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Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794
Automatic Translation
1,2, 1
1Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

Der Zebrabärbling ist ein Modell, das hat viele wertvolle Eigenschaften einschließlich optischen Klarheit, schnelle externe Entwicklung und von besonderer Bedeutung auf dem Gebiet der Gehör und Gleichgewicht befindet sich extern sensorischen Haarzellen. Dieser Artikel beschreibt wie transgene Zebrafisch Haarzelle Mechanosensation und präsynaptischen Funktion in toto assay genutzt werden.

Abstract

Sensorische Haarzellen sind Mechanorezeptoren gefunden im Innenohr, die für das hören und Gleichgewicht erforderlich sind. Haarzellen sind als Reaktion auf sensorische Reize aktiviert, die mechanisch apikalen Vorsprünge genannt Haar Bündel abzulenken. Durchbiegung öffnet Mechanotransduktion (MET) Kanäle in Haar bündeln, führt zu einem Zustrom von kationen, einschließlich Kalzium. Dieser Zustrom kation erschüttert die Zelle und öffnet Voltage-gated Calciumkanäle basal an der Haarzelle Presynapse gelegen. Bei Säugetieren Haarzellen sind eingehüllt in Knochen, und es ist schwierig, um diese Tätigkeiten in-vivo funktionell zu beurteilen. Im Gegensatz dazu Larven Zebrafisch sind transparent und besitzen eine extern befindet sich Seitenlinienorgan, die Haarzellen enthält. Diese Haarzellen sind funktionell und strukturell ähnlich wie Haare Säugerzellen und können funktionell in-vivo bewertet werden. Dieser Artikel beschreibt eine Technik, die einen genetisch codierte Kalzium-Indikator (GECI) nutzt, Signale GCaMP6s Reiz-evozierten Kalzium Messen in Zebrafisch-Seitenlinie Haarzellen. GCaMP6s kann verwendet werden zusammen mit confocal imaging, in-vivo Calcium-Signale an der Spitze und Basis der Seitenlinie Haarzellen messen. Diese Signale liefern eine in Echtzeit, quantifizierbare Auslesen der beiden Mechanosensation und Presynapse-abhängige Kalzium Tätigkeiten innerhalb diese Haarzellen. Diese Kalziumsignale bieten auch wichtige funktionelle Informationen über wie Haarzellen erkennen und sensorische Reize zu übertragen. Insgesamt erzeugt diese Technik nützliche Daten über relative Änderungen in Kalzium Aktivität in-vivo. Es eignet sich weniger für die Quantifizierung der Absolutwert des Kalzium-Änderungen. Diese in-vivo Technik reagiert empfindlich auf Bewegungsartefakte. Eine angemessene Menge an Übung und Geschick sind erforderlich für die richtige Positionierung, Immobilisierung und Stimulation der Larven. Letztlich, wenn richtig ausgeführt, das Protokoll in diesem Artikel beschriebenen bietet eine leistungsfähige Methode, wertvolle Informationen über die Aktivität der Haarzellen in ihre natürliche, voll integrierten Bundesstaaten ein lebendes Tier zu sammeln.

Introduction

Funktionale Kalzium Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Aktivität von vielen überwachen gleichzeitig1Zellen. Insbesondere Kalzium Bildgebung mittels genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) nachweislich vorteilhaft sein, weil GECIs können, in bestimmten Zelltypen ausgedrückt werden und subcellularly2 lokalisiert. In der neurowissenschaftlichen Forschung haben diese Eigenschaften gemacht Kalzium Bildgebung mit GECIs eine leistungsfähige Methode, um sowohl Aktivitätsmuster innerhalb neuronaler Netzwerke definieren und Messen Kalzium Zustrom an einzelne Synapsen3,4. Unter Ausnutzung dieser Funktionen, eine aktuelle Studie konfokalen Mikroskopie und GECIs zur subzellulären Aktivität in Sammlungen von sensorischen Haarzellen5Überwachung eingesetzt.

Haarzellen sind Mechanorezeptoren, die Ton- und vestibuläre Reize im Innenohr und lokalen Wasserbewegung zu, in der Seitenlinie System in aquatischen Vetebrates6,7 erkennen. Haarzellen sind häufig das Ziel von Schäden oder genetische Mutationen, die die häufigste Form des Verlusts der Hörfähigkeit in den Menschen bekannt als Anhörung sensorineuralem Verlust8,9führen. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie diese Zellen-Funktion um zu verstehen wie die Behandlung und Prävention von Hörverlust. Um richtig zu funktionieren, nutzen die Haarzellen zwei spezialisierte Strukturen, so genannte Mechanosensory-Haar-Bundles und synaptischen Bändern zu erkennen und zu reizen, bzw. zu übertragen. Haar-Bundles befinden sich an der Spitze der Haarzellen und bestehen hauptsächlich aus feinen, haarähnlichen Vorsprünge, bekannt als Stereocilia (Abb. 1A). Im vestibulären und Seitenlinie Haarzellen hat jedes Haarbündel auch eine einzelne lange Kinocilium (die Zelle einzig wahre Zilie), die weit über die Stereocilia (Abb. 1A) verlängern kann. Mechanosensory Reize abzulenken Haare bündeln, und Ablenkung legt Spannung auf Verbindungen genannt "Tipp-Links", die Stereocilia10miteinander zu verbinden. Diese Spannung öffnet Mechanotransduktion (MET) Kanäle befindet sich in der Stereocilia, wodurch eine apikale Zustrom von kationen, darunter Kalzium11,12. Diese apikale Aktivität letztlich erschüttert die Haarzellen und Spannung-gated Calciumkanäle (CaV1.3) an der Basis der Zelle öffnet. CaV1.3 Kanäle werden angrenzend an synaptischen Bändern, einer präsynaptischen Struktur gefunden, die Vesikel an aktiven Zonen begrenzt. Basalen Kalzium Zustrom durch CaV1.3 Kanäle ist erforderlich für Vesicle Fusion, Neurotransmission und Aktivierung der afferenten Neuronen13,14.

Seit vielen Jahren elektrophysiologische Techniken wie die gesamte Zelle Patch spannen wurden verwendet, um die funktionellen Eigenschaften der Haarzellen in vielen Arten, darunter Zebrafisch15,16,17, Sonde 18,19,20. Diese elektrophysiologischen Aufnahmen wurden besonders wertvoll im Bereich hören und Gleichgewicht, weil sie verwendet werden können, zu extrem empfindliche Messungen aus einzelnen Sinneszellen, deren Zweck es ist, extrem schnelle Reize über kodieren ein breites Spektrum an Frequenzen und Intensitäten21,22. Leider messen nicht ganz-Zell-Aufnahmen die Aktivität der Bevölkerung von Haarzellen. Um die Aktivität der Bevölkerungen der Zellen in der Zebrafisch Seitenlinie zu untersuchen, wurden Mikrofonie Potenziale und afferenten Aktionspotentiale zur Messung der summierten Mechanosensitive und postsynaptischen Antworteigenschaften der einzelnen Neuromasts23 ,24. Leider haben weder ganze Zelle Aufnahmen noch lokales Feld möglicher Messungen die räumliche Auflösung zu lokalisieren, wo Tätigkeit vollzieht sich in den einzelnen Zellen oder die Aktivität der einzelnen Zellen innerhalb einer Population zu messen. Vor kurzem haben Kalzium Farbstoffe und GECIs eingesetzt worden, um diesen Herausforderungen25,26zu umgehen.

Im Zebrafisch erwiesen GECIs sich ein leistungsfähiger Ansatz zu prüfen, Haar-Zellfunktion aufgrund der relativen Leichtigkeit der transgenen Zebrafisch und die optische Klarheit der Larven27zu schaffen. Im Zebrafischlarven sind Haarzellen im Innenohr sowie die Seitenlinie System vorhanden. Die Seitenlinie ist bestehend aus Rosette-wie Cluster von Haarzellen genannt Neuromasts, die verwendet werden, um lokale Änderungen in Bewegung des Wassers (Abbildung 1) zu erkennen. Die Seitenlinie ist besonders nützlich, weil es nach außen entlang der Oberfläche des Fisches befindet. Dieser Zugang hat es ermöglicht, zu stimulieren Haarzellen und Kalziumsignale optisch in intakten Larven zu messen. Insgesamt, die Leichtigkeit der Transgenese, Transparenz der Larven und der beispiellosen Zugang der Seitenlinie Haarzellen haben Zebrafisch eine unschätzbare Modell, die Aktivität der Haarzellen in vivo zu studieren. Dies ist ein wesentlicher Vorteil im Vergleich zu Säugetieren Systemen in die knöchernen Strukturen des Innenohrs Haarzellen umgeben sind. Dieser Mangel an Zugang machte es sehr schwierig, in-vivo Funktionsmessungen von Säugerzellen Haar zu erwerben.

Das Protokoll hier skizzierten beschreibt das MET Kanal und Presynapse-abhängige Änderungen an Kalzium in einzelnen Haarzellen und zwischen den Zellen in Neuromasts im Larvenstadium Zebrafisch zu überwachen. Dieses Protokoll nutzt eine etablierten transgenen Zebrafisch-Linie, die eine Membran lokalisiert GCaMP6s unter der Kontrolle der Haarzelle spezifischen myosin6b Promotor28drückt. Diese Membran Lokalisierung Positionen GCaMP6s um Kalzium Zustrom durch Ionenkanäle befindet sich in der Plasmamembran zu erkennen, die für Haar-Zellfunktion wichtig sind. Beispielsweise erkennt Membran lokalisiert GCaMP6s Kalzium Zustrom durch MET Kanälen in apikalen Haare bündeln und durch CaV1,3 in der Nähe von synaptischen Bändern an der Basis der Zelle. Im Gegensatz dazu mit GECIs in das Zytosol lokalisiert wie cytosolischen GECIs Kalziumsignale erkennen, die eine Kombination von MET und CaV1.3 Kanal Aktivität sowie Kalzium Beiträge aus anderen Quellen (z. B., Speicher freizugeben). Dieses Protokoll wird beschrieben, wie immobilisieren und GCaMP6s transgenen Larven vor Bildgebung zu lähmen. Es beschreibt dann vorbereiten und einen Fluid-Jet verwenden, um die Haare-Bündel zur Seitenlinie Haarzellen in einer kontrollierten und reproduzierbaren Weise stimulieren abzuwenden. Repräsentative Daten, die mithilfe dieses Protokolls erreicht werden kann, werden vorgestellt. Beispiele für Daten, die Bewegungsartefakte darstellen werden ebenfalls vorgestellt. Experimente, die verwendet werden, um Ergebnisse zu überprüfen und auszuschließen Artefakte werden beschrieben. Zu guter Letzt bezeichnet man eine Methode, um räumliche Kalziumsignale in der Fidschi-Software zu visualisieren. Diese Fidschi-Analyse ist von vorher festgelegten Visualisierungsmethoden entwickelt mit MATLAB5angepasst. Dieses Protokoll beschreibt insgesamt eine starke Vorbereitung Technik, die verwendet GECIs im Larvenstadium Zebrafisch zu messen und visualisieren Haarzelle Kalzium Dynamik in-vivo.

Protocol

Alle tierische Arbeit wurde von Animal Use Committee an den National Institutes of Health unter Tierstudie Protokoll #1362-13 genehmigt.

Hinweis: Dieses Protokoll dauert ca. 0,5 bis 1 h ohne Unterbrechungen durchführen, wenn die Lösungen und Produkte sind vorbereitet und im Voraus eingerichtet. Dieses Protokoll ist für Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 Zebrafischlarven bei 3 – 7 Tage nach Befruchtung (Dpf) optimiert. Diese transgenen Linie drückt eine Membran lokalisiert GCaMP6s (Zebrafisch Codon optimiert) speziell in allen Zebrafisch Haarzellen. Vor der Bildgebung, werden Larven in der Embryo-Puffer (E3) unter normalen Bedingungen aufgezogen. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für Katalog-Nummern aller Geräte und Medikamente, die zur Ausführung dieses Protokolls erforderlich.

1. Vorbereitung der Lösungen

  1. Bereiten Sie 1 mL der α-Bungarotoxin (125 µM), die verwendet wird, um Zebrafischlarven während der funktionellen Bildgebung zu lähmen.
    1. 1 mg α-Bungarotoxin (ganze Flasche) 968.6 µL steriler Reinstwasser und 33,4 µL Phenol rot hinzufügen. 100 µL-Aliquots und speichern Sie diese bei-20 ° C.
      Vorsicht: Tragen Sie Handschuhe und bereiten in der Haube, beim Umgang mit α-Bungarotoxin Pulver. Handschuhe sind ebenfalls empfehlenswert, beim Umgang mit der α-Bungarotoxin Lösung.
  2. Bereiten Sie 1 L 60 X Embryo Puffer (E3).
    1. 954,4 mL Reinstwasser 17,2 g NaCl und 0,76 g KCl Pulver hinzufügen.
    2. 19,8 mL 1 M CaCl2, 19,8 mL 1 M MgSO4und 6 mL 1 M HEPES-Puffer der Projektmappe hinzufügen. 60 x E3-Stammlösung bei 4 ° C für bis zu 6 Monate zu speichern.
  3. Vorbereitung 10 L 1 x E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7,2), das ist eine Lösung, die Larven vor der funktionellen Bildgebung propagiert werden.
    1. Zugeben Sie 167 mL 60 x E3 Stammlösung bis 10 L von Reinstwasser zu einer 1-x E3-Lösung. 1 x E3-Lösung bei Raumtemperatur (RT) für bis zu 6 Monate zu speichern.
  4. Bereiten Sie neuronale Puffer (NB) (140 mM NaCl; 2 mM KCl; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,3), der verwendet wird, um die Larven während der funktionellen Bildgebung zu tauchen.
    Hinweis: 1 x E3 kann auch verwendet werden, für die funktionelle Bildgebung, aber Antworten sind robuster und zuverlässiger in NB
    1. Kombinieren Sie 28 mL 5 M NaCl, 2 mL 1 m KCl, 2 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgCl2und 10 mL 1 M HEPES-Puffer mit 957 mL Reinstwasser. Bringen Sie den pH-Wert auf 7,3 mit 1 M NaOH.
    2. Filter zu sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
      Hinweis: RT vor mit Lösung zu bringen.
  5. Bereiten Sie MS-222-Lager (Tricaine, 0,4 %), die verwendet wird, um die Larven zu betäuben.
    1. 400 mg Ethyl-3-Aminobenzoate Methanesulfonate Salz und 800 mg Na2HPO4 in 100 mL destilliertem Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7. Shop bei 4 ° C.
    2. Verwenden von 0,04 % MS-222 um Larven während der Ruhigstellung und α-Bungarotoxin Einspritzung zu betäuben.

2. Vorbereitung von Imaging-Kammer und Pins

  1. Vorbereiten der bildgebenden Kammer (Abbildung 2A). Dünn auftragen von hohen Vakuum Silikonfett auf den Boden der Perfusion Kammer an den Rändern des Platzes, die das Deckglas eingehalten wird. Lassen Sie Lücken in das Fett nicht. Drücken Sie fest nach unten an den Rändern der das Deckglas zu der bildgebenden Kammer versiegeln. Wischen Sie überschüssiges Fett entfernt.
    Hinweis: Eine 5 mL Spritze mit 200 µL Mikropipette Spitze empfiehlt sich für Fett-Anwendung.
  2. Bereiten Sie das Silikon Verkapselungen, die Kammer zu füllen. Mischen Sie ein Verhältnis 10:1 (nach Gewicht) der Ausgangspunkt, um härter. Mischen Sie gründlich, aber sanft, mit einer Mikropipette Spitze minimalste Bläschen zu erstellen.
    1. Gießen Sie Silikon Verkapselungen auf die angebrachten Deckglas, damit es eben mit der Oberfläche der Kammer ist. Ca. 3 g Verkapselungen wird die Kammer füllen.
    2. Sorgfältig die Kammer gegen eine flache Oberfläche dabei horizontal tippen, oder verwenden einer Mikropipette Spitze (unter einem Stereomikroskop) zu entfernen oder Bläschen an den Rand der Kammer zu ziehen.
    3. Legen Sie die Kammer in einem Labor-Ofen über Nacht bei 60 – 70 ° C. Legen Sie die Kammer innerhalb einer belüfteten Box um sicherzustellen, dass die heiße Luft nicht direkt auf die empfindlichen zu vermeiden, Wellen weht.
  3. Verwenden Sie feine Pinzette und Wolframdraht die Pins verwendet, um die Larven durch den Kopf und Schweif (Abbildung 2B1) zu immobilisieren Mode auf die gehärtete Verkapselungen.
    1. Um Kopfstifte zu machen, halten Sie ein Stück 0,035 mm Wolframdraht in einer Hand unter einem Stereomikroskop. Mit feinen Pinzette in der anderen Hand, biegen Sie den Draht 1 mm nach oben vom Ende im 90 °-Winkel. Tauschen Sie die Zange für feine Schere und schneiden Sie 1 mm nach der Kurve, die Pin zu erstellen.
    2. Wiederholen Sie Schritt 2.3.1 mit einem 0,025 mm Draht Heck Stifte, sondern lassen Sie 0,5 mm Draht auf beiden Seiten des Bogens. Verwenden Sie Zange die Stifte in die gehärtete Verkapselungen auf die Kammer (für Lagerung) einfügen.

3. Vorbereitung der Nadeln für Lähmung und Stimulation

  1. Bereiten Sie Herzen Injektionsnadeln mit Glaskapillaren mit einem Faden. Ziehen Sie Nadeln, einen inneren Durchmesser von 1 – 3 µm (Abbildung 2C).
  2. Bereiten Sie Fluid-Jet-Nadeln mit Glaskapillaren ohne einen Heizfaden vor. Ziehen Sie die Nadeln mit einer dünnen, langen Spitze, die auf den richtigen Tipp Durchmesser durchbrochen werden kann.
    1. Brechen Sie die dünnen, langen Spitze der Flüssigkeit-Düsennadel durch Reiben senkrecht gegen eine andere Flüssigkeit-Düsennadel oder keramischen Fliese oberhalb, wo die Nadelspitze gebogen werden kann, um einen inneren Durchmesser von 30 – 50 µm zu erstellen [Abbildung 2C (mittleres Bild) und Abbildung 3 A2]. Sicherstellen Sie, dass die Pause ist auch über die Spitze (Abbildung 2C, mittleres Bild) und nicht gezackt oder sogar zu groß (Abbildung 2C, Bild rechts) zu gewährleisten und genaue Flüssigkeit fließen während der Haarzelle Stimulation.
      Hinweis: Eine Nadel-Polierer kann verwendet werden, um gezackte Pausen zu beheben.

(4) fixieren und Immobilisierung Larve Imaging Kammer

  1. Baden Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) Larve in etwa 1 mL der E3 Puffer mit 0,04 % MS-222 für 1 – 2 min. auf der empfindlichen Oberfläche Silikon der bildgebenden Kammer bis die Larve wird unbeweglich oder reagiert nicht zu berühren.
    1. Positionieren Sie unter einem Stereomikroskop die Larve in der Mitte der Perfusion Kammer so es flach auf der Seite gegen die Silikon Verkapselungen liegt.
      Hinweis: Aus Konsistenzgründen immer montieren Larven auf der gleichen Seite (z. B. rechts unten, links oben) (Abbildung 2B1).
  2. Mit feinen Pinzette, bringen Sie eine 0,035 mm Kopf Pin nach unten senkrecht auf die Larve und Kammer. Stecken Sie den Kopf Stift zwischen dem Auge und Ohrenoperationen Vesikel und hinunter in die empfindlichen (Abbildungen 2 b 1 und 2B2). Verwenden Sie eine zweite Reihe von Zangen, um die Larve entlang der dorsalen und ventralen Seite beim Anheften zu stabilisieren. Sicherstellen Sie, dass der horizontale Teil des Stiftes die Larve Kontakte und drücken Sie nicht bis zum Anschlag in die Verkapselungen. Winkel die Pin ventral (Abbildung 2B1) oder zeigen leicht in Richtung der vorderen des Fisches zu vermeiden spätere Herz-Injektion und Haarzellen Bildgebung zu stören.
    1. Mit der Pinzette, 0,025 mm Tail Pin stecken Sie die Chorda so nah wie möglich am Ende der Rute (Abbildung 2B1).
      Hinweis: Achten Sie darauf, um zu vermeiden, erstreckt sich die Larve. PIN der Larve flach. Augen sollten sein (Abbildung 2B1) überlagert. Dies ist sehr wichtig für eine einfache Herzen Injektion (Abbildung 2B2-B2', Schritt 5), erleichtert eine wünschenswerte Abbildungsebene (Abbildung 1B1-B2'', Schritte 8 und 9), und Quantifizierung der Intensität des Reizes Fluid-Jet ( Abbildung 3A3, Schritt 7).

5. Injektion von α-Bungarotoxin in den Herzen Hohlraum, Larve zu lähmen

Hinweis: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit α-Bungarotoxin.

  1. Zentrifugieren Sie die α-Bungarotoxin aliquoten kurz vor dem Gebrauch zu verhindern Verstopfung der Herz-Injektionsnadel.
    1. Backfill 3 µL α-Bungarotoxin Lösung in ein Herz Injektionsnadel mit einer Pipettenspitze laden Gel. Laden Sie die Projektmappe gleichmäßig bis zur Spitze ohne Blasen.
    2. Eine Pipette-Halterung befestigt, eine manuelle Mikromanipulator stecken Sie die Injektionsnadel Herz. Positionieren Sie unter einem Stereomikroskop die Nadel so, dass es senkrecht zur Achse der fixierten und narkotisierten Larven, nach unten in einem Winkel von ~ 30 ° A-P ist.
    3. Verbinden Sie die Pipette Halter zum Druck Injektor. Die folgenden empfohlenen Einstellungen anwenden: Pinjection = 100 hPa, Tinjection = 0,5 s und Pcompensation = 5 hPa. Injizieren Sie einen Bolus in der Lösung zu testen, ob die Nadelspitze patent ist.
    4. Suchen Sie eine kleine Rauchwolke die rote Lösung (aus Phenol-rot) um die Spitze der Nadel zu verlassen. Wenn keine rote Farbe zu sehen ist, sehr sanft die Nadelspitze gegen den Rand einer Stecknadel kratzen und versuchen Sie es erneut, bis die Nadel patent. Alternativ ziehen Sie eine Nadel mit einer größeren Öffnung der Spitze.
  2. Vorher die Nadel in Richtung Herz, bis es die Haut außerhalb der Herzen (Abbildung 2B2 berührt). Drücken Sie die Nadel in die Larve und suchen Sie nach Einzug der Pigment-Zelle auf der Haut vor das Herz um sicherzustellen, dass Nadel befindet sich in der richtigen Ebene bezogen auf die Larve (Abbildung 2B2 ").
    1. Schieben Sie die Nadel weiter, bis es die Haut durchdringt und den Herz Hohlraum betritt. Ziehen Sie die Nadel leicht zurück. Einen Bolus von α-Bungarotoxin in den Herzen Hohlraum zu injizieren. Suchen Sie für die Inflation der Herzen Kavität oder roten Farbstoff in den Hohlraum.
  3. Spülen Sie sanft die Larve 3 Mal mit 1 mL der NB, passives MS-222 zu entfernen. Entfernen Sie niemals alle des Fluids. Larve in etwa 1 mL der NB auf der Perfusion Kammer zu erhalten.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Larven Herzschlag und Blutfluss robust bleiben, nach anheften und Herz-Injektion und die gesamte imaging Experiment.

6. Vorbereitung des Mikroskops und Fluid-Jet-Setup

  1. Montieren Sie eine aufrechte confocal Mikroskop mit den Komponenten, die in der Tabelle der Materialienbeschrieben: ein confocal Mikroskop mit einem 488 nm Laser und entsprechende Filter, Mikroskop-Software zu steuern und zu koordinieren, Bildgebung und Stimulation, 10 X Luft Ziel, 60 x Wasser Ziel, Piezo-Z Objektive Scanner (für Z-Stapel), High-Speed-Kamera, runden Kammer Adapter, motorisierte Phase und Phase einfügen Adapter. Beziehen sich auf Zhang Et Al.29 für zusätzliche Optionen und Hinweise auf Mikroskop-Setups.
  2. Montieren Sie den Flüssigkeitsstrahl, bestehend aus 3 Hauptkomponenten: einem Vakuum Druckpumpe, High-Speed-Preßbacke und Kopf Bühne (auch in der Tabelle Materialien beschrieben). Verwenden Sie die High-Speed-Druck-Klemme, um Zeitpunkt und Dauer von Druck oder Vakuum Entlastung aus der Köpfe-Bühne und in der Fluid-Jet-Pipette zu kontrollieren.
    1. Verbinden Sie den Ausgang der Kopf Bühne für die Fluid-Jet-Pipette Halter über dickwandiger Silikonschlauch.

7. Anpassung der Larve und Fluid-jet

Hinweis: Es gibt 3 Ebenen der Interesse innerhalb jedes Neuromast: (1) die Spitzen der Haare Bundles (Abbildung 3A3: Kinocilia, zur Messung der Reizstärke); (2) das Haarbündel MET-Flugzeug (Abbildung 1B1-B1 ": die Basis der apikalen Haar Bundles wo MET-Kanal-abhängigen Kalziumsignale erkannt werden); (3) der synaptischen Ebene (Abbildung 1B2-B2': wo präsynaptischen Kalziumsignale sind an der Basis der Haarzelle erkannt). Diese Flugzeuge sind in Abbildung 1Abeschrieben.

  1. Backfill 10 µL der NB in einem richtig kaputt Flüssigkeit-Düsennadel (aus Schritt 3.2) Verwendung eines Gels laden Tipp. Laden Sie die Projektmappe gleichmäßig bis zur Spitze ohne Blasen. Stechen Sie die Nadel in die Pipette-Halterung befestigt, die motorisierten Mikromanipulator.
  2. Ort der Perfusion Kammer in einer runden Kammer-Adapter auf den Mikroskoptisch.
    Hinweis: Aus Konsistenzgründen immer positionieren die Larve in der gleichen Ausrichtung (z. B. die Kammer, die die Larve mit seiner Posterior in Richtung Flüssigkeitsstrahl und ventralen Seite nach oben in Richtung des Experimentators).
    1. Verschieben Sie die motorisierte Phase, so dass die Larve in der Mitte des Sichtfeldes. Drehen Sie den runden Kammer-Adapter, so dass die A-P-Achse von der Larve etwa die Flugbahn der Flüssigkeit-Düsennadel ausgerichtet ist.
    2. Mit übertragene Licht und differenzierte Interferenz-Kontrast (DIC), bringen Sie die Larve in den Vordergrund zu und zentrieren Sie ihn unter die 10 X-Objektiv. Die 10 X-Objektiv zu erhöhen.
  3. Stürzen Sie mit Hilfe der motorisierten Mikromanipulator, Flüssigkeit-Düsennadel in der Mitte des Sichtfeldes so dass es durch das transmittierte Licht und kaum berühren die NB-Lösung beleuchtet wird.
    1. Senken Sie die 10 X-Objektiv. Konzentrieren Sie sich auf die Larve, seine Position zu bestätigen. Konzentrieren Sie sich die Fluid-Jet-Nadel zu finden. Verschieben Sie die Fluid-Jet-Nadel mit dem Mikromanipulator in der x- und y-Achse bis in eine Position parallel zu der dorsalen Seite des Fisches.
    2. Konzentrieren Sie sich wieder auf die Larve. Bringen Sie die Nadel nach unten in der z-Achse. Positionieren Sie die Nadel entlang der dorsalen Seite der Fische und ~ 1 mm vom Körper (Abbildung 3A1).
    3. Vorsichtig bewegen runden Kammer-Adapter (falls erforderlich), um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit-Düsennadel entlang der A-P-Mittellinie von der Larve (Abbildung 3A1) ausgerichtet ist.
    4. Verschieben Sie die motorisierte Phase, die Neuromast von Interesse in der Mitte des Sichtfeldes zu platzieren. Halten Sie die Flüssigkeit-Jet Nadelspitze entlang der dorsalen Seite des Fisches. Berühren Sie die Spitze der Flüssigkeit-Düsennadel, die Larve oder die Kammer-Oberfläche nicht.
  4. Wechseln Sie zu der 60 x Wasser Ziel. Stellen Sie sicher, dass das Ziel in der NB-Lösung eingetaucht ist. Verwendung der Feinfokus Auffinden eines Neuromast mit übertragen Licht und DIC Optik.
    Hinweis: Diese Einrichtung soll die Neuromasts an der primären hintere Seitenlinie angeregt. Haarzellen in diese Neuromasts reagieren auf vorderen oder hinteren gerichtete Strömung. Chou Et Al.31 für eine genaue Karte der Neuromast Flüssigkeit Empfindlichkeit innerhalb des Systems der Seitenlinie zu sehen.
    1. Positionieren Sie die Fluid-Jet-Nadel mit dem Mikromanipulator so, dass es 100 µm von der Außenkante des Neuromast (Abbildung 3A2) ist.
      Hinweis: Wählen Sie Neuromasts, die klare Top-Down-Ausblicke bieten (Zahlen 1B1 "-B2" und Abbildung 3A3) anstatt Seite abgewinkelt Ansichten (Abbildung 1-C1-C2). Eine klare Top-Down-Ansicht ermöglicht gleichzeitige aller apikalen Haar-Bundles in einer optischen Ebene imaging oder imaging der synaptischen Gegenden weniger optische Flugzeuge (Abbildung 3A3).
    2. Bis zu den Spitzen der apikalen Haar-Bundles (Kinocilia) (Abbildung 1A, Zahlen 3A2 und 3A3) konzentrieren. Der Boden der Flüssigkeit-Düsennadel sollte im Fokus in dieser Ebene sein.
  5. Stellen Sie die High-Speed-Druck-Klemme aus dem Handbuch auf externen Modus zur Eingabe von imaging-Software empfangen ein
    1. Die High-Speed-Druck-Klemme durch Drücken der Taste "zero" auf Null. Verwenden Sie den Sollwert Knopf, der Ruhedruck leicht positiv (~ 2 MmHg) einzurichten. Bestätigen Sie die ruhende Ausgabe der High-Speed-Druck-Klammer mit einem PSI-Manometer an den Kopf Bühne Ausgang angeschlossen.
      Hinweis: Legen Sie einen leicht positiven Druck in Ruhe, die schrittweise Aufnahme von Flüssigkeit in Flüssigkeit-Düsennadel im Laufe der Zeit zu vermeiden. Wenn Flüssigkeit in den Schlauch angeschlossen, der Flüssigkeit-Jet und Kopf Stadium erreicht, kann das Gerät beschädigt werden.
    2. Bestimmen Sie den Druck benötigt, um die Haare-Bundles zu stimulieren. Einen 0,125 und 0,25 V-Eingang (6,25 und 12,5 MmHg) für 200 – 500 ms zu verwenden, um einen Test-Stimulus anzuwenden (Abbildung 3A3-A3'').
      Hinweis: Die High-Speed-Druck-Klemme wandelt einen Spannungseingang (von Software oder anderen Geräten, die an den BNC-Anschluss auf dem High-Speed-Druck Klemme Befehl Port verbinden) in Druck, der aus der Kopf Bühne und letztlich die Flüssigkeit-Düsennadel entlassen wird (1,0 V = 50 MmHg, während -1,0 V =-50 MmHg). In dieser Konfiguration (siehe Punkt 7.2) Druck ("Push") lenkt Bündel Haare in Richtung der vorderen, positiven und negativer Druck ("Pull") lenkt Bündel Haare in Richtung der hinteren.
    3. Mit Durchlicht und DIC Optik sowie eine Maßstabsleiste, Messen Sie den Abstand der Ablenkung durch die 6,25 und 12,5 MmHg Reize von den Spitzen der Haare Bundles, die Kinocilia (Abbildung 1A und Figuren 3A3-3''). Wählen Sie einen Druck, der die Pakete (als 1 geschlossene Einheit) bewegt sich ein Abstand von ca. 5 µm (Abbildung 3A3''). Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Kinocilia die ganze Zeit im Fokus bleiben.
    4. Bewegen Sie die Flüssigkeit-Jet ± 25 µm entlang der A-P-Achse der die Larve einen Abstand und Druck, der die Spitzen der Kinocilia 5 µm lenkt zu finden.
      Hinweis: Mit GCaMP6s in Larven 3 – 7 Dpf, eine 5 µm Auslenkung sollte in der Nähe von GCaMP6s Kalziumsignale Sättigung erreichen und apikalen Haarbündel Strukturen sollten nicht beschädigt werden (Abbildung 3A3''). Kleinere Hubraum Entfernungen können verwendet werden, um nicht zu sättigen Reize zu liefern (Abbildung 3A3'). Hubraum Entfernungen > 10 µm sind schwer abzuschätzen ( Abbildung 3A3'' ') und kann im Laufe der Zeit schädlich sein. Signalsättigung ist abhängig vom Alter des Neuromast (und Kinocilial Höhe) sowie der Indikator verwendet. Die Durchgängigkeit der Flüssigkeit-Düsennadel in jede Richtung (Druck/Zug und Vakuum/ziehen) in regelmäßigen Abständen während der Aufnahme zu überprüfen. Fluid-Jet Nadeln leicht verstopfen und Vakuum Durchgängigkeit zu verlieren, aber sie halten Restdruck Durchgängigkeit. Verwenden Sie DIC Optik und einen Kurztest Reiz in jede Richtung für Fluid-Jet Durchgängigkeit zu überprüfen.
    5. Konzentrieren Sie sich die Probe in die Ebene von Interesse (z. B. die Basis der apikalen Haar Bundles oder die Basis der Haarzellen in der synaptischen Ebene; Abbildung 1 B1-B2').

8. Imaging Acquisition Procedure-Option 1: Single-Flugzeug-Erwerb

Hinweis: Alle Bilder dieses Protokolls erfolgt bei RT

  1. Imaging-Software soll eine streaming oder kontinuierliche 80-Frame-Akquisition mit einer Einnahme alle 100 ms zu erwerben, um eine Bildrate von 10 Hz zu erreichen.
  2. Satz gewinnen, Blende und Laserleistung, Signalerkennung zu optimieren, aber vermeiden Sättigung, Immunofluoreszenz und Lärm. Beispieleinstellungen für eine Opterra/SFC sind wie folgt: 488 nm Laserleistung: 50 (Haarbündel MET Flugzeug), 75 (synaptische Flugzeug); 35 µm Schlitz; gewinnen = 2,7; EM-Gewinn = 3900.
    Hinweis: Wenden Sie 2 X binning, wenn Signale zu schwach oder laute sind oder übermäßige Immunofluoreszenz an. 2 x binning Willen erweitern Signalerkennung auf Kosten der räumlichen Auflösung.
  3. Wählen Sie einen Reiz, während der 80-Rahmen zu liefern (8 s) Erwerb nach Frame 30, 3 s.
    Hinweis: Einige Beispiel-Reize sind wie folgt: 200 ms (+ oder - 0,25 V) bis zu 2 s (+ oder - 0,25 V) Schritt in die vorderen oder hinteren Richtung zu identifizieren, die Richtungsempfindlichkeit jede Haarzelle; 2 s, 5 Hz Rechteckwelle (0,25 V 200 MS, -0,25 V 200 MS 5 Mal wiederholt), alle Haare zu stimulieren Zellen gleichzeitig. Ein positiver Druck (anterior Stimulus) wird die Hälfte der Haarzellen aktivieren. Ein Unterdruck (posterior Stimulus) aktiviert die andere Hälfte der Haarzellen. Achten Sie darauf, dass der Reiz-Software oder ein Gerät gibt die Preßbacke an 0 V zurück nach Abschluss der Reiz.
  4. Mechanosensitive Kalzium Antworten zu messen. Fokus auf der Basis der apikalen Haar Bundles (Abbildungen 1A und 1B1-B1 ") und Bildaufnahme zu starten.
    Hinweis: Wenn die Neuromast klar von oben nach unten angezeigt wird (Abbildung 1B1-B1'), alle apikalen Haar Bundles können gleichzeitig in einer einzigen Ebene abgebildet werden.
  5. Präsynaptischen Kalzium Antworten zu messen. Fokus auf der Basis der Haarzellen (Abbildungen 1A und 1B2-B2') und Bildaufnahme zu starten.
    Hinweis: Wenn die Neuromast klar von oben nach unten angezeigt wird (Abbildung 1B2-B2'), die präsynaptischen bildgebenden Flugzeuge alle Haarzellen können in 2 – 3 Ebenen Set 2 µm auseinander erworben werden. Tg [Myo6b:ribeye-Mcherry] zu identifizieren und zu lokalisieren präsynaptischen Bänder und Websites von Kalzium Eintrag29transgene Fische verwendet werden.

9. Imaging Acquisition Procedure-Option 2: Multi-plane Erwerb

  1. Optimieren der Piezo-Z 60 X Objektiv für schnelle Akquisitionen (12 – 18 ms) befestigt. Stellen Sie sicher, dass Max-Geschwindigkeit Einstellungen ausgewählt werden.
  2. Erstellen Sie eine Z-Stapel-Übernahme mit einem Piezo-Z. Erwerben Sie der Haarbündel MET Aktivität in 5 Ebenen mit Schrittweite von 0,5 µm. erwerben die präsynaptischen Signale in 5 Ebenen mit Schrittweite von 1 µm.
  3. Legen Sie die Frame-Rate auf 10 Hz. Jeder Frame wird erfasst alle 20 ms und jedem Z-Stapel alle 100 ms.
  4. Richten Sie die Anschaffung für 400 Frames oder 80 Z-Stacks bei 10 Hz für 8 s Streaming-Akquisition.
  5. Festlegen Sie Laserleistung, Blende und Gewinn zu optimieren Signalerkennung, aber vermeiden Sättigung, Immunofluoreszenz und Lärm. Beispieleinstellungen für ein Opterra/SFC-System sind wie folgt: 488 nm Laserleistung: 75 (Haarbündel MET Flugzeug), 125 (synaptische Flugzeug); 35 µm Schlitz; gewinnen = 2,7; EM-Gewinn = 3900.
    Hinweis: 2 X binning, wenn Signale zu schwach sind, geltenlaut, oder übermäßige Immunofluoreszenz. 2 x binning Willen erweitern Signalerkennung auf Kosten der räumlichen Auflösung.
  6. Wählen Sie einen Anreiz liefern bei der Übernahme ab Frame 150, nach 3 s.
  7. Das Protokoll weiter, wie oben beschrieben für einzelne Flugzeug-Erwerb, aber Mitte des Z-Stacks in der apikalen oder basalen Ebenen (Schritte 8.4 und 8.5).

10. Kontrolle: Pharmakologische Block alle evozierten Kalziumsignale

Hinweis: BAPTA (1,2-Bis(o-aminophenoxy) Ethan-N, N, N′, N′-Tetraacetic Säure) Behandlung ist eine kritische Kontrolle bei der erstmaligen dieses Protokolls.

  1. Ersetzen Sie nach Abschluss der Schritte 8 oder 9 die NB mit 1 mL NB mit 5 mM BAPTA an die Spitze Links apikale MET-Kanäle befindet sich in Haar bündeln Tor verpflichtet zu Spalten.
  2. 10-20 min bei RT inkubieren
  3. BAPTA 3 Mal mit 1 mL NB abwaschen
  4. Wiederholen Sie Schritt 8 oder 9. Nach BAPTA Behandlung sollte keine Änderung GCaMP6s Fluoreszenz in Reaktion auf die Fluid-Jet-Stimulation in der apikalen Haar Bündel oder synaptischer Ebene. Wenn Änderungen in GCaMP6s Fluoreszenz beizubehalten, diese sind nicht wahr Kalziumsignale und möglicherweise Bewegungsartefakte.

11.: Pharmakologische Steuerblock der präsynaptischen Kalziumsignale (Optional)

  1. Ersetzen Sie nach Abschluss der Schritte 8 oder 9 die NB mit NB mit 10 µM Isradipine mit 0,1 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), L-Typ-Kalziumkanäle in die Haarzelle Presynapse zu blockieren.
  2. 10 min bei RT inkubieren
  3. Ohne waschen, wiederholen Sie Schritt 8 oder 9. Nach der Behandlung sollte es GCaMP6s Fluoreszenz Änderungen in Reaktion auf die Stimulation der Fluid-Jet im apikalen Haar-Bundles aber nicht das synaptische Flugzeug. Wenn Änderungen in GCaMP6s Fluoreszenz in der synaptischen Ebene bestehen, diese sind nicht wahr Kalziumsignale und möglicherweise Bewegungsartefakte.

12. Bild-Verarbeitung und grafische Darstellung von Daten

Hinweis: Verwenden Sie Fidschi (12,1 – 12.1.5 Schritte) und ein Grafik-Programm (Schritte 12.2 – 12.2.3) für Schritt 12. StackReg, TurboReg (Schritt 12.1.3), Time Series Analyzer V3 (Schritte 12.1.4–12.1.6), und Fidschi Plugins sind auch erforderlich (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Öffnen Sie eine Bildsequenz in Fidschi, Single-Flugzeug Zeitreihen (80-Frame Ebene) oder Z-Stapel-Zeitreihen (400-Frame Multi-Ebene). Klicken Sie auf "Datei", wählen Sie "Importieren" aus dem Dropdown Menü, und klicken Sie auf "Image Sequence."
    1. Für eine Z-Stapel-Zeiten-Serie Z-Projekt jedes Mal darauf (5 Flugzeuge pro Timepoint) um eine Bild 80-Frame-Sequenz zu erstellen. Klicken Sie auf "Bild", wählen Sie "Stapel" aus der Drop-Down-Menü, wählen Sie "Extras" aus dem Dropdown-Menü und klicken Sie auf "Grouped Z-Projekt." Wählen Sie "Mittlere Intensität" als die Projektionsmethode, und geben Sie "5" für "Gruppengröße".
      Hinweis: Jede Ebene in der Z-Stack kann separat für weitere raumbezogene Informationen analysiert werden.
    2. Entfernen der ersten 1 s (10 Bilder) von 8 s (80 Bilder) der Bildaufnahme. Klicken Sie auf "Bild", wählen Sie "Stapel" aus dem Dropdown-Menü, wählen Sie "Extras" aus dem Dropdown-Menü und klicken Sie auf "Make Substack". Geben Sie "11-80" für "Scheiben".
      Hinweis: Dieser Substack wird als stk1bezeichnet werden.
    3. Registrieren Sie die Bildsequenz (stk1) mit dem StackReg Plugin32. Klicken Sie auf "Plugins", wählen Sie "StackReg" und "Übersetzung" als das Verfahren der Registrierung für die 70-Frame-Zeitreihen.
      Hinweis: Diese registrierten Substack wird als stk2bezeichnet werden.
    4. Verwenden Sie die Zeiten Serie Analyzer V3-Plugin, um GCaMP6 Intensität (F) Messungen zu extrahieren. Apikalen Haar Bündel oder präsynaptischen Standorte in stk2eine Region of Interest (ROI) aufsetzen. Beziehen sich auf die ImageJ-Website (siehe Tabelle der Materialien für den Link) für Anweisungen zur Verwendung von Time Series Analyzer V3.
      Hinweis: Verwenden Sie eine Runde 1 – 2 µm ROI für apikalen Haar bündelt und eine Runde 3 – 5 µm ROI für die synaptische Ebene (Zahlen 4A1 und 4A2).
    5. Wählen Sie die Messparameter. Klicken Sie auf "Analysieren", wählen Sie "Set Messung", und stellen Sie sicher, dass nur "bedeutet Grauwert" ausgewählt ist.
    6. Im ROI-Manager wählen Sie alle ROIs und Multi-Messfunktion Intensitätswerte (F) für jede ROI in den Zeitreihen zu generieren. Klicken Sie im ROI-Manager auf "Mehr >>" und wählen Sie aus "Multi Measure" aus der Drop-Down-Menü.
  2. Grundstück (F) Werte. Fügen Sie die Werte (F) aus "Multi Messungsergebnisse" in ein Grafik-Programm ein XY-Diagramm erstellen (Zahlen 4A1 "und 4A2").
    Hinweis: (X) schaffen Werte manuell oder verwenden Sie den Zeitstempel aus den Metadaten.
    1. Quantifizieren der Grundlinie (F-o) für jede ROI durch Mittelwertbildung (F) Werte in der Grafik-Programm aus den Pre-Reiz-Frames 1 – 20.
    2. Ziehen Sie für jede ROI ab (Fo) (F) Werte bei jedem Timepoint, ΔF (F-F-o) Werte zu schaffen. Replot, falls gewünscht.
    3. Berechnen Sie und zeichnen Sie ΔF/Fo. Für jedes ROI, teilen die ΔF Messung von (Fo) und Replot (Zahlen 4A1'' und 4A2'').

13. Bild-Verarbeitung und Hitze Kartendarstellung der räumlich-zeitliche Kalziumsignale

Hinweis: Bisherige Arbeit erstelle ich räumliche Hitze Kartendarstellung von Kalziumsignale in Zebrafisch-Seitenlinie Haarzellen habe Individualsoftware in Matlab5,28geschrieben. Diese Analyse ist für die open-Source-Analysesoftware Fidschi33angepasst worden. Verwenden Sie Fidschi-Inseln für alle unten beschriebenen Schritte. StackReg und TurboReg Fidschi Plugins sind auch erforderlich (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Führen Sie Schritte 12,1 – 12.1.3 für jeden Z-Stapel oder Ebene Zeitreihen zu den registrierten Substack als stk2bezeichnet.
  2. Verwenden Sie stk2 , um ein Baseline-Abbild zu erstellen. Klicken Sie auf "Bild" wählen Sie "Stapel" aus der Drop-Down-Menü, und wählen Sie "Z-Projekt". Wählen Sie "Mittlere Intensità ¤ t" für"Projektion", und geben Sie "1" für "Start Slice" und "20" für "Stop Slice".
    Hinweis: Diese Z-Projektion wird als BaselineIMGbezeichnet werden.
    1. Zeitlich bin Bildfolge 70-Frame (F) (stk2) in 14 0,5 s Lagerplätze. Klicken Sie auf "Bild", wählen Sie "Stapel" aus der Drop-Down-Menü, wählen Sie "Extras" aus dem Dropdown-Menü und klicken Sie auf "Gruppiert Z Projekt". Wählen Sie "Mittlere Intensität" als die "Projektionsmethode", und geben Sie 5 für "Gruppengröße."
      Hinweis: Diese gruppierten Z-Projektion wird als stk2bin und F in Abbildung 5bezeichnet werden.
    2. Subtrahieren Sie den Pixelwert Baseline (BaselineIMG) von der gebinnten (F) Bild-Sequenz (stk2bin), eine ΔF-Bild-Sequenz zu erstellen. Klicken Sie auf "Prozess" und wählen Sie aus "Bildrechner" aus der Drop-Down-Menü. Wählen Sie stk2bin als "Image1" und BaselineIMG als"Bild2." Wählen Sie "Subtrahieren", "Betriebsbereit".
      Hinweis: Dieser Ausgangswert subtrahiert Z-Projektion wird genannt stk2binBL und F-BL = ΔF in Abbildung 5.
  3. Wählen Sie eine Lookup-Tabelle (LUT) Wahl ΔF Bildsequenz (stk2binBL) angezeigt. Klicken Sie auf "Bild", "Lookup-Tabellen" aus der Drop-Down-Menü auswählen, und klicken Sie auf eine LUT Wahl.
    Hinweis: "Red Hot" ist die LUT in Abbildung 5verwendet. Dieser Ausgangswert subtrahiert Z-Projektion mit LUT bezeichnet man als stk2binBL-LUT und ΔF LUT in Abbildung 5.
    1. Minimum (min) und maximum (max) Helligkeitswerte für stk2binBL-LUTeinstellen. Klicken Sie auf "Bild", wählen Sie "Anpassen", und klicken Sie auf "Helligkeit/Kontrast". Legen Sie den Mindestwert stk2binBL-LUTHintergrundgeräusche entfernen. Legen Sie die max-Werte, Signale des Interesses zu behalten aber vermeiden Signalsättigung [z. B. 200 bis 1600 (12-Bit-Bild Intensitätsbereich = 0 bis 4095)].
      Hinweis: Verwenden Sie die gleichen min und Max Werte, wenn visuelle Vergleiche oder Zusicherungen zu machen. ΔF Kalibrierung LUT Bar kann in Fidschi für jedes LUT Bildsequenz (z. B. stk2binBL-LUT) generiert werden. Klicken Sie auf "Analysieren", wählen Sie "Extras" und klicken Sie auf"Kalibrierung". Deaktivieren Sie "Überlagern", um eine eigene, individuelle Bild mit LUT Kalibrierung Bar als Referenz zu erzeugen.
    2. Sowohl die ΔF (stk2binBL-LUT) konvertierenmit dem gewünschten Bild LUTand die zeitlich gebinnten (F) (stk2bin) Sequenzen zu RGB. Klicken Sie auf "Bild", wählen Sie "Typ", und klicken Sie auf "RGB-Farbe."
      Hinweis: Die RGB konvertiert Z-Projektionen werden als stk2binBL-LUT-RGB und stk2bin-RGB, bzw. bezeichnet werden.
  4. Die ΔF LUT Bilder (stk2binBL-LUT-RGB) auf gebinnten (F) Bilder (stk2bin-RGB) zu überlagern. Klicken Sie auf "Prozess" und dann "Bildrechner". Wählen Sie stk2bin-RGB als Image1 und stk2binBL-LUT-RGB als Bild2. Wählen Sie "Transparent-Null" für den "Betrieb".
    Hinweis: Wenn es zu viel Lärm oder Hintergrund in der ΔF LUT Überlagerung, wiederholen Sie Schritt 13.3 den Mindestwert erhöhen. Wenn es Sättigung, wiederholen Sie Schritt 13,3 und den max-Wert zu erhöhen.

14. Bild-Verarbeitung und räumlich-zeitliche Hitze Kartendarstellung mit einem Fidschi-Makro

Hinweis: Der folgende Abschnitt bezieht sich auf ein Fidschi Makro namens LUToverlay basierend auf Schritt 13, die räumliche Hitze Kartendarstellung GCaMP6s Signale automatisch erstellt wird. Diese Analyse erfordert die open-Source Analyse Software Fidschi33 und die StackReg und TurboReg Fidschi Plugins (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Fidschi-LUT Overlay Makro (LUToverlay.ijm) begleitet dieses Protokoll herunterladen (siehe Zusätzliche Codierung Datei).
  2. Öffnen Sie ein Multi-plane Zeitreihen oder Single-Flugzeug Zeitreihen (siehe Punkt 12.1).
  3. Klicken Sie auf "Plugins", wählen Sie "Makros", klicken Sie auf "Ausführen", und wählen Sie das LUToverlay-Makro. Ein Dialogfenster mit dem Text "über Ihre Bildaufnahme Tell me".
    Hinweis: Für das Dialogfeld die Zahl der Anwesenden sind Vorschlagswerte und können gemäß den Einstellungen anhand der Experimentator geändert werden. Die Werte im Feld aufgeführt und sind mit den nachstehenden für eine Multi-plane Zeitreihe mit 400 Bildern und 5 Flugzeuge pro Timepoint (Schritt 9).
  4. Nach "Anzahl von Flugzeugen pro Timepoint" geben Sie die Anzahl der Ebenen pro Timepoint (z. B. Schritt 12.1.1 mit einer Multi-Ebene 400 Zeitreihen mit 5 Flugzeugen pro Timepoint, geben Sie "5"). Für ein einziges Flugzeug-Erwerb (z. B. Schritt 8) geben Sie "1".
    Hinweis: In den folgenden Dialogfeldern für eine Multi-plane Zeitreihe "Zeitpunkte" bezeichnet die Anzahl Bilder im projizierten Z-Stapel (z. B.für Schritt 12.1.1 ist 80 Zeitpunkten).
    1. Verwenden Sie die Option "Definieren den Bereich analysieren", die erste 1 entfernen s der Bildsequenz (z. B. Schritt 12.1.2 auswählen "11-80" zu entfernen, die ersten 10 Frames und ersten 1 s).
    2. Nach "definieren Zeitpunkte im Baseline", geben Sie die Anzahl der Bilder verwendet werden, um die Baseline-Abbild zu erstellen [z. B. Schritt 13.2., geben Sie "20" zur Verwendung der Pre-Reiz-Bilder (11-30)].
    3. Geben Sie nach "Zeitpunkte pro zeitliche bin" die Anzahl der Bilder, für die Überlagerung bin. (z. B. Schritt 13.2.2. Wählen Sie "5" zu 14 0,5 s Lagerplätze erstellen).
    4. Nachdem "Min. Intensität" und "Max Intensität" die minimale und maximale Helligkeitswerte eingegeben haben, die Entfernen von Hintergrundgeräuschen (Minimum) und Signale von Interesse unter Vermeidung Sättigung (maximal) zu behalten.
    5. Nach "wählen Sie eine Lookup-Tabelle", wählen Sie die LUT gewünscht für die Überlagerung. Klicken Sie auf "OK".
      Anmerkung: Das Makro wird fertig analysiert die Bilder gemäß den Anweisungen in Schritt 13 vorgestellt. Durch das Makro erzeugten Bilder werden auch entsprechend den Anweisungen in Schritt 13 benannt werden.
  5. Schließen Sie alle Analysefenster vor der Verarbeitung einer neue Bildsequenz.

Representative Results

Nach Myo6b:GCaMP6s-Caax transgene Fische sind richtig immobilisiert und der Fluid-Jet-Reiz an Seitenlinie Haarzellen übermittelt, robuste Kalziumsignale visualisiert werden und gemessen(Abbildungen 4 und 5, 2 X binning genommen). Während der Fluid-Jet Stimulation Signale Kalzium entweder in den apikalen Haar-Bundles gemessen werden kann, wo MET Kanäle zu, in Reaktion auf Reize, oder an der Basis der Haarzellen öffnen, wo präsynaptischen CaV1.3 Calciumkanäle Neurotransmission auslösen. Ein repräsentatives Beispiel für Kalzium Antworten in diesen Regionen mit einer einzelnen Neuromast sind in Abbildung 4dargestellteA1-A2''. In diesem Beispiel wurde ein 2s 5 Hz Fluid-Jet Impulse geliefert, um alle Haarzellen in der repräsentativen Neuromast zu aktivieren. Während der Reiz, robuste Kalziumsignale in Haar-Bundles erkannt werden (Abbildung 4A1-A1'', Antworten von 8 Haar-Pakete werden angezeigt). In diesem System zeigen fast alle Reifen Haarzellen dieser apikalen Zustrom von Kalzium5. Im Gegensatz dazu innerhalb der gleichen Neuromast gibt es nachweisbar Kalziumsignale in der basalen, synaptische Ebene in nur eine Teilmenge (~ 30 %) der Haarzellen (Abbildung 4A2-A2'', 4 Zellen mit präsynaptischen Antworten gezeigt)5. Die 4 grün ROIs zeigen Zellen mit keine signifikante präsynaptischen Kalziumsignale (Abbildung 4A2-A2'') trotz robuster apikalen Kalziumsignale (Abbildung 4A1-A1''). In diesem repräsentativen Beispiel (Abbildung 4A1-A2''), farbige ROIs Bündel Haare in der apikalen MET-Ebene (Abbildung 4A1) mit ihren Zellkörper in den basalen synaptischen Ebene (Abbildung 4A2) überein. Dieses Beispiel zeigt, wie beide MET-abhängigen und präsynaptischen Calcium-Signale in einzelnen Haarzellen und zwischen den Populationen der Haarzellen gemessen werden können.

Kalziumsignale in beide die Haare bündeln und an die Presynapse grafisch als raw (F) GCaMP6s Intensität oder ΔF/Fo GCaMP6s Intensität geplottet werden können (siehe Schritt 12, Figuren 4A1 "-A1'' und 4A2'-A2''). (F) GaMP6s Grafiken unterstreichen, dass die Basislinie Fluoreszenz-Intensität für jede Zelle unterschiedlich sein kann (Zahlen 4A1' und 4A2'). In den ΔF/Fo GCaMP6s Grafiken, wird jede Zelle auf den Baselinewert normalisiert und die relative Intensität Veränderung vom Ausgangswert wird geplottet (Zahlen 4A1'' und 4A2''). In beiden der (F) und ΔF/Fo GCaMP6s Grundstücke, Kalziumsignale basale präsynaptischen Flugzeug sowohl im apikalen Haarbündel mit dem Beginn des Reizes (graues Feld) zu initiieren und exponentiell abnehmen, nachdem der Reiz endet. Während der Reiz Kalziumsignale bundweise Haare rapide ansteigen und ändert sich die Stärke der Durchbiegung nicht zu sättigen (Abbildung 4A1-A1''). Im Gegensatz dazu in der Teilmenge der Haarzellen mit nachweisbaren Kalziumsignale in der synaptischen Ebene die Kalziumsignale mehr schrittweise zu erhöhen und sind weniger anfällig für Sättigung (Abbildung 4A2-A2''). Haarzellen ohne präsynaptischen Kalziumsignale (grüne ROIs) bleiben die Calcium-Signale in der Nähe von Baseline.

Neben diesen grafischen Darstellungen (Abbildung 4) können Kalziumsignale räumlich innerhalb des gesamten Neuromast im Laufe der Zeit der Aufnahme visualisiert werden. Für präsynaptischen GCaMP6s Signale in der basalen Ebene der ein Neuromast ist ein Beispiel für eine räumlich-zeitliche Darstellung in Abbildung 5 dargestellt. In Abbildung 5sind die wichtigsten Schritte eine Bildsequenz für räumliche Visualisierung verarbeiten skizziert, wie in Schritt 13 beschrieben. Erstens die raw (F) GCaMP6s-Bilder sind zeitlich klassifiziert [Abbildung 5: Zeile 1 (5 der 14 Lagerplätze werden angezeigt); Schritt 13.2.1]. Dann ist das Basis-Image, berechnet aus Pre-Reiz Frames (Schritt 13.2), abgezogen (F) GCaMP6s-Fluoreszenz-Signale um ΔF Bilder zu erhalten (Abbildung 5: Zeile 2; Schritt 13.2.2). Als nächstes die ΔF-Graustufen-Bilder in einer Farbe LUT umgewandelt werden (Abbildung 5: Zeile 3, Red Hot LUT; Schritt 13.3). Zu guter Letzt die ΔF Bilder mit der LUT-Umstellung auf die zeitlich gebinnten (F)-Bilder (Abbildung 5, erste Zeile), die räumlich-zeitliche Signale innerhalb der Neuromast während der Stimulation zu offenbaren überlagert werden (Abbildung 5: Zeile 4; Schritt 13,4). Die Heatmaps ΔF GCaMP6s Signale bieten sowohl wertvolle räumliche und zeitliche Informationen, die nicht leicht zu analysieren, aus einzelnen ROIs und die Diagramme in Abbildung 4verwendet. Heatmaps können helfen, kritische raumzeitlichen Informationen, einschließlich der subzellulären Informationen über Beginn und Dauer der Kalziumsignale in jede Haarzelle sowie der Zeitpunkt und die Intensität Unterschiede zwischen den Haarzellen innerhalb der gesamten visualisieren Neuromast.

Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Diagramme und räumliche Heatmaps wahre Kalziumsignale darstellen und nicht Artefakte durch Bewegung. In diesem Protokoll können Bewegungsartefakte durch übermäßige Drift oder Bewegung der Larve oder Bewegung durch Fluid-Jet-Stimulation werden. Alle diese Elemente sind eine Herausforderung in dieser in-vivo Zubereitung vollständig zu beseitigen. Während Anmeldung von Bildsequenzen (Schritt 12.1.3) für korrigieren kann, muss die Mehrheit der Bewegung in der x- und y-Achsen, Bildsequenzen mit übermäßige Bewegung in der z-Achse identifiziert und aus Analysen entfernt. Bewegungsartefakte sind am einfachsten zu erkennen durch die Kalziumsignale Diagrammerstellung. Beispiele für GCaMP6s-Intensität-Änderungen, die Artefakte sind nicht wahr GCaMP6s Signale beobachtet werden, an der Spitze (Abbildung 4B1'-B1'') und base (Abbildung 4C1 "-C1'') der Haarzellen.

Die apikale Haar-Bundles sind Bewegungsartefakte häufig, wenn der Fluid-Jet-Stimulus zu stark ist (Abbildung 3A3'' '). Während diese übermäßig starke Reize die apikalen Haarbündel Ebene bewegen außerhalb des Fokus während der Fluid-Jet-Stimulation kann dann an der ursprünglichen Brennebene zurückzugeben, nachdem der Reiz endet (Abbildung 4B1'-B''). Dies erschwert die apikale MET-abhängige Kalziumsignale genau zu messen. Ein Beispiel für Haar-Bundle Bewegungsartefakte sehen Sie in Abbildung 4B1'-B1''. Hier die Diagramme zeigen einen Rückgang der GCaMP6s Signale während der Reiz (graues Feld) wenn die Bündel Haare sind Out-of-Focus. Nachdem der Reiz endet, erhöhen die GCaMP6s Signale schnell wie die Bündel Haare in ihre ursprüngliche Position zurück und zurück in den Fokus kommen. Im Gegensatz dazu des Beispiel in Abbildung 4A1 "-A1'' in der apikalen Kalziumsignale zu Beginn des Reizes zu erhöhen und zu verringern, wenn der Reiz endet.

Während Bewegung aufgrund übermäßiger Flüssigkeit-Jet Reize die synaptische Ebene unscharf auch bewegen kann, ist diese Art der Bewegung Artefakt seltener in dieser Ebene. Stattdessen sind Änderungen in der z-Achse durch Bewegung oder Drift der Larve im Fokus der häufigsten Ursachen für Bewegungsartefakte. Larval Bewegung oder Drift kann GCaMP6s Messungen an der Spitze und Basis der Haarzellen beeinflussen. Ein Beispiel für Larven Bewegung, die GCaMP6s in der basalen, synaptische Ebene, während der Reiz erhöht ist in Abbildung 4C'-C''. Motion-Artefakte (Abbildung 4C1 "-C1'') können von echten präsynaptischen Signale unterschieden werden (Abbildung 4A2"-A2'') durch den zeitlichen Verlauf der GCaMP6s Signale untersuchen. Statt zunehmender und abnehmender exponentiell mit dem Reiz (Abbildung 4A2 "-A2''), Motion-induzierten Anstieg GCaMP6s Signal haben ein Quadrat gestalten und Aufstieg und fall abrupt mit der Entstehung und Versatz des Reizes, bzw. () Abbildung 4 C1 "-C1'').

Experimente mit Pharmakologie ist neben der sorgfältigen Prüfung der den zeitlichen Verlauf von GCaMP6s Signalen lässt sich wahre GCaMP6s Signale von Bewegungsartefakte zu unterscheiden. Beispielsweise kann BAPTA (Schritt 10) angewendet werden, um die Tipp-Links zu Spalten, die für die MET-kanalig bundweise Haar erforderlich sind. BAPTA sollte Fluid-Jet-evozierten apikalen MET-Kanal-abhängige Kalzium Zustrom sowie der anschließenden basale, präsynaptischen Kalzium Zustrom durch CaV1.3 Kanäle beseitigen. In dem repräsentativen Beispiel der wahre Reiz-evozierten Kalziumsignale (Abbildung 4A1-A2'') während der Fluid-Jet-Stimulation, würden alle Änderungen GCaMP6s Fluoreszenz in den apikalen und basalen Ebenen nach BAPTA Behandlung beseitigt werden. Im Gegensatz dazu ändert sich in GCaMP6s Fluoreszenz durch Bewegung wie gezeigt Figuren 4B1'-B1'' und 4 C 1' C1'' würde nicht durch BAPTA Behandlung beseitigt werden.

Neben der Verwendung von BAPTA alle Impuls-evozierten GCaMP6s Signale zu beseitigen, Isradipine aufgebracht werden (Schritt 11) speziell CaV1,3-abhängige Kalzium Zustrom in die basale synaptischer Ebene blockieren, wobei apikalen MET-Kanal-abhängige Kalzium Zustrom intakt5. Nach Anwendung des Isradipine in eine einzelne Neuromast mit keine Bewegungsartefakte GCaMP6s Fluoreszenz bundweise apikalen Haare ändert (Abbildung 4A1 "-A1'') während der Fluid-Jet-Stimulation wäre unverändert, während alle synaptischen GCaMP6s Fluoreszenz-Änderungen an der Basis würde beseitigt werden (Abbildung 4A2 "-A2''). Jede Änderung in GCaMP6s Signal in der synaptischen Ebene nach Isradipine Anwendung (z. B.,Abbildung 4C1-C1'') entspräche wahrscheinlich Bewegungsartefakte.

Figure 1
Abbildung 1 : Überblick über eine Seitenlinie Neuromast und funktionelle Bildgebung Flugzeuge. (A) das Diagramm links zeigt eine Seitenansicht des Neuromast mit vier Haarzelle Körper (schwarz) Kontaktaufnahme mit postsynaptischen afferenten Neuronen (blau). Bänder (grün) Leine Vesikel am präsynaptischen aktiven Zentren in jeder Zelle. Apikalen zu jeder Zelle Körper ist ein Bündel von Stereocilia (1 µm), die MET-Kanäle enthalten. Jedes Haarbündel hat ein Kinocilium, die die mechanische Kraft des Wasserbewegung auf der Basis des das Haarbündel überträgt. Das Diagramm auf der rechten Seite zeigt das gleiche Modell in einer Top-Down Ansicht. In diesem Top-Down Ansicht schwarz wird verwendet, um die vier Zellen dargestellt im Diagramm auf der linken Seite zeigen, und grau wird verwendet, um andere Zellen in der Neuromast zeigen. Innerhalb dieses Modell und diese 2 Ansichten, drei wichtige Ebenen hervorgehoben werden: (1) die Spitzen der Haare Bundles (Kinocilia) verwendet, um das Ausmaß der Haarbündel Umlenkung, (2) der apikalen MET-Ebene an der Basis der Haare-Bundles zu quantifizieren, wo Kalzium die Zelle betritt, während der Stimulation und (3) der synaptischen Ebene an der Basis der Zelle, wo Kalzium in der Nähe von synaptischen Bändern tritt. (B1-B1 ") DIC und GCaMP6s Top-Down-Bilder von MET Flugzeug an der Basis der Haare Bundles, wo Mechanosensation-abhängige Kalziumsignale aufgezeichnet werden können. (B2-B2 ") DIC und GCaMP6s Top-Down-Bilder von der gleichen Neuromast als B1-B1 ", aber an der Basis des Neuromast in der synaptischen Ebene, wo präsynaptischen Kalziumsignale erkannt werden können. (C1-C2) Bilder von einer Neuromast mit dem Ausdruck GCaMP6s, wo die Larven nicht ordnungsgemäß montiert ist. In diesem Beispiel sind die apikale MET Flugzeug (C1) und synaptischen Flugzeug (C2) an der Basis der Zelle in einem nicht optimalen Winkel positioniert. Diese Position erlaubt es nicht für alle Haar-Bundles, in einer Ebene abgebildet werden, und viele weitere bildgebende Flugzeuge werden benötigt, um die Aktivität an allen Synapsen innerhalb dieser Neuromast im Vergleich zu B1-B2 zu erfassen ". Bilder sind der Larven bei 5 Dpf. Die Maßstabsleiste in C2 entspricht alle Bilder im B1-C2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Imaging-Kammer, Zebrafisch Montage und Herz Injektionsverfahren und Nadeln. (A) gezeigt ist eine bildgebende Kammer mit einer Larve (beschrieben durch eine gestrichelte Rechteck) in der Mitte oben auf dem Silikon Verkapselungen angeheftet. (B1) Gezeigt wird eine 5 Dpf Larve durch zwei Stifte fixiert. Eine große Kopf Pin befindet sich senkrecht zum Körper nur hintere für das Auge. Die beiden Augen sind völlig überlagert, so dass das untere Auge vollständig von der oberen Auge verdeckt wird. Eine kleine Rute Pin schneidet die Chorda im Heck. Die Larve ist flach und nicht verdreht. (B2) Um die Larve zu lähmen, ein Herz-Injektionsnadel ist orientierten senkrecht zum Körper und brachte angrenzend an das Herz. Die Herz-Injektionsnadel wenden die Pigment-Zelle vor dem Herzen. (B2 ") Depression der Nadel in die Haut verursacht Einzug der Pigment-Zelle vor dem Herzen. (C) Nadeln in Reihenfolge von links nach rechts: Beispiel für eine Herz-Injektionsnadel mit einer Öffnung von ca. 3 µm; Beispiel für eine gute Fluid-Jet-Nadel mit einer Öffnung von ca. 50 µm; Beispiel für eine schlecht gebrochenen Flüssigkeit Düsennadel, die groß und zerklüftet und wird wahrscheinlich übertrieben und unregelmäßige Reize. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Fluid-Jet-Ausrichtung, Positionierung und Impuls Kalibrierung. (A1) Dargestellt ist eine Larve mit der Kopf nach unten, nach links und nach rechts orientiert, und Flüssigkeit Düsennadel orientierte Parallel zur Achse des Körpers Zebrafisch A / P. Diese Flüssigkeit-Düsennadel orientiert sich um die Neuromasts zu stimulieren, die Beantwortung von anterior (Push/Druck) und Posterior (Pull/Vakuum) gerichtet Fluid-Flow. (A2) Dargestellt ist ein Neuromast (beschrieben durch gestrichelte weiße Linie) und Tipps von apikalen Haar Bundles (Kinocilia) auf der linken Seite das Panel und die Flüssigkeit Düsennadel auf der rechten Seite des Fensters. Der Fluid-Jet ist aufgestellt ca. 100 µm von der Kante der Neuromast. (A3-A3'' ') Die Spitzen der apikalen Haar Bündel (Kinocilia) sind ausgelenkten unterschiedlichen Entfernungen durch Variation der Reiz der Fluid-Jet-Druck. Die Flugbahn von einem einzigen Kinocilial-Tipp ist für 1,5 µm angegeben (A3 ") und 5 µm (A3'') Durchbiegung Entfernungen. Der schwarze Kreis zeigt die Ruhestellung das Kinocilium. Es ist wichtig, dass Kinocilia sind nicht zu weit abgelenkt, da sonst der Reizstärke nicht verlässlich quantifiziert werden und beschädigt werden kann (A3'' "). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Trafen sich apikale und basale präsynaptischen GCaMP6s Signale während der Fluid-Jet-Stimulation in Seitenlinie Haarzellen. (A1-A2'') GCaMP6s Intensität ändert sich während der Fluid-Jet-Stimulation im Rahmen einer repräsentativen Neuromast. Die Bilder auf der linken Seite zeigen die apikale MET Flugzeug (A1) und basalen synaptischen Flugzeug (A2) innerhalb der gleichen Neuromast. Die ROIs farbcodiert in A1 und A2 wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf der (F) und ΔF/F GCaMP6s Intensität Diagramme rechts neben jedem Bild zeichnen. (B1-B1'') Beispiel einer apikalen MET Bildsequenz mit überschüssige Bewegung während der Fluid-Jet-Stimulation. Das Bild auf der linken Seite (B1) zeigt die ROIs zur Handlung (F) und ΔF/F GCaMP6s Intensität Diagramme auf der rechten Seite. (C1-C1'') Beispiel einer Bildsequenz in der basalen synaptischer Ebene, dass zeigt Bewegungsartefakte und GCaMP6s Veränderungen signalisieren, die nicht wahr Calcium sind signalisiert. Das Bild auf der linken Seite (C1) zeigt die ROIs zur Handlung (F) und ΔF/F GCaMP6s Intensität Diagramme auf der rechten Seite. Das graue Feld in jedem Diagramm stellt die Dauer des Fluid-Jet Stimulus während jedes Bildsequenz dar. 2 s 5 Hz Fluid-Jet Anregung diente für das Beispiel in A1-A2'' und B1-B1''. In C1-C1'', 2 s vorderen Schritt Anregung diente. Die y-Achse für (F) GCaMP6s Graphen zeigt beliebige Einheiten (AE) von Fidschi Bild Intensität Messungen erhalten. Alle Beispiele sind von Larven bei 4-5 Dpf. Maßstabsleiste = 5 µm für alle Bilder. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Räumlich-zeitliche Visualisierung der präsynaptischen GCaMP6s Signale während der Stimulation der Fluid-Jet. Die Schritte, die räumlich-zeitliche Änderungen in GCaMP6s Intensität innerhalb einer Neuromast während der Reiz zu visualisieren sind aufgeführt. Mal wird von links nach rechts nach den Zeitstempel an der Spitze der Bilder dargestellt. Die oberste Zeile zeigt 5 der 14 zeitliche Kästen aus einer 70-Frame GCaMP6s (F) Bildsequenz (Schritt 13.2.1). In der zweiten Reihe hat jedes (F) GCaMP6s gebinnten Bild ΔF Bilder (Schritt 13.2.2) erstellen die Grundlinie (Schritt 13.2) entfernt wurde. In der dritten Zeile der ΔF Bilder von Graustufen konvertiert wurden (zweite Zeile), Red Hot LUT (Schritt 13.3). Die min und Max dieser LUT Bilder werden entsprechend der Red Hot LUT Heatmap des relativen ΔF Intensität (AE) auf der rechten Seite (Schritt 13.3.1) festgelegt. In der untersten Zeile hat die dritte Zeile auf die Bilder (F) in der obersten Zeile (Schritt 13,4) überlagert wurde. Die graue Leiste am oberen Rand der Abbildung zeigt das Timing des 2-s 5 Hz Fluid-Jet Stimulus. Das Beispiel ist aus einer 5 Dpf-Larven. Eine Legende der Red Hot LUT Heat Map des relativen ΔF Intensität (AE) ist auf der rechten Seite angezeigt. Maßstabsleiste = 5 µm für alle Bilder. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

In-Vivo Bildgebung bei intakten Tieren ist grundsätzlich schwierig. Mehrere Schritte in dieser Methode sind entscheidend für die Erlangung zuverlässig in Vivo Calcium-Messungen von Seitenlinie Haarzellen. Zum Beispiel ist es sehr wichtig, dass die Larve angeheftet und richtig gelähmt vor imaging zu Bewegung während der Bildgebung zu minimieren. Überschüssige Bewegung während der Bildgebung kann führen zu Veränderungen im GCaMP6s Fluoreszenz, die keine wahren Signale und Veränderungen der Calciumspiegel nicht entsprechen (z.B. Figuren 4B1'-B1'' und 4 C 1' C1''). Tail-Pins können mehr anterior zu minimieren, Bewegung, obwohl dies mehr posterior Neuromasts unzugänglich machen kann platziert werden. Darüber hinaus kann nach Herz-Injektion, Kopfstifte gedreht werden, dass der horizontale Teil des Stiftes über das Eigelb liegt. Zusätzlich die Veränderung der Position der Pins, ist es auch möglich, eine Gehirn-Scheibe Harfe statt Nadeln verwenden, um Larven34zu immobilisieren. Wenn über die Larven richtig platziert, ist eine Harfe eine zusätzliche, möglicherweise weniger invasive Methode der Immobilisierung Larven. Während nennenswerte Bewegung dazu führen kann, von unzureichend anheften, kann Nichterfüllung richtig die Herz-Injektion für α-Bungarotoxin und Larven zu lähmen unvollständige Lähmung, Bewegung, führen und letztlich Bewegung Artefakte. Obwohl häufig verwendeten Anästhetika gezeigt worden, um die Erregbarkeit der Zebrafisch Haarzellen beeinflussen, hat den letzten Arbeit gezeigt, dass die Betäubungsmittel Benzocain viele Aspekte des Haar-Zell-Aktivität nicht stört. In ähnlicher Weise verwendete mehr häufig Anästhetikum, die MS-222 nur mit bestimmten Aspekten der Haarzelle Aktivität15eingreift. Daher, aufgrund der anspruchsvollen Art der α-Bungarotoxin Injektion, Benzocain oder MS-222 Anwendung erweisen sich eine nützliche alternative Methode der Lähmung, Bewegung in die Larve während der funktionalen Kalzium-Aufnahme zu verhindern.

Neben den technischen Herausforderungen in diesem Protokoll ist auch eine perfekt montierte Probe nutzlos, wenn die Larve und Haarzellen nicht gesund vor und während jeder imaging Experiment sind. Um sicherzustellen, dass die Larven und Haarzellen gesund sind, ist es wichtig, dass Larven in E3 Puffer verwaltet werden, die frei von Verschmutzungen wie Chorions (Eierschalen), Abfall und Mikroorganismen ist. Obwohl die oberflächliche Lage der Seitenlinie Haarzellen vorteilhaft für die Bildgebung ist, macht diese Lage sie anfälliger für zelluläre Schäden bei der E3-Puffer verschmutzt ist. Eine saubere, wässrige Umgebung ist besonders wichtig für junge Larven (2-4 Dpf) oder Mutanten, die eine aufrechte schwimmen können nicht behaupten, zu positionieren und vor allem liegen auf dem Boden der Petrischale. In diesen Situationen können Seitenlinie Haarzellen und schützende Cupula, die rund um die Bündel Haare leicht beschädigt werden. Auch beim Starten mit gesunden Larven und Haarzellen im Laufe jedes Experiment ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Larve Herzschlag und schnelle Durchblutung hat. Wenn der Blutfluss verlangsamt oder stoppt, kann die Gesundheit der Haarzellen beschädigt werden. In gefährdeten Vorbereitungen mit ungesunden Larven oder Verlust des Blutflusses, sterben Haarzellen identifiziert werden mehrere Möglichkeiten: Erstens durch das Auftreten von Karyopyknosis oder nuklearen Kondensation, was als eine Blase innerhalb der Zelle unter DIC Optik; Zweitens durch Schrumpfung der Zelle und das Vorhandensein von sich schnell bewegenden Partikel im Zytoplasma; und drittens, wenn Kinocilia Tipps in verschiedene Richtungen35, heraus spreizen. Wenn Haare Bündel gestört sind, die gespreizten Kinocilia bewegen sich nicht zusammenhängend zusammen während der Stimulation.

Dieses Präparat hat mehrere kleinere Einschränkungen, ein Wesen, dass die Vorbereitung bleibt nur für 1-3 Stunden nach seiner Gründung ist robust. Änderungen wie die Verwendung kleiner Stifte oder eine Gehirn-Scheibe Harfe, um Larven zu immobilisieren und Hinzufügen einer Perfusion System kann die Lebensdauer dieses Präparats in Vivo verlängern. Eine weitere Einschränkung ist, dass Immunofluoreszenz und Phototoxizität kann auftreten, nachdem bildgebende Studien wiederholt. Eine spannende Möglichkeit, diese Herausforderung zu meistern ist, dieses Protokoll für die Licht-Blatt Mikroskopie anzupassen. Licht-Blatt Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, aus Licht fokussieren, was zu weniger Immunofluoreszenz und Phototoxizität36zu reduzieren. Zusammen, helfe sanfter Immobilisierung und weniger Foto-Exposition jeder bildgebenden Sitzung zu verlängern. Mehr bildgebende Sitzungen können verwendet werden, um die gesamte Dauer der funktionalen Veränderungen begleiten die Entwicklung und den Prozessen zugrunde liegenden Haarzellen Clearance und Regeneration nach Verletzungen zu untersuchen. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass neben Licht-Blatt-Mikroskopie, dieses Protokoll auf andere Arten konfokale Systeme (Punkt-Scan 2-Photonen und Spinnerei Disk) sowie relativ einfach Weitfeld Systeme28,34 angepasst werden kann . Alles in allem macht seine Vielseitigkeit ein wertvolles Werkzeug-Protokoll, das angepasst und mit mehreren bildgebenden Systemen verwendet werden können.

Während dieses Protokoll angepasst und mit vielen bildgebenden Systemen verwendet werden kann, können Teile dieses Protokolls auch angepasst und verwendet (1) mit anderen Indikatoren neben GCaMP6s und (2) Bild Tätigkeit in anderen Sinneszellen und Neuronen im Larvenstadium Zebrafisch. Z. B. in einer früheren Studie, wir dieses Protokoll zum Bild Aktivität mit mehrere genetisch codierte Indikatoren innerhalb des Seitenlinie Haarzellen zytosolischen Kalzium (RGECO1), Vesikel Fusion (SypHy), Membran-Spannung (Bongwoori) und Membran erkennen Kalzium (jRCaMP1a-Caax und GCaMP6s-Caax), und innerhalb der Seitenlinie afferenten Prozesse, Membran Kalzium (GCaMP6s-Caax)5zu erkennen. Basierend auf unserer Erfahrung im Umgang mit diesen Indikatoren, bietet die transgene Linie, die Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) in diesem Protokoll beschrieben einen hervorragenden Start für imaging-Aktivität in Seitenlinie Neuromasts. Alle oben aufgeführten Indikatoren haben wir festgestellt, dass GCaMP6s der sensibelsten und photostabil. Zusätzlich zu diesen Funktionen markieren wir die Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene Linie weil es verwendet werden kann, um zwei unterschiedliche Messungen vorzunehmen: Haarzelle Mechanosensation und präsynaptischen Calcium innerhalb einer einzigen transgene Linie.

Die Technik, die in diesem Artikel beschriebenen zeigt wie Kalzium Bildgebung in der Zebrafisch Seitenlinie sein kann eine leistungsfähige Methode zur Funktionsweise von Haarzellen in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Dieser Ansatz ist komplementär zum Studium der Säugetiere, die in die Haarzellen in Ex Vivo Explantaten Funktion derzeit untersucht wird. Darüber hinaus kann das Zebrafisch-Modell weiterhin als Plattform verwendet werden, um die Wirksamkeit der genetisch codierten Indikatoren zu testen, die dann angewendet werden kann, um Aktivität in Säugetierzellen Haar zu untersuchen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH/NIDCD intramuralen Forschung Mittel 1ZIADC000085-01 (K.S.K.) unterstützt. Wir würden gerne Candy Wong für ihre Hilfe bei der Fidschi-Makro schreiben zu bestätigen. Wir möchten auch Danke Doris Wu und Candy Wong für ihre Anregungen mit dem Protokoll.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

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References

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In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch
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Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo… More

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

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