Summary
인간의 탯 (UC) preterm, 용어, 결과로 perinatal 기간 동안 얻을 수 있습니다 하 고 postterm 배달. 이 프로토콜에서 우리 기술 분리와 UC 유래 중간 엽 줄기 세포 (UC-MSCs)의 태아/유아에서 임신 19-40 주.
Abstract
중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 상당한 치료 잠재력 있고 생물 의학 분야에서 증가 관심을 유치. MSCs는 원래 고립 된 골 수 (BM)에서 특징 그리고 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프와 같은 태 반, 태아 부속을 포함 하 여 조직에서 획득 한 탯 줄 혈액 (UCB), 그리고 탯 (UC). MSCs는 이종 세포 인구 (1) 표준 문화 조건, (2) 표면 마커 표현의 CD73 플라스틱 준수 한 용량+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- 고기, 그리고 (3) trilineage 차별화 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes, 현재 국제 사회에 의해 세포 치료 (ISCT)에 대 한 정의를 실현. BM은 MSCs의 가장 널리 사용 되는 소스, BM 포부의 침략 적인 본질은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 대조적으로, UC에서 얻은 태아 MSCs 활발 한 증식 및 분화 능력 등 장점이 있다. 그것은 일반적으로 의료 폐기물로 간주 UC 샘플링에 대 한 윤리적인 우려가입니다. 인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 성장을 지속적으로 개발을 시작 하 고 성장 하는 길이, 50-60 cm를 도달할 때까지 계속 전체 신생아 배달 기간 동안 격리 될 수 있습니다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 다양 한 임신 나가에 전달 하는 유아에서 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 분리와 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC MSCs의 특성을 설명합니다.
Introduction
중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 원래 고 골에서 (BM)1,2 특징 하지만 또한 다양 한 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프 및 태아 부속을 포함 하 여 조직에서에서 얻을 수 있습니다. 3. MSCs 격 증 하 고 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 인구로 서 인식 됩니다. MSCs 상해의 사이트로 마이그레이션할 억제 하 고 면역 반응을 조절 하는 능력을 소유 하는 또한, 개장 하 고 상해를 복구. 현재, 서로 다른 소스에서 MSCs 이식-비교-호스트 질병, 심근 경색 및 뇌4,5 포함 하 여 다루기 힘든 질병의 숫자에 대 한 세포 치료에 대 한 원본으로 성장 관심을 받고 있다 .
BM은 MSCs의 가장 좋은 특징이 소스, BM 포부의 침입은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 반면, 태 반, 탯 줄 혈액 (UCB) 등 태아 부속에서 얻은 태아 MSCs 및 탯 (UC) 샘플링 하 고 강력한 확산 및 감 별 법 용량6 덜 윤리적 문제를 포함 하는 장점이 있다 , 7. 중 의료 폐기물로 폐기 보통 태아 부속, UCB와 UC는 간주 태아 기관 태 fetomaternal 간주 됩니다. 또한, 태 반 및 UCB 샘플링 하 여 태 반 및 UC 수집 하 고 신생아 배달 후 처리 될 수 있습니다 신생아 배달의 정확한 순간에 수집 해야 합니다. 따라서, UC 세포 치료8,9대 유망 MSC 소스 이다.
인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 진보적인 확장 개발을 시작 하 고 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고 신생아 배달10의 전체 기간 동안 고립 될 수 있다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리는 다양 한 임신 성 연령11,12에서 제공 하는 유아에서 UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 사용 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 하 고 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC-MSCs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다.
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Protocol
이 연구에 대 한 인간의 샘플의 사용 고베 대학 대학원의 학부 (승인 제 1370, 1694)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 승인된 지침에 따라 실시.
1. 격리와 UC MSCs의 문화
참고: UC-MSCs 성공적으로 격리 된, 교양, 그리고 확장된 (이상 통로 번호 4) 200 이상에서 UCs이이 프로토콜을 복종. 이상의 200 간에 UCs, 100% 나타났습니다 성공적인 UC MSC 격리, 5% 미만 15%로 나타났습니다 성장 검거 하 고 80% 이상 성공적인 UC MSC 확장 우발적인 오염 나타났습니다.
-
UC를 수집 합니다.
- 50 mL 플라스틱 튜브를 준비, 무 균가 위, 그리고 알파의 500 mL 병 4 ° c.에이 글의 최소 필수 매체 (알파 MEM) 수정
- Aseptically 길이에서 대략 5-10 cm에서 수술 시저와 UC 잘라 고 제왕 절 개 하 여 신생아 출생 후 곧 그것을 수집 합니다.
- 즉시는 UC 50ml 플라스틱 튜브에 놓고 MEM 튜브에 알파의 20-30 mL를 추가 합니다.
- 그것은 실험실에 수송 될 때까지 실 온 (RT)에서 UC를 저장 합니다.
참고: 무 균 UC 최대 2 일 동안 RT에서 혈 청 자유로운 매체에 저장할 수 있습니다. 따라서, 2 일 이내 실험실으로 전달 되는 경우 인근 병원에서 얻은 UC는 수집할 수 있습니다.
-
UC를 해 부.
- 플라스틱 트레이, 소독된가 위, 집게, 10 mL 펫 25 mL 펫, 2 개의 60 m m 조직 문화 요리, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비, 정제 효소 혼합 (참조 테이블의 자료, 농도에서 살 균 PBS와 재구성 13 Wünsch 단위/mL의-80 ° C에 저장), 그리고 감소 된 혈 청 매체의 500 mL 병 ( 재료의 표참조).
- PBS, 정제 효소를 따뜻한 혼합, 실시간으로 혈 청 매체와 문화 매체 [알파 MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (AA) 4 ° C에 저장]을 감소
- 튜브에서 UC를 꺼내와 플라스틱 쟁반에.
- 무게 하 고 소독된가 위 UC의 5 g를 해 부.
- 10 mL 피 펫을 사용 하 여 살 균을 위한 UC의 70% 에탄올 10 mL 붓는 다.
- PBS는 10 mL 피 펫을 사용 하 여 두 번의 10 mL와 UC를 씻어.
- 멸 균된 60 m m 조직 문화 접시에는 UC를 놓습니다 ( 그림 1, 1 단계 참조).
- 접시에 감소 된 혈 청 매체의 10 mL를 추가 합니다.
- 정제 효소 혼합 약 0.62 Wünsch 단위/mL의 최종 농도 도달의 0.5 mL를 추가 합니다.
참고: 전통적인 콜라 대신 정제 효소 혼합의 사용 수율을 향상을 보여줘 왔다 그리고 UC MSCs의 UC에서 격리. - 집게 (참조 그림 1, 2 단계)와 소독된가 위는 UC 2-3 m m 조각으로 잘라.
참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다. - UC 조각 5% CO2 배양 기에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 부분적으로 소화 된 UC 조각 25 mL 피 펫을 쉽게 통과 하는 작은 조각으로 잘라.
참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다. - 작은 UC 조각 5% CO2 배양 기에서 15-45 분 동안 37 ° C에서 품 어.
참고: 부 화는 homogenates 점성 될 때까지 계속 해야 합니다. 총 소화 시간은 약 120 분입니다. 그러나 Preterm 유아에서 UCs를 사용 하는 경우, 소화 시간 단축 수 있다 수 있기 때문에 그는 쉽게 잘라 소화.
-
UC-MSCs를 격리 합니다.
- 4 50 mL 플라스틱 튜브와 문화 매체의 500 mL 병을 준비 합니다.
- UC homogenate를 2 50ml 플라스틱 튜브 각 튜브에 약 7.5 mL와 함께 25 mL 피 펫을 사용 하 여 나눕니다.
- 각 관으로 문화 매체의 20 mL를 추가 하 고 잘 혼합.
- 25 mL 피 펫을 사용 하 여 UC 파생 된 세포를 수집 하는 새로운 50 mL 컬렉션 튜브 위에 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 각 UC homogenate를 필터링 합니다.
참고: 소화 UC 솔루션은 끈 적이 과정 각각 15 분 정도 걸립니다. - 5 분 동안 1000 x g에서 두 튜브 원심
- 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.
- 문화 매체의 5 mL와 함께 두 개의 튜브에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 60 m m 플레이트에 세포 현 탁 액을 전송 ( 그림 1, 3 단계 참조).
-
-MSCs 문화 Uc입니다.
- PBS, 트립 신-EDTA (0.25 w/v%), 워밍업 및 매체 문화 (알파 MEM 10 %FBS 1 %AA 포함) 실시간을
- 셀 60 m m 플레이트에 장착 하는 경우 문화 매체를 제거 하 고 두 번 파편과 적혈구를 제거 하는 PBS의 5 mL로 씻어.
참고: 연결 된 셀은 일반적으로 초기 도금 후 3-5 일에 나타납니다 ( 그림 1, 4 단계 참조). - 두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어.
참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 7-14 일 걸립니다. - 5 mL의 PBS로 세척 세포는 두 번, 트립 신-EDTA의 0.5 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.
- 셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).
- 두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어.
참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 4-8 일 걸립니다. - 10 mL PBS의 셀을 두 번 씻어 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.
- 셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 두 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).
- 10 번째 통로까지 subculture (1:2 분할)을 반복 ( 그림 1, 5 단계 참조).
참고: 적은 confluent 조건 하에서 경작 하는 세포는 이전 확산 체포를 도달 하는 경향이, 때문에 분할 비율 1: 2의 통로 세포에 중요 하다. - 5 8 통로에 세포를 사용 하 여 세포 표면 마커 분석, 세포 감 별 법 분석 실험, 및 다른 실험에 대 한.
참고: 유지 하기 위해 가능한 한 길게를 위한 활발 한 증식, 세포 일반적으로 70-80 %confluent 조건 보다 더 아래 교양.
2. 표면 마커 UC MSCs의 표현
- 셀 100 mm 접시에 준비 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 트립 신-EDTA의 1 mL와 함께 그들을 떼어 놓다.
- 5 분 동안 1000 x g에서 문화 매체와 원심 분리기의 9 mL를 추가 합니다.
- 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.
- PBS의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 고 1000 x g에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 두 번이 세척 단계를 반복 합니다.
- ~ 1 × 106 셀/mL에서 교류 cytometry (FCM) 버퍼 (PBS 2 mM EDTA 및 10% 차단 시 약 포함)에 포함 된 셀을 resuspend.
- 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 50-100 µ L를 전송 phycoerythrin (PE) 추가-CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, 또는 HLA-DR;에 대 한 항 체를 활용 그리고 45 분 동안 얼음에 품 어.
- FCM과 워시 셀 두 번 버퍼링 하 고 0.2% 생존 염료 솔루션의 50-100 µ L를 추가 ( 재료의 표참조).
- 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 15 분, FCM 버퍼 두 번 세척 세포 및 필터 셀에 대 한 RT에서 품 어.
- FCM을 통해 셀을 실행 하 고 제조업체의 지침에 따라 FCM 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 결과 분석.
3. Trilineage UC MSCs의 차별화
-
지질을 수행 합니다.
- 5 × 103 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- 12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.
- Adipogenic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조)와 2-3 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 adipogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
- PBS와 셀 세 번 씻어.
- 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
- 셀 60% 소 프로 파 놀과 PBS 세 번 세 번 씻어.
- 0.5% 기름 빨간 O 솔루션 준비 석유의 84 mg를 용 해 하 여 빨간 O 100% 소 프로 파 놀과 추가의 6.7 mL 10 mL에서 증류수. 20 분에 대 한 실시간에 0.5% 기름 빨간 O 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.
- 60% 소 프로 파 놀과 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.
-
골을 수행 합니다.
- 1 × 104 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- 12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.
- Osteogeneic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조) 고 1-2 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 osteogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
- PBS와 셀 세 번 씻어.
- 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
- PBS와 셀 세 번 씻어.
- 알리자린의 200 mg를 용 해 하 여 2% 붉은 알리자린 S 용액 준비 빨간색 S 증류수 10 mL로. 2% 붉은 알리자린 S 솔루션 RT에서 3 분의 1 mL로 세포 얼룩.
- PBS와 웰 스 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.
-
Chondrogenesis을 수행 합니다.
- 1.6 × 107 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- 12-잘 접시 (micromass 문화)의 중심에 세포 현 탁 액의 5 µ L 방울을 배치 하 고 2-3 h 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
- 부드럽게 chondrogenic 차별화 매체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 및 4-7 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어. 일주일에 두 번 chondrogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
- PBS와 셀 세 번 씻어.
- 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
- PBS와 셀 세 번 씻어.
- Ph 4.1 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼의 500 mL와 함께 블루 톨루이의 250 mg를 용 해 하 여 0.05% 톨루이 블루 솔루션을 준비 합니다. 30 분에 대 한 실시간에 0.05% 톨루이 블루 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.
- PBS와 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.
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Representative Results
MSC 문화 UC 컬렉션에서 절차는 그림 1에서 요약 된다. 길이 약 5-10 cm의 UC 제왕 절 개에 의해 전달 하는 모든 신생아에서 수집할 수 있습니다. UC는 임신의 4-8 주에 개발을 시작 하 고 그림 2와 같이 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고. 그림 3 과 그림 4에서 같이 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 (CL), 안 감과 튼의 젤리 (WJ) UC에 있습니다. UC-MSCs 모든 코드 영역 또는 전체 코드13에서 격리 될 수 있습니다. 초기 임신 연령대와 유아에서 UC는 취약 하며 단일 코드 영역으로 해 부에 대 한 어려운, 때문에 UC MSCs 전체 코드11,12으로부터 격리 됩니다. Explant 방법14 및 효소 소화 방법15, 플러스 그들의 파생 상품16를 포함 하는 UC에서 MSCs를 격리 하기 위해 여러 가지 방법이 있다. 더 이상 문화 주기, 낮은 수율 및 이전 확산 체포 explant 방법17,18와 관련 된, UC MSCs 효소 소화 방법 그림 5 와 에서 볼 수 있듯이 교양 그림 6.
MSCs를 정의 하기 위한 최소한의 기준을 ISCT에 의해 설립 되 고 그들의 표면 마커 특성19를 포함 합니다. 표면 마커 식을 결정 하려면 UC-MSCs preterm와 기간 유아에서 적절 한 PE 활용 된 항 체와 알을 품는 고 cytometry에 의해 분석. 그들은 MSC 서명 마커 (CD73, CD90, CD105)에 대 한 긍정적인 하지만 대 한 부정적인 monocyte/대 식 세포 (CD14), 내 피 (CD34), 조 혈 (CD19, CD45) 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (HLA-DR) 마커, 그림 7에서 같이.
19ISCT 기준 따라 MSC mesodermal 차별화 용량 trilineage 차별화 분석 결과 의해 평가 보유 해야 합니다. Trilineage 차별화 능력 평가, UC-MSCs preterm와 기간 유아에서 osteocytes, adipocytes, 및 조건 표준 체 외에서 분화 chondrocytes로 차별화 하는 유도. 그림 8에서 같이, 그들은 잘 mesodermal 셀의 모든 세 가지 유형으로 차별화입니다.
그림 1 : UC MSCs의 문화와 격리의 회로도. 1 단계입니다. UC의 5-10 cm aseptically 태 반 조직에서 수집. 2 단계입니다. 정제 효소 혼합 소화 UC 조각입니다. 3 단계입니다. 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 UC MSCs의 문화. 4 단계입니다. 연결 된 UC-MSCs 초기 도금 후 3 일에서 나타났다. 5 단계입니다. UC의 subculture-MSCs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 다양 한 임신 나가에 태아/유아에서 UC 전달. 임신의 19-38 주에 태아/유아에서 UCs 표시 됩니다. UC의 크기와 임신 중인 나이 증가 한다. 스케일 바 = 8 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 용어 및 preterm 유아에서 UC의 단면 보기. Preterm와 기간 유아에서 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 (CL), 안 감과 튼의 젤리 (WJ) UC에 있습니다. 이러한 조직의 크기 임신 연령대와 다릅니다. 스케일 바 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : UC의. (A)에서 UC의 5 cm의 유아 (B) UC의 횡단면. (C)는 부분적으로 UC를 해 부. 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 라이닝 (CL), 그리고 Whalton의 젤리 (WJ) 있다. 이전 임신 연령의 유아에서 UC는 특히 취약 하며 해 부 수 어렵다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : UC 해 부 정화 효소 혼합을 사용 하 여. (A) UC의 5-10 cm. UC의 (B) 2-3 m m 조각. (C) 정화 효소 혼합 소화 UC 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : UC-MSCs preterm와 기간 유아에서의 형태. (A 와 E) UC-MSCs 문화 매체 (한: X40;의 교체 전에 통로 번호 1 (P1) E: X200)입니다. (B 와 F) P1 문화 매체 (b: X40;의 교체 후에 UC-MSCs F: X200)입니다. (C 와 G) UC-MSCs에서 P3 (c: X40; G: X200)입니다. (D 와 H) P5에 UC-MSCs (d: X40; H: X200)입니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 용어 및 preterm 유아에서 UC MSCs의 마커 식 표면. CD73/CD90/CD105-긍정과 CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-네거티브 고기는 preterm (임신 22 주)와 (37 주 임신) 기간 유아에서 UC MSCs에서 발견 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 용어 및 preterm 유아에서 UC MSCs의 Trilineage 엽 차별화. UC-MSCs preterm (임신 22 주) 및 용어 (37-40 주 임신) 유아 체형으로 분화 된다 (에 의해 시각 기름 빨간 O), osteocyte (알리자린에 의해 시각 빨간색 S), 그리고 chondrocyte (톨루이 블루에 의해 시각). 이미지는 200 x에서 촬영 했다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 일부가 이와타 외.11에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
MSCs는 다양 한 조직에서에서 고립 될 수 있다 고 할 모든 익스프레스 같은 phenotypic 표식 셀의 이종 인구. 여기, 우리는 preterm와 기간 유아에서 수집 및 UC의 해 부 가이드 및 절연 UC MSCs의 문화를 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 했다. 이 프로토콜에 따라 우리는 성공적으로 고립 된 UC-MSCs ISCT 기준19 태아/유아 임신 19-40 주에 전달 하 고 다루기 힘든 질병 이상의 일부 측면을 나타내는 시연에서 충족 동안 태아 개발11,12.
BM 파생 MSCs (BM-MSCs), 젊은 기증자 파생 BM MSCs 일반적으로 이전 보다 더 큰 증식 및 differentiative 잠재력을 표시 하 고 셀 치료20,21에 대 한 더 많은 잠재력이. 마찬가지로, 태아 임신의 8 ~ 12 주에 중단에서 격리 하는 preterm UC-MSCs 더 활발 한 확산 및 용어 UC-MSCs 임신22의 37-40 주에 전달 하는 신생아에서 격리에 비해 차별화를 보도 했다. 임신 나이 및 코드 지역 차이도 불구 하 고 UC-MSCs 절연이 프로토콜을 또한 용어 UC MSCs12보다 preterm UC-MSCs의 더 활발 한 증식을 밝혔다.
이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 정화 효소의 혼합을 가진 UC 해 부 I, II 및 dispase 콜라의 구성. 대표 결과에 명시 된 대로 UC의 강성 극적으로 임신 나이 (그림 2) 다양 한. UC의 최적의 해 부를 위해 순화 된 효소의 외피 시간 개별 UC의 강성을 조정할 수 필요가 혼합 합니다. 일반적으로, 일반적으로 걸리는 긴 기간 preterm UC 보다 UC에 대 한. UC에서 MSCs를 분리 하는 기존의 방법, 가운데 우리 더 이상 문화 주기, 낮은 수확량 및 이전 확산 체포17,18이어질 수 있습니다 explant 방법14 효소 소화 방법15 선택. 효소 소화 방법의 중요 한 수정은 효율적이 고 일관 된 해 부 UC의 가변 임신 연령대와 태아/유아에서 가능 하 게 전통적인 콜라 대신 정제 효소 혼합의 사용 이다.
이 프로토콜의 제한 UC에서 MSCs를 분리 하는 전체 코드의 사용 이다. UC-MSCs 모든 코드 영역 또는 전체 코드13에서 격리 될 수 있습니다, 때문에 UC MSCs이이 프로토콜에 전체 코드에서 격리 됩니다. 이것은 preterm 유아에서 UC 해 부의 타당성입니다. 그러나, 각 코드 영역의 비율에서 잠재적인 변이 UC-MSCs이이 프로토콜에 의해 고립 된 엄격한 비교를 제한할 수 있습니다.
UC-MSCs 점점 사용 되고있다 mesenchymal stromal 세포의 소스로 전 임상 및 임상 연구8,9. 이 증가 사용에도 불구 하 고 UC MSCs 격리의 방법에 대 한 합의 아직 실종이 같은 UC MSCs 간주를 다른 세포 인구에서 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜 궁극적으로 더 나은 이해 파생 및 UC MSCs의 기능적 특성에 연구원을 지원 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Scientific Research (C)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다 (번호 부여: 25461644)와 젊은 과학자 (B) (번호 부여: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) JSP KAKENHI의.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60 mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
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