Summary
人类脐带 (uc) 可以在围生期获得, 这是早产、足月和产后分娩的结果。在该协议中, 我们描述了在妊娠19-40周时从胎儿婴儿中分离和表征 uc 衍生的间充质干细胞 (uc-mscs) 的方法。
Abstract
间充质干细胞具有相当大的治疗潜力, 在生物医学领域引起越来越大的兴趣。骨髓间充质干细胞最初是从骨髓 (bm) 中分离出来并具有特征的, 然后从包括脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓和胎儿附属物 (如胎盘、脐带血) 和脐带 (uc)) 在内的组织中获得。骨髓间充质干细胞是一种异质细胞群, 有能力 (1) 在标准培养条件下坚持塑料, (2) cd73+/cd90+/cd105 +/cd45-/cd34-/cd14-/cd19 的表面标记表达--hla-dr-表型, 和 (3) 三系分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞, 目前由国际细胞治疗学会 (isct) 定义.虽然 bm 是 msc 中应用最广泛的来源, 但 bm 吸入的侵入性在伦理上限制了其可访问性。bm 中获得的骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力普遍随着供体年龄的扩大而下降。相反, 从 uc 中获得的胎儿骨髓间充质干细胞具有旺盛增殖和分化能力等优点。u c 抽样不存在伦理问题, 因为它通常被视为医疗废物。人类 uc 开始发展与羊膜腔的持续增长在4-8 的怀孕, 并不断增长, 直到达到50-60 厘米的长度, 它可以在整个新生儿分娩期间被隔离。为了深入了解难治性疾病的病理生理学, 我们使用了不同胎龄婴儿的 uc 衍生骨髓间充质干细胞 (uc-mscs)。在该协议中, 我们描述了在妊娠19-40周时从胎儿婴儿中分离和表征 uc-mscs 的方法。
Introduction
间充质干细胞 (mscs) 最初是从骨髓 (bm)1, 2 中分离和表征的, 但也可以从各种组织中获得, 包括脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓和胎儿附属物3. 骨髓间充质干细胞被认为是异质细胞群, 可以增殖并分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。此外, 骨髓间充质干细胞具有迁移到损伤部位、抑制和调节免疫反应、重塑和修复损伤的能力。目前, 不同来源的骨髓间充质干细胞作为细胞治疗的来源, 包括移植物抗宿主病、心肌梗死和脑梗死4, 5,引起了越来越大的兴趣..
虽然 bm 是 msc 最有特色的来源, 但 bm 吸入的侵入性在伦理上限制了其可访问性。bm 中获得的骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力普遍随着供体年龄的扩大而下降。相反, 从胎盘、脐带血 (ucb) 和脐带 (uc) 等胎儿附属物中获得的胎儿骨髓间充质干细胞具有优势, 包括对取样的伦理关注较少, 以及对增殖和分化能力的鲁棒性 6,7. 在通常作为医疗废物丢弃的胎儿附属物中, ucb 和 uc 被视为胎儿器官, 而胎盘被视为胎儿器官。此外, 需要在新生儿分娩的确切时刻对胎盘和 ucb 进行取样和收集, 而胎盘和 uc 则可以在新生儿分娩后收集和处理。因此, uc 是一个有前途的 msc 来源的细胞治疗 8,9。
人类 uc 开始发展与羊膜腔在4-8 的妊娠, 继续增长, 直到50-60 厘米的长度, 并可以在整个新生儿分娩期间隔离10。为了深入了解难治性疾病的病理生理学, 我们使用了不同妊娠年龄11岁、12岁的婴儿的 uc 衍生骨髓间充质干细胞 (uc-mscs)。在该协议中, 我们描述了如何在妊娠19-40周时从胎儿婴儿中分离和表征 uc-mscs。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究的人体样本使用得到了神户大学医学研究生院伦理委员会的批准 (第1370号和第1694号批准), 并按照批准的准则进行。
1. uc-mscs 的分离和培养
请注意:已成功地从200多个受该协议影响的 uc-mscs 中分离、培养和扩展 (超过第4段)。在200多家用品中, 100% 的 uc-msc 隔离成功, 不到5% 的人出现意外污染, 不到15% 的人表现出生长抑制, 80% 以上的人显示 uc-msc 成功扩张。
-
收集 uc。
- 准备一个50毫升塑料管, 一个无菌剪刀, 和一个500毫升瓶的阿尔法修改鹰的最低必要介质 (α-mL) 在4°c。
- 在大约5-10 厘米长的手术剪刀的情况下, 无菌地切割出 uc, 并在新生儿出生后通过剖腹产不久收集。
- 立即将 uc 放入50毫升塑料管中, 并在塑料管中加入 20-30 ml 的 alpha mL。
- 将 uc 存放在室温 (rt) 下, 直至送往实验室。
请注意:无菌 uc 可在 rt 的无血清介质中储存长达2天。因此, 从邻近医院获得的 uc 如果在2天内送到实验室, 可以被收集。
-
解剖 uc。
- 准备一个塑料托盘, 消毒剪刀和钳子, 10 毫升移液器, 25 毫升移液器, 两个60毫米组织培养盘, 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 纯化的酶混合物 (见材料表, 用无菌 pbs 重组在一个浓度储存在-80°c 时的 13个 wünsch unitsml, 以及一瓶500毫升的减少血清介质 (见材料表)。
- 将 pbs、纯化酶共混物、还原血清培养基和培养基 [α mem 含有10% 的胎牛血清 (fbs) 和1% 抗生素-抗真菌溶液 (aa) 储存在 4°c] 加热到 rt。
- 从管子里拿出 u c, 放在塑料托盘里。
- 用消毒剪刀称量5克的 uc。
- 在 uc 中倒出10毫升的乙醇, 用于使用10毫升的移液器进行灭菌。
- 用10毫升的移液器用10毫升的 pbs 清洗 uc 两次。
- 将 uc 放入经过消毒的60毫米组织培养盘中 (参见图 1, 步骤 1)。
- 在盘中加入10毫升的减少血清中的血清培养基。
- 加入0.5 毫升的纯化酶共混物, 最终浓度约为 0.62 wünsch units\ ml。
请注意:采用纯化的酶共混物代替传统的胶原酶, 提高了 uc 分离出的 uc-mscs 的产量和生存能力。 - 用消毒剪刀和钳子将 uc 切割成2-3 毫米的碎片 (参见图 1, 步骤 2)。
请注意:此过程大约需要30分钟。 - 在37°c 条件下, 在5% 的 co2 孵化器中孵育 uc 件 30分钟 。
- 将部分消化的 uc 件切割成更小的部件, 很容易流经25毫升的移液器。
请注意:此过程大约需要30分钟。 - 在 5% co2 孵化器中, 在37°c 下孵育较小的 uc 件 15-45.
请注意:孵化需要继续, 直到均质物变得粘稠。总消化时间约为120分钟。然而, 在使用早产儿的 u c 的情况下, 消化时间可以缩短, 因为这些可以很容易地切割和消化。
-
隔离 uc-mscs。
- 准备四个50毫升塑料管和一个500毫升的培养基。
- 使用25毫升移液器将 uc 均质体划分为两个50毫升塑料管, 每个管约 7.5 ml。
- 在每管中加入20毫升培养基, 搅拌均匀。
- 通过放置在新的 50 ml 收集管顶部的100μm 单元过滤器, 使用 25 ml 移液器收集 uc 衍生的细胞, 从而过滤每个 uc 均质。
请注意:这个过程每个大约需要 15分钟, 因为消化的 uc 解决方案是粘性的。 - 以 1, 000 x g 离心两管5分钟。
- 小心地吸气, 并丢弃它。
- 用5毫升培养基在两个管中重新填充细胞颗粒。
- 将细胞悬浮液转移到新的60毫米板中, 并在37°c 下在 5% co2 孵化器中培养 (参见图 1, 步骤 3).
-
培养 uc-mscs。
- 将 pbs、色氨酸 edta (0.25 w%) 和培养基 (alpha mem 包含 10% fbs 和 1% aa) 加热到 rt。
- 当细胞连接到60毫米板上时, 取出培养基, 用5毫升的 pbs 清洗两次, 以清除碎片和红血球。
请注意:连接的细胞通常出现在初始电镀后的 3-5天 (参见图 1, 步骤 4)。 - 每周更换两次培养基, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育至 90%至 100%-100% 融合。
请注意:这通常需要7-14 的初始电镀后。 - 用5毫升的 pbs 清洗细胞两次, 加入 0.5 ml 的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育5-10。
- 当细胞变得圆形和分离时, 加入9毫升培养基, 很好地混合以灭活胰蛋白酶。
- 将细胞悬浮液转移到新的100毫米板中, 并在37°c 下在5% 的 co2 孵化器中培养 (参见图 1, 步骤 5)。
- 每周更换两次培养基, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育至 90%至 100%-100% 融合。
请注意:这通常需要4-8 的初始电镀后。 - 用10毫升的 pbs 清洗细胞两次, 加入1毫升的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育5-10。
- 当细胞变得圆形和分离时, 加入9毫升培养基, 很好地混合以灭活胰蛋白酶。
- 将细胞悬浮液转移到两个新的100毫米板中, 并在37°c 下在 5% co2 孵化器中培养 (参见图 1, 步骤 5)。
- 重复亚文化 (1: 2 拆分) 直到第十段 (参见图 1, 步骤 5)。
请注意:由于在较不融合条件下培养的细胞往往会达到较早的增殖抑制, 因此, 分裂比例为1:2 的通道细胞很重要。 - 使用第五至第八通道的细胞进行细胞表面标记分析、细胞分化分析和其他实验。
请注意:为了尽可能长时间地保持旺盛的增殖, 细胞一般在 7 0%-8 0% 以上的融合条件下培养。
2. uc-mscs 的表面标记表达
- 在100毫米的板中制备细胞, 并在37°c 下用1毫升的色氨酸 edta 分离5-10。
- 加入9毫升培养基, 离心机以 1, 000 x 克的速度加入, 5分钟。
- 吸收上清液并丢弃它。
- 以 1, 000 x g 的速度将10毫升 pbs 和离心机的细胞颗粒重新弹回用, 每次 5分钟. 重复此清洗步骤。
- 流式细胞仪 (fcm) 缓冲液 (pbs 含有 2 mm edta 和10% 阻断试剂) 在 ~ 1x106细胞中排斥细胞。
- 将50-100μl 的细胞悬浮液转移到 1.5 ml 管中;加入针对 cd14、cd19、cd34、cd45、cd73、cd90、cd105 或 hla-dr 的植物菊酯 (pe) 共轭抗体;在冰上孵育45分钟
- 用 fcm 缓冲液清洗细胞两次, 并添加50-100μl 的0.2% 活力染料溶液 (见材料表)。
- 在 rt 中提取 15分钟, 用 fcm 缓冲液清洗细胞两次, 并通过70μm 的滤网过滤器过滤细胞。
- 通过 fcm 运行单元, 并根据制造商的说明使用 fcm 软件分析获得的结果。
3. uc-mscs 的三叶草分化
-
进行发育。
- 在培养基中制备细胞悬浮液, 浓度为 5x103 细胞。
- 细胞悬浮液的片板1毫升在12井板中, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育 ~ 24小时。
- 将培养基替换为脂原分化培养基 (见材料表), 并在37°c 时在5% 的 co2 孵化器中孵育 2-3周。每周两次改变脂原分化培养基。
- 用 pbs 清洗细胞三次。
- 在 rt 中将4% 甲醛溶液中的细胞孵化30分钟。
- 用 pbs 清洗细胞三次, 用60% 异丙醇清洗细胞三次。
- 在100% 异丙醇的10毫升中溶解84毫克的油红色 o, 加入6.7 毫升的蒸馏水, 制备0.5% 的油红色 o 溶液。在 rt 中使用 1 ml 0.5% 油红色 o 溶液的染色细胞20分钟。
- 用60% 异丙醇清洗细胞三次, 并在显微镜下显示。
-
进行成骨。
- 在培养基中制备细胞悬浮液, 浓度为 1x104 cellsl。
- 细胞悬浮液的片板1毫升在12井板中, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育 ~ 24小时。
- 用成骨分化培养基取代培养基 (见材料表), 在37°c 时在5% 的 co2 孵化器中孵育 1-2周 。每周两次改变成骨分化介质。
- 用 pbs 清洗细胞三次。
- 在 rt 中将4% 甲醛溶液中的细胞孵化30分钟。
- 用 pbs 清洗细胞三次。
- 用10毫升蒸馏水溶解200毫克的阿利素红色 s, 制备2% 的阿利沙林红色 s 溶液。在 rt 处用1毫升的2% 阿利沙林红色 s 溶液染色细胞3分钟。
- 用 pbs 清洗三次井, 并在显微镜下可视化。
-
进行软骨病。
- 在培养基中制备细胞悬浮液, 浓度为 1.6x107 细胞。
- 将5μl 细胞悬浮液液滴放入12孔板 (微囊培养物) 的井心, 在37°c 的 5% co2 孵化器中孵育 2-3小时.
- 轻轻加入1毫升的软骨分化培养基 (见材料表), 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育 4-7.每周两次改变软骨基因分化培养基。
- 用 pbs 清洗细胞三次。
- 在 rt 中将4% 甲醛溶液中的细胞孵化30分钟。
- 用 pbs 清洗细胞三次。
- 通过溶解250毫克的甲苯胺蓝与500毫升 0.1 m 醋酸钠缓冲液, ph 4.1, 制备0.05% 的甲苯胺蓝溶液。在 rt 处用1毫升0.05% 的甲苯胺蓝色溶液染色细胞30分钟。
- 用 pbs 清洗细胞三次, 并在显微镜下可视化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图 1总结了从 uc 集合到 msc 区域性的过程。大约5-10 厘米长的 uc 可以从所有新生儿剖宫产中收集。uc 开始发展在4-8 的妊娠, 并继续增长, 直到50-60 厘米的长度, 如图 2所示。uc 中有两条动脉 (a)、一条静脉 (v)、脐带衬里 (cl) 和沃顿果冻 (wj), 如图 3和图 4所示。uc-mscs 可以从所有电源线区域或整个电源线 13中隔离。由于早期妊娠年龄婴儿的 uc 是脆弱的, 难以分割成一个单一的脐带区域, 因此从整个脐带11,12中分离出 uc-mscs。从 uc 中分离骨髓间充质干细胞的方法有几种, 其中包括外植体法14和酶消化法15, 以及它们的衍生物16。由于培养周期较长, 产量较低, 早期的增殖抑制与外植体方法17,18, uc-mscs 是通过酶消化法培养, 如图 5所示, 图6。
isct 确定了定义骨髓间充质干细胞的最低标准, 并包括其表面标记特性19。为了确定表面标记的表达, 早产儿和足月婴儿的 uc-mscs 用适当的 pe 共轭抗体孵育, 并通过流式细胞仪进行分析。它们对 msc 特征标记 (cd73、cd90、cd105) 呈阳性, 但对单核细胞巨噬细胞 (cd14)、内皮细胞 (cd34)、造血 (cd19、cd45) 和主要组织相容性复合体 (hla-dr) 标志物呈阴性反应, 如图 7所示。
根据 isct 标准19, msc 必须具有经三系分化法评估的中胚层分化能力。为了评价三系分化能力, 在标准的体外分化条件下, 诱导早产儿和足月婴儿的 uc-mscs 分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。如图 8所示, 它们被很好地分化为所有三种类型的中胚层细胞。
图 1: uc-mscs 的隔离和培养示意图.步骤1。5-10 厘米的 uc 无菌地从胎盘组织中收集。步骤2。纯化酶消融消化 uc 片。步骤3。在 5% co2 孵化器中37°c 时培养 uc-mscs 。步骤4。连接的 uc-mscs 在初始电镀后3天出现。第5步。uc-mscs 的亚培养. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 不同胎龄分娩的 uc.显示妊娠19-38周时胎儿婴儿的 uc。uc 的大小随着胎龄的增加而增加。刻度条 = 8 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 早产儿和足月婴儿对 uc 的部分看法.uc 有两个动脉 (a), 一个静脉 (v), 脐带衬里 (cl) 和沃顿果冻 (wj) 在 uc 从早产儿和足月婴儿。这些组织的大小随年龄的变化而变化。刻度条 = 2 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: uc 的解剖.(a) 从足月婴儿5厘米的 uc。(b) uc 的横截面。(c) 部分解剖的 uc。有两条动脉 (a), 一种静脉 (v), 脐带衬里 (cl) 和沃顿果冻 (wj)。早期妊娠年龄婴儿的 u c 特别脆弱, 难以解剖。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: uc 解剖使用纯化的酶混合物.(a) 5-10 厘米的 uc。(b) 2-3 毫米的 uc 件。(c) 纯化酶的混合消化 uc 片。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 早产儿和足月婴儿的 uc-mscs 形态.(a和e) 取代培养基前1号段 (p1) 的 uc-mscs (a:x40;e:x200)。(b和f) 取代培养基后 p1 的 uc-msc (b:x40;f:x200)。(c和g) p3 处的 uc-mscs (c:x40;g:x200)。(d和h) p5 的 uc-mscs (d:x40;h:x200)。刻度条 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 早产儿和足月婴儿 uc-mscs 的表面标记表达.在早产儿 (怀孕 22周) 和足月 (妊娠 37周) 的 uc-mscs 中都发现了 cd95 阳性和 cd14/cd19/cd34/cd34/hlaha-dr-nisc 中的阴性表型。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8* umc-mscs 与早产儿和足月婴儿的三内神经间充质分化.早产儿 (妊娠 22周) 和足月 (妊娠 37周) 的 uc-mscs 被分化为脂肪细胞 (由油红色 o 可视化)、骨细胞 (可视化的由 alizarin 红色 s) 和软骨细胞 (视为甲二胺蓝)。图像拍摄于200xx。刻度柱 = 50μm。这一数字的一部分已从岩谷等人的报告中改编。请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
骨髓间充质干细胞可以从各种组织中分离出来, 并且是异质性的细胞群, 并不都表达相同的表型标记。在这里, 我们概述了一个协议, 指导从早产儿和足月婴儿的收集和解剖 uc, 并实现 pc-mscs 的隔离和培养。根据该协议, 我们成功地从妊娠19-40周的胎儿婴儿中分离出符合 isct 标准的uc-msc, 并证明它们代表了难治性疾病病理生理学的某些方面在产前发展期间 11,12。
在骨髓间充质干细胞 (bm-mscs) 中, 年轻的捐助方来源的骨髓间充质干细胞通常比年长的捐助者相比表现出更大的增殖和分化潜力, 并具有更多的细胞治疗潜力 20,21。同样, 据报告, 与从第37-40周妊娠22周出生的新生儿中分离出的长期 uc-mscs 相比, 从妊娠8-12 中止的胎儿中分离出的肠内肠间充质干细胞表现出更强烈的增殖和分化。尽管在胎龄和脐带区域存在差异, 但与长期的 mc-mscs 12 相比, 使用该协议隔离的 uc-mscs 也显示出更强劲的长期 uc-mscs的增殖。
该协议中的一个关键步骤是 uc 解剖与纯化酶共混物, 由胶原酶 i 和 ii 和溶解酶组成。正如代表性结果中所概述的, uc 的刚度随胎龄的变化而急剧变化 (图 2)。为了实现 uc 的最佳解剖, 纯化酶共混物的培养时间需要根据个别 uc 的刚度进行调整。一般来说, 与长期 u c 相比, 长期 u c 通常需要更长的时间。在现有的将骨髓间充质干细胞与 uc 分离的方法中, 我们选择了酶消化法15而不是外植体法14 , 这可能导致培养周期延长、产量较低、早期增殖抑制 17,18.酶消化法的一个重要改进是使用纯化的酶混合物, 而不是传统的胶原酶, 这使得一个有效和一致的解剖 uc 从胎儿/婴儿与可变胎龄。
此协议的一个限制是使用整个电源线将 mscs 与 uc 隔离开来。由于 uc-mscs 可以从所有电源线区域或整个电源线13 中分离, 因此在本协议中, uc-mscs 与整个电源线分离。这是由于 uc 从早产儿中解剖的可行性。然而, 每个电源线区域的比例的潜在变化可能会限制该协议隔离的 uc-mscs 之间的严格比较。
uc-mscs 正越来越多地被用作临床前和临床研究8、9 的间充质间质细胞的来源。尽管使用增加, 但仍未就 uc-mscs 隔离方法达成共识, 这可能导致不同的细胞群被视为相同的 uc-mscs。该协议最终将帮助研究人员更好地了解 uc-mscs 的衍生和功能特性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 jps kakenhi 的援助赠款 (c) (赠款编号: 25461644) 和青年科学家 (b) (赠款编号: 15k1914、2686045、17k16 298) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60 mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
