализовать личинки может привести к неполной паралич, движение и в конечном счете движения артефакты. Хотя было показано, что часто используемые анестетиков влияет на возбудимость клетки волос данио рерио, последние работы показал, что цистит бензокаин не вмешиваться с многими аспектами волос клеточной активности. Аналогичным образом более широко используется анестетиком, которые MS-222 только мешает с некоторыми аспектами волос клеточной активности15. Таким образом из-за сложной природы α-bungarotoxin инъекции, бензокаин или MS-222 приложения может оказаться полезным альтернативный метод паралича для предотвращения движения в личинки во время функционального кальция изображений.

Помимо технических проблем, участвующих в настоящем Протоколе даже совершенно установлен образец бесполезны, если личинки и клетки волос не здоровы, до и во время каждого изображения эксперимента. Чтобы гарантировать здоровые личинок и клетки волос, важно, что личинки сохраняются в буфере E3, которая свободна от мусора, таких как chorions (яичная скорлупа), отходы и микроорганизмов. Хотя поверхностное расположение боковой линии клетки волос является выгодным для воображения, это место делает их более уязвимыми для клеточных повреждений при загрязненной E3 буфер. Водная среда особенно важно для молодых личинок (2-4 dpf) или мутантов, которые не могут поддерживать вертикально плавательный позиции и главным образом лежат на дне Петри. В таких ситуациях может легко стать угрозой боковой линии клетки волос и защитные куполом, окружающих пучки волос. Даже когда начиная с здоровых личинок и клетки волос, на протяжении каждого эксперимента, важно обеспечить что личинка имеет сердцебиение и быстрое кровообращение. Если кровоток замедляется или останавливается, здоровье волосковых клеток может стать угрозой. В скомпрометировано препараты, связанные с нездоровым личинки или потери потока крови, умирая клетки волос можно определить несколькими способами: во-первых, появление karyopyknosis или ядерной конденсации, которая проявляется как пузырь внутри клетки под ДВС оптика; Во-вторых на сжатие клеток и присутствие быстро движущихся частиц в цитоплазме; и в-третьих, когда kinocilia советы скошенный в различных направлениях35. Когда волосы связки разрушаются, растопыренные kinocilia слаженно вместе не двигаться во время стимуляции.

Этот препарат имеет несколько незначительных ограничений, один из которых, что подготовка остается только надежные для 1-3 часа после того, как установлено. Модификации, такие как использование меньших булавки или ломтиком мозг Арфа для иммобилизации личинок и добавление перфузии системы может продлить срок службы этой подготовки в естественных условиях . Еще одним ограничением является что Фотообесцвечивание и Фототоксичность может произойти после неоднократных визуализации процессов. Один захватывающий способ преодолеть этот вызов должен адаптировать этот протокол для микроскопии свет лист. Свет лист микроскопии является мощным средством для сокращения из фокус света, приводит к менее Фотообесцвечивание и Фототоксичность36. Вместе мягче иммобилизации и меньше фото облучения могут помочь продлить изображений каждой сессии. Больше изображений сессий может использоваться для изучения на весь срок действия функциональных изменений, сопровождающих развитие и процессы, лежащие в основе Распродажа волос клеток и регенерации после травмы. Важно отметить, что, помимо света лист микроскопии, этот протокол может быть адаптирована к конфокальный систем других типов (точка сканирование, 2-Фотон и спиннинг диск) а также относительно простых widefield систем28,34 . В целом его универсальность делает этот протокол ценный инструмент, который может быть адаптированы и использованы с несколько тепловизионных систем.

Хотя этот протокол могут быть адаптированы и использованы с многих систем тепловидения, части настоящего Протокола также могут быть адаптированы и использованы (1) с другими показателями, кроме GCaMP6s и (2) к деятельности изображения в другие сензорные клетки и нейроны в личиночной данио рерио. Например в предыдущем исследовании, мы использовали этот протокол к деятельности изображения с использованием нескольких генетически закодированный показателей в боковой линии клетки волос для обнаружения цитозольной кальция (RGECO1), сплавливание vesicle (SypHy), напряжение мембраны (Bongwoori) и мембраны Кальций (jRCaMP1a-caax и GCaMP6s-caax) и внутри боковой линии афферентных процессы для выявления мембраны кальция (GCaMP6s-caax)5. Основываясь на нашем опыте, с использованием этих показателей, трансгенные линии Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) описано в настоящем Протоколе предлагает отличный старт для визуализации активности в боковой линии neuromasts. Из всех перечисленных выше показателей мы обнаружили, что GCaMP6s является наиболее чувствительные и фотостабилен. Помимо этих функций, мы подчеркиваем трансгенные линии Tg(myo6b:GCaMP6s-caax), потому что оно может использоваться для двух отдельных измерений: волосы клеточной mechanosensation и Пресинаптический кальция в пределах одной трансгенные линии.

Метод, описанный в этой статье показано, как кальций изображений в zebrafish боковой линии может быть мощный метод для изучения, как клетки волос функционировать в их родной среде. Этот подход дополняет исследования млекопитающих, в которой волосы ячейка функция в настоящее время изучается в эксплантов ex vivo . Кроме того в zebrafish модель может по-прежнему использоваться в качестве платформы для тестирования эффективности генетически закодированный индикаторов, которые затем могут быть применены для изучения активности в клетках млекопитающих волос.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH/NIDCD очных исследовательских средств 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Мы хотели бы признать Candy Вонг за помощь в написании макросов Фиджи. Мы также хотели бы поблагодарить за их полезные предложения с протоколом Дорис Wu и Candy Вонг.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. , Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

Tags

Нейробиологии выпуск 141 данио рерио кальция изображений конфокальная томография в естественных условиях изображений клетки волос сенсорные нейробиологии боковая линия генетически кодирования показателям GCaMP
В естественных условиях кальция изображений боковой линии клетки волос в личиночной данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo… More

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter