Neuroscience

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794

¹Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, ²National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

De zebravis is een modelsysteem dat heeft veel waardevolle eigenschappen met inbegrip van optische helderheid, snelle externe ontwikkeling, en, met name van belang op het gebied van gehoor en evenwicht extern gelegen zintuiglijke haarcellen. Dit artikel schetst hoe transgene zebrafish kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van zowel de Haarcel mechanosensation en de presynaptische functie in toto.

Abstract

Sensorische haarcellen zijn mechanoreceptors gevonden in het binnenoor die vereist voor het gehoor en evenwicht zijn. Haarcellen zijn geactiveerd in reactie op sensorische stimuli die mechanisch apicale uitsteeksels genaamd haar bundels afbuigen. Mechanotransduction (BMO) kanalen opent doorbuiging in haar bundels, wat leidt tot een toestroom van kationen, zoals calcium. Deze toevloed kation depolarizes van de cel en spanning-gated calcium kanalen basally gelegen aan de Haarcel presynapse opent. Haarcellen zijn ingekapseld in bot in zoogdieren, en het is uitdagend om functioneel beoordelen deze activiteiten in vivo. Daarentegen larvale zebrafish transparant zijn en beschikken over een extern gelegen dwarslijn orgaan waarin haarcellen. Deze haarcellen zijn functioneel en structureel vergelijkbaar met zoogdieren haarcellen en kan functioneel worden beoordeeld in vivo. Dit artikel schetst een techniek die gebruik maakt van een genetisch gecodeerde calcium indicator (GECI), signalen GCaMP6s, voor het meten van stimulus-opgeroepen calcium in zebrafish dwarslijn haarcellen. GCaMP6s kan worden gebruikt, samen met confocal imaging, om te meten in vivo calcium in de apex en basis van haarcellen dwarslijn signalen. Deze signalen geven een real-time, kwantificeerbare uitlezing van beide mechanosensation - en presynapse-afhankelijke calcium activiteiten binnen deze haarcellen. Deze calcium signalen ook belangrijke functionele zij informatie verstrekken over hoe haarcellen detecteren en doorgeven van zintuiglijke prikkels. Over het algemeen deze techniek nuttige gegevens over relatieve wijzigingen in calcium activiteit genereert in vivo. Het is minder geschikt voor de kwantificering van de absolute magnitude van calcium veranderingen. Deze in vivo techniek is gevoelig voor beweging artefacten. Een redelijke hoeveelheid praktijk en vaardigheden zijn vereist voor de juiste positionering, immobilisatie en stimulatie van larven. Uiteindelijk, wanneer goed uitgevoerd, het protocol dat in dit artikel beschreven is een handige manier voor het verzamelen van de waardevolle informatie over de activiteit van de haarcellen in hun natuurlijke, volledig geïntegreerde Staten binnen een levende dieren.

Introduction

Functionele calcium imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het controleren van de activiteit van veel cellen tegelijk¹. In het bijzonder heeft calcium geschikt zijn met behulp van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) aangetoond dat het nuttig zijn, omdat de GECIs kan worden uitgedrukt in specifieke celtypen en gelokaliseerde subcellularly². In onderzoek neurowetenschap hebben deze functies calcium geschikt zijn met behulp van GECIs een krachtige methode om zowel activiteit patronen binnen neuronale netwerken definiëren en meten van calcium toestroom op individuele synapsen³^,⁴. Profiteren van deze functies, een recente studie gebruikt confocale microscopie en GECIs om subcellular activiteit binnen collecties van sensorische haarcellen⁵te controleren.

Haarcellen zijn de mechanoreceptors die geluid en vestibulaire prikkels in het binnenoor en lokale water beweging te in de zijlijn systeem in aquatische vetebrates⁶^,^{7 detecteren}. Haarcellen zijn vaak het doelwit van schade of genetische mutaties die leiden de meest voorkomende vorm van gehoorverlies in de mens bekend als perceptief hoorzitting verlies⁸^,^{9 tot}. Daarom is het essentieel om te begrijpen hoe deze functie van de cellen om te begrijpen hoe te behandelen en voorkomen van gehoorverlies. Haarcellen gebruiken om goed kan functioneren, twee gespecialiseerde structuren, genaamd mechanosensory-haar bundels en synaptische linten voor het detecteren en doorgeven van stimuli, respectievelijk. Haar bundels bevinden zich op de top van haarcellen en bestaan uit voornamelijk uit fijne, haar-achtige uitsteeksels bekend als stereocilia(Figuur 1). In vestibulaire en dwarslijn haarcellen heeft elke haar bundel ook een enkele lange kinocilium (van de cel enige echte cilium), die uitbreiden ver boven de stereocilia(Figuur 1 tot kan). Mechanosensory prikkels afbuigen haar bundels, en doorbuiging zet spanning op verbanden genaamd "tip-links", die stereocilia¹⁰interconnect. Deze spanning opent mechanotransduction (BMO) kanalen gelegen in de stereocilia, wat resulteert in een apicaal toestroom van kationen, zoals calcium¹¹^,¹². Deze apicale activiteit uiteindelijk depolarizes de Haarcel en spanning-gated calcium kanalen (Ca_vvan 1.3) aan de voet van de cel opent. CA_v1.3 kanalen worden grenzend aan synaptic linten, een presynaptische structuur die blaasjes op actieve zones aanbinden aangetroffen. Basale calcium toestroom via Ca_v1.3 kanalen is vereist voor het blaasje fusion, transmissie en activering van afferent neuronen¹³^,¹⁴.

Voor vele jaren, elektrofysiologische technieken zoals geheel-cel patch klemmen zijn gebruikt om de sonde van de functionele eigenschappen van haarcellen in vele soorten, met inbegrip van de zebravis¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^, ¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Deze elektrofysiologische opnames geweest op het gehoor en evenwicht gebied bijzonder waardevol omdat ze kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van uiterst gevoelige metingen van individuele zintuigcellen, waarvan het doel is voor het coderen van extreem snelle prikkels een breed scala aan frequenties en intensiteiten²¹^,²². Helaas meten niet geheel-cel opnamen de activiteit van de populaties van haarcellen. Om te bestuderen van de activiteit van de populaties van cellen in de zebravis-zijlijn, microphonic potentieel en afferent actie potentials zijn gebruikt voor het meten van de opgetelde mechanosensitive en postsynaptisch reactie eigenschappen van individuele neuromasten²³ ^,²⁴. Helaas, noch lokale potentiële veldmetingen als geheel-cel opnames hebben de ruimtelijke resolutie te lokaliseren waar de activiteit plaatsvindt in afzonderlijke cellen of meten van de activiteit van elke cel binnen een populatie. Meer recentelijk, calcium kleurstoffen en GECIs zijn tewerkgesteld te omzeilen deze uitdagingen²⁵^,²⁶.

In zebrafish, hebben GECIs bewezen een krachtige aanpak van de behandeling van haar-cel functie als gevolg van het relatieve gemak voor het creëren van transgene zebravis en de optische helderheid van larven²⁷. In zebrafish larven zijn haarcellen in het binnenoor, alsmede de dwarslijn systeem aanwezig. De zijlijn bestaat uit rozet-achtige clusters van haarcellen genoemd neuromasten die worden gebruikt voor opsporing van lokale wijzigingen in water beweging (Figuur 1). De zijlijn is vooral handig omdat het extern is gelegen langs het oppervlak van de vis. Deze toegang heeft het mogelijk gemaakt te stimuleren van de haarcellen en meten van calcium signalen optisch in intact larven. Globaal, het gemak van Transgenese, transparantie van de larven en de ongeëvenaarde toegang van dwarslijn haarcellen heb zebrafish een onschatbare waarde model om te bestuderen van de activiteit van de haarcellen in vivo. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van zoogdieren systemen waarin haarcellen zijn omringd door benige structuren van het binnenoor. Dit gebrek aan toegang heeft het zeer moeilijk te verwerven van functionele in vivo metingen van zoogdieren haarcellen gemaakt.

Het protocol hier geschetst wordt beschreven hoe om te controleren MET kanaal - en presynapse-afhankelijk wijzigingen aan calcium binnen individuele haarcellen en tussen cellen binnen neuromasten in larvale zebrafish. Dit protocol maakt gebruik van een gevestigde transgene zebrafish lijn die een membraan-gelokaliseerde GCaMP6s onder de controle van de Haarcel specifieke myosin6b promotor²⁸uitdrukt. Dit membraan lokalisatie posities GCaMP6s op te sporen van calcium toestroom via ionenkanalen gelegen in het plasma-membraan die essentieel zijn voor Haarcel functie. Bijvoorbeeld, membraan-gelokaliseerde GCaMP6s calcium kan detecteren toestroom via BMO kanalen in de apicale haar bundels en door Ca_V1.3 kanalen in de buurt van synaptic linten aan de voet van de cel. Dit staat in contrast met het gebruik van GECIs in het cytosol, gelokaliseerd als cytosolische GECIs detecteren signalen van de calcium die een combinatie van BMO en Ca_V1.3 kanaal activiteit evenals calcium bijdragen uit andere bronnen zijn (bijvoorbeeld, winkel release). Dit protocol beschrijft hoe te immobiliseren en te verlammen de transgene larven GCaMP6s voorafgaand aan de beeldvorming. Het beschrijft dan hoe te bereiden en een vloeistof-jet gebruiken om te doen afwijken van de bundels van de haar ter stimulering van de zijlijn haarcellen in een gecontroleerde en reproduceerbare manier. Representatieve gegevens die kan worden bereikt met behulp van dit protocol worden gepresenteerd. Voorbeelden van gegevens die bewegingsartefacten vertegenwoordigen worden ook gepresenteerd. Control-experimenten die worden gebruikt om te controleren van de resultaten en sluiten artefacten worden beschreven. Tot slot, een methode om ruimtelijke calcium signalen in de Fiji-software te visualiseren is beschreven. Deze analyse van Fiji is aangepast van tevoren vastgelegde visualisatie methoden ontwikkeld met behulp van MATLAB⁵. Over het geheel genomen schetst dit protocol een krachtige voorbereiding techniek die gebruikmaakt van GECIs in larvale zebrafish te meten en te visualiseren Haarcel calcium dynamiek in vivo.

Protocol

Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de Commissie gebruik dier op de National Institutes of Health in dierenstudie protocol #1362-13.

Opmerking: Dit protocol gaat ongeveer 0,5 tot 1 h om uit te voeren zonder onderbrekingen als de oplossingen en de apparatuur zijn voorbereid en vooraf ingesteld. Dit protocol is geoptimaliseerd voor Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)⁵^,²⁹ zebrafish larven op 3-7 dagen na bevruchting (dpf). Deze transgene lijn spreekt een membraan-gelokaliseerde GCaMP6s (zebrafish codon-geoptimaliseerde) specifiek in alle zebrafish haarcellen. Voorafgaand aan de beeldvorming, worden larven gefokt in de embryo buffer (E3) onder standaardomstandigheden. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor de catalogus nummers van alle uitrusting en drugs vereist voor het uitvoeren van dit protocol.

1. bereiding van de oplossingen

Bereiden 1 mL van α-bungarotoxin (125 µM), die wordt gebruikt om te verlammen zebrafish larven tijdens functionele beeldvorming.
1. Voeg 968.6 µL van ultrazuiver steriel water en 33.4 µL van fenol rood tot 1 mg van α-bungarotoxin (hele fles). Maak 100 µL aliquots en sla ze bij-20 ° C.
  Let op: Draag handschoenen en voorbereidingen te treffen in de kap, bij de behandeling van α-bungarotoxin poeder. Handschoenen zijn ook aangeraden bij het verwerken van de α-bungarotoxin-oplossing.
Bereiden 1 L 60 x embryo buffer (E3).
1. 17.2 g NaCl en 0,76 g KCl poeder aan 954.4 mL ultrazuiver water toevoegen.
2. 19,8 mL 1 M CaCl₂, 19,8 mL 1 M MgSO₄en 6 mL 1 M HEPES-buffer toevoegen aan de oplossing. Bewaar de 60 x E3 stockoplossing bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
Bereiden van 10 L voor 1 x E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0.33 mM CaCl₂; 0.33 mM MgSO₄, pH 7,2), dat is een oplossing die larven worden doorgegeven voorafgaand aan functionele beeldvorming.
1. 167 mL van 60 x E3-stockoplossing toevoegen aan 10 L ultrazuiver water om een 1 x E3-oplossing te maken. Bewaar de 1 x E3-oplossing bij kamertemperatuur (RT) voor maximaal 6 maanden.
Bereiden van neuronale buffer (NB) (140 mM NaCl; 2 mM KCl; 2 mM CaCl₂; 1 mM MgCl₂; 10 mM HEPES-buffer, pH 7.3), die wordt gebruikt om te dompelen larven tijdens functionele beeldvorming.
Opmerking: 1 x E3 kan ook worden gebruikt voor functionele beeldvorming, maar de reacties zijn meer robuust en betrouwbaar in NB.
1. Combineren van 28 mL NaCl van 5 M, 1 M KCl 2 mL, 2 mL 1 M CaCl_2,1 mL van de 1 M MgCl₂en 10 mL van de 1 M HEPES-buffer met 957 mL ultrazuiver water. Breng de pH aan 7.3 met 1 M NaOH.
2. Filter steriliseren. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  Opmerking: Voorleggen aan RT met behulp van de oplossing.
Bereiden MS-222 voorraad (tricaïne, 0,4%), die wordt gebruikt om de anesthetize van de larven.
1. Los op 400 mg ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate zout en 800 mg Na₂HPO₄ in 100 mL gedestilleerd water. Breng de pH op 7. Bewaren bij 4 ° C.
2. Gebruik van 0,04% MS-222 tot larven tijdens immobilisatie en α-bungarotoxin injectie anesthetize.

2. voorbereiding van de Imaging kamer en Pins

Bereiden de imaging kamer(Figuur 2). Breng een dunne laag van hoog vacuüm Siliconenvet aan de onderkant van de perfusie kamer langs de randen van het plein waaraan het dekglaasje aan zal houden. Laat geen hiaten in het vet. Druk stevig naar beneden rond de randen van het dekglaasje aan te verzegelen het aan de beeldvorming kamer. Vegen weg overtollige vet.
Opmerking: Een 5 mL-spuit met een tip van 200 µL micropipet wordt aanbevolen voor vet toepassing.
De siliconen encapsulant te vullen van de kamer voor te bereiden. Meng een 10:1-verhouding (in gewicht) van base naar uithardende agent. Meng voorzichtig, maar grondig minimale bubbels maken met behulp van een micropipet-tip.
1. Giet de silicone encapsulant op de aangebrachte dekglaasje aan zodat het niveau met het oppervlak van de kamer. Ongeveer 3 g encapsulant vult de kamer.
2. Zorgvuldig Tik op de kamer tegen een vlakke ondergrond terwijl het horizontale of gebruik een micropipet tip (onder een stereomicroscoop) te verwijderen of te trekken van bubbels tot aan de rand van de kamer.
3. Plaats van de kamer in een laboratorium oven's nachts bij 60-70 ° C. Plaats de kamer binnenkant van een geventileerde doos om ervoor te zorgen dat hete lucht niet rechtstreeks op de encapsulant te vermijden dat er rimpelingen is waait.
Fijne pincet en wolfraam draad om de pinnen gebruikt om te immobiliseren van larven via de kop en de staart (Figuur 2B1) op de verharde encapsulant gebruiken.
1. Om hoofd pinnen, een stuk van 0,035 mm wolfraam draad te houden in de ene hand onder een stereomicroscoop. Met behulp van fijne pincet in de andere hand, buig de draad 1 mm omhoog vanaf het einde van 90°. Wisselen van de verlostang voor fijne schaar en knip 1 mm na de bocht naar het maken van de pin.
2. Herhaal stap 2.3.1 een 0,025 mm draad gebruikt te maken van de staart pennen, maar verlaten van 0.5 mm draad aan weerszijden van de bocht. Gebruik pincet te voegen de pinnen in de geharde encapsulant op de kamer (voor opslag).

3. voorbereiding van naalden van verlamming en stimulatie

Bereiden hart injectie naalden glas haarvaten met een gloeidraad. Trek naalden naar een innerlijke tip diameter van 1 – 3 µm (Figuur 2C).
Vloeistof-jet naalden met glazen capillairen zonder een gloeidraad voor te bereiden. Trek met een dunne, lange tip die doorbroken met de juiste tip diameter worden kan naalden.
1. De dunne, lange uiteinde van de vloeistof-jet naald afbreken door wrijven loodrecht tegen een andere vloeistof-jet naald of een keramische tegel net boven waar de naald tip kan worden gebogen om te maken een innerlijke tip diameter van 30-50 µm [Figuur 2C (middelste afbeelding) en Figuur 3 A2]. Zorgt ervoor dat de pauze is zelfs over de tip (Figuur 2C, middelste afbeelding) en niet gekarteld of te groot (Figuur 2C, rechterafbeelding) te garanderen zelfs en nauwkeurige fluid flow tijdens Haarcel stimulatie.
  Opmerking: Een naald polijstmachine kan worden gebruikt om de gekartelde einden.

4. worden vastgehouden en Immobilizing van larve naar Imaging kamer

De larve van een Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) in ongeveer 1 mL E3 buffer met 0,04% Baden MS-222 voor 1-2 min op het silicone encapsulant oppervlak van de beeldvorming kamer pas de larve immobiel is of niet reageert te raken.
1. Onder een stereomicroscoop, plaatst u de larve in het midden van de kamer van de perfusie dus het ligt plat op zijn kant tegen de siliconen encapsulant.
  Opmerking: Voor consistentie, mount altijd larven aan dezelfde kant (bijvoorbeeld rechts onderaan, linker kant naar boven) (Figuur 2B1).
Met behulp van fijne pincet, een 0,035 mm head pin naar beneden loodrecht naar de larve en de kamer brengen. Plaats de pin van het hoofd tussen de oog en otic blaasje en down in de encapsulant (cijfers 2B1 en 2B2). Gebruik een tweede reeks van de verlostang om te stabiliseren van de larve langs de dorsale of ventrale zijde terwijl vastzetten. Ervoor zorgen dat het horizontale deel van de pin contact op met de larve en doet niet helemaal in de encapsulant drukken. Hoek van de pin ventrally (Figuur 2B1) of iets wijst naar de voorste van de vis te voorkomen bemoeien met latere hart injectie en Haarcel imaging.
1. Voeg met behulp van de verlostang een 0,025 mm staart pin in de chorda zo dicht mogelijk aan het einde van de staart (Figuur 2B1).
  Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat zich uitstrekt van de larve. PIN de larve plat. Ogen moet bovenop (Figuur 2B1). Dit is zeer belangrijk voor het gemak van hart injectie (Figuur 2B2-B2', stap 5), vergemakkelijking van een wenselijk imaging vliegtuig (Figuur 1B1-B2'', stappen 8 en 9), en kwantificeren van de intensiteit van de vloeistof-jet stimulus ( Figuur 3A3, stap 7).

5. injectie van α-Bungarotoxin in het hart holte te verlammen larve

Opmerking: Draag handschoenen bij het verwerken van α-bungarotoxin.

Centrifugeer het α-bungarotoxin monster kort voorafgaand aan het gebruiken om te voorkomen dat de verstopping van de hart injectie naald.
1. Aanvulling funderingsput 3 µL van α-bungarotoxin oplossing in een hart injectie naald met behulp van een gel laden pipette uiteinde. Laad de oplossing gelijkmatig tot aan de vingertop met geen bubbels.
2. De naald van de injectie hart invoegen door een houder van de pipet gekoppeld aan een handmatige micromanipulator. Onder een stereomicroscoop, plaats de naald zo uitgelijnd loodrecht op de as A-P van de vastgezette en narcose larven, naar beneden onder een hoek van ongeveer 30° is.
3. De houder van de pipet verbinden met de druk injector. De volgende voorgestelde instellingen toepassen: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s, en Pcompensation = 5 hPa. Een bolus injecteren de oplossing om te testen of de naald tip patent is.
4. Zoekt u een kleine wolk van de rode oplossing (van fenol rood) om de punt van de naald. Als geen rode kleur wordt gezien, heel voorzichtig schrapen het topje van de naald tegen de rand van een PIN-code en probeer het opnieuw totdat de naald patent is. Als alternatief, trek een naald met een grotere opening van de tip.
Verder de naald naar het hart, totdat het raakt de huid buiten het hart (Figuur 2B2). Druk op de naald in de larve en zoekt u de inspringing voor de cel pigment op de huid voor het hart om ervoor te zorgen dat naald is gepositioneerd in het juiste vliegtuig ten opzichte van de larve (Figuur 2B2').
1. Verder de naald verder totdat het de huid doorboort en het hart holte voert. Trek de naald iets terug. Injecteren een bolus van α-bungarotoxin in het hart holte. Kijk voor de inflatie van het hart holte of rode kleurstof invoeren van de holte.
Spoel zachtjes de larve 3 keer met 1 mL NB te verwijderen van de resterende MS-222. Verwijder nooit alle van de vloeistof. Handhaven van larve in ongeveer 1 mL NB op de perfusie-zaal.
Opmerking: Zorgen dat larvale hartslag en doorbloeding robuust blijven na het vastzetten en hart inspuiten en gedurende het gehele imaging experiment.

6. bereiding van de Microscoop en vloeistof-jet Setup

Monteren van een rechtop confocal microscoop met behulp van de componenten, beschreven in de Tabel van de materialen: een confocal microscoop met een 488 nm laser en passende filters, Microscoop software te controleren en coördineren van beeldvorming en stimulatie, 10 x-air doelstelling, 60 x water doelstelling, piëzo-Z objectieve scanner (voor z-stacks), high-speed camera, circulaire kamer adapter, gemotoriseerde stadium en stadium invoegen adapter. Verwijzen naar Zhang et al.²⁹ voor extra opties en begeleiding op Microscoop opstellingen.
Monteren van de vloeistof jet bestaat uit 3 hoofdonderdelen: een vacuüm en drukpomp, high-speed druk klem en hoofd stadium (ook beschreven in de tabel van materialen). Gebruik de snelle druk klem om controle van de timing en de duur van druk of vacuüm kwijting uit de hoofden fase en in de vloeistof-jet pipet.
1. Sluit de uitgang van de hoofd fase tot de vloeistof-jet Pipetteer houder via dikwandige Siliconen slang.

7. aanpassing van de larve en vloeistof-jet

Opmerking: Er zijn 3 vliegtuigen van belang binnen elke neuromast: (1) de toppen van de haar bundels (Figuur 3A3: de kinocilia, gebruikt voor het meten van de intensiteit van de stimulus); (2) de haren-bundel MET vliegtuig (Figuur 1B1-B1': de basis van de apicale haar bundels waar BMO-kanaal-afhankelijke calcium signalen worden gedetecteerd); en (3) de synaptische vliegtuig (Figuur 1B2-B2': waar de presynaptische calcium signalen aan de voet van de Haarcel worden gedetecteerd). Deze vliegtuigen zijn aangegeven in Figuur 1A.

Aanvulling funderingsput 10 µL van NB in een behoorlijk gebroken vloeistof-jet naald (uit stap 3.2) met behulp van een gel laden tip. Laad de oplossing gelijkmatig tot aan de vingertop met geen bubbels. Steek de naald in de pipet houder verbonden aan de gemotoriseerde micromanipulator.
Plaats de perfusie-zaal in een circulaire kamer adapter in het werkgebied van de Microscoop.
Opmerking: Voor consistentie, altijd plaats de larve in dezelfde afdrukstand (bijvoorbeeld het cupje met de larve met het zitvlak richting vloeistof jet en ventrale zijde naar richting de experimentator).
1. Verplaats de gemotoriseerde fase zodat de larve in het midden van het gezichtsveld. Draai de circulaire kamer-adapter zodat de as A-P van de larve is ruwweg afgestemd op het traject van de vloeistof-jet naald.
2. Met doorvallend licht en differentiële inmenging contrast (DIC) brengen de larve in beeld en centreer het kader van de doelstelling van 10 x. Verhogen van de doelstelling van 10 x.
Met behulp van de gemotoriseerde micromanipulator, neerhalen de vloeistof-jet naald in het midden van het gezichtsveld zodat het brandt door de doorvallend licht en nauwelijks raken de NB-oplossing.
1. Het doel van de 10 x lager. Focus op de larve ter bevestiging van de locatie. Focus omhoog te vinden van de vloeistof-jet naald. Verplaats de vloeistof-jet naald met de micromanipulator in de x - en y - assen in een positie parallel aan de dorsale zijde van de vis.
2. Focus terug op de larve. Breng de naald omlaag in de z-as. Plaats de naald langs de dorsale zijde van de vis en ~ 1 mm afstand van het lichaam (Figuur 3A1).
3. Zorgvuldig verplaatsen de circulaire kamer-adapter (indien nodig) om ervoor te zorgen dat de naald van de vloeistof-jet wordt uitgelijnd tussen de A-P middellijn van de larve (Figuur 3A1).
4. Verplaats de gemotoriseerde fase te plaatsen van de neuromast van belang in het midden van het gezichtsveld. Houd het uiteinde van de vloeistof-jet naald langs de dorsale zijde van de vis. Raak niet de tip van de vloeistof-jet naald aan de larve of het oppervlak van de kamer.
Schakel over naar de 60 x water doelstelling. Ervoor zorgen dat de doelstelling wordt ondergedompeld in de NB-oplossing. Gebruik de fijne focus om te zoeken met behulp van een neuromast overgebracht licht en DIC optica.
Opmerking: Deze setup is ontworpen voor het stimuleren van neuromasten langs de primaire posterieure zijlijn. Haarcellen binnen deze neuromasten inspelen op de voorste of achterste gestuurde vloeistofstromen. Zie Chou et al.³¹ voor een nauwkeurige kaart van de vloeistof gevoeligheid van de neuromast binnen de dwarslijn systeem.
1. Plaats de naald van de vloeistof-jet met de micromanipulator zodat er 100 µm van de buitenste rand van de neuromast (Figuur 3A2).
  Opmerking: Kies neuromasten die duidelijke topdown uitzicht een (cijfers 1B1'-B2' en Figuur 3A3) in plaats van kant-hoek weergaven (Figuur 1-C1-C2). Een heldere top-down mening zorgt voor gelijktijdige beeldvorming van alle apicale haar bundels in een enkel optische vliegtuig of imaging van synaptic gebieden in minder optische vlakken (Figuur 3A3).
2. Zich richten tot de toppen van de apicale haren-bundels (kinocilia) (Figuur 1A, cijfers 3A2 en 3A3). De bodem van de vloeistof-jet naald moet in focus in dit vliegtuig.
Stel de high-speed druk klem van de handleiding op externe modus input ontvangen de beeldbewerkingssoftware.
1. Nul de high-speed druk klem door de "nul" knop te drukken. Gebruik de set-punt-knop om de rust druk licht positief (~ 2 mmHg). Bevestig de rust output van de klem van de high-speed druk met behulp van een manometer van de PSI gekoppeld aan de hoofd fase-uitvoer.
  Opmerking: Stel een licht positieve druk in rust om te voorkomen dat de geleidelijke opname van vocht in de vloeistof-jet naald na verloop van tijd. Als vloeistof de leidingen verbonden met de vloeistof-jet invoert en het hoofd stadium bereikt, kan het schade aan de apparatuur.
2. Het bepalen van de druk die nodig is ter stimulering van de haar bundels. Gebruik een 0,125 en 0,25 V-ingang (6,25 en 12,5 mmHg) voor 200 – 500 ms toe te passen een stimulans van de test (Figuur 3A3-A3'').
  Opmerking: De hoge druk klem converteert een spanning input (van software of andere apparaten die verbinding met de BNC-poort op de poort van hoge snelheid druk klem opdracht maken) in druk die is ontslagen uit het hoofd podium, en uiteindelijk, de vloeistof-jet naald (1.0 V = 50 mmHg, terwijl -1,0 V =-50 mmHg). In deze configuratie (zie stap 7.2) positieve druk (push) afbuigt haar bundels naar de voorste, en negatieve druk (pull) afbuigt haar bundels naar de zitvlak.
3. Met doorvallend licht en DIC optica samen met een schaal bar, meet de afstand van de uitwijking van de 6,25 en 12,5 mmHg stimuli van de uiteinden van het haar bundels, de kinocilia (Figuur 1A en cijfers 3A3-3''). Kies een druk die de bundels (als 1 hechte eenheid beweegt) een afstand van ongeveer 5 µm (Figuur 3A3''). Zorg ervoor dat de uiteinden van de kinocilia in focus de hele tijd blijven.
4. Verplaats de vloeistof-jet ± 25 µm langs de as A-P van de larve te vinden van een afstand en de druk die de toppen van de kinocilia 5 µm afbuigt.
  Opmerking: Met behulp van GCaMP6s in larven 3 – 7 dpf, 5 µm verlegging moeten bereiken in de buurt van GCaMP6s calcium signalen verzadigen en moeten niet beschadigen apicale haren-bundel structuren (Figuur 3A3''). Kleinere verplaatsing afstanden kunnen worden gebruikt voor het leveren van niet-verzadigen van prikkels (Figuur 3A3'). Verplaatsing afstanden > 10 µm zijn moeilijk te schatten ( Figuur 3A3'' ') en na verloop van tijd schadelijk kan zijn. Signaal intensiteit is afhankelijk van de leeftijd van de neuromast (en kinocilial hoogte) evenals de indicator gebruikt. Controleer de bij van de vloeistof-jet naald in elke richting (druk/push- en vacuüm/pull) periodiek tijdens imaging. Vloeistof-jet naalden gemakkelijk verstoppen en vacuüm bij verliezen, maar zij behouden residuele druk bij. Gebruik DIC optica en een korte test stimulans in elke richting om te controleren voor vloeistof-jet bij.
5. Focus van het monster in het vliegtuig van belang (bijvoorbeeld de basis van de apicale haar bundels of de basis van de Haarcel in de synaptische vlak; Figuur 1 B1-B2').

8. imaging overname Procedure optie 1: Single-vliegtuig overname

Opmerking: Alle beeldvorming geschetst in dit protocol wordt uitgevoerd op RT.

Stel de beeldbewerkingssoftware te verwerven van een streaming of ononderbroken verwerving van de 80-frame met een capture elke 100 ms om een beeldfrequentie van 10 Hz.
Set krijgen, diafragma, en laser bevoegdheid te optimaliseren signaal detectie, maar vermijd verzadiging, photobleaching en lawaai. Voorbeeld instellingen voor een Opterra/SFC zijn als volgt: 488 nm laser macht: 50 (haren-bundel MET vliegtuig), 75 (synaptic vliegtuig); 35 µm gleuf; krijgen = 2.7; EM winst = 3900.
Opmerking: 2 X weggooien als signalen te zwak of lawaaierige zijn of buitensporige photobleaching toepast. 2 x weggooien wil verbeteren signaal detectie ten koste van ruimtelijke resolutie.
Selecteer een stimulans om te leveren tijdens de 80-frame (8 s) overname na frame 30, 3 s.
Opmerking: Sommige voorbeeld prikkels zijn als volgt: 200 ms (+ of - 0,25 V) maximaal 2 s (+ of - 0,25 V) stap in de richting van de voorste of achterste op het identificeren van de directionele gevoeligheid van elke haarcel; 2 s, 5 Hz blokgolf (0,25 V voor 200 ms,-0.25 V voor 200 ms, doorlopend 5 keer) te stimuleren van al haar cellen tegelijk. Een positieve druk (anterior stimulus) zal de helft van de haarcellen activeren. Een negatieve druk (posterieure stimulus) zal de andere helft van de haarcellen activeren. Zorg ervoor dat de prikkel software of apparaat retourneert de druk klem terug naar 0 V nadat de prikkel is voltooid.
Maatregel mechanosensitive calcium reacties. Focus op basis van de apicale haar bundels (figuren 1A en 1B1-B1') en beeldacquisitie beginnen.
Opmerking: Als de neuromast duidelijk vanaf de bovenkant naar beneden gezien wordt (Figuur 1B1-B1'), alle apicale haar bundels kunnen gelijktijdig image worden gemaakt in een enkel vliegtuig.
Maatregel presynaptische calcium reacties. Focus op de basis van de haarcellen (figuren 1A en 1B2-B2') en beeldacquisitie beginnen.
Opmerking: Als de neuromast duidelijk wordt bekeken vanaf de bovenkant naar beneden (Figuur 1B2-B2'), de presynaptische imaging vliegtuigen van alle haarcellen kunnen worden verkregen in 2-3 vliegtuigen set 2 µm uit elkaar. GS [myo6b:ribeye-mcherry] transgene vis kan worden gebruikt voor het identificeren en opsporen van exocytose linten en sites van calcium vermelding²⁹.

9. imaging overname Procedure optie 2: Multi vliegtuig overname

Tune de piezo-Z verbonden met de doelstelling van de 60 x voor snelle overnames (12-18 ms). Zorg ervoor dat max-snelheid instellingen zijn ingeschakeld.
Maak een overname van de Z-stack met een piëzo-Z. Het verwerven van de haren-bundel MET activiteiten in 5 vliegtuigen met een stap grootte van 0,5 µm. ophaal de presynaptische signalen in 5 vliegtuigen met een stap grootte van 1 µm.
Stel de framesnelheid tot 10 Hz. Elk frame zal worden gevangen elke 20 ms en elke Z-stack elke 100 ms.
Instellen van de overname voor 400 frames of 80 Z-stacks bij 10 Hz voor een 8 s streaming acquisitie.
Laser macht, diafragma en winst te optimaliseren signaal detectie, maar vermijd verzadiging, photobleaching en lawaai instellen. Voorbeeld instellingen voor een Opterra/SFC-systeem zijn als volgt: 488 nm laser vermogen: 75 (haren-bundel MET vliegtuig), 125 (synaptic vliegtuig); 35 µm gleuf; krijgen = 2.7; EM winst = 3900.
Opmerking: Toepassing van 2 X weggooien als signalen te zwak zijn,luidruchtig, of buitensporige photobleaching hebben. 2 x weggooien wil verbeteren signaal detectie ten koste van ruimtelijke resolutie.
Selecteer een stimulans om te leveren tijdens de overname begint bij frame 150, na 3 s.
Ga verder het protocol als beschreven boven voor enkel vliegtuig verwerving, maar centreren van de Z-stack in de apicale of basale vlakken (stappen 8.4 en 8.5).

10.: Farmacologische regelblok van alle Evoked Calcium signalen

Opmerking: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) ethaan-N, N, N′, N′ Dinatriumethyleendiaminetetra azijnzuuroplossing) behandeling is een kritische controle bij de eerste vaststelling van dit protocol.

Na het voltooien van de stappen 8 of 9, door de NB te vervangen door 1 mL NB met 5 mM BAPTA te klieven van de tip-links moeten gate apicale BMO kanalen gelegen in haar bundels.
Incubeer gedurende 10-20 min op RT.
BAPTA 3 keer met 1 mL NB. afwassen
Herhaal stap 8 of 9. Na de BAPTA behandeling, moet er geen verandering in GCaMP6s fluorescentie in reactie op de stimulatie van de vloeistof-jet in de apicale haar bundels of synaptic vliegtuig. Als de wijzigingen in GCaMP6s fluorescentie aanhouden, deze zijn niet waar calcium signalen en mogelijk beweging artefacten.

11.: Farmacologische regelblok van exocytose Calcium signalen (optioneel)

Na het voltooien van de stappen 8 of 9, door de NB te vervangen door NB met 10 µM isradipine met 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) voor het blokkeren van de L-type calcium kanalen aan de Haarcel presynapse.
Incubeer gedurende 10 min op RT.
Zonder het uitvoeren van een wasbeurt, herhaalt u stap 8 of 9. Na de behandeling, moet er wel GCaMP6s fluorescentie wijzigingen in reactie op de stimulatie van de vloeistof-jet in de apicale haren-bundels, maar niet de synaptische vliegtuig. Als de wijzigingen in GCaMP6s fluorescentie aanhouden in de synaptische vlak, deze zijn niet waar calcium signalen en mogelijk beweging artefacten.

12. beeld verwerking en grafische weergave van gegevens

Opmerking: Fiji (stappen 12,1 – 12.1.5) en een grafische programma (stappen 12.2-12.2.3) gebruiken voor stap 12. StackReg, TurboReg (stap 12.1.3), Time Series Analyzer V3 (stappen 12.1.4–12.1.6), en Fiji plugins zijn ook vereist (Zie Tabel van materialen).

Een reeks afbeeldingen opent in Fiji, een single-vliegtuig tijdreeksen (80-frame enkel vliegtuig) of de Z-stack tijdreeksen (400-frame multi vliegtuig). Klik op "File", selecteer "Importeren" van het drop-down menu, en klik op "Afbeeldingsvolgorde."
1. Voor een Z-stack keer serie, Z-project telkens punt (5 vliegtuigen per timepoint) om een reeks van 80-frame image te maken. Klik op "Afbeelding", selecteer "Stapels" in het drop-down menu, selecteer "Tools" in het drop-down menu en klik op "Gegroepeerde Z-project." Selecteer "Gemiddelde intensiteit" als de projectiemethode, en voer "5" voor "De grootte van de groep".
  Opmerking: Elk vlak binnen de Z-stack kan afzonderlijk worden geanalyseerd voor meer ruimtelijke informatie.
2. Verwijder de eerste 1 s (10 frames) van de 8 s (80 frames) van Beeldacquisitie. Klik op "Afbeelding", selecteer "Stapels" in het drop-down menu, selecteer "Tools" in het drop-down menu en klik op "Make Substack." Voer "11-80" voor "Segmenten".
  Opmerking: Deze substack zal worden verwezen als stk1.
3. Registreer de Afbeeldingsvolgorde (stk1) met behulp van de StackReg plugin³². Klik op de "Plugins", selecteer "StackReg" en selecteer "Vertaling" als de methode voor de registratie van de tijdreeks van 70-frame.
  Opmerking: Deze geregistreerde substack zal worden verwezen als stk2.
4. Gebruik de tijden Series Analyzer V3 plugin om uit te pakken van de metingen van de intensiteit (F) GCaMP6. Plaats een gebied van belang (ROI) op apicale haar bundels of presynaptische sites in stk2. Verwijzen naar de website van ImageJ (Zie Tabel van materialen voor de link) voor instructies over het gebruik van Time Series Analyzer V3.
  Opmerking: Gebruik een circulaire 1 – 2 µm ROI voor apicale haar bundels en een circulaire 3 – 5 µm ROI voor de synaptische vliegtuig (cijfers 4A1 en 4A2).
5. Selecteer de parameters van de meting. Klik op "Analyze," Selecteer "Set Measurement" en zorg ervoor dat alleen "Mean grijswaarde" is geselecteerd.
6. Selecteer alle ROIs in de ROI-manager, en gebruik de multi functie voor het genereren van (F) intensiteitswaarden voor elke ROI in de tijdreeks. Binnen de Manager van de ROI, klik op "Meer >>" en selecteer "Multi maatregel" in het drop-down menu.
(F) waarden worden uitgezet. Plak de waarden (F) vanuit de "Multi maatregel" resultaten in een grafische programma een xy grafiek maken (cijfers 4A1 'en 4A2').
Opmerking: Maken van (X) waarden handmatig of gebruik de tijdstempel van de metagegevens.
1. Kwantificeren van de basislijn (F_o) voor elke ROI door het gemiddelde van de waarden van de (F) in het grafische programma van de frames voorafgaande prikkel 1 – 20.
2. Voor elke ROI, kunt u de (F_o) aftrekken door de waarden van de (F) op elke timepoint om ΔF (F-F_o) waarden te maken. Replot, indien gewenst.
3. Berekenen en uitzetten ΔF/F_o. Voor elke ROI, verdeel de ΔF meting door (F_o) en replot (cijfers 4A1'' en 4A2'').

13. image Processing en warmte kaart vertegenwoordiging van Spatio-temporele Calcium signalen

Opmerking: Vorige werk ruimtelijke warmte kaart om weergave te maken van calcium signalen in zebrafish dwarslijn haarcellen hebben aangepaste software geschreven in Matlab⁵^,²⁸gebruikt. Deze analyse is aangepast voor de open source analysesoftware Fiji³³. Gebruik Fiji voor alle stappen zoals hieronder beschreven. StackReg en TurboReg Fiji plugins zijn ook vereist (Zie Tabel van materialen).

Stappen 12,1 – 12.1.3 voor elke Z-stack of enkel vliegtuig tijdreeksen te maken van de geregistreerde substack aangeduid als stk2.
Gebruik stk2 om een basislijn-afbeelding te maken. Klik op "Afbeelding", selecteer "Stapels" van het drop-down menu, en selecteer "Z Project". Selecteer "Gemiddelde intensiteit" voor "Type van de projectie" en "1" voor "Start slice" en "20" voor "Stop slice" invoeren.
Opmerking: Deze Z-projectie zal worden verwezen als baselineIMG.
1. Stoffelijk bin de 70-(F) afbeelding framereeks (stk2) in 14 0,5-s opslaglocaties. Klik op "Afbeelding", selecteer "Stapels" in het drop-down menu, selecteer "Tools" in het drop-down menu en klik op "Gegroepeerd Z Project". Selecteer "Gemiddelde intensiteit" als de "projectiemethode", en voer 5 voor "Grootte van de groep."
  Opmerking: Deze gegroepeerde Z-projectie zal worden verwezen als stk2bin en F in Figuur 5.
2. Aftrekken de pixelwaarde van basislijn (baselineIMG) van de binned (F) Afbeeldingsvolgorde (stk2bin) om een reeks ΔF afbeelding te maken. Klik op "Proces" en selecteer "Afbeelding Calculator" in het drop-down menu. Selecteer stk2bin als "Image1" en baselineIMG als"Image2." Selecteer "Aftrekken" voor "Operation."
  Opmerking: Deze basislijn-afgetrokken Z-projectie wordt aangeduid als stk2binBL en F-BL = ΔF in Figuur 5.
Kies een opzoektabel (LUT) van keuze te geven ΔF Afbeeldingsvolgorde (stk2binBL). Klik op "Afbeelding", selecteer "Opzoektabellen" uit het drop-down menu en klik op een LUT van keuze.
Opmerking: "Red Hot" is de LUT gebruikt in Figuur 5. Deze basislijn-afgetrokken Z-projectie met LUT wordt aangeduid als stk2binBL-LUT en ΔF LUT in Figuur 5.
1. Stel de minimale (min) en de maximale (max) helderheidswaarden voor stk2binBL-LUT. Klik op "Afbeelding", selecteer "Aanpassen" en klik op "Helderheid/Contrast". Stel de minimumwaarde achtergrondgeluiden verwijderen uit stk2binBL-LUT. De max waarden voor behouden van signalen van belang maar vermijden signaal verzadiging instellen [bijvoorbeeld 200 tot 1600 (12-bits afbeelding intensiteit bereik 0 tot en met 4095 =)].
  Opmerking: Gebruik dezelfde min en max waarden bij het maken van visuele vergelijkingen of vertegenwoordigingen. Een ΔF kalibratie LUT bar kan worden gegenereerd in Fiji voor elke reeks afbeeldingen LUT (bijvoorbeeld stk2binBL-LUT). Klik op "Analyze", selecteer "Tools", en klik op "Kalibratiebalk". Klik "Overlay" voor het genereren van een apart, individueel beeld met de LUT kalibratiebalk ter referentie.
2. Converteren van zowel de ΔF (stk2binBL-LUT)met de gewenste afbeelding van de LUTand het stoffelijk binned (F) (stk2bin) sequenties in RGB worden omgezet. Klik op "Afbeelding", selecteer "Type", en klik op 'RGB kleur'.
  Opmerking: De RGB-geconverteerde Z-projecties zal worden verwezen als stk2binBL-LUT-RGB en stk2bin-RGB, respectievelijk.
Bedekken de ΔF LUT beelden (stk2binBL-LUT-RGB) weggegooid (F) beelden (stk2bin-RGB). Klik op "Proces" en vervolgens "Afbeelding Calculator". Selecteer stk2bin-RGB als Image1 en stk2binBL-LUT-RGB als Image2. Selecteer "Transparant-nul" voor "Operation".
Opmerking: Als er teveel lawaai of de achtergrond in de ΔF LUT overlay, herhaal stap 13.3 de minimumwaarde te verhogen. Als er verzadiging, herhaal stap 13,3 en de max waarde verhogen.

14. beeld verwerking en Spatio-temporele warmte kaart vertegenwoordiging met behulp van een Macro van Fiji

Opmerking: In het volgende gedeelte verwijst naar een Fiji macro met de naam LUToverlay op basis van stap 13 die automatisch tot ruimtelijke warmte kaart vertegenwoordiging van GCaMP6s signalen leiden zal. Deze analyse vereist de opensource analyse software Fiji³³ en de plugins van het StackReg en TurboReg Fiji (Zie Tabel van materialen).

Downloaden van de Fiji LUT overlay macro (LUToverlay.ijm) bij dit protocol (Zie Aanvullende codering bestand).
Open een multi vliegtuig tijdreeksen of single-vliegtuig tijdreeksen (zie stap 12.1).
Klik op de "Plugins", selecteer "Macro's" tikken voort "Stormloop", en selecteert u de macro LUToverlay. Er verschijnt een dialoogvenster met de tekst "Tell me over uw Beeldacquisitie".
Opmerking: Voor het dialoogvenster de huidige nummers zijn voorgestelde waarden en kunnen worden gewijzigd volgens de instellingen die worden gebruikt door de experimentator. De waarden vermeld in het vak en onder zijn ingesteld voor een multi vliegtuig tijdreeksen met 400 beelden en 5 vliegtuigen per timepoint (stap 9).
Na "Aantal vliegtuigen per timepoint", geef het aantal vliegtuigen per timepoint (bv. voor stap 12.1.1 met behulp van een multi vliegtuig 400 tijdreeksen met 5 vliegtuigen per timepoint, voer "5"). Voor een enkel vliegtuig overname (bijvoorbeeld stap 8) Voer "1".
Opmerking: In de resterende dialoogvensters, voor een multi vliegtuig tijdreeksen, "Timepoints" verwijst naar het aantal beelden in de geprojecteerde Z-stack (bijvoorbeeldvoor stap 12.1.1 is dit 80 timepoints).
1. Gebruik de optie "Definiëren het bereik te analyseren" verwijderen van de eerste 1 s van de reeks afbeeldingen (bijvoorbeeld voor stap 12.1.2 Selecteer "11-80" te verwijderen van de eerste 10 frames en eerste 1 s).
2. Na "definiëren timepoints volgens basislijn", geef het aantal afbeeldingen die worden gebruikt om de basislijn-image te maken [bijvoorbeeld voor stap 13.2., voer "20" aan het gebruik van de afbeeldingen van de voorafgaande prikkel (11-30)].
3. Voer het aantal afbeeldingen naar de bin voor de overlay na "Timepoints per temporele bin". (bijvoorbeeld voor stap 13.2.2. Selecteer "5" 14 0,5-s opslaglocaties maken).
4. Nadat "Min intensiteit" en "Max intensiteit" de minimale en maximale helderheidswaarden invoeren die verwijdert achtergrondgeluid (minimum) en signalen van belang behouden terwijl het vermijden van verzadiging (maximaal).
5. Na "Kies een opzoektabel", selecteer de LUT gewenst voor de overlay. Klik op "OK".
  Opmerking: De macro zal klaar bent met het analyseren van de beelden volgens de instructies in stap 13 gepresenteerd. De beelden die worden gegenereerd door de macro zal ook de naam volgens de instructies in stap 13.
Sluit alle vensters van de analyse alvorens een nieuwe reeks van de afbeeldingen te verwerken.

Representative Results

Na myo6b:GCaMP6s-caax transgene vis zijn goed geïmmobiliseerdet en de stimulans van de vloeistof-jet wordt geleverd aan de zijlijn haarcellen, robuuste calcium signalen kunnen worden gevisualiseerd en gemeten (figuren 4 en 5, genomen op 2 X weggooien). Tijdens de vloeistof-jet stimulatie signalen calcium kan ofwel worden gemeten in de apicale haar bundels, waar BMO communicatiekanalen in reactie op prikkels, of aan de voet van haarcellen open, waar presynaptische Ca_v1.3 calcium kanalen leiden transmissie tot. Een representatief voorbeeld van calcium reacties in deze regio's met een individuele neuromast worden weergegeven in Figuur 4A1-A2''. In dit voorbeeld, werd een 2-s 5 Hz vloeistof-jet stimulans om te activeren alle haarcellen binnen de representatieve neuromast afgeleverd. Tijdens de stimulus, robuuste calcium signalen kunnen worden opgespoord in haar bundels (Figuur 4A1-A1'', reacties van 8 haar bundels worden weergegeven). In dit systeem weergeven bijna alle volwassen haarcellen deze apicale toestroom van calcium⁵. Daarentegen binnen de dezelfde neuromast, er zijn aantoonbaar calcium signalen in het basale, synaptic vliegtuig alleen een deelverzameling (~ 30%) van de haarcellen (Figuur 4A2-A2'', 4 cellen met presynaptische reacties worden weergegeven)⁵. De 4 groen ROIs Toon cellen met geen significante presynaptische calcium-signalen (Figuur 4A2-A2'') ondanks de robuuste apicale calcium signalen (Figuur 4A1-A1''). In dit representatieve voorbeeld (Figuur 4A1-A2''), gekleurde ROIs haar bundels in het apicale BMO vlak (Figuur 4A1) overeenkomen met hun lichamen van de cel in de basale synaptic vlak (Figuur 4A2). Hierbij benadrukt hoe beide signalen MET afhankelijke - en presynaptische-calcium kunnen worden gemeten binnen individuele haarcellen en tussen populaties van haarcellen.

De signalen van de calcium in zowel de haar bundels en op de presynapse kunnen grafisch worden uitgezet als raw (F) GCaMP6s intensiteit of ΔF/F_oGCaMP6s intensiteit (zie stap 12, cijfers 4A1'-A1'' en 4A2'-A2''). De grafieken van de GaMP6s (F) benadrukken dat de intensiteit van de fluorescentie basislijn voor elke cel kan verschillen (cijfers 4A1' en 4A2'). In de grafieken van de ΔF/F_oGCaMP6s, elke cel is genormaliseerd naar de waarde van de basislijn en de verandering van de relatieve intensiteit van de basislijn wordt uitgezet (cijfers 4A1'' en 4A2''). In zowel de (F) en ΔF/F_oGCaMP6s percelen, de signalen van de calcium in zowel de basale presynaptische vliegtuig de apicale haar bundel starten met het begin van de stimulus (grijze doos) en weigeren exponentieel na afloop van de stimulus. Tijdens de stimulus, calcium signalen in haar bundels snel stijgen en verzadigen als de sterkte van de uitwijking niet verandert (Figuur 4A1-A1''). In tegenstelling, de calcium-signalen binnen de subset van haarcellen met detecteerbare calcium signalen in de synaptische vlak, meer geleidelijk verhogen en zijn minder gevoelig voor verzadiging (Figuur 4A2-A2''). In de haarcellen zonder presynaptische calcium signalen (groene ROIs) blijven de calcium-signalen in de buurt van basislijn.

Naast deze grafische voorstellingen (Figuur 4), kunnen calcium signalen worden gevisualiseerd ruimtelijk binnen de hele neuromast in de tijdsverloop van de opname. Een voorbeeld van een Spatio vertegenwoordiging is afgebeeld in Figuur 5 voor presynaptische GCaMP6s signalen in het basale vlak voor een neuromast. In Figuur 5, zijn de belangrijkste stappen voor het verwerken van een reeks afbeeldingen voor ruimtelijke visualisatie zoals beschreven in stap 13 beschreven. Ten eerste, de raw beelden (F) GCaMP6s stoffelijk zijn weggegooid [Figuur 5: rij 1 (5 van de 14 opslaglocaties worden weergegeven); stap 13.2.1]. Vervolgens het beeld van de basislijn, berekend op basis van pre stimulans frames (stap 13.2), wordt afgetrokken van de signalen van de fluorescentie (F) GCaMP6s om ΔF beelden (Figuur 5: rij 2; stap 13.2.2). Vervolgens de ΔF grijswaardenafbeeldingen worden geconverteerd naar een kleur LUT (Figuur 5: rij 3, Red Hot LUT; stap 13,3). Tot slot, de beelden van de ΔF met de LUT conversie overlaymodus op het stoffelijk binned (F) beelden (Figuur 5, eerste rij) te onthullen de spatio signalen binnen de neuromast tijdens de stimulatie (Figuur 5: rij 4; stap 13.4). De kaarten van de hitte van ΔF GCaMP6s signalen geven beide waardevolle ruimtelijke en temporele informatie, dat is niet gemakkelijk te parseren uit van één ROIs en de grafieken gebruikt in Figuur 4. Warmte kaarten kunnen helpen bij het visualiseren van kritische Spatio informatie, met inbegrip van subcellular informatie met betrekking tot het begin en de duur van calcium signalen binnen elke haarcel, evenals de timing en intensiteit verschillen tussen haarcellen binnen het gehele neuromast.

Het is belangrijk om te verifiëren dat de grafieken en ruimtelijke warmte kaarten waar calcium signalen vertegenwoordigen en niet artefacten als gevolg van beweging. In dit protocol, motion artefacten kunnen zijn het resultaat van buitensporige drift of beweging van de larve of beweging als gevolg van vloeistof-jet stimulatie. Alle van deze artefacten zijn uitdagend om volledig te elimineren in deze in vivo voorbereiding. Terwijl registratie van beeldsequenties (stap 12.1.3) kunt corrigeren voor moet de meerderheid van de beweging in x - en y-axes, afbeeldingsreeksen met buitensporige verkeer in de z-as worden geïdentificeerd en verwijderd uit de analyses. Motie artefacten zijn makkelijkst te identificeren door graphing de calcium-signalen. Voorbeelden van GCaMP6s intensiteit wijzigingen die artefacten zijn en niet waar GCaMP6s signalen kunnen worden waargenomen op de apex (Figuur 4B1'-B1'') en basis (Figuur 4C1'-C1'') van haarcellen.

In de apicale haar bundels, motion artefacten gelden wanneer de vloeistof-jet stimulus te sterk is (Figuur 3A3'' '). Tijdens deze extreem sterke prikkels, het apicale haren-bundel vliegtuig kunt verplaatsen onscherp tijdens de vloeistof-jet stimulatie en vervolgens terugkeren naar het oorspronkelijke brandvlak nadat de prikkel is beëindigd (Figuur 4B1'-B''). Dit maakt het moeilijk voor het nauwkeurig meten van de apicale BMO-afhankelijke calcium signalen. Een voorbeeld van haar-bundel beweging artefacten te zien in Figuur 4B1'-B1''. Hier, de grafieken tonen een afname van de signalen van de GCaMP6s tijdens de prikkel (grijze doos) wanneer de haar bundels zijn out-of-focus. Na afloop van de stimulus, toenemen de GCaMP6s-signalen snel als de bundels haar terug naar hun oorspronkelijke positie en in focus terugkomen. Dit in tegenstelling tot het voorbeeld in Figuur 4A1'-A1'' waarin de apicale calcium signalen verhogen bij het begin van de stimulus of wanneer de prikkel wordt beëindigd.

Terwijl verkeer als gevolg van buitensporige vloeistof-jet prikkels ook de synaptische vliegtuig onscherp bewegen kan, is dit soort beweging artefact minder gebruikelijk in dit vliegtuig. In plaats daarvan, veranderingen in focus in de z-as als gevolg van beweging of drift van de larve zijn de meest voorkomende oorzaken van beweging artefacten. Larvale beweging of drift kan invloed hebben op metingen van de GCaMP6s op zowel de apex en basis van haarcellen. Een voorbeeld van larvale beweging die een toename van GCaMP6s in de basale, synaptic vlak tijdens de prikkel wordt weergegeven in Figuur 4C'-C''. Bewegings-artefacten (Figuur 4C1'-C1'') kan worden onderscheiden van echte presynaptische signalen (Figuur 4A2'-A2'') door het onderzoek van het tijdsverloop van de signalen van de GCaMP6s. In plaats van verhogen en exponentieel afneemt met de stimulus (Figuur 4A2'-A2''), de motie-geïnduceerde stijging van GCaMP6s signaal hebben een vierkante vorm en stijgen en dalen abrupt met het ontstaan en de verschuiving van de stimulus, respectievelijk () Figuur 4 C1'-C1'').

Naast de zorgvuldige bestudering van het tijdsverloop van GCaMP6s signalen, kan control-experimenten met behulp van farmacologie worden gebruikt om te onderscheiden waar GCaMP6s signalen van beweging artefacten. BAPTA (stap 10) kan bijvoorbeeld worden toegepast om te klieven van de tip-links die vereist voor de functie van de BMO-kanaal in haar bundels zijn. BAPTA moeten elimineren zowel vloeistof-jet-opgeroepen apicale BMO-kanaal-afhankelijke calcium toestroom evenals de latere basale, presynaptische calcium toestroom via Ca_v1.3 kanalen. In het representatief voorbeeld van ware stimulans-opgeroepen calcium signalen (Figuur 4A1-A2'') tijdens de vloeistof-jet stimulatie, alle wijzigingen in de GCaMP6s in de apicale en basale vliegtuigen fluorescentie na behandeling van de BAPTA zou worden geëlimineerd. In tegenstelling, veranderingen in GCaMP6s fluorescentie als gevolg van de beweging zoals die worden weergegeven in cijfers 4B1'-B1'' en 4 C 1'-C1'' niet zou worden opgeheven door BAPTA behandeling.

Naast het gebruik van BAPTA voor het elimineren van alle stimulus-opgeroepen GCaMP6s signalen, isradipine kan worden toegepast (step 11) te blokkeren specifiek toestroom van Ca_v1.3-afhankelijke calcium in het basale synaptic vlak terwijl de apicale BMO-kanaal-afhankelijke calcium toestroom intact⁵. Na toepassing van isradipine, in een individuele neuromast met geen beweging artefacten, in GCaMP6s fluorescentie in apicale haar bundels veranderingen (Figuur 4A1'-A1'') tijdens de vloeistof-jet stimulatie zou ongewijzigde, terwijl alle synaptische GCaMP6s fluorescentie wijzigingen aan de basis zou worden opgeheven (Figuur 4A2'-A2''). Wijzigingen in GCaMP6s signaal in de synaptische vlak na isradipine toepassing (bijvoorbeeld,Figuur 4C1-C1'') zou waarschijnlijk overeen met motie artefacten.

Figuur 1 : Overzicht van een zijlijn neuromast en functionele beeldvorming vliegtuigen. (A) het diagram aan de linkerkant ziet u een zijaanzicht van een neuromast met vier Haarcel organen (zwart) contact opnemen met postsynaptisch afferent neuronen (blauw). Linten (groen) ketting vesikels in de presynaptische actieve sites binnen elke cel. Apicale aan elke cel lichaam is een bundel van stereocilia (1 µm) die MET kanalen bevatten. Elke haar bundel heeft een kinocilium dat de overdracht van de mechanische kracht van water beweging aan de basis van de haar bundel. Het diagram aan de rechterkant ziet u hetzelfde model in een top-down-weergave. In deze weergave topdown zwart wordt gebruikt om aan te geven de vier cellen afgebeeld in het diagram aan de linkerkant en grijs wordt gebruikt om aan te geven van de andere cellen in de neuromast. Binnen dit model en deze 2 x bekeken, drie belangrijke vlakken worden gemarkeerd: (1) de toppen van de haar bundels (kinocilia) bij de berekening van de omvang van haar-bundel afbuiging, (2) het apicale BMO vlak aan de voet van de haar bundels waarin calcium kan de cel invoeren tijdens de stimulatie, en (3) de synaptische vlak aan de voet van de cel waar calcium in de buurt van synaptic linten komt. (B1-B1') DIC en GCaMP6s top-down beelden van BMO vlak aan de voet van de haar bundels, waar mechanosensation-afhankelijke calcium signalen kunnen worden opgenomen. (B2-B2') DIC en GCaMP6s top-down-beelden uit de dezelfde neuromast als B1-B1', maar aan de voet van de neuromast in de synaptische vlak, waar de presynaptische calcium signalen kunnen worden opgespoord. (C1-C2) Beelden van een neuromast uiten van GCaMP6s waar de larven is onjuist gemonteerd. In dit voorbeeld zijn de apicale BMO vliegtuig (C1) en synaptische vliegtuig (C2) aan de voet van de cel geplaatst in een hoek van suboptimaal. Dit standpunt niet mogelijk is om alle haar bundels aan het image worden gemaakt in een enkel vliegtuig, en veel meer imaging vliegtuigen zijn nodig om het vastleggen van de activiteit op alle synapsen binnen deze neuromast in vergelijking met B1-B2'. Beelden zijn van larven aan 5 dpf. De bar van de schaal in C2 komt overeen met alle afbeeldingen in de B1-C2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Imaging kamer, zebravis montage en hart injectie procedures en naalden. (A) getoond is een imaging kamer met een larve (aangegeven door een onderbroken rechthoek) naar het midden bovenop de silicone encapsulant vastgemaakt. (B1) Komt te staan is een 5 dpf larve geïmmobiliseerd door twee pinnen. Een groot hoofd pin is loodrecht op het lichaam enkel posterieure voor het oog geplaatst. De twee ogen zijn volledig bovenop zodat het onderste oog is volledig verduisterd door het bovenste oog. Een kleine staart pin kruist de chorda in de staart. De larve is vlak en niet gedraaid. (B2) Om te verlammen larve, een hart injectie naald is georiënteerde loodrecht op het lichaam en grenzend aan het hart gebracht. De naald van de injectie hart moet contact opnemen met de cel pigment voor het hart. (B2') Depressie van de naald in de huid veroorzaakt inspringing voor de cel pigment voor het hart. (C) Needles in volgorde van links naar rechts: voorbeeld van een hart injectie naald met een opening van ongeveer 3 µm; voorbeeld van een goede vloeistof-jet naald met een opening van ongeveer 50 µm; voorbeeld van een slecht gebroken vloeistof-jet naald die is groot en gekartelde en zal waarschijnlijk produceren buitensporige en onregelmatige stimuli. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Fluid-jet uitlijning, positionering en stimulans kalibratie. (A1) Wordt getoond een larve georiënteerd met de hoofd naar beneden aan de linkerkant en staart naar rechts en een naald van vloeistof-jet georiënteerde evenwijdig aan de as A-P van het lichaam van de zebravis. Deze vloeistof-jet naald is uitgelijnd zodat het stimuleren van de neuromasten die op anterior (push/druk reageren) en posterior (pull/vacuüm) geregisseerd vloeistof-flow. (A2) Weergegeven is een neuromast (aangegeven door witte stippellijn) en tips van apicale haar bundels (kinocilia) aan de linkerkant het paneel en de naald van de vloeistof-jet aan de rechterkant van het deelvenster. De vloeistof-jet is gepositioneerd ongeveer 100 µm vanaf de rand van de neuromast. (A3-A3'' ') De tips van apicale haar bundels (kinocilia) zijn bolle verschillende afstanden door het variëren van de druk van de vloeistof-jet stimulans. Het traject van een enkele kinocilial tip wordt weergegeven voor 1,5 µm (A3') en 5 µm (A3'') doorbuiging afstanden. De zwarte cirkel geeft de rust positie van de kinocilium. Het is belangrijk dat kinocilia niet te ver zijn afgebogen, anders de stimulans intensiteit niet op betrouwbare wijze worden gekwantificeerd en kan worden schadelijk (A3'' '). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Apicale ONTMOETTE en basale presynaptische GCaMP6s signalen tijdens de vloeistof-jet stimulatie in zijlijn haarcellen. (A1-A2'') GCaMP6s intensiteit tijdens de vloeistof-jet stimulatie binnen een representatieve neuromast verandert. De afbeeldingen aan de linkerkant tonen de apicale BMO plane (A1) en basale synaptic plane (A2) binnen de dezelfde neuromast. De kleur van de ROIs gecodeerd in A1 en A2 werden gebruikt om het plot van het tijdsverloop van (F) en de ΔF/F GCaMP6s intensiteit grafieken rechts van elke afbeelding. (B1-B1'') Voorbeeld van een apicaal BMO Afbeeldingsvolgorde met overtollige beweging tijdens de vloeistof-jet stimulatie. De afbeelding aan de linkerkant (B1) toont de ROIs gewend plot de (F) en ΔF/F GCaMP6s intensiteit grafieken naar rechts. (C1-C1'') Voorbeeld van een reeks afbeeldingen in het basale synaptic vlak dat toont bewegingsartefacten en GCaMP6s signaal wijzigingen die niet waar calcium signalen. De afbeelding aan de linkerkant (C1) toont de ROIs gewend plot de (F) en ΔF/F GCaMP6s intensiteit grafieken naar rechts. Het grijze vak in elke grafiek vertegenwoordigt de duur van de prikkel van de vloeistof-jet tijdens elke reeks afbeeldingen. Een 2-s 5 Hz vloeistof-jet stimulans werd gebruikt voor het voorbeeld in de A1-A2'' en B1-B1''. In C1-C1'', een 2 s voorste stap stimulans werd gebruikt. De Y-as voor (F) GCaMP6s grafieken toont willekeurige eenheden (A.U.) verkregen uit Fiji afbeelding intensiteit metingen. Alle voorbeelden zijn van larven op 4-5 dpf. Schaal bar = 5 µm voor alle afbeeldingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Spatio visualisatie van presynaptische GCaMP6s signalen tijdens de vloeistof-jet stimulatie. De stappen voor het visualiseren van de spatio wijzigingen in GCaMP6s intensiteit binnen een neuromast tijdens de stimulans zijn beschreven. Tijd is vertegenwoordigd van links naar rechts volgens het tijdstempel op de top van de beelden. De bovenste rij bevat 5 van de 14 tijdelijke opslaglocaties van een 70-GCaMP6s (F) afbeelding framereeks (stap 13.2.1). In de tweede rij, worden de basislijn (stap 13.2) is verwijderd uit elk beeld (F) GCaMP6s binned om ΔF beelden (stap 13.2.2) te creëren. In de derde rij, ΔF afbeeldingen zijn geconverteerd van grijswaarden (tweede rij) aan Red Hot LUT (stap 13,3). De min en max van deze LUT beelden zijn ingesteld op basis van de Red Hot LUT warmte kaart van relatieve ΔF intensiteit (A.U.) aan de rechterkant (stap 13.3.1). In de onderste rij, heeft de derde rij op de (F) beelden in de bovenste rij (stap 13.4) zijn bedekt. De grijze balk aan de bovenkant van de figuur geeft de timing van de 2-s 5 Hz vloeistof-jet stimulus. Het voorbeeld is afkomstig uit een 5 dpf-larven. Een legende van de Red Hot LUT warmte kaart van relatieve ΔF intensiteit (A.U.) wordt weergegeven aan de rechterkant. Schaal bar = 5 µm voor alle afbeeldingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In vivo imaging in intact dieren is inherent uitdagend. Verschillende stappen in deze methode zijn cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare in-vivo calcium metingen vanaf de zijlijn haarcellen. Bijvoorbeeld, is het zeer belangrijk dat de larve is gespeld en verlamd goed voor imaging om te minimaliseren van verkeer tijdens imaging. Overtollige beweging gedurende de beeldvorming kan leiden tot veranderingen in GCaMP6s fluorescentie die geen echte signalen en komen niet overeen met de veranderingen in calciumgehalte (b.v. cijfers 4B1'-B1'' en 4 C 1'-C1''). Staart pennen kunnen meer anteriorly te helpen minimaliseren van beweging, maar dit meer posterieure neuromasten ontoegankelijk renderen kan worden geplaatst. Bovendien, na injectie van hart, hoofd pinnen kan worden gedraaid zodat het horizontale gedeelte van de pin over de dooier ligt. Naast het wijzigen van de positie van de pinnen, is het ook mogelijk met een hersenen-delige harp in plaats van de pinnen te immobiliseren larven³⁴. Wanneer geplaatst over de larven goed, is een harp een extra, potentieel minder invasieve methode van de immobilizing van de larven. Terwijl belangrijke beweging voortvloeien kan uit de ontoereikende vastzetten, kan niet naar behoren uitvoeren van de hart-injectie verlammen van larven te leveren van α-bungarotoxin leiden tot onvolledige verlamming, verkeer, en uiteindelijk bewegings-artefacten. Hoewel gebruikte verdoving is aangetoond dat ze invloed op de prikkelbaarheid van de zebravis haarcellen, heeft recente onderzoek aangetoond dat de verdoving benzocaïne niet met vele aspecten van Haarcel activiteit interfereert. Ook gebruikte de meer verdoving die MS-222 alleen met bepaalde aspecten van Haarcel activiteit^{15 interfereert}. Daarom, vanwege de moeilijke aard van α-bungarotoxin injectie, benzocaïne of MS-222 toepassing kan blijken te zijn een handige alternatieve methode van verlamming om beweging te voorkomen in de larve tijdens functionele calcium imaging.

Naast de technische uitdagingen die betrokken zijn bij dit protocol is zelfs een perfect gemonteerd monster nutteloos als de larve en de haarcellen niet gezond voorafgaand aan en tijdens elk imaging experiment zijn. Om ervoor te zorgen dat de larven en haarcellen gezond zijn, is het belangrijk dat de larven in E3-buffer die is vrij van vuil zoals chorions (eierschalen), afval en micro-organismen worden gehandhaafd. Hoewel de oppervlakkige locatie van dwarslijn haarcellen gunstig voor de beeldvorming is, maakt deze locatie ze kwetsbaarder zijn voor cellulaire schade wanneer de E3-buffer is vervuild. Een schone, waterige omgeving is bijzonder belangrijk voor de jonge larven (2-4 dpf) of mutanten dat kan toch niet een rechtop zwemmen blijven plaats en vooral liggen op de bodem van de petrischaal. In deze situaties, kunnen dwarslijn haarcellen en de beschermende cupula rondom de haar bundels gemakkelijk worden aangetast. Zelfs bij het starten met gezonde larven en haarcellen, in de loop van elk experiment, is het essentieel om ervoor te zorgen dat de larve een hartslag en snelle bloedstroom heeft. Als de bloedstroom vertraagt of reageert, kan de gezondheid van de haarcellen worden aangetast. Gecompromitteerde voorbereidingen met betrekking tot ongezonde larven of verlies van bloedstroom, sterven haarcellen kan worden geïdentificeerd op verschillende manieren: ten eerste, door de verschijning van karyopyknosis of nucleaire condensatie, wat zich als een zeepbel in de cel onder DIC optica manifesteert; Ten tweede, door de krimp van de cel en de aanwezigheid van snel bewegende deeltjes binnen het cytoplasma; en ten derde, wanneer kinocilia tips splay uit in verschillende richtingen³⁵. Wanneer haar bundels worden verstoord, de gespreide kinocilia niet alleen samen verplaatst tijdens stimulatie.

Deze voorbereiding heeft verschillende kleine beperkingen, namelijk dat de voorbereiding alleen blijft robuust voor 1-3 uur nadat het is ingesteld. Wijzigingen zoals het gebruik van kleinere jumperpennen of een hersenen-delige harp te immobiliseren van larven en het toevoegen van een perfusie-systeem kan verlengt u de levensduur van deze voorbereiding in vivo . Een andere beperking is dat photobleaching en fototoxiciteit kan optreden na herhaalde proeven imaging. Een spannende manier naar het overwinnen van deze uitdaging is te passen dit protocol voor licht vel microscopie. Licht vel microscopie is een krachtige manier om uit focus licht, wat leidt tot minder photobleaching en fototoxiciteit³⁶. Samen, kunnen zachter immobilisatie en minder foto-blootstelling helpen verlengen elke imaging sessie. Meer imaging sessies kunnen worden gebruikt om te onderzoeken van de volledige duur van functionele veranderingen begeleidende ontwikkeling en de processen die ten grondslag liggen aan de Haarcel ontruiming en herstel na blessure. Het is belangrijk erop te wijzen dat, naast licht vel microscopie, dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten confocal systemen (punt-scannen, 2-foton en draaiende schijf) en relatief eenvoudige widefield systemen²⁸^,³⁴. Over het algemeen maakt zijn veelzijdigheid dit protocol een waardevol instrument dat kan worden aangepast en gebruikt met meerdere beeldvormende systemen.

Terwijl dit protocol kan worden aangepast en met veel beeldvormingssystemen gebruikt, kunnen delen van dit protocol ook worden aangepast en gebruikt (1) met andere indicatoren naast GCaMP6s en (2) afbeelding activiteit in andere sensorische cellen en neuronen binnen larvale zebrafish. Bijvoorbeeld, in een eerdere studie gebruikten we dit protocol afbeelding activiteit met behulp van meerdere genetisch gecodeerde indicatoren binnen dwarslijn haarcellen cytosolische calcium (RGECO1), blaasje fusion (SypHy), membraan spanning (Bongwoori) en membraan calcium (jRCaMP1a-caax en GCaMP6s-caax), en binnen de dwarslijn afferent processen te detecteren membraan calcium (GCaMP6s-caax)⁵. De transgene lijn die TG(myo6b:gcamp6s-caax) in dit protocol beschreven is gebaseerd op onze ervaring met behulp van deze indicatoren, en biedt een uitstekende start voor imaging-activiteit in zijlijn neuromasten. Van alle bovengenoemde indicatoren, hebben we gevonden dat GCaMP6s de meest gevoelige en photostable is. Naast deze functies, markeren we de transgene lijn van Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) omdat het kan worden gebruikt om twee afzonderlijke metingen: Haarcel mechanosensation en presynaptische calcium binnen een transgene streep.

De techniek die in dit artikel beschreven toont aan hoe calcium beeldvorming in de zijlijn zebrafish kan zijn een krachtige methode om te bestuderen hoe de haarcellen in hun eigen omgeving functioneren. Deze aanpak vormt een aanvulling op de studies van zoogdieren in welke haar-cel functie momenteel bestudeerd wordt in ex vivo explantaten. Bovendien, kunt de zebravis model blijven om te worden gebruikt als een platform voor het testen van de werkzaamheid van genetisch gecodeerde indicatoren die vervolgens kunnen worden toegepast om te controleren van activiteit in zoogdieren haarcellen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH/NIDCD intramurale onderzoek middelen 1ZIADC000085-01 (KSK). Wij willen erkennen Candy Wong voor haar hulp bij het schrijven van de Fiji-macro. Wij zouden ook graag Doris Wu en Candy Wong bedanken voor hun nuttige suggesties met het protocol.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Section 1
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%	Sigma-Aldrich	P0290	For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber	Siskiyou	PC-R	Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm	VWR	48366-227	To seal imaging chamber
High vacuum silicone grease	Fischer Scientific	14-635-5D	For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG	To fill imaging chamber to create a surface to pin fish
Oven	Techne	HB-1D	For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 with transmitted light illumination	For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	For making pins
Fine scissors	Cole-Palmer	5.5", EW-10818-00	For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm	Goodfellow	W005131	For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller	Sutter Instrument Company	P-97	For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament	Sutter Instrument Company	BF 150-86-10	Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher	Narishige	MF-830 microforge	To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile	Sutter Instrument Company	NC9569052	For scoring and evening breaking fluid-jet needles
Sections 4 & 5
Fine forceps	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10	For pinning larvae
Gel loading tips	Eppendorf	5242956003	For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 with transmitted light illumination	For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder	WPI	MPH315	To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin
Magnetic stand	Narishige	GJ-1	For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector	Eppendorf	Femtojet 4x	To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope	Bruker	Swept field/Opterra confocal microscope	Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software	Bruker	Prairieview 5.3	To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective	Nikon	MRH00101	Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective	Nikon	MRF07620	Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD camera	Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter	Siskiyou	PC-A	For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage	Prior Scientific	ZDN12MP	Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor	NIH Machine shop	custom	To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus	ALA scientific instruments	HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP	For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator	Sutter Instrument Company	MP-225	For holding and positioning of needle holder for fluid jet
Micromanipulator controller	Sutter Instrument Company	MPC-200	For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips	Eppendorf	5242956003	For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder	WPI	MPH315	To hold fluid-jet needles
PSI manometer	Sper Scientific	840081	For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant	ThermoFischer Scientific	B1204	To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine	Sigma-Aldrich	I6658	To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7	Graphpad	Prism7	Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI	Schindelin, et., al.³⁴	https://fiji.sc/	Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.²⁹	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.²⁹	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
Fiji is just ImageJ. , Available from: https://fiji.sc/ (2018).
Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

Neuroscience

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.