Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58794
Automatic Translation
1,2, 1
1Section on Sensory Cell Development and Function, NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

Summary

Zebra balığı optik netlik, hızlı harici diller, dahil olmak üzere birçok değerli özellikleri ve işitme ve denge için belirli önemini, dışarıdan duyu saç hücreleri bulunan bir modeli sistemidir. Bu makalede nasıl transgenik zebra balığı özetlenmektedir saç hücreli mechanosensation ve presynaptic fonksiyonu toto tahlil için kullanılabilir.

Abstract

Duyusal saç hücreleri işitme ve denge için gerekli olan iç kulak buldum mechanoreceptors vardır. Saç hücrelerinin apikal çıkıntılar Saç demetleri denilen mekanik saptırmak duyusal uyaranlara yanıt olarak aktif hale gelir. Saptırma Saç demetleri, katyon kalsiyum da dahil olmak üzere, bir akını için önde gelen mechanotransduction (MET) kanalları açılır. Bu ba * akını hücre depolarizes ve basally saç-hücre presynapse bulunan voltaj kalsiyum kanalları açar. Memeliler, saç hücreleri kemik kaplı ve işlevsel olarak bu faaliyetler içinde vivo değerlendirmek için meydan okuyor. Buna ek olarak, larva zebra balığı şeffaf ve saç hücreleri içeren harici olarak bulunduğu sonradan içini kaplamak organ sahip. Bu saç hücreleri memeli saç hücreleri için işlevsel ve yapısal olarak benzer ve işlevsel olarak içinde vivo tespit edilebilir. Bu makalede bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) kullanan bir teknik özetliyor, uyarıcı uyarılmış kalsiyum ölçmek için GCaMP6s, zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücreleri sinyal gönderir. GCaMP6s, confocal görüntüleme ile birlikte, tepe ve Bankası sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin içinde vivo kalsiyum sinyalleri ölçmek için kullanılabilir. Bu sinyaller bu saç hücreleri içinde her iki mechanosensation ve presynapse bağlı kalsiyum faaliyetlerin bir gerçek zamanlı, ölçülebilir okuma sağlar. Bu kalsiyum sinyalleri de nasıl saç hücreleri tespit ve duyusal uyaranlara iletimi ile ilgili önemli işlevsel bilgiler sağlar. Genel olarak, bu teknik kalsiyum etkinliğinde göreli değişiklikler hakkında yararlı veriler oluşturur içinde vivo. Bu daha az kalsiyum değişikliklerin mutlak parlaklık miktar için uygundur. Bu içinde vivo teknik hareket yapılara duyarlıdır. Uygulama ve beceri makul bir miktarda, uygun konumlandırma, immobilizasyon ve larva uyarılması için gereklidir. Sonuçta, düzgün çalıştırıldığında, bu makalede özetlenen Protokolü onların doğal, tam entegre Birleşik Devletleri yaşayan bir hayvan içinde saç hücrelerinin etkinliği hakkında değerli bilgiler toplamak için güçlü bir yol sağlar.

Introduction

Fonksiyonel kalsiyum görüntüleme birçok etkinliğini izlemek için kullanılan güçlü bir araç, aynı anda1hücreleri olduğunu. Özellikle, kalsiyum görüntüleme genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk) kullanarak turk belirli hücre tipleri içinde ifade ve subcellularly2lokalize avantajlı olduğu gösterilmiştir. Nörolojik araştırma, bu özellikleri güçlü bir yöntem hem nöron ağları içerisinde faaliyet desenleri tanımlamak ve kalsiyum akını bireysel sinapslarda3,4ölçmek için kalsiyum görüntüleme turk kullanarak yaptık. Özelliklerden yararlanarak, bir çalışmada confocal mikroskobu ve turk duyu saç hücreleri5koleksiyonları içindeki hücre altı etkinliği izlemek için kullanılır.

Saç ses ve vestibüler uyaranlara bulmak belgili tanımlık iç kulak ve yerel su hareketi su vetebrates6,7sonradan içini kaplamak sisteminde mechanoreceptors hücrelerdir. Saç hücreleri hedef hasar veya işitme kaybı sensorinöral işitme kaybı8,9olarak bilinen insanlarda en sık görülen neden genetik mutasyonlar çoğu kez. Bu nedenle, tedavi ve işitme kaybı önlemek nasıl anlamak için nasıl bu hücrelerin işlevini anlamak için önemlidir. Düzgün çalışması için saç hücreleri denilen mechanosensory-Saç demetleri ve sinaptik şeritler algılamak ve uyaranlara, sırasıyla iletmek için iki özel yapıları kullanmaktadır. Saç demetleri saç hücreleri apeks bulunur ve stereocilia (Şekil 1A) bilinen öncelikle iyi, saç benzeri çıkıntılar oluşur. Vestibüler ve sonradan içini kaplamak saç hücrelerde, her saç demeti da hangi çok stereocilia (Şekil 1A) genişletebilirsiniz tek bir uzun kinocilium (hücrenin tek gerçek cilium) vardır. Mechanosensory uyaranlara Saç demetleri saptırmak ve saptırma gerilim ucu-stereocilia10Interconnect "bağlantılar" adı verilen bağlantıları üzerinde koyar. Bu gerilim katyon kalsiyum11,12de dahil olmak üzere, apikal bir akını sonucunda stereocilia yer alan mechanotransduction (MET) kanalları açılır. Apikal bu etkinlik sonuçta saç hücre depolarizes ve voltaj kalsiyum kanalı (Cav1.3) hücre Bankası olarak açar. CAv1.3 Kanalları sinaptik şeritler, veziküllere aktif bölgelerde tethers presynaptic bir yapı bitişiğinde bulunur. Bazal kalsiyum akını Cav1.3 kanallar aracılığıyla vezikül füzyon, neurotransmission ve afferent nöronların13,14aktivasyonu için gereklidir.

Uzun yıllar boyunca, birçok türleri, zebra balığı15,16,17, de dahil olmak üzere saç hücrelerinin fonksiyonel özellikleri soruşturma için bütün hücreli yama sıkma gibi elektrofizyolojik teknikleri kullanılmıştır 18,19,20. Çünkü amacı olan üzerinde son derece hızlı uyaranlara kodlamak için bireysel duyu hücreleri son derece hassas ölçümler almak için kullanılabilir bu elektrofizyolojik kayıtlar işitme ve denge alanlarında özellikle değerli olmuştur bir çok çeşitli frekansları ve yoğunluklarda21,22. Ne yazık ki, tüm hücreli kayıtları saç hücreleri nüfus etkinliği ölçemezsiniz. Nüfus zebra balığı lateral satırındaki hücrelerin aktivitesini çalışmaya microphonic potansiyelleri ve afferent Aksiyon potansiyelleri toplanan mechanosensitive ve bireysel neuromasts23 postsinaptik yanıt özelliklerini ölçmek için kullanılmaktadır ,24. Ne yazık ki, ne bütün hücreli kayıtları var ne de yerel alan potansiyel ölçümleri nerede faaliyet tek tek hücreleri içinde meydana gelen ya da bir nüfus içinde her hücre aktivitesini ölçmek kesin olarak belirlemek için uzamsal çözünürlük. Daha yakın zamanlarda, kalsiyum boyalar ve Turk bu zorlukları25,26atlamak için istihdam edilmiştir.

Zebra balığı, Turk saç-hücre işlevi oluşturma transgenik zebra balığı ve larva27optik netlik göreli kolaylığı nedeniyle incelenmesi için güçlü bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığı larva saç hücreleri iç kulak gibi sonradan içini kaplamak sistemi mevcuttur. Sonradan içini kaplamak rozet gibi kümeleri saç su hareketi (Şekil 1) yerel değişiklikleri algılamak için kullanılan neuromasts denilen hücre oluşur. Dışarıdan balık yüzeyi boyunca bulunması nedeniyle sonradan içini kaplamak özellikle yararlıdır. Bu erişim saç hücreleri uyarmak ve kalsiyum sinyalleri optik sağlam larva ölçmek mümkün kıldı. Genel olarak, transgenesis, larvalar saydamlığını ve sonradan içini kaplamak saç hücreleri benzersiz erişim kolaylığı yapmış zebra balığı saç hücreleri içinde vivo aktivitesi eğitim için çok değerli bir model. Bu saç hücreleri iç kulak kemik yapılar tarafından çevrilidir memeli sistemleri ile karşılaştırıldığında önemli bir avantajdır. Bu erişim eksikliği çok zor memeli saç hücrelerinin işlev içinde vivo ölçümler elde etmek yaptı.

Burada özetlenen Protokolü kalsiyum tek tek saç hücreleri içinde ve larva zebra balığı neuromasts içindeki hücreleri arasında MET kanal ve presynapse bağımlı değişiklikleri izlemek açıklar. Bu iletişim kuralı bir membran lokalize GCaMP6s saç hücreli belirli myosin6b organizatörü28kontrol altında ifade eder bir kurulan transgenik zebra balığı hattı kullanır. Bu membran yerelleştirme GCaMP6s kalsiyum akını saç-hücre işlevi için kritik olan plazma zarı bulunan iyon kanalları aracılığıyla algılamaya konumlandırır. Örneğin, GCaMP6s membran lokalize kalsiyum algılayabilir akını MET ile kanalları apikal Saç demetleri ve CaV1.3 Kanalları hücrenin dibinde sinaptik şeritler yakınındaki. Bu sitozolik turk MET ve CaV1.3 kanal aktivite yanı sıra kalsiyum katkıları diğer kaynaklardan gelen bir bileşimidir kalsiyum sinyalleri tespit gibi sitozol, yerelleştirilmiş turk kullanarak ile tezat (örneğin, mağaza serbest). Bu iletişim kuralı hareketsiz ve GCaMP6s transgenik larva görüntüleme önce felç nasıl belirleneceğini açıklar. Sonra hazırlamak ve sıvı püskürtmeli kontrollü ve tekrarlanabilir bir şekilde sonradan içini kaplamak saç hücreleri uyarmak için saç demetleri saptırmak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bu iletişim kuralı kullanılarak elde edilebilir temsilcisi verileri sunulmaktadır. Hareket yapıları temsil eden veri örnekleri de sunulmaktadır. Sonuçları doğrulamak ve eserler dışlamak için kullanılan kontrol deneyleri açıklanmıştır. Son olarak, kayma kalsiyum sinyalleri Fiji yazılımında görselleştirmek için bir yöntemi açıklanmıştır. MATLAB5kullanılarak geliştirilmiş ve böylece daha önce kurulan görselleştirme metotlarından adapte bu Fiji analizidir. Genel olarak, bu iletişim kuralını turk larva zebra balığı ölçmek ve saç hücre içi kalsiyum dinamiği içinde vivo görselleştirmek için kullanan güçlü hazırlık teknik özetliyor.

Protocol

Tüm hayvan iş hayvan kullanım Komitesi, Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan çalışma protokolü #1362-13 altında tarafından kabul edildi.

Not: Bu protokol yaklaşık 0,5-1 h çözümleri ve ekipman hazır ve önceden ayarlanmış hiçbir kesinti ile tamamlamak için alır. Bu iletişim kuralı Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 zebra balığı larva, 3-7 gün sonrası döllenme (dpf) için optimize edilmiştir. Membran lokalize GCaMP6s transgenik bu satırı ifade eder (zebra balığı kodon için optimize edilmiş) özellikle tüm hücrelerdeki zebra balığı saç. Görüntüleme önce larva standart koşullar altında embriyo arabelleği (E3) yetiştirilir. Katalog numaraları tüm ekipman ve bu iletişim kuralı yürütmek için gerekli ilaç için Reçetesi tablo bakın.

1. hazırlanması çözümleri

  1. α-bungarotoxin (125 µM), zebra balığı larva fonksiyonel görüntüleme sırasında felç için kullanılan 1 mL hazırlayın.
    1. Ultrasaf steril su 968.6 µL ve fenol kırmızı 33.4 µL α-bungarotoxin (tüm şişe) 1 mg için ekleyin. 100 µL aliquots yapmak ve onları-20 ° C'de depolayın
      Uyarı: Eldiven giymek ve α-bungarotoxin toz işlerken mahallede hazırlıkları yapın. Eldiven de α-bungarotoxin çözüm işlerken önerilir.
  2. 1 L 60 x embriyo arabelleği (E3) hazırlayın.
    1. 17.2 g NaCl ve 0.76 g KCl tozu 954.4 mL ultrasaf su ekleyin.
    2. 19,8 mL 1 M CaCl2, 1 M MgSO419,8 mL ve 1 M HEPES tampon 6 mL ekleyin. 4 ° C'de 60 x E3 hisse senedi çözüm 6 aya kadar saklayın.
  3. 1 10 L hazırlamak x E3 (5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7.2), fonksiyonel görüntüleme önce larva bulaşan bir çözüm olduğu.
    1. 167 mL 60 x E3 stok çözeltisi 10 1 x E3 çözüm yapmak L için ultrasaf su ekleyin. 1 x E3 çözüm, oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.
  4. Larva fonksiyonel görüntüleme sırasında sokmak için kullanılan nöronal arabellek (NB) (140 mM NaCl; 2 mM KCl; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES tampon, pH 7.3), hazır olun.
    Not: 1 x E3 de fonksiyonel görüntüleme için kullanılabilir, ancak daha güçlü ve güvenilir NB içinde yanıt-e doğru
    1. Birleştirmek 28 mL 5 M NaCl, 2 mL 1 m KCl, 2 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgCl2ve 1 M HEPES tampon 10 mL 957 mL Ultrasaf Su ile. 7.3 ile 1 M NaOH pH getirmek.
    2. Filtre sterilize. 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
      Not: RT için çözüm kullanmadan önce getir.
  5. Larva anestezi için kullanılan MS-222 hisse senedi (tricaine, % 0,4), hazır olun.
    1. 400 mg etil 3-aminobenzoate methanesulfonate tuz ve 800 mg 100 ml distile su Na2HPO4 geçiyoruz. PH 7'ye ayarlayın. 4 ° C'de mağaza
    2. Kullanmak %0,04 larva immobilizasyon ve α-bungarotoxin enjeksiyon sırasında anestezi için MS-222.

2. hazırlık odası ve toplu iğneler görüntüleme

  1. Görüntüleme odası (Şekil 2A) hazırlayın. Perfüzyon odası coverslip uygun olacaktır kare kenarları boyunca altına yüksek vakum Silikon gres ince bir tabaka uygulayın. Yağ boşluklar bırakmayın. Sıkıca coverslip kenarlarına etrafında görüntüleme odasına imzalamaya bastırın. Dış görev aşırı yağ silin.
    Not: 200 µL micropipette bahşiş 5 mL şırınga yağ kullanma için önerilir.
  2. Odası doldurmak için silikon encapsulant hazırlayın. Kür Ajan tabanına (ağırlıkça) 10:1 oranında karıştırın. İyice ama nazikçe, en az kabarcıklar oluşturmak için micropipette ucu kullanarak karıştırın.
    1. Böylece yüzey odasının düzeyiyle silikon encapsulant yapıştırılmış coverslip üzerine dökün. Encapsulant yaklaşık 3 g Oda dolduracaktır.
    2. Dikkatli bir şekilde yatay tutarken odası düz bir yüzeye karşı dokunun veya kaldırmak veya kabarcık odası kenarına çekmek için micropipette bahşiş (altında bir stereomicroscope) kullanın.
    3. Odası laboratuvar 60-70 ° c gece fırında yerleştirin Sıcak hava doğrudan dalgaların oluşturmaktan kaçınmak için encapsulant üzerinde üfleme değil emin olmak için bir yer oda havalandırılmış bir kutusunun içinde.
  3. Baş ve kuyruk (Şekil 2B1) aracılığıyla larvaları hareketsiz için kullanılan iğneler moda iyi forseps ve tungsten tel üzerinde sertleştirilmiş encapsulant kullanın.
    1. Kafa iğne yapmak için bir stereomicroscope altında bir elinde bir parça 0.035 mm tungsten tel tutun. İyi forseps diğer elinde kullanarak, 90 ° sondan 1 mm kadar tel viraj. İyi makas pens değişimi ve 1 mm PIN oluşturmak için viraj sonra kesti.
    2. Kuyruk iğne yapmak, ancak 0,5 mm tel viraj her iki tarafında bırakmak için 0.025 mm tel kullanarak 2.3.1 arasındaki adımları yineleyin. Forseps pimleri odası (depolama için) üzerinde sertleştirilmiş encapsulant eklemek için kullanın.

3. iğne felç ve hazırlık stimülasyon

  1. Kalp enjeksiyon iğneler cam kılcal damarlar ile bir filament kullanarak hazırlayın. İğne 1-3 µm (Şekil 2C) bir iç uç çapı için çekin.
  2. Sıvı Püskürtmeli iğneler cam kılcal bir filament olmadan kullanarak hazırlayın. İğneler doğru uç çapı kırılmış olabilir ince, uzun bir ipucu ile çek.
    1. Bu dik başka bir sıvı püskürtmeli iğne veya hemen üzerinde bir iç uç çapı 30 – 50 µm oluşturmak için iğne ucu nereye bükülebilir bir seramik karşı sürtünme sıvı püskürtmeli iğne ince, uzun ipucu off break [Şekil 2C (orta görüntü) ve Şekil 3 A2]. Break bile ucu (Şekil 2C, orta görüntü) arasında ve değil pürüzlü veya (güvence altına almak için çok büyükŞekil 2C, doğru görüntü) bile ve doğru sıvı akışı saç hücreli stimülasyon sırasında emin olun.
      Not: Bir iğne Parlatıcı pürüzlü sonları düzeltmek için kullanılabilir.

4. sabitleme ve larvası odası Imaging'e Immobilizing

  1. Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) larva içeren %0,04 E3 arabellek yaklaşık 1 ml banyo MS-222 larva hareketsiz veya dokunmak tepkisiz hale gelinceye kadar görüntüleme odasının silikon encapsulant yüzey üzerinde 1-2 min için.
    1. Düz Silikon encapsulant karşı kendi tarafında yatıyor şekilde bir stereomicroscope altında larva perfüzyon odası merkezinde yerleştirin.
      Not: Tutarlılık sağlamak için her zaman aynı tarafta (örneğin, aşağı, sol tarafı yukarı sağ tarafta) larvaları mount (Şekil 2B1).
  2. İyi forseps kullanarak, larva ve odası 0.035 mm kafa PIN dik aşağı getir. Göz ve vezikül arasında kafa çiviyi yerleştirmeden ve encapsulant (rakamlar 2B1 ve 2B2) içine aşağı. Bir ikinci forseps sabitleme ise larva dorsal veya ventral yan boyunca stabilize etmek için kullanın. İğneyi yatay parçası larva bağlantı kurar ve sonuna kadar encapsulant tuşuna değil emin olun. İğneyi ventrally açı (Şekil 2B1) veya biraz ön sonraki kalp enjeksiyon ve saç hücreli görüntüleme ile engel önlemek için balık doğru işaret.
    1. Forseps kullanarak, (Şekil 2B1) kuyruk sonuna mümkün olduğunca yakın notochord 0.025 mm kuyruk iğne takın.
      Not: Larva germe önlemek dikkatli olun. PIN düz larva. Gözleri olmalıdır (Şekil 2B1) üst üste. Bu kalp enjeksiyon kolaylığı için çok önemlidir (Şekil 2B2-B2', adım 5), arzu edilen bir görüntüleme uçak kolaylaştırmak (Şekil 1B1-B2'', adım 8 ve 9) ve sıvı püskürtmeli uyarıcı ( yoğunluğunu miktarının Şekil 3A3, adım 7).

5. enjeksiyon α-Bungarotoxin Larva felç için kalp kavite içine

Not: α-bungarotoxin ele alırken eldiven.

  1. α-bungarotoxin aliquot kalp enjeksiyon iğne tıkanma kullanmak için kısa bir süre önce santrifüj kapasitesi.
    1. α-bungarotoxin çözüm pipet ucu yükleme bir jel kullanarak kalp enjeksiyon iğne içine backfill 3 µL. Hava kabarcığı yok ucuyla eşit olarak çözüm yükleyin.
    2. Kalp enjeksiyon iğne için el ile bir micromanipulator bağlı bir pipet tutucusuna takın. Hizalanmış dikey bir ~ 30 ° açıyla aşağıyı sabitlenmiş ve imzalat larvalar, A-P eksen olarak yani bir stereomicroscope altında iğne getirin.
    3. Pipet tutucu basınç enjektörü bağlayın. Aşağıdaki önerilen ayarlar uygulanır: Pinjection 100 hPa, tinjection = 0.5 s ve Pcompensation = 5 inç =. Bir iğne ucu patent olup olmadığını sınamak için çözüm içine enjekte.
    4. Kırmızı çözüm küçük bir nefes için iğne ucu bırakmak (fenol red) bakın. Kırmızı renk görüldüğünde, çok yavaşça İğne ucunu iğnenin kenarına scrape ve iğne patent kadar yeniden deneyin. Alternatif olarak, bir iğne daha büyük bir ipucu açılış ile çek.
  2. Kalp (Şekil 2B2) dışında cilt dokunana kadar İğneyi kalbine doğru ilerlemek. İğne larva basın ve girinti o iğneyi larva göre doğru düzlemde konumlandırılmış sağlamak için kalbe önünde deride pigment hücrenin arayabilirsiniz (Şekil 2B2').
    1. Cildi delip geçiyor ve kalp boşluğuna girer kadar iğne daha da ilerlemek. İğne biraz geri çek. α-bungarotoxin bolus kalp boşluğuna enjekte. Kırmızı boya boşluğuna girerek veya kalp boşluğuna enflasyon için bak.
  3. Yavaşça 3 kez ile kalan MS-222 kaldırmak için NB 1 mL larva durulayın. Asla tüm sıvı kaldırmak. NB perfüzyon odası üzerinde yaklaşık 1 ml larva korumak.
    Not: Bu larva kalp atışı sağlamak ve sabitleme ve kalp enjeksiyon sonra ve tüm görüntüleme deneyi boyunca kan akımı sağlam kalır.

6. mikroskop ve sıvı püskürtmeli Kur hazırlanması

  1. Bir dik confocal mikroskobu Malzemeler tabloaçıklanan bileşenleri kullanarak monte: bir 488 confocal mikroskopla nm lazer ve uygun filtreler, kontrol ve koordine görüntüleme ve stimülasyon, 10 x hava mikroskop bilgisayar yazılımı Amaç, 60 x su amaç, piezo-Z objektif tarayıcı (için z-yığınlar), yüksek hızlı kamera, dairesel odası adaptör, motorlu sahne ve sahne Ekle adaptörü. Zhang ve ark.29 için ek seçenekler ve rehberlik mikroskop kurulumları için başvurun.
  2. 3 ana bileşenden oluşan sıvı jet monte: vakum ve basınç pompası, yüksek hızlı baskı kelepçe ve baş sahne (Ayrıca malzemeler tablo açıklanmıştır). Yüksek hızlı baskı kelepçe zamanlama ve basınç veya vakum deşarj kafaları sahne ve sıvı püskürtmeli pipet süresini denetlemek için kullanın.
    1. Baş sahneye çıkışını sıvı püskürtmeli pipet sahibi ile kalın duvarlı silikon tüp için bağlayın.

7. uyum Larva ve sıvı püskürtmeli

Not: Her neuromast içinde ilgi 3 uçak: (1) Saç demetleri ipuçları (Şekil 3A3: uyarıcı yoğunluğunu ölçmek için kullanılan kinocilia); (2) saç demeti MET uçak (Şekil 1B1-B1': MET kanal bağlı kalsiyum sinyalleri nerede algılanır apikal Saç demetleri Bankası); ve (3) sinaptik uçak (Şekil 1B2-B2': nerede presynaptic kalsiyum sinyalleri saç hücre tabanında algılandı). Bu uçakların Şekil 1içindeAözetlenmiştir.

  1. NB backfill 10 µL içine (Kimden adım 3.2) düzgün kırık bir sıvı püskürtmeli iğne ucu yükleme bir jel kullanarak. Hava kabarcığı yok ucuyla eşit olarak çözüm yükleyin. İğne motorlu micromanipulator bağlı pipet tutucusuna takın.
  2. Perfüzyon odası bir dairesel odası bağdaştırıcısına mikroskop sahnesinde yerini.
    Not: Tutarlılık sağlamak için her zaman larva aynı yönde pozisyon. (örneğin, sıvı jet ve ventral doğru onun arka ile larva içeren odası yüzü deneyci doğru bakacak şekilde).
    1. Motorlu sahne larva görüş alanı merkezinde olacak biçimde taşıyın. Larva A-P ekseninin kabaca sıvı püskürtmeli iğne yörünge ile hizalanır dairesel odası adaptör açarak kapatın.
    2. İletilen ışık ve fark girişim kontrast (DIC) kullanarak, larva odak haline getirmek ve 10 x amaç altında merkezi. 10 x amaç yükseltmek.
  3. Tarafından iletilen ışık ve zar zor NB çözüm yandığından motorlu micromanipulator kullanarak, sıvı püskürtmeli iğne görüş alanı merkezi haline getir de.
    1. 10 x hedefi indirin. Konumu onaylamak için larva üzerinde odaklanın. Sıvı Püskürtmeli iğneyi bulmak için konsantre. Bir konumda balıkların dorsal kenarda paralel olana micromanipulator sıvı püskürtmeli iğneyle x - ve y - axes içinde hareket.
    2. Geri larva üzerinde odaklanın. İğne z ekseni içinde aşağı getirmek. Balık ve ~ 1 mm (Şekil 3A1) uzaklýkta sırt tarafında iğne getirin.
    3. Dikkatle dairesel odası adaptör sıvı püskürtmeli iğne larva (Şekil 3A1) A-P orta çizgi hizalanır emin olmak için (gerekiyorsa) taşıyın.
    4. Motorlu sahne neuromast görüş alanı merkezinde ilgi yerleştirmek için taşıyın. Balık sırt tarafındaki sıvı püskürtmeli iğne ucu tut. Larva veya odası yüzeyi sıvı püskürtmeli iğne ucu dokunmayın.
  4. Su amaç x 60 geçin. Amaç NB çözümde dalmış emin olun. Kullanım bir neuromast kullanarak bulmak için iyi odak ışık ve DIC optik iletilir.
    Not: Bu kurulum neuromasts birincil arka lateral hattı boyunca uyarmak için tasarlanmıştır. Bu neuromasts içindeki saç hücreleri anterior veya posterior yönlendirilmiş sıvı akış için yanıt. Chou vd.31 neuromast sıvı duyarlılık sonradan içini kaplamak sistemi içinde doğru bir harita için bkz.
    1. Böylece neuromast (Şekil 3A2) dış kenarından 100 µm micromanipulator sıvı püskürtmeli iğneyle getirin.
      Not: NET yukarıdan aşağıya manzaralıdır neuromasts seçin (rakamlar 1B1'-B2' ve Şekil 3A3) yan açılı sayısı (Şekil 1C1-C2) yerine. Aynı anda tek bir optik uçağı tüm apikal Saç demetleri görüntüleme veya sinaptik az optik uçak (Şekil 3A3) yerlerde görüntüleme için net yukarıdan aşağıya görünümü sağlar.
    2. Apikal Saç-demetleri (kinocilia) (resim 1A, rakamlar 3A2 ve 3A3) ipuçları kadar odaklan. Sıvı Püskürtmeli iğne alt odak Bu düzlemde olmalıdır.
  5. Yüksek hızlı baskı kelepçe den Kılavuzu girişi görüntüleme yazılımı almak için dış moduna ayarlayın.
    1. Yüksek hızlı baskı kelepçe "sıfır" düğmesine basarak sıfır. Ayar noktası topuzu istirahat baskının biraz pozitif (~ 2 mmHg) ayarlamak için kullanın. Baş sahneye çıkışına bağlı bir PSI manometre kullanarak yüksek hızlı baskı kelepçe dinlenme çıkışını onaylayın.
      Not: Zaman içinde sıvı püskürtmeli iğne yavaş yavaş sıvı alımını önlemek için dinlenme biraz pozitif basınç ayarlı. Sıvı sıvı püskürtmeli bağlı boru girer ve baş sahne ulaşır, ekipman zarar verebilir.
    2. Saç demetleri uyarmak için gerekli basınç belirlemek. Bir 0,125 ve 0,25 V giriş (6.25 ve 12.5 mmHg) 200-500 ms için bir test uyarıcı uygulamak için kullanın (Şekil 3A3 A3'').
      Not: Yüksek hızlı baskı kelepçe (yazılım veya BNC bağlantı yüksek hızlı baskı kelepçe komut bağlantı noktası noktasına bağlanan diğer aygıtlar) kafa sahne ve sonuçta, sıvı püskürtmeli iğne taburcu basınç içine biçeme bir gerilim dönüştürür (1.0 V = 50 mmHg, süre-V 1.0-50 mmHg =). Bu yapılandırmadaki (bkz. Adım 7.2) pozitif basınç (gönderme) saptırır Saç demetleri anterior doğru ve negatif basınç (çekme) Saç demetleri arka doğru saptırır.
    3. İletilen ışık ve DIC optik bir ölçek çubuğu ile birlikte kullanarak, saptırma mesafe ölçmek 6.25 ve 12.5 mmHg uyaranlara Saç demetleri, kinocilia ipuçları tarafından (Şekil 1A ve rakamlar 3A3-3''). Paketler (1 tutarlı birim olarak) taşır bir basıncı seçin bir mesafe yaklaşık 5 mikron (Şekil 3A3''). Kinocilia ipuçları süre boyunca odakta kalmasını sağlamak.
    4. Sıvı Püskürtmeli ± 25 µm larva bir mesafe ve kinocilia 5 µm ipuçları saptırır basınç bulmak için A-P ekseni boyunca taşıyın.
      Not: GCaMP6s 3-7 dpf larva kullanarak, 5 mikron saptırma GCaMP6s kalsiyum sinyalleri doyurarak yakınındaki ulaşmak ve apikal saç demeti yapıları zarar değil (Şekil 3A3''). Daha küçük deplasman mesafeler doyurarak olmayan uyarıcılara teslim etmek için kullanılan (Şekil 3A3'). Deplasman mesafeler > 10 µm tahmin etmek zor ( Şekil 3A3'' ') ve zamanla zarar verebilir. Sinyal doygunluk neuromast (ve kinocilial yükseklik) yaş üzerinde bağımlı yanı sıra kullanılan gösterge. Görüntüleme sırasında düzenli olarak her yönde (basınç/itme ve vakum/çekme) Sıvı Püskürtmeli iğne a_ılabilinirse denetleyin. Sıvı Püskürtmeli iğneler kolayca yapışmasına neden olabilir ve vakum a_ılabilinirse kaybetmek, ama onlar artık basınç a_ılabilinirse korumak. DIC optik ve kısa test uyarıcı her yönde sıvı püskürtmeli açıklık için denetlemek için kullanın.
    5. Örnek ilgi (örneğin, temel apikal Saç demetleri veya saç hücre Bankası sinaptik uçak uçak içine odak; Resim 1 B1-B2').

8. görüntüleme edinme yordam seçeneği 1: Tek-uçak Alım

Not: Bu protokol için özetlenen tüm görüntüleme RT. gerçekleştirilir

  1. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı 10 Hz kare hızı elde etmek için bir yakalama her 100 ms ile akış veya sürekli 80-çerçeve kazanım elde etmek için ayarlayın.
  2. Kazanç, diyafram ve lazer güç sinyal algılama en iyi duruma getirmek, ama doygunluk, photobleaching ve gürültü önlemek için ayarlayın. Bir Opterra/SFC için örnek ayarlar aşağıdaki gibidir: 488 nm lazer gücü: 50 (saç demeti MET uçak), 75 (sinaptik uçak); 35 µm yarık; kazanmak 2.7; = EM kazanç 3900 =.
    Not: 2 X binning sinyalleri çok zayıf ya da gürültülü veya aşırı photobleaching varsa geçerlidir. 2 x binning uzaysal çözünürlük pahasına sinyal algılama geliştirmek.
  3. 80-dilimi içinde teslim etmek için bir uyarıcı seçin (8 s) 3 çerçeve 30, sonra Alım s.
    Not: Bazı örnek uyaranların aşağıdaki gibidir: 200 ms (+ veya - 0,25 V) en fazla 2 s (+ veya - 0,25 V) her saç hücresi; yönlü duyarlılığını belirlemek için anterior veya posterior yönünde adım 2 s, 5 Hz kare dalga (0.25 V 200 ms,-0.25 V 200 ms için için 5 kere tekrarlanan) tüm saç teşvik hücreleri için aynı anda. Pozitif basınç (anterior uyarıcı) yarım saç hücrelerinin devreye giriyor. Negatif basınç (posterior uyarıcı) yarım saç hücrelerinin diğeri devreye giriyor. Uyarıcı tamamlandıktan sonra uyarıcı yazılım veya aygıt basınç kelepçe yeniden 0 V verir emin olun.
  4. Mechanosensitive kalsiyum yanıt-e doğru ölçü. Odak apikal Saç demetleri temel alınarak (Şekil 1A ve 1B1-B1') ve resim alma başlar.
    Not: Neuromast açıkça en baştan aşağı görüntüleniyorsa (Şekil 1B1-B1'), tüm apikal Saç demetleri aynı anda tek bir düzlemde yansıma.
  5. Presynaptic kalsiyum yanıtları ölçmek. Saç hücreleri temel odak (Şekil 1A ve 1B2-B2') ve resim alma başlar.
    Not: Neuromast açıkça en baştan aşağı bakıldı Eğer (Şekil 1B2-B2'), tüm saç hücrelerinin presynaptic görüntüleme uçak 2-3 uçaklar 2 set µm içinde ayrı elde edilebilir. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] Transgenik balık presynaptic şeritler ve kalsiyum giriş29siteleri tanımlamak ve bulmak için kullanılabilir.

9. görüntüleme edinme prosedürü seçenek 2: Çok uçak Alım

  1. 60 x amaç için hızlı satın almalar (12-18 ms) bağlı piezo-Z ayar. Max hız ayarı seçili olduğuna emin olun.
  2. Bir Z-yığın edinimi bir piezo-Z kullanma oluşturun. Saç demeti MET etkinlik adım büyüklüğü 0,5 µm. edinme ile 5 uçaklarda adım 1 µm boyutunda 5 uçaklarda presynaptic sinyalleri kazanmak.
  3. Kare hızı 10 Hz olarak ayarlayın. Her çerçeve olacak her 20 ms ve her Z-yığın her 100 ms ele geçirdi.
  4. 400 kare veya 10 Hz 80 Z-yığında edinmesinin bir 8 için ayarlayın edinme akarsu s.
  5. Lazer güç, diyafram ve kazanç sinyal algılama en iyi duruma getirmek, ama doygunluk, photobleaching ve gürültü önlemek için ayarlayın. Bir Opterra/SFC Sistem için örnek ayarlar aşağıdaki gibidir: 488 nm lazer gücü: 75 (saç demeti MET uçak), 125 (sinaptik uçak); 35 µm yarık; kazanmak 2.7; = EM kazanç 3900 =.
    Not: 2 X binning sinyalleri çok zayıf iseniz geçerlidirgürültülü, ya da aşırı photobleaching. 2 x binning uzaysal çözünürlük pahasına sinyal algılama geliştirmek.
  6. Çerçeve 150, 3 sonra başlayan alım sırasında teslim etmek için bir uyarıcı seçin s.
  7. Protokol tek uçak alımı için yukarıda açıklandığı gibi devam, ancak apikal veya bazal uçaklar (adım 8,4 ve 8.5) Z yığınında merkezi.

10. kontrol: Farmakolojik blok tüm uyarılmış kalsiyum sinyallerin

Not: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) etan-N, N, N′, N′-tetraacetic asit) önce bu protokolü kurulurken bir kritik kontrol tedavisidir.

  1. 8 veya 9 adımları tamamladıktan sonra NB NB 5 mM Saç demetleri bulunan apikal MET kanalları kapısı için gereken ipucu bağlantıları ayırmak için BAPTA içeren 1 mL ile değiştirin.
  2. 10-20 dk RT. az için kuluçkaya
  3. Kapalı BAPTA 3 kez NB 1 mL ile yıkayın
  4. 8 veya 9 arasındaki adımları yineleyin. BAPTA tedaviden sonra GCaMP6s floresan sıvı püskürtmeli stimülasyon apikal Saç demetleri veya sinaptik uçak yanıt olarak bir değişiklik olmalı. GCaMP6s floresan değişimler devam ederse, bu değil gerçek kalsiyum sinyalleri ve hareket eserler olabilir.

11. denetim: Farmakolojik bloğu Presynaptic kalsiyum sinyal (isteğe bağlı)

  1. 8 veya 9 adımları tamamladıktan sonra NB % 0,1 dimetil sülfoksit (DMSO) ile 10 µM isradipine içeren NB saç hücreli presynapse L tipi kalsiyum salgılarını engellemek için değiştirin.
  2. 10 dakika dik, kuluçkaya
  3. Bir yıkama yapmadan, 8 veya 9 arasındaki adımları yineleyin. Tedaviden sonra hala olmalı GCaMP6s floresan değişiklikleri yanıt olarak sıvı püskürtmeli stimülasyon apikal Saç demetleri ama değil sinaptik uçak. GCaMP6s floresan değişimler sinaptik düzlemde devam ederse, bu değil gerçek kalsiyum sinyalleri ve hareket eserler olabilir.

12. görüntü veri işleme ve grafik gösterimi

Not: Fiji (adım 12.1-12.1.5) ve grafik programı (adım 12,2-12.2.3) adım 12 için kullanın. StackReg, TurboReg (adım 12.1.3), zaman serisi Analyzer V3 (adımları 12.1.4–12.1.6), ve Fiji eklentileri de gerekli (bakınız Tablo malzeme).

  1. Görüntü sırası Fiji, bir tek-uçak saat serisi (80-çerçeve tek uçak) veya Z-yığın zaman serisi (400-çerçeve multi uçak) açın. Tıklayın "Dosya" "Alma" açılan menüsünden seçin ve "Görüntü sırası"'yi tıklatın
    1. Bir Z-yığın kez serisi için Z-proje her zaman nokta (timepoint başına 5 uçakları) 80-frame görüntü sırası oluşturmak için. Tıklayın "Resim," "Yığın" aþaðý açýlan menüsünden seçin, aşağı açılan menüden "Araçlar" ve "Gruplandırılmış Z-projesi."'ı tıklatın Projeksiyon yöntemi olarak "Ortalama yoğunluğu" seçin ve "5" "Grup boyutu için" girin.
      Not: Her uçağa Z-yığın içinde ayrı olarak ek mekansal bilgi için analiz edilebilir.
    2. Kaldır ilk 1 s (10 çerçevesi) 8 s (80 kare) resim alma. Tıklayın "Resim üzerinde" "Yığın" açılan menüsünden seçin, aşağı açılan menüden "Araçlar" ve "Yapmak Substack üzerinde." tıklatın "Dilim" için "11-80" girin.
      Not: Bu substack stk1ifade edilecektir.
    3. StackReg eklenti32kullanarak görüntü sırası (stk1) kayıt. Tıklatın "Eklentileri," "StackReg" seçin ve "Çeviri" 70-çerçeve saat serisi için kayıt yöntemi olarak seçin.
      Not: Bu kayıtlı substack stk2ifade edilecektir.
    4. Kez serisi Analyzer V3 eklenti GCaMP6 yoğunluğu (F) ölçümleri ayıklamak için kullanın. Apikal Saç demetleri veya stk2presynaptic siteler bölgesi faiz (ROI) yerleştirin. ImageJ Web sitesine bakın ( Tablo malzemeler için bağlantıya bakınız) zaman serisi Analyzer V3 kullanımı hakkında talimatlar için.
      Not: Dairesel 1 – 2 µm ROI apikal Saç demetleri ve sinaptik uçak (rakamlar 4A1 ve 4A2) için dairesel 3 – 5 µm yatırım getirisi için kullanın.
    5. Ölçüm parametreleri seçin. Tıklatın "Analiz," "Ölçüm ayarla" seçin ve tek "demek gri değeri" seçili olduğundan emin olun.
    6. ROI Yöneticisi ' nde tüm ROIs seçin ve her yatırım getirisini saat serisi için (F) yoğunluk değerleri oluşturmak için çok ölçü işlevini kullanın. ROI Yöneticisi içinden, "Daha >>" tıklatın ve aşağı açılan menüsünden "Multi ölçü" seçin.
  2. Arsa (F) değerleri. Değerleri (F) "Çoklu ölçü" sonuçlarından bir XY grafik oluşturmak için grafik bir programa yapıştırmak için (rakamlar 4A1 've 4A2').
    Not: (X) oluşturmak el ile değerlerinden veya zaman damgası meta verilerinden kullanın.
    1. Temel (Fo) öncesi uyarıcı çerçeveleri 1 – 20 grafik programından (F) değerlerin ortalamasını tarafından her yatırım getirisi için ölçmek.
    2. Her yatırım getirisi için (Fo) ΔF (F-Fo) değerleri oluşturmak için her timepoint (F) değerlerinde değerden çıkarmak. Replot, istenirse.
    3. Hesaplamak ve ΔF/Foarsa. ΔF ölçüm (Fo) tarafından ve replot her yatırım getirisi için bölmek (rakamlar 4A1'' ve 4A2'').

13. görüntü işleme ve ısı harita gösterimi Spatio-temporal kalsiyum sinyalleri

Not: Kalsiyum sinyalleri kayma ısı harita gösterimi zebra balığı içinde sonradan içini kaplamak saç hücreleri oluşturmak için önceki çalışma Matlab5,28' yazılı özel yazılım kullandık. Bu analiz açık kaynak analiz yazılımı Fiji33için uyarlanmıştır. Fiji için aşağıda açıklanan tüm adımları kullanın. StackReg ve TurboReg Fiji eklentileri de gerekli (bakınız Tablo reçetesi) vardır.

  1. 12.1-12.1.3 her Z-yığın veya tek uçak saat serisi stk2anılacaktır kayıtlı substack oluşturmak adımları uygulayın.
  2. Temel görüntü oluşturmak için stk2 kullanın. Tıklayın "Resim," açılır menüsünden "Yığın" seçin ve "Z" seçin. "Ortalama yoğunluğu" "Projeksiyon tip" seçin ve "Başlangıç dilim" ile "20" "Dur dilim" için için "1" girin.
    Not: Bu Z-projeksiyon baselineIMGifade edilecektir.
    1. Geçici 70-çerçeve (F) görüntü sırası (stk2) 14 0,5-s depo bin. Tıklayın "Resim," "Yığın" aþaðý açýlan menüsünden seçin, aşağı açılan menüden "Araçlar" ve "Gruplandırılmış Z projede"'ı tıklatın. "Projeksiyon yöntemi" olarak "ortalama yoğunluğu" seçin ve "Grup boyutu" için 5 girin
      Not: Bu gruplandırılmış Z-projeksiyon için stk2bin ve F Şekil 5' olarak anılacaktır.
    2. Temel (baselineIMG) piksel değerini ΔF görüntü sırası oluşturmak için binned (F) görüntü serisinden (stk2bin) çıkarın. "Süreci" tıklatın ve aşağı açılan menüsünden "Resim hesap makinesi" seçin. "Image1" olarak stk2bin ve baselineIMG "Image2." seçin Seç "çıkarmak"İçin işlem.""
      Not: Bu temel düşülen Z-projeksiyon stk2binBL ve F-BL için denir ΔF Şekil5 =.
  3. Bir arama iş tablo (LUT) seçimi ΔF görüntü sırası (stk2binBL) görüntülemek için seçin. Tıklayın "Resim," "Arama tabloları" açılan menüsünden seçin ve seçim LUT üzerinde'yi tıklatın.
    Not: "Kırmızı sıcak" Şekil 5' te kullanılan LUT var. Bu temel düşülen Z-projeksiyon LUT ile stk2binBL-LUT ve ΔF LUT Şekil 5' olarak adlandırılır.
    1. En az (dk) ve stk2binBL-LUTen fazla (maksimum) parlaklık değerlerini ayarlayın. Tıklayın "Resim," "Ayarla" seçin ve "Üzerinde parlaklık/kontrast"'yi tıklatın. stk2binBL-LUTarka plan gürültü çıkarmak için en küçük değer ayarla. İlgi sinyalleri korur ancak sinyal doygunluk kaçınmak için maksimum değerleri ayarlamak [Örneğin, 200-1600 (12-bit görüntü yoğunluk aralığı 0-4095 =)].
      Not: Aynı küçük ve en büyük değerleri görsel karşılaştırma ya da temsil eden yaparken kullanın. Bir ΔF kalibrasyon LUT bar Fiji'de her LUT resim silsilesi (örneğin, stk2binBL-LUT) oluşturulabilir. Tıklatın "Analiz," "Araçlar" ve "Kalibrasyon çubuğunda"'yi tıklatın. LUT kalibrasyon Bar başvuru için ayrı, tek tek görüntü oluşturmak için "Overlay" seçimini kaldırın.
    2. Her iki ΔF (stk2binBL-LUT) dönüştürmekistenen LUTand geçici dönüştüm (F) görüntü ile (stk2bin) RGB serileri. Tıklayın "Resim," "Türü" seçin ve "RGB renk"'yi tıklatın
      Not: RGB dönüştürülmüş Z-projeksiyonlar stk2binBL LUT RGB ve stk2bin-RGB, sırasıyla sevk edilecek.
  4. Dönüştüm (F) görüntüleri (stk2bin-RGB) üzerine ΔF LUT görüntüleri (stk2binBL-LUT-RGB) yerleşimi. "Süreci" ve "Görüntü hesap makinesi"'ı tıklatın. stk2bin-RGB olarak Resim1 ve stk2binBL-LUT-RGB Image2 olarak seçin. "Sıfır şeffaf" "İşlemi için" seçin.
    Not: Çok fazla gürültü veya arka planda ΔF LUT bindirme varsa, 13,3 min değeri artırmak için yineleyin. Doygunluk, adımları yineleyin 13,3 ve maksimum değeri artırın.

14. görüntü işleme ve kendisinin zamansal ısı harita gösterimi Fiji makro kullanma

Not: Aşağıdaki bölümde üzerinde adım 13 kayma ısı harita gösterimi GCaMP6s sinyalleri otomatik olarak oluşturan temel LUToverlay denilen bir Fiji makro anlamına gelir. Bu analiz açık kaynak analiz yazılımı Fiji33 ve StackReg ve TurboReg Fiji eklentileri ( Tablo malzemelerigörmek) gerektirir.

  1. Bu iletişim kuralı eşlik eden Fiji LUT bindirme makro (LUToverlay.ijm) download ( Ek kodlama dosyasınabakın).
  2. Bir çok uçak saat serisi veya tek-uçak saat serisi (bkz. adım 12.1) açın.
  3. Tıkırtı üstünde "Eklentiler," Seç "Makro" tıkırtı üstünde "koşmak" ve LUToverlay makroyu seçin. Metin ile "resim alma hakkında söyle" bir iletişim kutusu görüntülenir.
    Not: İletişim kutusu için mevcut numaraları önerilen değerler ve deneyci tarafından kullanılan kuruluma göre değiştirilebilir. Değerleri kutusunda listelenen ve altındaki 400 adet fotoğraf ve timepoint (adım 9) başına 5 uçak ile bir çok uçak saat serisi için ayarlanır.
  4. "Timepoint başına uçak sayısı", sonra timepoint başına uçak sayısını girin (örneğin, adım bir çok uçak kullanarak 12.1.1 için 400 saat serisi timepoint, başına 5 uçak ile "5" girin). Bir uçak satın alma (örneğin, adım 8) girmek için "1".
    Not: Kalan iletişim kutularında, bir çok uçak saat serisi için "Timepoints" öngörülen Z fiş numarası Albümdeki anlamına gelir (Örneğin, 80 timepoints Bu adım 12.1.1 için).
    1. İlk 1 kaldırmak için "çözümlemek için Aralık tanımlamak" seçeneği kullanın görüntü sırası s (örneğin, adım 12.1.2 select için "11-80" ilk 10 çerçeveleri ve ilk 1 kaldırmak için s).
    2. Sonra "timepoints temelde tanımlamak", temel görüntü oluşturmak için kullanılacak görüntü sayısını girin [Örneğin adım 13,2., "20" girin öncesi uyarıcı resimleri (11-30) kullanmak için].
    3. "Timepoints" geçici depo gözü başına sonra görüntüleri bindirme için bin sayısını girin. (örneğin adım 13.2.2. "5" 14 0,5-s depo oluşturmak için seçin).
    4. "Min yoğunluğu" ve "Max yoğunluğu" arka plan gürültü (en az) çıkarmak ve doygunluk (maksimum) kaçınırken sinyalleri ilgi korumak minimum ve maksimum parlaklık değerlerini girdikten sonra.
    5. Sonra "seçmek bir arama tablosu", bindirme için istenen LUT seçin. "Tamam" düğmesini tıklatın.
      Not: Makro görüntüleri adım 13 sunulan talimatlara göre analiz tamamlanır. Makro tarafından oluşturulan görüntüler adım 13 yönergelere göre adlandırılır.
  5. Yeni bir görüntü sırası işleme önce tüm analiz pencerelerini kapatın.

Representative Results

Myo6b:GCaMP6s sonra-caax Transgenik balık düzgün immobilize ve sıvı püskürtmeli uyarıcı sonradan içini kaplamak saç hücreleri için teslim edilir, sağlam kalsiyum sinyalleri görüntülenmeyecektir ve (rakamlar 4 ve 52 X binning alındığı,) ölçülür. Sıvı Püskürtmeli stimülasyon sırasında kalsiyum ya apikal Saç demetleri, nereye yanıt uyaranlara karşı veya saç hücreleri, nerede presynaptic Cav1.3 kalsiyum kanal neurotransmission tetiklemek temelini MET kanalları açık ve ölçülebilir sinyalleri. Bireysel bir neuromast ile bu bölgelerde kalsiyum tepkilerin bir temsilcisi örnek Şekil 4' te gösterilenA1-A2''. Örneğin, bir 2-s 5 Hz sıvı püskürtmeli uyarıcı temsilcisi neuromast içindeki tüm saç hücreleri etkinleştirmek için teslim edildi. Uyarıcı sırasında saç demetleri sağlam kalsiyum sinyalleri tespit edilebilir (Şekil 4A1-A1'', 8 Saç demetleri tepkiler gösterilir). Bu sistemde, kalsiyum5apikal bu akını neredeyse tüm olgun saç hücreleri görüntüler. Buna ek olarak, aynı neuromast içinde vardır algılanamaz kalsiyum sinyalleri bazal, sinaptik düzlemde yalnızca bir alt kümesini saç hücreleri içinde (~ %30) (Şekil 4A2-A2'', presynaptic Yanıt ile 4 hücreleri gösterilir)5. 4 yeşil ROIs Haritayı hücreleri yok önemli presynaptic kalsiyum sinyalleri ile (Şekil 4A2-A2'') sağlam apikal kalsiyum sinyalleri rağmen (Şekil 4A1-A1''). Temsilcisi bu örnekte (Şekil 4A1-A2''), renkli ROIs hücre vücutlarını bazal sinaptik düzlemde (Şekil 4A2) ile saç demetleri apikal MET düzlemde (Şekil 4A1) kadar maç. Bu örnek nasıl her iki MET bağımlı - ve presynaptic-kalsiyum sinyali tek tek saç hücreleri içinde ve nüfus saç hücrelerinin arasında ölçülebilir vurgulamaktadır.

Kalsiyum sinyalleri her iki saç paketi ve presynapse grafik olarak ham (F) GCaMP6s yoğunluğu veya ΔF/Fo GCaMP6s yoğunluk olarak çizilebilir (bkz. adım 12, rakamlar 4A1'-A1'' ve 4A2'-A2''). (F) GaMP6s grafikler temel floresan yoğunluğu her hücre için farklı olabilir vurgulamak (rakamlar 4A1' ve 4A2'). ΔF/Fo GCaMP6s grafikler temel değerine her hücre normalleştirilmiş ve temel göreli yoğunluğunu değişikliğinden çizilir (rakamlar 4A1'' ve 4A2''). Her iki (f) ve ΔF/Fo GCaMP6s arsalar, kalsiyum sinyalleri apikal saç demeti ve bazal presynaptic uçak uyarıcı (gri kutu) başlangıcı ile başlatmak ve uyarıcı sona erdikten sonra katlanarak reddedin. Uyarıcı sırasında saç demetleri kalsiyum sinyalleri hızla yükselişi ve saptırma gücünü değişmez eğer emdirmek (Şekil 4A1-A1''). Buna ek olarak, alt kümesini saç hücreleri tespit kalsiyum sinyalleriyle sinaptik düzlemde içinde kalsiyum sinyalleri daha yavaş yavaş artırın ve doygunluk için daha az eğilimli (Şekil 4A2-A2''). Presynaptic kalsiyum sinyalleri (yeşil ROIs) olmadan saç hücrelerinde kalsiyum sinyalleri temel kalır.

Bu grafiksel gösterimleri (Şekil 4) ek olarak, kalsiyum sinyalleri dağınık şekilde tüm neuromast içinde kayıt saat süresince görüntülenmeyecektir. Bir kronolojik zamanmekansal temsil örneği Şekil 5 ' te bir neuromast, bazal düzlemde presynaptic GCaMP6s sinyalleri için gösterilir. Şekil 5' te, mekansal görüntüleme için görüntü sırası işlemek için ana adım adım 13'te açıklandığı gibi özetlenmiştir. İlk olarak, ham (F) GCaMP6s görüntüleri geçici binned [Şekil 5: satır 1 (5 / 14 depo gözleri gösterilir); adım 13.2.1]. O zaman, öncesi uyarıcı çerçeveler (13,2. adım) hesaplanan temel görüntü ΔF görüntü elde etmek (F) GCaMP6s floresan sinyallerini çıkarılır (Şekil 5: satır 2; adım 13.2.2). Daha sonra ΔF gri tonlamalı görüntüler bir renk LUT dönüştürülür (Şekil 5: satır 3, kırmızı sıcak LUT; adım 13,3). Son olarak, LUT dönüşüm ΔF görüntülerle neuromast içinde kronolojik zamanmekansal sinyalleri stimülasyon sırasında ortaya çıkarmak için geçici dönüştüm (F) görüntüleri (5 rakam, ilk satır) üzerine bindirilmiş (Şekil 5: satır 4; adım 13,4). Isı haritaları ΔF GCaMP6s sinyallerin tek ROIs ve Şekil 4' te kullanılan grafikleri ayrıştırmak kolay değil her iki değerli zamansal ve mekansal bilgi sağlar. Isı haritaları başlangıçlı ve kalsiyum sinyalleri içindeki tüm saç hücreleri arasındaki zamanlama ve yoğunluk farkları yanı sıra her saç hücre içinde süresi ile ilgili hücre altı bilgiler dahil olmak üzere kritik kronolojik zamanmekansal bilgileri görselleştirmek yardımcı olabilir neuromast.

Grafikler ve kayma ısı haritaları gerçek kalsiyum sinyalleri temsil ve eserler nedeniyle hareket değildir doğrulamak önemlidir. Bu protokol için hareket eserler aşırı drift veya larva veya hareket nedeniyle sıvı püskürtmeli stimülasyon hareketi sonucu olabilir. Tüm bu yapılar içinde vivo bu hazırlık aşamasında tamamen ortadan kaldırmak için zorlu. Görüntü dizileri (adım 12.1.3) kayıt için doğru olabilir iken aşırı hareket z ekseni ile x - ve Axes, görüntü sıralarını hareket çoğunluğu tespit ve analiz kaldırıldı. Hareket eserler kalsiyum sinyalleri grafiklerini çizerek tanımlamak kolay olan. Eserler ve gerçek GCaMP6s sinyalleri değildir GCaMP6s yoğunluk değişikliklere örnek olarak apex görülebilir (Şekil 4B1'-B1'') ve temel (Şekil 4C1'-C1'') saç hücrelerinin.

Sıvı Püskürtmeli uyarıcı çok güçlü olduğunda apikal Saç demetleri hareket eserler yaygındır (Şekil 3A3'' '). Bu aşırı derecede güçlü bir çekim gücü sırasında apikal saç demeti uçak odak dışında sıvı püskürtmeli stimülasyon sırasında hareket sonra uyarıcı sonlandırıldıktan sonra orijinal odak düzlemi için dönmek (Şekil 4B1'-B''). Doğru apikal MET bağlı kalsiyum sinyalleri ölçmek zorlaştırır. Şekil 4' te saç demeti hareket eserler örneği görülebilirB1'-B1''. Burada, GCaMP6s sinyalleri azalma uyarıcı (gri kutu) sırasında grafikleri göstermek ne zaman odak Saç demetleri. Uyarıcı sona erdikten sonra saç demetleri onların ilk yerine dönmesi ve odak haline geri GCaMP6s sinyalleri hızla artar. Şekil 4örnekte ile karşıttırA1'-A1'' apikal kalsiyum sinyalleri uyarıcı başlangıcında artırın ve uyarıcı sona erdiğinde azaltın.

Hareketi nedeniyle aşırı sıvı püskürtmeli uyaranlara da odak sinaptik uçaktan taşıyabilirsiniz iken, bu tür bir hareket artefaktı Bu düzlemde yaygın değildir. Bunun yerine, z-ekseni hareket veya larva sürüklenme nedeniyle odakta değişiklikler hareket eserler en yaygın nedenleri vardır. Larva hareket veya drift GCaMP6s ölçülerde apex ve saç hücrelerinin baz etkiler. GCaMP6s bazal, sinaptik düzlemde uyarıcı sırasında artar larva hareket örneği Şekil 4' te gösterilenC'-C''. Hareket eserler (Şekil 4C1'-C1'') doğru presynaptic sinyal--dan ayırt edici olabilir (Şekil 4A2'-A2'') GCaMP6s sinyalleri zaman tabii inceleyerek. Katlanarak uyarıcı ile azalan ve artan yerine (Şekil 4A2'-A2''), bir kare şekli ve yükselme ve aniden başlayan ve uyarıcı, sırasıyla (uzaklığı ile düşme GCaMP6s sinyal hareket kaynaklı artışlar var Şekil 4 C1'-C1'').

GCaMP6s sinyalleri zaman tabii dikkatli incelenmesi yanı sıra denetim Farmakoloji kullanarak deneyler gerçek GCaMP6s sinyalleri hareket yapılardan ayırt etmek için kullanılabilir. Örneğin, BAPTA (adım 10) Saç demetleri MET-kanal işlevi için gerekli olan uç bağlantıları ayırmak için uygulanabilir. BAPTA hem sıvı jet uyarılmış apikal MET kanal bağlı kalsiyum akını hem de sonraki bazal, presynaptic kalsiyum akını Cav1.3 kanallar aracılığıyla ortadan kaldırmak gerekir. Doğru uyarıcı uyarılmış kalsiyum sinyallerin temsilcisi örnekte (Şekil 4A1-A2'') Sıvı Püskürtmeli stimülasyon sırasında tüm değişiklikleri GCaMP6s floresan apikal ve bazal uçakta BAPTA tedaviden sonra ortadan. Buna ek olarak, GCaMP6s floresan olanlar gösterildiği gibi hareket nedeniyle değişiklikler rakamlar 4B1'-B1'' ve 4 C 1'-C1'' BAPTA tedavi tarafından elimine değil.

Tüm uyarıcı uyarılmış GCaMP6s sinyaller ortadan kaldırmak için BAPTA kullanmaya ek olarak, isradipine uygulanabilir (özellikle Cav1.3 bağlı kalsiyum akını bazal sinaptik düzlemde apikal MET kanal bağlı kalsiyum bırakarak engellemek için adım 11) akın tek parça5. GCaMP6s floresan apikal Saç demetleri içinde uygulanması isradipine, hiç hareket eserler ile bireysel bir neuromast değiştirdikten sonra (Şekil 4A1'-A1'') Sıvı Püskürtmeli stimülasyon sırasında tüm sinaptik GCaMP6s tam olur floresans değişiklikleri üssünde elimine (Şekil 4A2'-A2''). GCaMP6s sinyal isradipine uygulamadan sonra sinaptik düzlemde herhangi bir değişiklik (örneğin,Şekil 4C1-C1'') büyük olasılıkla hareket yapılara karşılık gelir.

Figure 1
Resim 1 : Sonradan içini kaplamak neuromast ve fonksiyonel görüntüleme uçak genel bakış. (A) diyagram sol yan görünümünü postsinaptik afferent nöronların (mavi) başvurarak dört saç hücreli organları (siyah) ile bir neuromast gösterir. Şeritler (yeşil) veziküller presynaptic etkin sitelere her hücre içinde kabloyu Sal. A bohça-in stereocilia (1 µm) MET kanalları içeren her hücreyi vücuda apikal. Her saç demeti su hareketi mekanik kuvvet saç demeti üsse transfer eden bir kinocilium vardır. Sağdaki diyagram bir yukarıdan aşağı görünüme aynı modelde gösterir. Bu yukarıdan aşağı görünüme siyah soldaki çizime tasvir dört hücreleri belirtmek için kullanılır ve gri neuromast diğer hücreleri belirtmek için kullanılır. Bu model ve bu 2 kez içinde üç önemli uçak vurgulanır: (1 ipuçları saç demeti saptırma, (2) nerede kalsiyum girer hücre Saç demetleri temelini apikal MET Uçak büyüklüğünü ölçmek için kullanılan saç demetleri (kinocilia) stimülasyon ve (3) sırasında nerede kalsiyum girer sinaptik şeritler hücre Bankası sinaptik uçakta. (B1-B1') MET uçak nereye mechanosensation bağlı kalsiyum sinyalleri kaydedilebilir Saç demetleri temelini DIC ve GCaMP6s yukarıdan aşağıya görüntüleri. (B2-B2') B1 B1 olarak aynı neuromast DIC ve GCaMP6s yukarıdan aşağıya görüntülerden ', ama nerede presynaptic kalsiyum sinyalleri tespit sinaptik düzlemde neuromast dibinde. (C1-C2) Nerede larvalar hatalı monte edilmiş GCaMP6s ifade neuromast görüntüleri. Bu örnekte, apikal MET uçak (C1) ve sinaptik uçak (C2) hücreyi temelini suboptimal bir açıyla konumlandırılmış. Bu konuma tek bir düzlemde yansıma tüm saç demetleri için izin vermez ve çok daha fazla görüntüleme uçak B1-B2 için karşılaştırıldığında bu neuromast içinde tüm sinapslarda adresindeki etkinliği yakalamak için gerekli olan '. 5 dpf, larva, görüntülerdir. Ölçek çubuğu C2 içinde tüm görüntüleri B1-C2 karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Düşsel odası, zebra balığı montaj ve kalp enjeksiyon prosedürleri ve iğneler. (A) gösterildi Merkezi silikon encapsulant üstüne sabitlenmiş (kesikli bir dikdörtgen tarafından özetlenen) bir larva ile görüntüleme bir odası olduğunu. (B1) Gösterilen 5 dpf larva tarafından iki iğneli immobilize. Büyük kafa PIN vücut dik sadece arka göze yerleştirilir. Böylece alt göz tamamen üst göz tarafından gizlenmiş iki gözü tamamen üst üste. Küçük kuyruk pin kuyruk notochord kesişiyor. Larva düz ve değil bükülmüş. (B2) Larva felç için bir kalp enjeksiyon iğne vücuda odaklı dik olduğunu ve kalbe komşu getirdi. Kalp enjeksiyon iğne pigment hücre kalp önünde başvurmalısınız. (B2') İğne depresyon deri içine girinti pigment hücrenin önünde kalp neden olur. (C) iğneler sırayla soldan sağa: örnek bir kalp enjeksiyon iğneyle bir açılış yaklaşık 3 µm; yaklaşık 50 µm bir açılış iyi bir sıvı püskürtmeli iğneyle örneği; büyük ve tırtıklı ve büyük olasılıkla üretmek aşırı ve düzensiz uyaranlar kötü kırık bir sıvı püskürtmeli iğne örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Sıvı Püskürtmeli hizalama, konumlandırma ve uyarıcı kalibrasyon. (A1) Gösterilen baş bakan soldaki ve sağdaki kuyruklu odaklı bir larva ve zebra balığı vücut A-P eksenine paralel bir sıvı püskürtmeli iğne odaklı. Bu sıvı püskürtmeli iğne anterior (itme/basınç için) yanıt neuromasts uyarmak için hizalanır ve sıvı akış arka (çekme/vakum) yönetti. (A2) Bir neuromast (kesikli beyaz çizgi tarafından özetlenen) ve sol tarafında apikal Saç demetleri (kinocilia) ipuçları panel ve sıvı püskürtmeli iğne panelinin sağ tarafta gösterilir. Sıvı Püskürtmeli neuromast kenarından konumlandırılmış yaklaşık 100 µm var. (A3 A3'' ') Apikal Saç demetleri (kinocilia) ipuçları sıvı püskürtmeli uyarıcı baskılar değiştirerek farklı mesafelerde bükülmesi vardır. Tek kinocilial bahşiş yörüngesini için 1,5 µm gösterilir (A3') ve 5 mikron (A3'') saptırma mesafeler. Siyah daire kinocilium istirahat konumunu gösterir. Bu kinocilia değil çok uzakta olamaz, aksi takdirde uyaran şiddeti güvenilir sayısal olamaz ve zarar olabilir önemlidir (A3'' '). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Apikal bir araya geldi ve bazal presynaptic GCaMP6s sinyalleri sonradan içini kaplamak saç hücreleri içinde sıvı püskürtmeli stimülasyon sırasında. (A1-A2'') Temsil edici bir neuromast içinde sıvı püskürtmeli stimülasyon sırasında GCaMP6s yoğunluğunu değiştirir. Sol tarafta görüntüler apikal MET uçak (A1) ve bazal sinaptik uçak (A2) aynı neuromast içinde göstermektedir. A1 ve A2 kodlu ROIs renk saat ders (f) ve ΔF/F GCaMP6s yoğunluk grafikler her resmin sağındaki çizmek için kullanılmıştır. (B1 B1'') Apikal MET görüntü sırası sıvı püskürtmeli stimülasyon sırasında aşırı hareketi ile örneği. Soldaki (B1) görüntü eskiden Arsa (F) ve ΔF/F GCaMP6s yoğunluk grafikler sağdaki ROIs gösterir. (C1-C1'') Gerçek kalsiyum olmayan değişiklikler sinyal gösterir hareket eserler ve GCaMP6s örnek görüntü sırası bazal sinaptik düzlemde sinyalleri. Soldaki (C1) görüntü eskiden Arsa (F) ve ΔF/F GCaMP6s yoğunluk grafikler sağdaki ROIs gösterir. Her grafik gri kutu sıvı püskürtmeli uyarıcı süresi sırasında her resim dizisini temsil eder. 2-s 5 Hz sıvı püskürtmeli uyarıcı A1-A2 örnekte kullanılan '' ve B1 B1''. C1-C1 içinde '', 2 s ön adım uyarıcı kullanıldı. Y ekseni (F) GCaMP6s grafiklerde isteğe bağlı birimleri (yapıyordum) Fiji görüntü yoğunluk ölçümleri elde edilen gösteriyor. Tüm örnekler, 4-5 dpf larvaları vardır. Ölçek çubuğu tüm resimler için 5 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Presynaptic GCaMP6s sinyalleri kronolojik zamanmekansal görselleştirme sıvı püskürtmeli stimülasyon sırasında. Uyarıcı sırasında GCaMP6s yoğunluğu bir neuromast içinde kronolojik zamanmekansal değişiklikleri görselleştirmek için adımları özetlenmiştir. Zaman soldan sağa görüntüleri üstündeki zaman damgası göre temsil edilir. Üst satır 5 / 14 geçici depo gözlerinden 70-çerçeve GCaMP6s (F) resim silsilesi (adım 13.2.1) gösterir. İkinci satırda (adım 13,2) temel ΔF görüntüler (adım 13.2.2) oluşturmak için her (F) GCaMP6s dönüştüm görüntüden kaldırıldı. Üçüncü sıradaki ΔF görüntüleri gri tonlamalı dönüştürüldü (ikinci sırada) kırmızı sıcak LUT (adım 13,3) için. Min ve max bu LUT görüntülerin göreli ΔF yoğunluğu (yapıyordum) (adım 13.3.1) sağdaki kırmızı sıcak LUT ısı haritası göre ayarlanır. Alt satırda, üçüncü sıra üst satırdaki (adım 13,4) (F) görüntüleri üzerine bindirilmiş. Rakamın üzerindeki gri çubuk 2-s 5 Hz sıvı püskürtmeli uyarıcı zamanlamasını gösterir. 5 dpf larvaları örnektir. Göreli ΔF yoğunluğu (yapıyordum) kırmızı sıcak LUT ısı haritası efsanesi sağda gösterilir. Ölçek çubuğu tüm resimler için 5 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Vivo görüntüleme olduğu gibi hayvanlarda doğal olarak meydan okuyor. Bu yöntemde birkaç adım güvenilir vivo içinde kalsiyum ölçümleri sonradan içini kaplamak saç hücrelerinden elde etmek için önemlidir. Örneğin, larva tutturulmuş ve düzgün hareketi görüntüleme sırasında en aza indirmek için Imaging önce felç çok önemli. Görüntüleme sırasında aşırı hareketi doğru sinyalleri olmayan ve kalsiyum düzeyleri değişikliklere karşılık gelmeyen GCaMP6s floresan değişikliklere neden (Örneğin, rakamlar 4B1'-B1'' ve 4 C 1'-C1''). Kuyruk pin bu daha fazla posterior neuromasts ulaşılmaz hale gelebilir rağmen anteriorly hareketi, en aza indirgemek için daha fazla yerleştirilebilir. Ayrıca, böylece PIN yatay kısmını sarısı arasında yatıyor kalp enjeksiyon sonra kafa pins döndürülebilir. Pimleri konumunu değiştirmeden ek olarak, ayrıca larva34hareketsiz için iğne yerine bir beyin dilimli harp kullanmak mümkündür. Larvaları düzgün yerleştirildiğinde, harp larva immobilizing potansiyel invaziv yöntem daha az bir ek olduğunu. Önemli hareket yetersiz sabitleme neden olabilir iken, düzgün kalp enjeksiyon α-bungarotoxin teslim ve larva felç için gerçekleştirmek için hata eksik felç, hareket, neden ve sonuçta eserler hareket. Yaygın olarak kullanılan anestezikler zebra balığı saç hücreleri uyarılabilirlik etkilemeye göstermiştir rağmen son iş anestezik benzokain saç hücreli aktivite birçok yönleri ile müdahale değil göstermiştir. Benzer şekilde, daha sık kullanılan anestezik MS-222 sadece saç hücreli etkinlik15belirli yönleri ile müdahale. Bu nedenle, α-bungarotoxin enjeksiyon zorlu doğası gereği, benzokain veya MS-222 uygulama felç larva hareketinde fonksiyonel kalsiyum görüntüleme sırasında önlemek için yararlı bir alternatif yöntem olduğunu kanıtlayabilir.

Bu protokol için ilgili teknik sorunlar yanı sıra bile mükemmel bağlı bir örnek larva ve saç hücreleri öncesinde ve görüntüleme her deney sırasında sağlıklı değilse gereksizdir. Larva ve saç hücreleri sağlıklı olduğundan emin olmak için larva enkaz chorions (yumurta kabukları), atık ve mikroorganizmalar gibi ücretsizdir E3 arabelleği korunur önemlidir. Sonradan içini kaplamak saç hücreleri yüzeysel konumunu görüntüleme için avantajlı olmasına rağmen E3 arabellek faul bu konuma onları hücre hasarına karşı daha savunmasız yapar. Temiz, sulu çevre genç larvalar (2-4 dpf) için özellikle önemlidir veya dik bir yüzme sürdüremez mutantlar getirin ve öncelikle Petri kabına dibinde yalan. Bu durumlarda, sonradan içini kaplamak saç hücreleri ve saç demetleri çevreleyen koruyucu cupula kolayca açığa çıktığını düşündüğünüz. Hatta sağlıklı larvalar ve her deneme seyri boyunca saç hücreleri ile başlatırken larva bir kalp atışı ve hızlı kan akışı olduğundan emin olmak önemlidir. Kan akımı yavaşlar veya durur, saç hücreleri sağlığını tehlikeye haline. Sağlıksız larva veya kaybı kan akımı içeren güvenliği aşılan hazırlıklar, saç hücreleri ölmek üzere çeşitli yolları tanımlanabilir: ilk karyopyknosis veya altında DIC optik; hücre içinde bir balon olarak tecelli nükleer yoğunlaşma görünümünü tarafından İkinci olarak, hücre büzülme ve hızla parçacıklar sitoplazma içinde hareket ettirerek varlığını tarafından; ve üçüncü, kinocilia ipuçları farklı yönlere35edebilir zaman. Saç demetleri bozulduğu zaman, yayvan kinocilia hareket etme birlikte çalışabilirliğe stimülasyon sırasında.

Bu hazırlık birkaç küçük sınırlamalar, bir hazırlık sadece 1-3 saat için oluşturulduktan sonra sağlam kalır varlık vardır. Daha küçük iğne veya beyin dilimli kullanma gibi değişiklikler larvaları hareketsiz durmak ve perfüzyon sistemi ekleme bu vivo içinde hazırlık ömrünü uzatabilir. Bu photobleaching başka bir kısıtlamadır ve fototoksisite denemeler Imaging tekrarlanan sonra oluşabilir. Bu zorluğu aşmak için bir heyecan verici bu iletişim kuralı için ışık sayfalık mikroskobu adapte yoludur. Işık sayfalık mikroskobu odak ışık, daha az photobleaching ve fototoksisite36için önde gelen dışında azaltmak için güçlü bir yoldur. Birlikte, nazik immobilizasyon ve daha az fotoğraf çekim görüntüleme her oturum uzatmak yardımcı olabilir. Artık bu görüntü oturumlarının süresi boyunca geliştirme ve saç-hücre Temizleme ve yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra yaralanma temel süreçler eşlik eden işlev değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Işık sayfalık mikroskobu yanı sıra, bu iletişim kuralı diğer türleri confocal sistemleri (nokta-tarama, 2-foton ve iplik disk) nispeten basit widefield sistemleri28yanı sıra,34 adapte edilebilir, işaret etmek önemlidir . Genel olarak, çok yönlü bu protokol uyarlanmış ve birden çok görüntüleme sistemiyle kullanılabilecek değerli bir araç yapar.

Uyarlanmış ve birçok görüntüleme sistemleri ile kullanılan bu iletişim kuralı iken, bu protokol bölümlerini ayrıca uyarlanmış ve (1) yanı sıra GCaMP6s ve (2) için görüntü aktivite diğer duyu hücreleri ve nöronlar larva zebra balığı içinde diğer göstergeler ile kullanılan. Örneğin, bir önceki çalışmada, bu protokol sitozolik kalsiyum (RGECO1), vezikül füzyon (SypHy), membran voltaj (Bongwoori) ve membran algılamak için sonradan içini kaplamak saç hücreleri içinde birden çok genetik olarak kodlanmış gösterge kullanarak görüntü etkinliğini için kullanılan kalsiyum (jRCaMP1a-caax ve GCaMP6s-caax) ve membran kalsiyum (GCaMP6s-caax)5algılamak için sonradan içini kaplamak afferent süreçleri içinde. Bu göstergeler kullanarak bizim deneyimlere dayanarak, bu protokol için Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) açıklanan transgenik çizgi sonradan içini kaplamak neuromasts etkinliğinde görüntüleme için mükemmel bir başlangıç sunuyor. Yukarıda listelenen tüm göstergelerin GCaMP6s en duyarlı ve photostable olduğunu bulduk. İki ayrı ölçüm yapmak için kullanılabilir çünkü bu özelliklere ek olarak, biz Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgenik satırı vurgulayın: saç hücreli mechanosensation ve tek bir transgenik satır içinde presynaptic kalsiyum.

Bu makalede özetlenen tekniği nasıl kalsiyum görüntülemede zebra balığı sonradan içini kaplamak-ebilmek var olmak güçlü bir yöntem nasıl doğal ortamlarındaki saç hücreleri çalışması çalışma için gösterir. Bu çalışmalar memelilerin hangi saç hücreye işlev şu anda ex vivo explants incelenmiştir için tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Ayrıca, zebra balığı modeli memeli saç hücreleri etkinliğini incelemek uygulanabilir genetik olarak kodlanmış göstergeleri etkinliğini test etmek için bir platform olarak kullanılacak devam edebilirsiniz.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser NIH/NIDCD intramural araştırma fonları 1ZIADC000085-01 tarafından da (adı) destek verdi. Fiji makro yazma konusunda ona yardım için şeker Wong kabul etmek istiyoruz. Ayrıca Doris Wu ve şeker Wong protokolü ile yararlı öneriler için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. , Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

Tags

Neuroscience sayı: 141 zebra balığı kalsiyum görüntüleme confocal görüntüleme in vivo görüntüleme saç hücreleri duyusal neuroscience sonradan içini kaplamak genetik olarak kodlanmış göstergeleri GCaMP
Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo… More

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter