En exosome er en ny generasjon av stoffet levering bærere. Vi etablert en exosome isolasjon protokoll med høy kapasitet og renhet for siRNA levering. Vi innkapslet fluorescently merket uspesifisert siRNA i exosomes og undersøkt mobilnettet opptaket av siRNA lastet exosomes i kreftcellene.
Ekstracellulære blemmer, i bestemte exosomes, har nylig fått interesse som roman stoff levering vektorer deres biologiske opphavet, overflod og iboende evne i intercellulære levering av ulike biomolecules. Dette arbeidet etablerer en isolasjon protokoll for å oppnå høy kapasitet og høy renhet av exosomes for siRNA levering. Menneskelige embryonale nyreceller (HEK-293 celler) er kultivert i bioreactor flasker og kultur supernatant (heretter referert til som betinget medium) er høstet ukentlig å tillate anriking av HEK-293 exosomes. Betinget mediet (CM) er pre-klarert av døde celler og mobilnettet rusk av differensial sentrifugering og er utsatt for ultracentrifugation på en sukrose pute etterfulgt av en vask trinnet å samle exosomes. Isolerte HEK-293 exosomes kjennetegnes avkastning, morfologi og exosomal markør uttrykk av hydrogenion sporing analyse, protein kvantifisering, elektronmikroskop og flowcytometri, henholdsvis. Lite forstyrrende RNA (siRNA), fluorescently merket med Atto655, lastes inn i exosomes av electroporation og overflødig siRNA fjernes av gel filtrering. Cellen opptak i PANC-1 kreftceller, etter 24-timers inkubasjon ved 37 ° C, bekreftes av flowcytometri. HEK-293 exosomes er 107.0 ± 8.2 nm i diameter. Exosome yield og partikkel-til-protein forholdet (P:P) forholdet er 6.99 ± 0.22 × 1012 partikkel/mL og 8.3 ± 1.7 × 1010 partikkel/µg, henholdsvis. Innkapsling effektiviteten av siRNA i exosomes er ~ 10-20%. Førti prosent av cellene viser positive signaler for Atto655 på 24 h etter inkubasjon. Avslutningsvis tilbyr exosome isolasjon av ultracentrifugation på sukrose pute en kombinasjon av god avkastning og renhet. siRNA kan være er lastet inn i exosomes av electroporation og leverte senere i kreftceller i vitro. Denne protokollen gir en standard prosedyre for å utvikle siRNA lastet exosomes for effektiv levering til kreftceller.
Exosomes er en undertype av ekstracellulære blemmer (EV) fra 50-200 nm i diameter, skilles ut av ulike celletyper som immunceller1,2, kreft celler3,4,5, 6 og stamceller7. Exosomes har også vist seg å være til stede i ulike fysiologiske væsker8,9,10,11. Kombinasjonen av iboende evne til exosomes å bære ulike biomolecules (f.eks RNA og proteiner)12,13,14 og effektiv levering av disse biomolecules i mottakerens celler 15 , 16 , 17 tiltrukket interesse for sitt potensial som nano-skala stoffet levering vektorer. Ulike små molekyler som tjene som anti-kreft og anti-inflammatorisk narkotika er vist for å være er lastet inn i exosomes og levert til målet celler18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. interessant nukleinsyrer som siRNA28,29 og microRNA30 har også vært er lastet inn i exosomes via electroporation og leveres til målcellene.
Nylig har RNA forstyrrelser (RNAi) via lite forstyrrende RNA (siRNA) fått mer interesse som foretrukket mekanismen i genet silencing dens høy spesifisitet, potente effekt, minimale bivirkninger og enkel siRNA syntese28, 29. siRNAs er double-strandet RNA molekyler, fra 19 til 25 nukleotider i lengde som utløser sekvens-spesifikke katalytisk mRNA knockdown. Sin store molekylvekt og polyanionic natur er passiv opptak av nakne siRNA i cellene hindret28,29. Det er heller ikke mulig for naken siRNA skal injiseres i systemisk sirkulasjonen på grunn av rask nedbrytning av plasma nucleases31. Dermed ville innkapsling av siRNA i en nanocarrier hjelpe effektiv levering og opptak av siRNA i målcellene.
Exosomes er et ideelt system for siRNA innkapsling strukturen består av en hul, vandig kjerne innhyllet i en phospholipid bilayer. Exosomes ikke bare har god stabilitet i blodet, men har også naturlige målretting egenskaper å levere funksjonelle RNA i celler32. Studien utført av Alvarez-Erviti et al. vellykket demonstrert effektiv levering av siRNA til hjernen til mus bruker utviklet exosomes med nesten ingen komplikasjoner31. Det er en teori om at exosome-basert terapi er relativt tryggere enn andre terapier som exosomes ikke repliseres endogenously som celler og derfor ikke vise egenskaper for metastatisk15.
Ulike metoder har blitt rapportert å med hell isolere exosomes fra cellekultur eller fysiologiske væsker. Den mest populære metoden bruker ultracentrifugation for å pellets exosomes den starter materiale31,32,33. Denne metoden kan være ganske harde på exosomes og vanligvis co precipitates proteiner fra utvalget. Kombinere ultracentrifugation med en tetthet-baserte separasjon som sukrose graderinger blir mer vanlig, redusere protein og ikke-exosomal forurensning i de isolerte exosomes19,34. Størrelse-utestenging kromatografi (SEC) gir utskillelse av exosomes fra andre typer ekstracellulære blemmer (EV) etter størrelse og kan også føre til minimal protein forurensning men begrenses lite starter materiale det kan behandle35, 36. Immunoaffinity fange bruker perler belagt med antistoffer som binder til exosomal overflaten proteiner som tetraspanins eller andre celle-spesifikk markør som lar bestemt erobringen av exosomes i stedet for EVs eller andre proteiner, i tillegg til å isolere sub-populasjon av exosomes fra hele eksempler, men igjen er begrenset av mengden starter materiale og er kostbare36,37. Polymer-baserte utfelling av exosomes pleide å være populære også, men siden det er en ganske grov nedbør, det fører til en høyere ikke-exosomal vesicle og protein forurensning38,39.
Electroporation er rapportert for dens ineffektivitet som en metode for å laste exosomes med siRNA på grunn av protein aggregering15,28,31. Hva tilnærminger ble vist for å ha bedre lasting effektivitet og protein stabilitet, men er uønsket pga toksisitet og bivirkninger av hva agenter i endre mobilnettet gene expression28. Dermed har electroporation blitt mer brukt i siRNA lastes inn i exosomes som det er en sikrere metode. Imidlertid må en optimalisert innkapslingsmetode etableres for å levere tilstrekkelige mengder siRNA til målområdet for en potent genet knockdown.
Her foreslår vi en exosome isolasjon protokollen bruker tetthet-baserte ultracentrifugation på bare en enkelt 25% (w/w) sukrose pute i deuterium oksid, i stedet for sukrose tetthet gradering. Dette er en kostnadseffektiv metode som omgår arbeidskrevende tetthet gradert utarbeidelse og tillater behandling av store mengder starter materiale, men resulterer i intakt exosomes av høy avkastning og renhet egnet for påfølgende lasting med siRNA. Fluorescerende Atto655-konjugerte uspesifisert siRNA ble lagt inn menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293 celler) avledet exosomes via electroporation og levert til menneskelig bukspyttkjertelen adenocarcinoma (PANC-1) kreftceller i vitro.
Få en anstendig exosome avkastning fra kulturperler celler, er som er nok for flere runder i vitro eller i vivo studier, fortsatt en utfordring. Ifølge produsenten, var bioreactor kolber ment for produksjon av antistoffer og proteiner med høy kapasitet fra kultur av ulike udødeliggjort linjer. Dette gjør at cellene å kontinuerlig berike kultur medium med det ønskede produktet, noe som resulterer i en konsentrert betinget medium (CM) i celle-rommet. Teoretisk sett, det samme konseptet vil være nyttig exosome produksjon fra ulike linjer, og faktisk dyrking disse cellene i de bioreactor flasker ble demonstrert å betydelig øke exosome avkastning40. Store middels reservoaret kontinuerlig leverer næringsstoffer til og fjerner avfallsstoffer fra cellen rommet gjennom en 10 kDa halvt gjennomtrengelig membran, slik at langvarig kultur uten store mengder middels være i kontakt med cellene eller vanlige kolber endring, som til slutt kan lagre den totale kostnaden og arbeid av høy-skala exosome produksjon40. Det ble også demonstrert at morfologi, fenotype, samt immunmodulerende funksjoner exosomes isolert celler langsiktige bioreactor kolber kulturer er lik som fra celler kultivert i vanlig 75 cm2 flasker40. Kultur for andre udødeliggjort linjer som exosome kilder i bioreactor flasken vil derfor bidra til å øke deres exosome utbytte mens deres integritet og funksjon. Denne formen for kultur er imidlertid ikke gjelder primære celler med begrenset divisjon sykluser, og de som ikke kan kultivert i høy tetthet.
Siden av CM er gjort ukentlig, og cellene i kultur var aldri passaged, kan det antas at cellene i bioreactor kolbe ikke vokser i en monolayer som vanlig cellekultur. De er mest sannsynlig å danne klynger med nekrotisk sentre, eller bare koble fra overflaten og dø når cellene er for confluent for en monolayer. Visuell inspeksjon av cellen kupé av bioreactor kolbe er ikke mulig å bekrefte denne antakelsen, men gjenspeiles av det store antallet døde celler fikk under CM høsting. Vanlig fjerning av dårlig tilhenger og ikke-levedyktige celler fra bioreactor kolbe kan hindre oppbygging av materiale på den halvt gjennomtrengelig membranen som kan påvirke utveksling av gass, næringsstoffer og avfall mellom cellen rommet og medium reservoaret slik at langvarig kultur i bioreactor flasker for > 6 måneder40. I denne sammenheng, denne ikke-regularitet av cellevekst i bioreactor flasker er ideelt som vi spekulere at det etterligner den faktiske tilstanden til tumor vekst i vivo tettere enn konvensjonelle monolayer cellekultur, og håpet er at exosomes produsert av kreft celler i bioreactor kolbe ville være mer lik som skilles ut av svulster i vivo. Dette vil være spesielt nyttige i studier ser på rollen svulst-avledet exosomes i utviklingen av svulst patologi. Svulst-avledet exosomes har blitt rapportert til bunn og fortrinnsvis hjem til deres vev av opprinnelse32, derfor ha exosomes produsert i et system etterligne sine i vivo produksjon ville også være ønskelig i studier ser på utforske passiv målretting evne til exosomes som narkotika nanocarriers.
P:P forholdet ble rapportert som en parameter å vurdere renheten av isolerte exosomes fra forurensende proteiner fra kultur medium med fysiologiske væske som exosomes ble Hentet fra41. P:P forholdet mellom 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg innhentet i denne studien ligger innenfor høy renhetsgrad foreslått i studien. Dette forholdet understreker faren for å bruke protein konsentrasjon for å uttrykke kapasitet eller dose exosomes isolert eller brukes i nedstrøms studier, som dette ikke gjenspeiler den virkelige mengden av exosomes tilgjengelig i av prøven problemet protein forurensning under isolasjon. NTA via instrumenter som NanoSight, som måler konsentrasjonen av exosomes i partikkel tall, er en mer fornuftig og nøyaktig måte å kvantifisere exosomes.
Svært nøyaktig veiing under utarbeidelsen av 25% sukrose løsningen i deuterium oksid er avgjørende som denne metoden er en tetthet-baserte isolasjon. Exosomes har en ganske smal rekke flotasjon tetthet i sucrose løsning så nøyaktig utarbeidelse av sukrose puten vil redusere forurensning av ikke-exosomal blemmer som apoptotisk organer eller Golgi-avledet blemmer under isolasjon42. Det anbefales ikke å holde leftover sucrose løsning og bruke den selv etter en dag for å unngå risikoen for faktorer som kan endre tettheten som tap eller tilsetting av vann i løsningen av fordampning eller kondens luft i røret. Bruk av en swing-out rotoren er også avgjørende under sentrifugering på sukrose pute å tillate selv overføring av exosomes fra CM til sucrose løsning.
Uttak sucrose løsning etter sentrifugering er også et delikat skritt, og det innebærer å finne et kompromiss mellom maksimere mengden exosomes gjenopprettet, og ikke for mye at protein fra kultur medium er introdusert til exosome prøven trukket tilbake . Grensesnittet mellom sucrose løsning og tilstand medium er der proteiner fra kultur medium ville samle etter sentrifugering, og kan vanligvis sees som en mørk brun ring som sitter på grensesnittet. I våre hender er uttak 2 mL sukrose pute fra den første 3 mL lagt optimal volumet enig med kompromiss nevnt ovenfor. Volumer som er beskrevet i denne protokollen er for spesifikke rotorene brukes; Derfor anbefales det å optimalisere volumet av sukrose å trekkes ved skalering opp eller ned volumene for de rotorer tilgjengelig i forskjellige fasiliteter. Det er også viktig å unngå område rett i midten av bunnen av røret når uttak sukrose, da dette er der partikler av høyere tetthet enn sukrose sedimenter og kan vanligvis bli sett på som et off-white pellets.
Vask trinnet med en relativt stor mengde PBS bidrar til å redusere graden av protein forurensning under exosome isolasjon41. Dette trinnet er også viktig å fjerne overflødig sukrose fra exosomes for å unngå osmotisk skade exosomes seg selv eller biomolecules i exosomal-lumen, i tillegg til å redusere risikoen for bakteriell og/eller sopp vekst i exosome lager. Forbereder sukrose løsningen i deuterium oksid i stedet for vann bidrar til å redusere mengden av sukrose måtte oppnå exosome flotasjon tettheten for isolering, dermed redusere risikoen for både osmotisk skade og mikrobiell forurensning. Etter den første sentrifugering på sukrose pute, den exosome inneholder sukrose lag trukket og lagt til PBS kan lagres på 4 ° C og behandles dagen hvis overfor tidspress.
Til best av vår kunnskap er exosome/siRNA molar forholdet en viktig faktor i å avgjøre effektiviteten av electroporation. I denne protokollen brukte vi 1:60 som exosome siRNA molar forhold. Som innkapsling evnen til ulike typer exosomes er forskjellige, foreslår vi sterkt dette optimaliseres på et sak-til-sak grunnlag. Men kan innkapsling effektiviteten foreslått her alltid være en parameter for å velge den optimale electroporation forhold.
I tillegg antas samling av siRNA å være en av de fleste vanlig problem i electroporation. Det er bevist at electroporation kan indusere sterk samling av siRNA, noe som gjør det enda vanskeligere å angi exosomes. siRNA samlinger blir ofte feilaktig tolket som innkapsling av siRNA i exosome derfor riktig kontroller ble brukt i denne studien som dannelsen av siRNA aggregater er uunngåelig under electroporation28. Prosentandel innkapsling effektiviteten av våre rensing metoden ble beregnet ved normaliserte verdier for å minimalisere påvirkning fra andre kilder som bakgrunn støy, exosome og siRNA samlinger som vil påvirke datapålitelighet. Basert på våre funn, var det ubetydelig siRNA samlinger i på kontroll prøven dvs. bruke electroporated og FN-electroporated siRNA.
Denne protokollen har vist innkapsling av siRNA i exosomes og deres påfølgende intracellulær levering av siRNA til kreft celler i vitro. Ulike typer exosomes fra forskjellige linjer kan derfor være isolert preget med foreslåtte protokollen, og deretter lastet med forskjellige terapeutiske siRNA for ulike typer kreftfremkallende mål over uttrykt i ulike kreftformer. Et interessant program som vil være å utforske siRNA levering og opptak effektiviteten ved hjelp av forskjellige permutasjoner av exosome kilde-målet cellen par i vitro. Dette kan deretter oversettes til dyr modeller for å vurdere effektiviteten av både leveransen og effektivitet av siRNA-kapslet exosomes i vivo.
The authors have nothing to disclose.
F. N. Faruqu er finansiert av den malaysiske regjering agency Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu er en mottaker av Marie Sklodowska-Curie individuelle stipend (horisonten 2020) (H2020-MSCA-hvis-2016). K. T. Al-Jamal erkjenner finansiering fra BBSRC (BB/J008656/1) og Wellcome Trust (WT103913). Forfatterne vil også gjerne takke Dr. Paul Lavender og Dr David Fear (Institutt for åndedretts indremedisin og allergi, King’s College London) for å gi electroporator.
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |