Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794
Automatic Translation
1,2, 1
1Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

O peixe-zebra é um sistema de modelo que tem muitos recursos valiosos, incluindo claridade ótica, rápido desenvolvimento externo e, de particular importância para o campo de audição e equilíbrio, localizado externamente células sensoriais do cabelo. Este artigo descreve como transgênico zebrafish pode ser usado para ensaiar tanto cabelo-célula mechanosensation e função pré-sináptica em toto.

Abstract

Células sensoriais do cabelo são mecanorreceptores encontrados no ouvido interno que são necessárias para a audição e equilíbrio. Células ciliadas são ativadas em resposta aos estímulos sensoriais que mecanicamente desviar apicais saliências chamadas pacotes de cabelo. Deflexão abre canais mechanotransduction (MET) em pacotes de cabelo, levando a um afluxo de cátions, incluindo o cálcio. Este influxo de cátion depolarizes a célula e abre canais de cálcio voltagem-dependentes basalmente localizados no presynapse do cabelo-célula. Nos mamíferos, células ciliadas são encerradas em osso, e é difícil avaliar funcionalmente estas actividades in vivo. Em contraste, o zebrafish larval são transparente e possuem um órgão localizado externamente de linha lateral que contém células ciliadas. Estas células ciliadas são funcionalmente e estruturalmente semelhantes às células dos mamíferos e pode ser funcionalmente avaliadas in vivo. Este artigo descreve uma técnica que utiliza um indicador de cálcio geneticamente codificado (Lino), GCaMP6s, para medir o cálcio evocada por estímulo sinais em células de cabelo de linha lateral de zebrafish. GCaMP6s pode ser usado, junto com a imagem latente confocal, para medir sinais de cálcio em vivo no ápice e base de células de cabelo de linha lateral. Estes sinais fornecem uma leitura em tempo real e quantificável de ambas as atividades de cálcio mechanosensation presynapse-dependentes e dentro destas células. Estes sinais de cálcio também fornecem importantes informações funcionais como células ciliadas detectam e transmitem estímulos sensoriais. Em geral, esta técnica gera dados úteis sobre mudanças relativos na atividade de cálcio in vivo. É menos well-suited para quantificação da magnitude absoluta de alterações de cálcio. Esta técnica in vivo é sensível aos artefatos de movimento. Uma quantidade razoável de prática e habilidade são necessários para o adequado posicionamento, imobilização e estimulação de larvas. Em última análise, quando executado corretamente, o protocolo descrito neste artigo fornece uma maneira poderosa para coletar informações valiosas sobre a atividade de células ciliadas em seus Estados naturais, totalmente integrados dentro de um animal vivo.

Introduction

Imagem latente funcional de cálcio é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para monitorar a atividade de muitas células, simultaneamente,1. Em particular, imagem de cálcio através de indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) foi mostrada para ser vantajoso, porque GECIs podem ser expressos em tipos de células específicas e localizadas subcellularly2. Na pesquisa da neurociência, essas características fizeram imagens de cálcio usando GECIs um poderoso método para definir padrões de atividade dentro de redes neuronais e medir o influxo de cálcio em sinapses individuais3,4. Aproveitando estas características, um estudo recente usou microscopia confocal e GECIs para monitorar a atividade subcellular dentro de coleções de células sensoriais do cabelo5.

Células ciliadas são mecanorreceptores que detectam estímulos som e vestibulares no ouvido interno e movimento de água local no sistema de linha lateral em aquático vetebrates6,7. Células ciliadas são muitas vezes alvo de danos ou mutações genéticas que resultam na forma mais comum de perda de audição em humanos, conhecido como perda de audição neurossensorial8,9. Portanto, é fundamental entender como esses função de células a fim de compreender como tratar e prevenir a perda de audição. Para funcionar adequadamente, células ciliadas utilizam duas estruturas especializadas chamadas feixes mechanosensory-cabelo e sinápticas fitas para detectar e transmitir estímulos, respectivamente. Pacotes de cabelo estão localizados no ápice das células ciliadas e são compostas principalmente de fina, cabelo-como saliências conhecidas como Estereocílio (Figura 1A). Nas células de cabelo vestibulares e linha lateral, cada pacote de cabelo também tem um único kinocilium longo (cílio única verdadeira da célula), que pode estender-se muito acima do Estereocílio (Figura 1A). Mechanosensory estímulos desviar feixes de cabelo, e deflexão coloca tensão sobre ligações chamadas "ponta-links" que interligam Estereocílio10. Esta tensão abre canais mechanotransduction (MET), localizados em Estereocílio, resultando em um influxo apical de cátions, incluindo cálcio11,12. Em última análise, esta atividade apical depolarizes a célula do cabelo e abre canais de cálcio voltagem-dependentes (Cav1.3) na base da célula. Canais de CAv1.3 encontram-se adjacentes para fitas sinápticas, uma estrutura pré-sináptica que amarras vesículas em zonas ativas. Influxo de cálcio basal através de canais de Cav1.3 é necessário para a fusão de vesículas, neurotransmissão e ativação dos neurônios aferentes13,14.

Por muitos anos, eletrofisiológicas técnicas como aperto de células inteiras remendo têm sido usadas para investigar as propriedades funcionais de células ciliadas em muitas espécies, incluindo zebrafish15,16,17, 1819,de,20. Estas gravações eletrofisiológicas foram particularmente valiosas no campo de audição e equilíbrio, porque eles podem ser usados para obter medições extremamente sensíveis de células sensoriais individuais, cujo objetivo é codificar estímulos extremamente rápidos sobre um ampla gama de frequências e intensidades de21,22. Infelizmente, as gravações de células inteiras não medem a atividade de populações de células ciliadas. Para estudar a atividade de populações de células na linha lateral do zebrafish, alertarão potenciais e aferentes potenciais de ação têm sido utilizados para medir a mechanosensitive somado e propriedades da resposta pós-sináptica de neuromasts individual23 ,24. Infelizmente, células inteiras gravações nem medições de potenciais de campo locais têm a resolução espacial para determinar onde a atividade está ocorrendo dentro de células individuais ou mede a atividade de cada célula dentro de uma população. Mais recentemente, corantes de cálcio e GECIs têm sido empregadas para contornar estes desafios25,26.

No zebrafish, GECIs provaram para ser uma poderosa abordagem para examinar a função do cabelo-célula devido a relativa facilidade de criação de zebrafish transgênico e a claridade ótica de larvas27. Larvas de peixe-zebra, células ciliadas estão presentes no ouvido interno, bem como o sistema da linha lateral. A linha lateral é composta de Roseta, como aglomerados de células ciliadas chamados neuromasts que são usados para detectar alterações locais no movimento de água (Figura 1). A linha lateral é particularmente útil porque está localizado externamente ao longo da superfície do peixe. Este acesso tornou possível para estimular células ciliadas e medir sinais de cálcio opticamente em larvas intactas. Em geral, a facilidade de transgênese, transparência das larvas e o acesso sem paralelo-linha lateral células fizeram zebrafish um modelo inestimável para estudar a atividade de células in vivo. Esta é uma vantagem significativa em comparação com sistemas de mamíferos em que células ciliadas estão rodeadas por estruturas ósseas do ouvido interno. Esta falta de acesso tornou muito difícil adquirir funcionais medições in vivo de células mamíferas.

O protocolo descrito aqui descreve como monitorar mudanças de canal presynapse-dependentes e MET em cálcio dentro de células individuais do cabelo e entre células dentro de neuromasts no zebrafish larval. Este protocolo utiliza uma linha estabelecida zebrafish transgênicos que expressa um GCaMP6s membrana-localizada sob o controle do promotor específico myosin6b cabelo-célula28. Esta localização de membrana posições GCaMP6s para detectar o influxo de cálcio através de canais iônicos, localizado na membrana plasmática que são críticas para a função de cabelo-célula. Por exemplo, GCaMP6s de membrana-localizada pode detectar cálcio influxo através de MET canais nos pacotes de cabelo apical e através do CaV1,3 canais perto sinápticas fitas na base da célula. Isto contrasta com o uso de GECIs localizadas no citosol, como GECIs citosólica detectam sinais de cálcio que são uma combinação de atividade de canal 1.3VMET e Ca, bem como contribuições de cálcio de outras fontes (por exemplo, lançamento de loja de, ). Este protocolo descreve como imobilizar e paralisar GCaMP6s transgénicas larvas antes da imagem latente. Ele então descreve como preparar e usar um jato de fluido para desviar os pacotes de cabelo para estimular células de cabelo de linha lateral de uma forma controlada e reprodutível. São apresentados dados representativos que podem ser alcançados usando este protocolo. Também são apresentados exemplos de dados que representam os artefatos de movimento. Experimentos de controle que são usados para verificar os resultados e excluir artefatos são descritos. Por último, um método para visualizar sinais de cálcio espacial no software Fiji é descrito. Esta análise de Fiji é uma adaptação de métodos de visualização estabelecida anteriormente desenvolvidos usando MATLAB5. Em geral, este protocolo descreve uma técnica de preparação poderoso que usa GECIs no zebrafish larval para medir e visualizar a dinâmica de cálcio cabelo células in vivo.

Protocol

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comité de uso Animal em institutos nacionais de saúde, no âmbito do protocolo de estudo animal #1362-13.

Nota: Este protocolo leva aproximadamente 0,5 a 1 h para completar sem interrupções, se as soluções e equipamentos são preparados e configurar antecipadamente. Este protocolo é otimizado para Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 zebrafish larvas na pós-fertilização de 3 a 7 dias (dpf). Esta linha de transgénica exprime um GCaMP6s membrana-localizada (zebrafish códon otimizado) especificamente em todas as células de cabelo zebrafish. Antes da imagem latente, as larvas são geradas no buffer de embrião (E3), em condições normais. Consulte a Tabela de materiais para os números de catálogo de todos os equipamentos e medicamentos necessários para executar este protocolo.

1. preparação de soluções

  1. Prepare-se 1 mL de α-bungarotoxina (125 µM), que é usado para paralisar o zebrafish larvas durante a imagem latente funcional.
    1. Adicione 968.6 µ l de água ultrapura esterilizada e 33,4 µ l de vermelho de fenol a 1 mg de α-bungarotoxina (garrafa). Faça 100 alíquotas µ l e armazená-los a-20 ° C.
      Atenção: Usar luvas e fazer preparações do capuz ao manusear a α-bungarotoxina pó. Também são recomendadas para luvas quando manusear a solução de α-bungarotoxina.
  2. Prepare 1 L de tampão de embriões x 60 (E3).
    1. Adicione 17,2 g de NaCl e 0,76 g de pó de KCl a 954,4 mL de água ultrapura.
    2. Adicione 19,8 mL de 1 M CaCl219,8 mL de 1m MgSO4e 6 mL de tampão HEPES de 1 M para a solução. Armazene a solução-mãe 60 x E3 a 4 ° C por até 6 meses.
  3. Prepare-se 10 L de 1 x E3 (5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7.2), que é uma solução que as larvas são propagadas em antes da imagem latente funcional.
    1. Adicione 167 mL de solução-mãe x E3 60 para 10 L de água ultrapura para fazer uma solução de x E3 1. Armazene a solução de x E3 1 à temperatura ambiente (RT) por até 6 meses.
  4. Prepare o buffer neuronal (NB) (140 mM NaCl 2 mM KCl 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; tampão HEPES de 10 mM, pH 7,3), que é usado para mergulhar as larvas durante a imagem latente funcional.
    Nota: 1 x E3 também pode ser usado para a imagem latente funcional, mas as respostas são mais robustas e confiáveis em NB.
    1. Combinar a 28 mL de 5 M de NaCl, 2 mL de KCl de 1 M, 2 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgCl2e 10 mL de tampão HEPES de 1 M com 957 mL de água ultrapura. Trazer o pH para 7,3 com 1 M de NaOH.
    2. Filtro de esterilizar. Armazenar a 4 ° C por até 1 mês.
      Nota: Trazer para RT antes de usar a solução.
  5. Prepare o estoque de MS-222 (tricaina, 0,4%), que é usado para anestesiar as larvas.
    1. Dissolva 400 mg de sal de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo e 800 mg de Na2HPO4 em 100 mL de água destilada. Ajuste o pH a 7. Loja a 4 ° C.
    2. Use a 0,04% MS-222 para anestesiar as larvas durante a imobilização e a α-bungarotoxina injeção.

2. preparação da câmara e pinos de imagem

  1. Prepare a câmara de imagem(Figura 2). Aplica uma fina camada de graxa de silicone de vácuo elevado para o fundo da Câmara ao longo das bordas do quadrado para o qual irá aderir a lamela de perfusão. Não deixe lacunas na graxa. Pressione firmemente para baixo em torno das bordas da lamela para selá-lo para a câmara de imagem. Limpe o excesso de graxa afastado.
    Nota: Uma seringa de 5 mL com uma ponta de micropipeta de 200 µ l é recomendada para aplicação de graxa.
  2. Prepare o encapsulante do silicone para encher a câmara. Misture a proporção de 10:1 (em peso) de base para o agente de cura. Misture cuidadosamente, mas com cuidado, usando uma ponta da micropipeta para criar bolhas mínimas.
    1. Despeje o encapsulante do silicone no sentido do lamela Aposto para que é o nível com a superfície da câmara. Cerca de 3 g de encapsulante vai encher a câmara.
    2. Com cuidado toque da câmara contra uma superfície plana mantendo-o horizontal, ou use uma ponta de micropipeta (sob um estereomicroscópio) remover ou puxar as bolhas para a borda da câmara.
    3. Coloque a câmara em um forno de laboratório durante a noite em 60 – 70 ° C. Coloque a câmara dentro de uma caixa ventilada para garantir que o ar quente não é diretamente soprando sobre o encapsulante para evitar criar ondulações.
  3. Use pinça fina e fio de tungstênio para formar os pinos usados para imobilizar as larvas através da cabeça e cauda (Figura 2B1) sobre o encapsulante endurecido.
    1. Para fazer com alfinetes de cabeça, segure um pedaço de fio de tungstênio de 0,035 mm com uma mão sob um estereomicroscópio. Usando a pinça fina na outra mão, dobre o fio 1 mm acima da extremidade a 90°. Trocar o fórceps para tesoura fina e corte 1mm depois da curva para criar o pin.
    2. Repita a etapa 2.3.1 usando um fio de 0,025 mm para fazer pinos de cauda, mas deixar de fio 0,5 mm em ambos os lados da curva. Use a pinça para inserir os pinos o encapsulante endurecido na câmara (para armazenamento).

3. preparação de agulhas para paralisia e estimulação

  1. Prepare as agulhas de injeção de coração usando capilares de vidro com um filamento. Puxe as agulhas com um diâmetro de ponta interna de 1 – 3 µm (Figura 2C).
  2. Prepare o jato de fluido agulhas usando capilares de vidro sem um filamento. Puxe as agulhas com uma ponta fina e longa que pode ser quebrado para o diâmetro da ponta correcta.
    1. Quebre a ponta fina, longa da agulha jato de fluido, esfregando-o perpendicularmente contra outro jato de fluido de agulha ou uma telha cerâmica logo acima onde a ponta da agulha pode ser dobrada para criar um diâmetro de ponta interna de 30-50 µm [Figura 2C (imagem central) e Figura 3 A2]. Verifique se o intervalo é mesmo através de ponta (Figura 2C, imagem média) e não recortados ou muito grande (Figura 2Cimagem direita) para garantir o mesmo e exato fluido fluir durante a estimulação de células de cabelo.
      Nota: Um polidor de agulha pode ser usado para corrigir a intervalos irregulares.

4. fixação e Larva de imobilização para câmara de imagem

  1. Banhar-se uma larva de Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) em cerca de 1 mL de tampão de E3 contendo 0,04% MS-222 por 1 – 2 min na superfície encapsulante do silicone da câmara de imagens até a larva torna-se imóvel ou não responder ao toque.
    1. Sob um estereomicroscópio, posicione a larva no centro da câmara de perfusão para situa-se no seu lado contra o encapsulante do silicone.
      Nota: Para obter consistência, monte sempre larvas do mesmo lado (por exemplo, o lado direito para baixo, lado esquerdo para cima) (Figura 2B1).
  2. Usando a pinça fina, trazer um alfinete de cabeça de 0,035 mm para baixo perpendicular a larva e câmara. Insira o pino de cabeça entre os olhos e vesícula ótica e para baixo para o encapsulante (figuras 2B1 e 2B2). Use um segundo conjunto de pinças para estabilizar a larva ao longo de seu lado dorsal ou ventral durante a fixação. Certifique-se que a parte horizontal do pino entra em contato com a larva e não pressione o até o encapsulante. O pino do ângulo ventralmente (Figura 2B1) ou apontando ligeiramente para o anterior do peixe para evitar interferência com injeção de coração subsequentes e imagem latente da pilha de cabelo.
    1. Usando a pinça, introduza um pin de cauda de 0,025 mm a notocorda tão perto como possível à extremidade da cauda (Figura 2B1).
      Nota: Tenha cuidado para evitar alongamento a larva. Pino liso a larva. Os olhos devem ser sobreposta (Figura 2B1). Isto é muito importante para facilitar a injeção de coração (Figura 2B2-B2', passo 5), facilitando um avião imagem desejável (Figura 1B1-B2 ', as etapas 8 e 9) e quantificar a intensidade do estímulo jato de fluido ( Figura 3A3, etapa 7).

5. injeção de α-bungarotoxina na cavidade do coração a paralisar a Larva

Nota: Use luvas quando manusear a α-bungarotoxina.

  1. Centrifugue a α-bungarotoxina alíquota brevemente antes de usar para evitar o entupimento da agulha de injeção de coração.
    1. Aterramento de 3 µ l de solução de α-bungarotoxina em uma agulha de injeção de coração usando um gel carregando a ponta da pipeta. Carrega a solução uniformemente até a ponta com nenhuma bolha.
    2. Insira a agulha de injeção de coração um titular da pipeta anexado a um micromanipulador manual. Sob um estereomicroscópio, posicione a agulha para é alinhada perpendicular ao eixo A-P das larvas fixados e anestesiados, apontando para baixo em um ângulo de 30°.
    3. Conectar-se a titular da pipeta para o injetor de pressão. Aplique as seguintes configurações sugeridas: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s e Pcompensation = 5 hPa. Injete a solução para testar se a ponta da agulha é patente em bolus.
    4. Procure por um pequeno sopro da solução de vermelho (de vermelho de fenol) para deixar a ponta da agulha. Se nenhuma cor vermelho é visto, muito gentilmente raspar a ponta da agulha contra a ponta de um alfinete e tente novamente até que a agulha é patente. Alternativamente, puxe uma agulha com uma maior abertura de ponta.
  2. Avance a agulha em direção ao coração, até que toca a pele fora do coração (Figura 2-B2). Pressione a agulha contra a larva e procurar o recuo da célula de pigmento na pele na frente do coração para garantir essa agulha é posicionada no plano correto em relação a larva (Figura 2B2').
    1. Avance a agulha ainda mais até que perfura a pele e entra na cavidade do coração. Puxe a agulha ligeiramente para trás. Injete um bolus de α-bungarotoxina na cavidade do coração. Olhar para a inflação da cavidade do coração ou para entrar na cavidade de corante vermelho.
  3. Lave suavemente a larva 3 vezes com 1 mL de NB para remover MS-222 residual. Nunca retire todo o líquido. Manter a larva em cerca de 1 mL de NB na câmara de perfusão.
    Nota: Garantir a batida do coração larval e fluxo de sangue permanecem robusta após a injeção de fixação e de coração e ao longo de todo o experimento de imagem.

6. preparação da instalação do jato de fluido e microscópio

  1. Montar um microscópio confocal vertical usando os componentes descritos na Tabela de materiais: um microscópio confocal com um 488 nm laser e filtros adequados, programas de microscópio para controlar e coordenar a imagem latente e estimulação, ar de x 10 objetivo, objetivo de água x 60, scanner objetiva de piezo-Z (para z-stacks), câmera de alta velocidade, adaptador de câmara circular, palco motorizado e adaptador de inserção de palco. Consulte Zhang et al.29 para opções adicionais e orientação sobre as configurações de microscópio.
  2. Montar o jato fluido constituído por 3 componentes principais: um vácuo e bomba de pressão, braçadeira de pressão de alta velocidade e palco de cabeça (também descrita na tabela de materiais). Use o grampo de pressão de alta velocidade para controlar a temporização e duração de descarga de pressão ou vácuo fora do palco de cabeças e dentro da pipeta de jato de líquido.
    1. Conecte a saída do palco principal para o jato de fluido pipeta titular através de paredes grossas do silicone tubo.

7. alinhamento da Larva e fluido-jato

Nota: Há 3 planos de interesse dentro de cada neuromast: (1) as dicas de feixes do cabelo (Figura 3A3: a forma, utilizada para medir a intensidade do estímulo); (2) o avião MET de cabelo-bundle (Figura 1B1-B1': a base dos pacotes cabelo apical onde que são detectados sinais de cálcio MET-canal-dependente); e (3) o avião sináptico (Figura 1B2-B2': onde os sinais de cálcio pré-sináptica são detectados na base da célula do cabelo). Estes aviões estão descritos na Figura 1A.

  1. Aterramento de 10 µ l de NB em uma agulha de fluido-jato corretamente quebrada (da etapa 3.2) usando um gel de ponta de carga. Carrega a solução uniformemente até a ponta com nenhuma bolha. Introduza a agulha no suporte pipeta anexado para o micromanipulador motorizado.
  2. Coloque a câmara de perfusão em um adaptador de câmara circular no palco microscópio.
    Nota: Para obter consistência, sempre posicione a larva na mesma orientação (por exemplo, a câmara que contém a larva com sua posterior em direção jato de fluido e ventral lateral virada para o experimentador).
    1. Mova o palco motorizado para que a larva está no centro do campo de visão. Ativar o adaptador de câmara circular para que o eixo A-P da larva está aproximadamente alinhado com a trajetória da agulha jato de fluido.
    2. Usando o contraste de interferência diferencial e luz transmitida (DIC), trazer a larva em foco e centralizá-lo no âmbito do objectivo de 10x. Levante o objectivo 10 x.
  3. Usando o micromanipulador motorizado, derrubar a agulha de fluido-jato no centro do campo de visão para que ele é iluminado pela luz transmitida e mal tocando a solução NB.
    1. Baixe o objectivo 10 x. Focar a larva para confirmar a sua localização. Concentre-se para encontrar a agulha de jato de líquido. Mova a agulha de fluido-jato com o micromanipulador nos x - e y eixos até que esteja em uma posição paralela ao lado dorsal do peixe.
    2. Focar em volta a larva. Traga a agulha para baixo do eixo z. Posicione a agulha ao longo do lado dorsal do peixe e mm ~ 1 longe do corpo (Figura 3A1).
    3. Deslocar cuidadosamente o adaptador de câmara circular (se necessário) para assegurar que a agulha de fluido-jato é alinhada ao longo da linha mediana A-P da larva (Figura 3A1).
    4. Mova o palco motorizado para colocar o neuromast de interesse no centro do campo de visão. Mantenha a ponta da agulha de jato de líquido ao longo do lado dorsal do peixe. Não toque a ponta da agulha para a larva ou a superfície da câmara jato de fluido.
  4. Alterne para o 60 x objetivo de água. Certifique-se de que o objetivo é imerso na solução de NB. Uso o foco fino para localizar um neuromast usando transmitidos DIC óptica e luz.
    Nota: Esta instalação é projetada para estimular o neuromasts ao longo da linha lateral posterior primária. Células ciliadas dentro desses neuromasts responder ao fluxo de fluido de direção anterior ou posterior. Ver Chou et al31 em um mapa preciso da neuromast sensibilidade fluido dentro do sistema da linha lateral.
    1. Coloque a agulha de fluido-jato com o micromanipulador é 100 µm da borda exterior da neuromast (Figura 3A2).
      Nota: Escolher neuromasts que oferecem uma vista clara de cima para baixo (figuras 1B1'-B2' e Figura 3A3) ao invés de lado-angular vistas (Figura 1C1-C2). Simultânea de todos os pacotes de cabelo apical em um único plano ótico de imagem ou de imagens de áreas sinápticas em menos aviões ópticos (Figura 3A3) permite uma visão clara de cima para baixo.
    2. Concentre-se até as pontas dos cabelos-pacotes apicais (forma) (Figura 1A, figuras 3A2 e 3A3). O fundo da agulha jato de líquido deve estar em foco neste avião.
  5. Defina o grampo de pressão de alta velocidade do manual para o modo externo para receber entrada do software da imagem latente.
    1. Zero a braçadeira de pressão de alta velocidade, pressionando o botão de "zero". Utilize o botão de ponto de ajuste para ajustar a pressão de repouso ligeiramente positiva (~ 2 mmHg). Confirme a saída de descanso da mordaça pressão alta velocidade usando um manômetro PSI anexado à saída do palco principal.
      Nota: Defina uma pressão ligeiramente positiva em repouso para evitar a absorção gradual de líquido na agulha a jato de fluido ao longo do tempo. Se o fluido entra no tubo conectado para o jato de fluido e atinge o estágio de cabeça, pode danificar o equipamento.
    2. Determine a pressão necessária para estimular os pacotes de cabelo. Utilize uma 0,125 e 0,25 V entrada (6,25 e 12,5 mmHg) para 200-500 ms para aplicar um teste de estímulo (Figura 3A3-A3 ').
      Nota: O grampo de pressão de alta velocidade converte uma tensão de entrada (de software ou outros dispositivos que se conectam à porta BNC na porta de comando do grampo de pressão de alta velocidade) em pressão que é expulso do palco principal e, finalmente, a agulha de fluido-jato (1.0 V = 50 mmHg, enquanto -1,0 V =-50 mmHg). Nesta configuração (consulte a etapa 7.2) positivo de pressão (empurrão) desvia pacotes de cabelo para o anterior, e pressão negativa (puxar) desvia pacotes de cabelo em direção posterior.
    3. Usando a luz transmitida e DIC óptica juntamente com uma barra de escala, medir a distância de deflexão por 6,25 e 12,5 mmHg estímulos das pontas dos pacotes cabelo, a forma (Figura 1A e figuras 3A3-3 '). Escolha uma pressão que move os pacotes (como 1 unidade coesa) uma distância de aproximadamente 5 µm (Figura 3A3 '). Certifique-se de que as pontas de forma a mantêm em foco o tempo todo.
    4. Mova o jato de fluido ± 25 µm ao longo do eixo A-P da larva encontrar a distância e a pressão que desvia as pontas de forma 5 µm.
      Nota: Usando GCaMP6s em larvas 3 – 7 dpf, uma deflexão de 5 µm deve atingir perto de saturar os sinais de cálcio GCaMP6s e não deve danificar estruturas de cabelo-pacote apical (Figura 3A3 '). Menores distâncias de deslocamento podem ser usadas para fornecer estímulos não-saturação (Figura 3A3'). Distâncias de deslocamento > 10 µm são difíceis de estimar ( Figura 3A3 ' ') e pode ser prejudicial ao longo do tempo. Sinal de saturação é dependente da idade da neuromast (e kinocilial altura) bem como o indicador utilizado. Verifica a permeabilidade da agulha jato de líquido em cada direção (pressão/push e vácuo/pull) periodicamente durante a imagem latente. Jato de fluido agulhas entopem facilmente e perdem a permeabilidade do vácuo, mas eles mantenham a patência de pressão residual. Use DIC óptica e um pequeno teste estímulo em cada direção para verificar se há patência jato de fluido.
    5. Concentrar a amostra para o avião de interesse (por exemplo, a base dos pacotes cabelo apical ou a base da célula de cabelo no plano sináptico; Figura 1 B1-B2').

8. imagem aquisição procedimento opção 1: Aquisição de Single-avião

Nota: Todas as imagens descritas neste protocolo é realizado a RT

  1. Defina o software de imagem para adquirir uma streaming ou contínua aquisição de 80-quadro com uma captura cada 100 ms para atingir uma taxa de quadros de 10 Hz.
  2. Conjunto de ganho, abertura e potência do laser para otimizar a detecção do sinal, mas evitar a saturação, fotobranqueamento e ruído. Configurações de exemplo para um Opterra/SFC são como segue: potência de laser 488 nm: 50 (avião MET de cabelo-bundle), 75 (avião sináptica); fenda de 35 µm; ganho = 2,7; Ganho EM = 3900.
    Nota: Aplica 2 X binning se sinais muito fracos ou barulhento ou tem fotobranqueamento excessivo. 2 x binning vontade melhorar a detecção do sinal à custa de resolução espacial.
  3. Selecione um estímulo para entregar durante o 80-frame (8 s) aquisição após quadro 30, em 3 s.
    Nota: Alguns estímulos de exemplo são as seguintes: 200 ms (+ ou - 0,25 V) até 2 s (+ ou - 0,25 V) um passo na direção anterior ou posterior para identificar a sensibilidade direcional de cada célula do cabelo; 2 s, 5 Hz onda quadrada (0,25 V para 200 ms,-0.25 V para 200 ms, repetida 5 vezes) para estimular o cabelo de todas as células simultaneamente. Uma pressão positiva (estímulo anterior) ativará metade das células de cabelo. Uma pressão negativa (estímulo posterior) ativará a outra metade das células de cabelo. Certifique-se de que o estímulo software ou dispositivo retorna o grampo de pressão para 0 V após o estímulo é terminado.
  4. Medida mechanosensitive cálcio respostas. Concentre-se na base dos pacotes cabelo apical (Figuras 1A e 1B1-B1') e iniciar a aquisição de imagens.
    Nota: Se o neuromast é visto claramente de cima para baixo (Figura 1B1-B1'), todos os pacotes de cabelo apical podem ser fotografados simultaneamente em um único avião.
  5. Respostas de cálcio pré-sináptica de medida. Foco na base das células de cabelo (Figuras 1A e 1B2-B2') e iniciar a aquisição de imagens.
    Nota: Se o neuromast é visto claramente de cima para baixo (Figura 1B2-B2'), os aviões pré-sináptica de imagens de todas as células do cabelo podem ser adquiridos em 2 – 3 aviões conjunto 2 µm separados. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] peixes transgênicos podem ser usados para identificar e localizar as fitas pré-sináptica e sites de cálcio entrada29.

9. imagem aquisição procedimento opção 2: Aquisição multi-plano

  1. Sintonize a piezo-Z anexado ao objectivo 60 x para aquisições rápidos (12 – 18 ms). Certifique-se de que as configurações de velocidade máxima são selecionadas.
  2. Crie uma aquisição de Z-pilha usando um piezo-Z. Adquira a atividade MET de cabelo-bundle 5 aviões com tamanho de passo de 0,5 µm. adquirir os sinais pré-sináptica em 5 aviões com tamanho de passo de 1 µm.
  3. Defina a taxa de quadros de 10 Hz. Cada quadro será capturado a cada 20 ms e cada pilha-Z cada 100 ms.
  4. Configurar a aquisição de 400 frames ou 80 Z-pilhas a 10 Hz para um 8 s aquisição de streaming.
  5. Definir a potência do laser, abertura e ganho para otimizar a detecção do sinal, mas evitar a saturação, fotobranqueamento e ruído. Configurações de exemplo para um sistema de Opterra/SFC são as seguintes: potência de laser 488 nm: 75 (avião MET de cabelo-bundle), 125 (avião sináptica); fenda de 35 µm; ganho = 2,7; Ganho EM = 3900.
    Nota: Aplicar 2 X binning se os sinais são muito fracos,barulhento, ou ter fotobranqueamento excessivo. 2 x binning vontade melhorar a detecção do sinal à custa de resolução espacial.
  6. Selecione um estímulo para entregar durante a aquisição, iniciando-se no quadro 150, após 3 s.
  7. Continuar o protocolo como descrito acima para a aquisição de nenhum avião, mas o centro Z-pilha dos aviões apical ou basal (etapas 8.4 e 8.5).

10. controle: Farmacológico bloco de cálcio tudo evocado sinais

Nota: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) etano-N, N, n', n'-tetraacetic ácido) o tratamento é um controle crítico ao primeiro estabelecer este protocolo.

  1. Depois de concluir as etapas de 8 ou 9, substitua o NB 1 mL de NB contendo 5 mM BAPTA para decompor as ligações de ponta necessárias para portão apical MET canais localizados em pacotes de cabelo.
  2. Incubar durante 10-20 min no RT.
  3. Lave a BAPTA 3 vezes com 1 mL de NB.
  4. Repita a etapa 8 ou 9. Após o tratamento BAPTA, não deveria haver nenhuma mudança na GCaMP6s de fluorescência em resposta à estimulação do jato de fluido em pacotes de cabelo apical ou do avião sináptica. Se persistirem alterações em fluorescência GCaMP6s, estes não são sinais verdadeiros de cálcio e podem ser artefatos de movimento.

11. controle: Farmacológico bloco de cálcio pré-sináptica sinais (opcionais)

  1. Depois de concluir as etapas de 8 ou 9, substitua o NB NB contendo 10 µM isradipine com 0,1% dimetilsulfóxido (DMSO) para bloquear os canais de cálcio tipo L no presynapse cabelo-célula.
  2. Incubar durante 10 minutos a RT.
  3. Sem executar uma lavagem, repita o passo 8 ou 9. Após o tratamento, deve ainda haver alterações de fluorescência GCaMP6s em resposta à estimulação de jato de líquido no cabelo apicais-pacotes, mas não o avião sináptico. Se alterações na fluorescência GCaMP6s mantidas no plano sináptico, estes não são sinais verdadeiros de cálcio e podem ser artefatos de movimento.

12. representação gráfica e processamento de dados da imagem

Nota: Use Fiji (etapas 12.1 – 12.1.5) e um programa gráfico (etapas 12.2 – 12.2.3) para a etapa 12. StackReg, TurboReg (etapa 12.1.3), tempo série Analyzer V3 (passos 12.1.4–12.1.6), e Fiji plugins também são necessária (veja Tabela de materiais).

  1. Abra uma sequência de imagem em Fiji, uma série de tempo do único-avião (80-quadro único plano) ou série Z-pilha (400-quadro multi avião). Clique em "Arquivo", selecione "Importar" no menu suspenso e clique em "Sequência de imagens".
    1. Para uma série de vezes Z-pilha, Z-projeto cada vez apontar (5 aviões por commit) para criar uma sequência de imagens quadro-80. Clique em "Imagem", selecione "Stacks" no menu suspenso, selecione "Ferramentas" no menu suspenso e clique em "Agrupados Z-projeto." Selecione "Intensidade média" como método de projeção e digite "5" para "Tamanho de grupo".
      Nota: Cada avião dentro da pilha-Z pode ser analisado separadamente para adicionais informações espaciais.
    2. Remove o primeiro 1 s (10 quadros) de 8 s (80 frames) de aquisição de imagem. Clique em "Imagem", selecione "Stacks" no menu suspenso, selecione "Ferramentas" no menu suspenso e clique em "Make Substack". Digite "80-11" para "Fatias".
      Nota: Esse substack será referido como stk1.
    3. Registre a sequência de imagens (stk1) usando o plugin de StackReg32. Clique em "Plugins", selecione "StackReg" e selecione "Tradução" como o método de registo para a série de tempo 70-quadro.
      Nota: Este substack registrado será referido como stk2.
    4. Use o plugin vezes série Analyzer V3 para extrair as medições de intensidade (F) GCaMP6. Coloque uma região de interesse (ROI) em pacotes de cabelo apical ou pré-sináptica sites em stk2. Consulte o website do ImageJ (consulte Tabela de materiais para o link) para obter instruções sobre como usar o V3 de analisador de série de tempo.
      Nota: Use uma circular 1 – 2 µm ROI para pacotes de cabelo apical e uma circular de 3 – 5 µm ROI para o avião sináptico (figuras 4A1 e 4A2).
    5. Selecione os parâmetros de medição. Clique em "Analisar", selecione "Definir medição" e certifique-se de que só "significa" cinza valor é selecionado.
    6. No Gerenciador de ROI, selecione todos os ROIs e usar a função multi medida para gerar valores de intensidade (F) para cada ROI da série de tempo. Gerenciador de ROI, clique em "Mais >>" e selecione "Multi medida" do menu drop-down.
  2. Trama (F) valores. Cole os valores (F) resultados da "Medida de Multi" em um programa gráfico para criar um gráfico de X-Y (figuras 4A1 'e 4A2').
    Nota: Criar (X) valores manualmente ou usar o carimbo de hora de metadados.
    1. Quantificar a linha de base (Fó) para cada ROI calculando os valores de (F) no programa de gráficos de quadros os pre-estímulos 1-20.
    2. Para cada ROI, subtrai o (Fó) os valores de (F) em cada commit para criar valores ΔF (F-F.o). Replot, se desejado.
    3. Calcular e plotar ΔF/Fó. Para cada ROI, dividir a medição de ΔF por (Fó) e replot (figuras 4A1 ' e 4A2 ').

13. processamento e representação de mapa de calor de cálcio espácio-temporal de sinais de imagem

Nota: Trabalhos anteriores para criar a representação de mapa espacial calor de cálcio sinais no zebrafish lateral-linha cabelo células utilizaram software personalizado escrito em Matlab5,28. Esta análise foi adaptada para o software de análise de código-fonte aberto Fiji33. Uso Fiji para todas as etapas descritas abaixo. StackReg e TurboReg Fiji plugins também são necessária (veja Tabela de materiais).

  1. Execute as etapas 12.1 – 12.1.3 para cada série de tempo nenhum avião ou Z-pilha criar o substack registrado referido como stk2.
  2. Use o stk2 para criar uma imagem de linha de base. Clique em "Imagem", selecione "Stacks" no menu suspenso e selecione "Project Z". Selecione "Intensidade média" para "Tipo de projeção" e digite "1" para "Fatia de início" e "20" para "Fatia de paragem".
    Nota: Este Z-projeção será referido como baselineIMG.
    1. Temporalmente bin a sequência de imagens do quadro-70 (F) (stk2) em 14 latas de 0.5-s. Clique em "Imagem", selecione "Stacks" no menu suspenso, selecione "Ferramentas" no menu suspenso e clique em "Projeto de Z agrupados". Selecione "Intensidade média" como o "método de projeção" e digite 5 para "Tamanho do grupo."
      Nota: Este agrupados Z-projeção será referido como stk2bin e F na Figura 5.
    2. Subtrai o valor de pixel de linha de base (baselineIMG) binned (F) imagem sequência (stk2bin) para criar uma sequência de imagens ΔF. Clique no "Processo" e selecione "Calculadora de imagem" no menu suspenso. Selecione stk2bin como "Imagem1" e baselineIMG como"Imagem2". Selecione "Subtrair" para "Operação".
      Nota: Esta projeção-Z subtraído de linha de base é conhecida como stk2binBL e F-BL = ΔF na Figura 5.
  3. Escolha uma tabela de pesquisa (LUT) de escolha para exibir a sequência de imagens ΔF (stk2binBL). Clique em "Imagem", selecione "Tabelas de pesquisa" do menu drop-down e clique em uma LUT de escolha.
    Nota: "Red Hot" é o LUT usado na Figura 5. Este Z-projeção de base-subtraído com LUT é referido como stk2binBL-LUT e ΔF LUT na Figura 5.
    1. Defina o mínimo (min) e os valores de brilho máximo (máx.) para stk2binBL-LUT. Clique em "Imagem", selecione "Ajustar" e clique em "Brightness/Contrast". Defina o valor de min para remover o ruído de fundo de stk2binBL-LUT. Definir os valores máximos para reter os sinais de interesse, mas evitar a saturação do sinal [por exemplo, de 200 a 1600 (escala de intensidade de 12 bits de imagem = 0 a 4095)].
      Nota: Use os mesmos valores min e max ao fazer comparações visuais ou representações. Um bar LUT ΔF calibração pode ser gerado em Fiji para cada sequência de imagens LUT (por exemplo, stk2binBL-LUT). Clique em "Analisar", selecione "Ferramentas" e clique em "Barra de calibração". Desmarque "Overlay" para gerar uma imagem separada, individual com a barra de calibração de LUT para referência.
    2. Converter ambos o ΔF (stk2binBL-LUT)com a imagem desejada de LUTand o temporalmente binned (F) (stk2bin) sequências para RGB. Clique em "Imagem", selecione "Tipo" e clique em "RGB Color".
      Nota: As Z-projeções RGB-convertido serão referidas como stk2binBL-LUT-RGB e RGB stk2bin, respectivamente.
  4. Sobrepor as imagens LUT de ΔF (stk2binBL-LUT-RGB) para binned imagens (F) (stk2bin-RGB). Clique no "Processo" e, em seguida, "Calculadora de imagem". Selecione stk2bin-RGB como imagem1 e stk2binBL-LUT-RGB como Image2. Selecione "Transparente-zero" para a "Operação".
    Nota: Se houver demasiado ruído ou fundo na sobreposição ΔF LUT, repita a etapa 13.3 para aumentar o valor de min. Se houver saturação, repita a etapa 13.3 e aumentar o valor máximo.

14. imagem de processamento e espaço-temporais representação de mapa de calor usando uma Macro de Fiji

Nota: A seção a seguir refere-se a uma macro de Fiji, chamada LUToverlay, com base na etapa 13 que criará automaticamente a representação de mapa de calor espacial dos sinais GCaMP6s. Esta análise requer software de análise do código-fonte aberto Fiji33 e os plugins de StackReg e TurboReg Fiji (ver Tabela de materiais).

  1. Baixe a macro de sobreposição de Fiji LUT (LUToverlay.ijm) que acompanha este protocolo (consulte o Arquivo de codificação suplementar).
  2. Abra uma série temporal multi-plano ou single-avião MTS (consulte a etapa 12.1).
  3. Clique em "Plugins", selecione "Macros", clique em "Executar" e selecione a macro LUToverlay. Uma caixa de diálogo aparecerá com o texto, fala-me de sua aquisição de imagem".
    Nota: Para a caixa de diálogo, os números presentes são valores sugeridos e podem ser alterados de acordo com a configuração usada pelo experimentador. Os valores listados na caixa e abaixo são definidos por uma série de tempo multi-avião com 400 imagens e 5 aviões por Commit (etapa 9).
  4. Depois de "Número de aviões por Commit", digite o número de aviões por Commit (por exemplo, para a etapa 12.1.1 usando um avião multi 400 mts com 5 aviões por Commit, digite "5"). Para uma aquisição de avião único (por exemplo, passo 8) digite "1".
    Nota: Nas caixas de diálogo restantes, para uma série de tempo multi-plano, "Momentos" refere-se às imagens números na Z-pilha projetada (por exemplo, para etapa 12.1.1 é 80 momentos).
    1. Use a opção "Definir o intervalo para analisar" para remover o primeiro 1 s da sequência de imagem (por exemplo, para a etapa 12.1.2 Selecione "11-80" para remover os primeiros 10 quadros e primeiro 1 s).
    2. Depois "definir momentos de linha de base", digite o número de imagens a ser usado para criar a imagem de base [por exemplo, para a etapa 13.2., digite "20" para usar as imagens de pré-estímulos (11-30)].
    3. Depois de "Momentos por bin temporal" Insira o número de imagens a bin para a sobreposição. (por exemplo, para a etapa 13.2.2. Selecione "5" para criar 14 caixas de 0.5-s).
    4. Depois de "Intensidade de Min" e "Intensidade de Max" Introduza os valores mínimo e máximo brilho que irão remover o ruído de fundo (mínimo) e reter os sinais de interesse, evitando a saturação (no máximo).
    5. Depois de "escolher uma tabela de pesquisa", selecione o LUT desejado para a sobreposição. Clique em "Okey".
      Nota: A macro vai terminar de analisar as imagens de acordo com as instruções apresentadas na etapa 13. As imagens geradas pela macro também serão nomeadas de acordo com as instruções na etapa 13.
  5. Feche todas as janelas de análise antes de processar uma nova sequência de imagem.

Representative Results

Depois de myo6b:GCaMP6s-lipidação peixe transgénicos é devidamente imobilizado e o estímulo de jato de fluido é entregue à linha lateral células de cabelo, sinais de cálcio robusto podem ser visualizados e medido (figuras 4 e 5, tirada em 2 X binning). Durante a estimulação de jato de fluido, cálcio sinaliza também pode ser medido em pacotes o cabelo apical, onde operam canais abertos em resposta a estímulos, ou na base das células capilares, onde os canais de cálcio pré-sináptica Cav1.3 desencadear neurotransmissão. Um exemplo representativo de respostas de cálcio nestas regiões com um neuromast individual são mostrados na Figura 4A1-A2 '. Neste exemplo, um estímulo de fluido-jato de 5 Hz 2-s foi entregue para ativar todas as células do cabelo dentro o neuromast representante. Durante o estímulo, sinais robustos de cálcio podem ser detectados em feixes do cabelo (Figura 4A1-A1 ', respostas de 8 pacotes de cabelo são mostradas). Neste sistema, quase todas as células maduras do cabelo exibir este apical influxo de cálcio5. Em contraste, dentro da mesma neuromast, existem sinais de cálcio detectável no plano basal, sináptico em apenas um subconjunto (~ 30%) de células ciliadas (Figura 4A2-A2 ', 4 células com respostas pré-sináptica são mostradas)5. O 4 verde ROIs mostrar células com sem sinais significativos de cálcio pré-sináptica (Figura 4A2-A2 ') apesar de sinais robustos de cálcio apical (Figura 4A1-A1 '). Neste exemplo representativo (Figura 4A1-A2 '), coloridos ROIs igualar-se feixes de cabelo no plano MET apical (Figura 4A1) com seus corpos celulares no plano sináptico basal (Figura 4A2). Este exemplo destaca como ambos os sinais de- e pré-sináptica-cálcio dependente do MET podem ser medidos dentro de células individuais do cabelo e entre as populações de células ciliadas.

Os sinais de cálcio em ambos os feixes do cabelo e o presynapse podem ser plotados graficamente como cru (F) GCaMP6s intensidade ou intensidade deó GCaMP6s ΔF/F (consulte a etapa 12, figuras 4A1'-A1 ' e 4A2'-A2 '). Os gráficos (F) GaMP6s destacam que a intensidade de fluorescência de base para cada célula pode diferir (figuras 4A1' e 4A2'). Nos gráficos aó GCaMP6s ΔF/F, cada célula é normalizada para o valor de base e a mudança de intensidade relativa da linha de base é plotada (figuras 4A1 ' e 4A2 '). Em ambos o (F) e ΔF/Fó GCaMP6s parcelas, os sinais de cálcio no pacote cabelo apical e basal avião pré-sináptica iniciar com o aparecimento do estímulo (caixa cinza) e declinar exponencialmente após o estímulo termina. Durante o estímulo, sinais de cálcio nos pacotes de cabelo subir rapidamente e saturar-se a força da deflexão não muda (Figura 4A1-A1 '). Em contraste, no subgrupo de células ciliadas com sinais de cálcio detectável no plano sináptico, os sinais de cálcio aumentar mais gradualmente e são menos propensos a saturação (Figura 4A2-A2 '). Nas células de cabelo sem sinais de cálcio pré-sináptica (ROIs verdes), os sinais de cálcio permanecem perto da linha de base.

Além dessas representações gráficas (Figura 4), sinais de cálcio podem ser visualizados espacialmente dentro o neuromast inteiro no decurso do tempo da gravação. Um exemplo de uma representação spatiotemporal é mostrado na Figura 5 para sinais de GCaMP6s pré-sináptica no plano basal de um neuromast. Na Figura 5, as principais etapas para processar uma sequência de imagens para visualização espacial estão descritas conforme descrito na etapa 13. Primeiro, as imagens raw de GCaMP6s (F) são guardadas temporariamente [Figura 5: linha 1 (5 dos 14 escaninhos são mostradas); etapa 13.2.1]. Em seguida, a imagem de linha de base, calculada a partir do pre-estímulos quadros (etapa 13,2), é subtraída os sinais de fluorescência (F) GCaMP6s para obter imagens ΔF (Figura 5: linha 2; Passo 13.2.2). Em seguida, as imagens em tons de cinza ΔF são convertidas para uma cor LUT (Figura 5: linha 3, Red Hot LUT; etapa 13.3). Finalmente, as imagens ΔF com a conversão de LUT são sobrepostas para as temporalmente binned imagens (F) (Figura 5, primeira linha) para revelar os sinais spatiotemporal dentro o neuromast durante a estimulação (Figura 5: linha 4; Passo 13,4). Os mapas de calor de ΔF GCaMP6s sinais fornecem ambas as valiosas informações espaciais e temporais que não é fácil de analisar de ROIs único e gráficos utilizados na Figura 4. Mapas de calor podem ajudar a visualizar informações spatiotemporal críticas, incluindo subcellular informações sobre o início e a duração dos sinais de cálcio dentro de cada célula do cabelo, bem como as diferenças de tempo e na intensidade entre células ciliadas dentro de todo neuromast.

É importante verificar que os gráficos e mapas de calor espaciais representam sinais de cálcio de verdade e não são artefatos devido ao movimento. Neste protocolo, artefatos de movimento podem ser o resultado de tração excessiva ou movimento da larva ou movimento devido à estimulação de jato de líquido. Todos esses artefatos estão desafiando a eliminar completamente desta preparação in vivo. Enquanto registro de sequências de imagem (etapa 12.1.3) pode corrigir a maioria dos movimentos em x - e y-Axes, sequências de imagem com movimentação excessiva no eixo z deve ser identificada e removida de análises. Artefatos de movimento são mais fáceis de identificar por representação gráfica dos sinais de cálcio. Exemplos de mudanças de intensidade de GCaMP6s que são artefatos e não são verdadeiros sinais de GCaMP6s podem ser observados no ápice (Figura 4B1'-B1 ') e base (Figura 4C1'-C1 ') de células de cabelo.

Em pacotes o cabelo apical, artefatos de movimento são comuns quando o estímulo de jato de líquido é muito forte (Figura 3A3 ' '). Durante estes estímulos excessivamente fortes, o avião de cabelo-bundle apical pode mover fora de foco durante a estimulação de jato de líquido então retornar para o plano focal original após o estímulo termina (Figura 4B1'-B '). Isto torna difícil medir com precisão os sinais de cálcio apicais MET-dependente. Um exemplo de artefatos de movimento de cabelo-pacote pode ser visto na Figura 4B1'-B1 '. Aqui, os gráficos mostram uma diminuição GCaMP6s sinais durante o estímulo (caixa cinza) quando os pacotes de cabelo estão fora de foco. Após o estímulo termina, os sinais de GCaMP6s aumentam rapidamente como os pacotes de cabelo retornem à sua posição original e voltem em foco. Isto contrasta com o exemplo na Figura 4A1'-A1 ' em que os sinais de cálcio apical aumentar no início do estímulo em diminuir quando o estímulo termina.

Enquanto o movimento devido a estímulos de jato de fluido excessivos também pode mover o avião sináptico fora de foco, este tipo de artefato de movimento é menos comum neste avião. Em vez disso, as alterações em foco no eixo z devido ao movimento ou deriva da larva são as causas mais comuns de artefatos de movimento. Movimento larval ou deriva pode afetar GCaMP6s medições no ápice e base de células de cabelo. Um exemplo de movimento larval que aumenta GCaMP6s no plano basal, sináptico durante o estímulo é mostrado na Figura 4C'-C '. Artefatos de movimento (Figura 4C1'-C1 ') pode ser distinguido do verdadeiros sinais pré-sináptica (Figura 4A2'-A2 '), examinando o curso do tempo dos sinais de GCaMP6s. Ao invés de aumentando e diminuindo exponencialmente com o estímulo (Figura 4A2'-A2 '), os aumentos induzida por movimento em sinal de GCaMP6s tem um quadrado da forma e subir e descer abruptamente com o aparecimento e o deslocamento do estímulo, respectivamente ( Figura 4 C1'-C1 ').

Além de um exame cuidadoso do curso tempo de sinais GCaMP6s, experimentos de controle usando a farmacologia pode ser usados para diferenciar o verdadeiro GCaMP6s sinais de artefatos de movimento. Por exemplo, BAPTA (etapa 10) pode ser aplicado para decompor os ponta-links que são necessários para a função de MET-canais nos pacotes de cabelo. BAPTA deve eliminar fluido-jato-evocada influxo de cálcio apical MET-canal-dependente, bem como o influxo de cálcio basal, pré-sináptica subsequentes através dos canais de Cav1.3. No exemplo representativo dos sinais de verdadeiro estímulo-evocada cálcio (Figura 4A1-A2 ') durante a estimulação de jato de líquido, todas as alterações no GCaMP6s de fluorescência em ambos os planos apicais e basais seria eliminadas após tratamento BAPTA. Em contraste, alterações na fluorescência GCaMP6s devido ao movimento, como as mostradas na figuras 4B1'-B1 ' e -C1 4 C 1' ' não seriam eliminados pelo tratamento BAPTA.

Além de usar BAPTA para eliminar todos os sinais de GCaMP6s evocada por estímulo, isradipine pode ser aplicado (etapa 11) para bloquear especificamente o influxo de cálcio dependente de 1,3vCa no plano basal sináptico deixando apical cálcio MET-canal-dependente influxo intacta5. Após aplicação de isradipine, em um neuromast individual com nenhum artefato de movimento, mudanças na GCaMP6s de fluorescência em pacotes de cabelo apical (Figura 4A1'-A1 ') durante a estimulação de jato de líquido seria inalterado, enquanto todos os GCaMP6s sináptica alterações de fluorescência na base seriam eliminadas (Figura 4A2'-A2 '). Qualquer mudança no sinal de GCaMP6s no plano sináptico após aplicação de isradipine (por exemplo,,Figura 4C1-C1 ') provavelmente corresponderia a artefatos de movimento.

Figure 1
Figura 1 : Visão geral de uma linha lateral neuromast e aviões de imagiologia funcionais. (A) o diagrama à esquerda mostra uma vista lateral de uma neuromast com quatro corpos de cabelo-celular (preto) entrar em contato com os neurônios aferentes pós-sináptico (azul). Fitas (verde) baraço vesículas na pré-sináptica sites ativos dentro de cada célula. Apical de cada corpo celular é um feixe de Estereocílio (1 µm) que contêm canais MET. Cada pacote de cabelo tem uma kinocilium que transfere a força mecânica do movimento da água para a base do pacote cabelo. O diagrama à direita mostra o mesmo modelo em uma vista de cima para baixo. Neste ponto de vista de cima para baixo, preto é usado para indicar as quatro células representadas no diagrama da esquerda, e cinza é usada para indicar as outras células no neuromast. Dentro deste modelo e essas 2 visualizações, destacam-se três aviões importantes: (1) as pontas dos pacotes cabelo (forma) usadas para quantificar a magnitude da deflexão de feixe de cabelo, (2) o avião MET apical na base dos pacotes cabelo onde cálcio entra na célula durante a estimulação e (3) o avião sináptico na base da célula, onde o cálcio entra perto fitas sinápticas. (B1-B1') DIC e GCaMP6s imagens de cima para baixo do avião MET na base dos pacotes cabelo, onde sinais mechanosensation dependente de cálcio podem ser gravados. (B2-B2') Imagens de cima para baixo DIC e GCaMP6s da mesma neuromast como B1-B1', mas na base do neuromast no plano sináptico, onde sinais de cálcio pré-sináptica podem ser detectados. (C1-C2) Imagens de um neuromast expressando GCaMP6s onde as larvas é montado incorretamente. Neste exemplo, o avião MET apical (C1) e avião sináptica (C2) na base da célula são posicionados em um ângulo de qualidade inferior. Esta posição não permite a todos os pacotes de cabelo ser fotografada em um avião, e muitos mais aviões de imagem são necessários para capturar a atividade em todas as sinapses dentro deste neuromast em comparação com o B1-B2'. As imagens são de larvas no dpf 5. A barra de escala em C2 corresponde a todas as imagens em B1-C2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imaging câmara, procedimentos de injeção de montagem e coração de zebrafish e agulhas. (A) mostrado é uma câmara de imagens com uma larva (esboçada por um retângulo tracejado) fixada ao centro no topo o encapsulante do silicone. (B1) Mostrada é uma larva de dpf 5 imobilizados por dois pinos. Um alfinete de cabeça grande é colocado perpendicularmente ao corpo só posterior ao olho. Os dois olhos se sobrepõem completamente, então o olho inferior é inteiramente obscurecido pelo olho superior. Um pino de pequena cauda intercepta a notocorda na cauda. A larva é plana e não distorcida. (B2) Para paralisar a larva, uma agulha de injeção de coração é orientado perpendicularmente ao corpo e trouxe adjacente ao coração. A agulha de injeção de coração deve contactar a célula de pigmento na frente do coração. (B2') Depressão da agulha na pele faz com que o recuo da célula de pigmento na frente do coração. (C) agulhas na ordem da esquerda para a direita: exemplo de uma agulha de injeção de coração com uma abertura de aproximadamente 3 µm; exemplo de uma boa agulha jato de fluido com uma abertura de aproximadamente 50 µm; exemplo de uma agulha de fluido-jato mal quebrada que é grande e irregulares e irá provavelmente produzir estímulos excessivos e irregulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Fluido-jato alinhamento, posicionamento e calibração de estímulo. (A1) É mostrada uma larva orientada com a cabeça virada para a esquerda e a cauda para a direita, e uma agulha de fluido-jato orientados paralelamente ao eixo A-P do corpo zebrafish. Esta agulha de fluido-jato está alinhada para estimular o neuromasts que respondem à anterior (impulso/pressão) e posterior (tração/vácuo) dirigiu o fluxo de fluido. (A2) Mostrado é um neuromast (delineado pela linha tracejada de branca) e dicas de pacotes de cabelo apical (forma) no lado esquerdo do painel e a agulha do jato de fluido no lado direito do painel. O jato de fluido é posicionado aproximadamente 100 µm da borda do neuromast. (A3-A3 ' ') As pontas dos feixes de cabelo apical (forma) são desviadas diferentes distâncias variando as pressões de jato de fluido estímulo. A trajetória de uma único kinocilial dica é mostrada para 1,5 µm (A3') e 5 µm (A3 ') distâncias de deflexão. O círculo preto indica a posição de repouso do kinocilium. É importante que a forma não são desviados longe demais, caso contrário a intensidade do estímulo não pode ser quantificada de forma confiável e pode tornar-se prejudicial (A3 ' '). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Conheci apical e basal pré-sináptica GCaMP6s sinais durante a estimulação de jato de líquido nas células de cabelo de linha lateral. (A1-A2 ') GCaMP6s alterações de intensidade durante a estimulação de jato de fluido dentro de um neuromast representante. As imagens à esquerda mostram o apical MET avião (A1) e avião sináptica basal (A2) dentro da mesma neuromast. A cor de ROIs codificada em A1 e A2 foram usados para plotar o tempo curso de (F) e gráficos de intensidade de GCaMP6s ΔF/F à direita de cada imagem. (B1-B1 ') Exemplo de uma sequência de imagens MET apical com movimento em excesso durante a estimulação de jato de líquido. A imagem à esquerda (B1) mostra o ROIs usado para plotar o (F) e gráficos de intensidade de GCaMP6s ΔF/F para a direita. (C1-C1 ') Exemplo de uma sequência de imagens no plano basal sináptica que mostra artefatos de movimento e GCaMP6s sinal de mudanças que não são verdade cálcio sinaliza. A imagem à esquerda (C1) mostra o ROIs usado para plotar o (F) e gráficos de intensidade de GCaMP6s ΔF/F para a direita. A caixa cinza em cada gráfico representa a duração do estímulo jato de fluido durante cada sequência de imagens. Um estímulo de fluido-jato de 5 Hz 2-s foi usado para o exemplo em A1-A2 ' e B1-B1 '. Em C1-C1 ', utilizou-se um estímulo de passo anterior s 2. O eixo Y para (F) GCaMP6s gráficos retrata unidades arbitrárias (U.A.) obtidas de medições de intensidade de imagem de Fiji. Todos os exemplos são de larvas no dpf de 4-5. Barra de escala = 5 µm para todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Spatiotemporal visualização de sinais de GCaMP6s pré-sináptica durante a estimulação de jato de líquido. Os passos para visualizar as alterações spatiotemporal GCaMP6s intensidade dentro de um neuromast durante estímulo são descritos. Tempo é representado da esquerda para a direita de acordo com o carimbo de hora no topo das imagens. A linha superior mostra 5 dos 14 escaninhos temporais de uma sequência de imagens de GCaMP6s (F) 70-quadro (etapa 13.2.1). Na segunda linha, a linha de base (passo 13,2) foi removida do cada imagem binned GCaMP6s (F) para criar imagens ΔF (etapa 13.2.2). Na terceira fila, imagens ΔF foram convertidas de tons de cinza (segunda linha) para Red Hot LUT (etapa 13.3). O min e max destas imagens de LUT são definidas de acordo com o mapa de calor vermelho quente LUT de intensidade relativa ΔF (U.A.) no lado direito (passo 13.3.1). Na linha inferior, a terceira fileira tem sido sobreposta para as imagens (F) na linha superior (etapa 13,4). A barra cinza na parte superior da figura indica o momento do estímulo de fluido-jato de 5 Hz 2-s. O exemplo é de uma larva de dpf 5. Uma lenda sobre o mapa de calor vermelho quente LUT de intensidade relativa ΔF (U.A.) é mostrada à direita. Barra de escala = 5 µm para todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Imagens in vivo em animais intactos é inerentemente um desafio. Várias etapas neste método são críticas para obtenção confiável na vivo medições de cálcio das pilhas de cabelo de linha lateral. Por exemplo, é muito importante que a larva é fixada e paralisada corretamente antes de imagens para minimizar o movimento durante a imagem latente. Movimento em excesso durante a imagem latente pode levar a mudanças na fluorescência de GCaMP6s que não são sinais de verdadeiros e não correspondem às alterações nos níveis de cálcio (p. ex., figuras 4B1'-B1 ' e -C1 4 C 1' '). Pinos de cauda podem ser colocados mais anteriormente para ajudar a minimizar o movimento, embora isto pode render mais posterior neuromasts inacessível. Além disso, após a injeção de coração, alfinetes de cabeça pode ser girados para que a parte horizontal do pin encontra-se em toda a gema. Além de alterar a posição dos pinos, também é possível usar uma harpa de cérebro-fatia em vez de pinos para imobilizar as larvas34. Quando colocado sobre as larvas corretamente, uma harpa é um adicional, potencialmente menos método invasivo de larvas de imobilização. Enquanto movimento significativo pode resultar de fixação inadequada, executar corretamente a injeção de coração para entregar a α-bungarotoxina e paralisar as larvas pode resultar em paralisia incompleta, movimento e, finalmente, artefatos de movimento. Embora comumente usados anestésicos têm sido mostrados para afetar a excitabilidade das células de cabelo zebrafish, trabalhos recentes tem demonstrado que o anestésica benzocaína não interfere com muitos aspectos da atividade das células de cabelo. Da mesma forma, o mais comumente usado anestésico que MS-222 só interfere com certos aspectos da atividade de cabelo-célula15. Portanto, devido à natureza desafiadora do α-bungarotoxina injeção, benzocaína ou aplicação de MS-222 pode provar para ser um método alternativo útil de paralisia para impedir a movimentação da larva durante a imagem latente funcional de cálcio.

Além dos desafios técnicos envolvidos no presente protocolo, nem uma amostra perfeitamente montada é inútil se a larva e células ciliadas não são saudáveis antes e durante cada experiência de imagem. Para garantir que as larvas e as células ciliadas são saudáveis, é importante que as larvas são mantidas na reserva de E3 que é livre de detritos, tais como chorions (cascas de ovos), resíduos e microrganismos. Embora a localização superficial de células de cabelo de linha lateral é vantajosa para a imagem latente, este local torna mais vulneráveis a danos celulares quando o buffer de E3 é derrubado. Um ambiente limpo e aquoso é particularmente importante para as larvas jovens (2-4 dpf) ou mutantes que não podem manter uma natação vertical Posicione e deite-se principalmente na parte inferior da caixa de Petri. Nessas situações, células de cabelo de linha lateral e a cupula protetora ao redor dos feixes de cabelo podem facilmente tornar-se comprometido. Mesmo quando começando com larvas saudáveis e células ciliadas, no decorrer de cada experimento, é fundamental para garantir que a larva tem um batimento cardíaco e o fluxo de sangue rápido. Se o fluxo sanguíneo abranda ou para, a saúde das células de cabelo pode ficar comprometida. Em preparações comprometidas envolvendo larvas insalubres ou perda de fluxo sanguíneo, morrendo pilhas de cabelo pode ser identificada várias maneiras: primeiro, pelo aparecimento de karyopyknosis ou condensação nuclear, que se manifesta como uma bolha dentro da célula sob ótica do DIC; em segundo lugar, pela retração da célula e a presença de partículas dentro do citoplasma; movendo-se rapidamente e terceiro, quando forma dicas splay para fora em diferentes direções,35. Quando pacotes de cabelo são rompidas, a forma inclinada não mover juntos forma coesa durante a estimulação.

Esta preparação tem várias limitações menores, sendo que a preparação apenas permanece robusta para 1-3 horas depois é estabelecido. Modificações, como o uso de pinos menores ou uma cérebro-fatia harpa para imobilizar as larvas e adicionando um sistema de perfusão pode estender a vida útil desta preparação na vivo . Outra limitação é que fotobranqueamento e fototoxicidade pode ocorrer após repetidas experimentações de imagem. Uma maneira emocionante para superar este desafio é adaptar este protocolo para microscopia de luz-folha. Microscopia de luz-folha é uma maneira poderosa para reduzir a luz do foco, levando a menos fotobranqueamento e fototoxicidade36. Juntos, imobilização mais suave e menos exposição de fotografia podem ajudar a prolongar a cada sessão de imagens. Sessões mais de imagem podem ser usadas para examinar a duração total de alterações funcionais que acompanham o desenvolvimento e os processos subjacentes à autorização de cabelo-celular e regeneração após lesão. É importante salientar que, além de microscopia de luz-folha, este protocolo pode ser adaptado para outros sistemas confocal tipos (ponto-digitalização, 2-fóton e girando disco) bem como de sistemas relativamente simples widefield28,34 . Em geral, sua versatilidade torna este protocolo uma ferramenta valiosa que pode ser adaptada e usada com vários sistemas de imagem.

Enquanto este protocolo pode ser adaptado e usado com muitos sistemas de imagem, partes do presente protocolo também podem ser adaptadas e usadas (1) com outros indicadores, além de GCaMP6s e (2) a atividade de imagem em outras células sensoriais e neurônios dentro zebrafish larval. Por exemplo, em um estudo anterior, usamos este protocolo para atividade de imagem usando vários indicadores geneticamente codificados dentro das células de cabelo de linha lateral para detectar o cálcio citosólico (RGECO1), fusão de vesículas (SypHy), voltagem da membrana (Bongwoori) e membrana cálcio (jRCaMP1a-lipidação e GCaMP6s-lipidação) e a linha lateral aferentes processos para detectar membrana cálcio (GCaMP6s-lipidação)5. Com base na nossa experiência utilizando estes indicadores, a linha transgênica que TG(myo6b:gcamp6s-CAAX) descrito neste protocolo oferece um excelente começo para atividade em linha lateral neuromasts de imagem. De todos os indicadores listados acima, nós encontramos que o GCaMP6s é o mais sensível e fotoestável. Além desses recursos, destacamos a linha transgênica Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) porque ele pode ser usado para fazer duas medições distintas: cabelo-célula mechanosensation e cálcio pré-sináptica dentro de uma única linha de transgénico.

A técnica descrita neste artigo demonstra como imagem de cálcio na linha lateral do zebrafish pode ser um poderoso método para estudar a forma como células ciliadas funcionam em seu ambiente nativo. Esta abordagem é complementar aos estudos de mamíferos no qual cabelo-célula função atualmente está sendo estudada em explantes ex vivo . Além disso, o modelo de zebrafish pode continuar a ser usado como uma plataforma para testar a eficácia dos indicadores geneticamente codificados que pode então ser aplicado para examinar a atividade em células de mamíferos cabelo.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH/NIDCD intramural pesquisa fundos 1ZIADC000085-01 (K.S.K). Gostaríamos de agradecer a Candy Wong por sua assistência em escrever a macro de Fiji. Também gostaríamos de agradecer a Doris Wu e Candy Wong por suas sugestões úteis com o protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. , Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

Tags

Neurociência edição 141 Zebrafish imagem latente de cálcio imagem latente confocal na vivo de imagem células ciliadas neurociência sensorial linha lateral geneticamente codificado indicadores GCaMP
Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo… More

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter