在这里, 我们提出了一个最近开发的蛋白酶分析平台的详细程序, 利用 n-端六利三烷基-马氏体结合蛋白和荧光蛋白融合重组基板附着在镍硝基三乙酸表面酸性磁性琼脂糖珠。并对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的测定样品进行了凝胶分析。
蛋白酶由于其在生物的几种生物学途径和发病机制中的重要作用而被密集地研究酶;因此, 它们是重要的药物靶点。我们开发了一个基于磁性琼脂-珠的检测平台, 用于研究蛋白溶解活性, 该平台是基于重组融合蛋白底物的使用。为了证明该检测系统的使用, 本文以人体免疫缺陷病毒1型 (hiv-1) 蛋白酶为例, 提出了一个协议。所介绍的检测平台可有效地用于蛋白酶的生化表征, 包括诱变、动力学、抑制或特异性研究中的酶活性测量, 可适用于高通量底物筛选或可适应其他蛋白水解酶。
在此检测系统中, 应用底物中含有 n-末端六角蛋白 (他的 6) 和麦芽结合蛋白 (mbp) 标记、烟草蚀刻病毒 (tev) 和 hiv-1 蛋白酶的裂解位点以及 c-末端荧光蛋白。在大肠杆菌细胞中有效地生产基板, 并可使用镍 (ni)-螯合物涂层珠进行纯化。在测定过程中, 含珠基板的蛋白水解裂解会导致荧光裂解片段的释放, 这些碎片可以通过荧光法测量。此外, 可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 对裂解反应进行分析。还描述了一种检测成分的凝胶内再生方案, 因为荧光蛋白的部分再生使其能够基于分子量和荧光进行检测。
蛋白质水解酶属于最密集的研究酶组, 因为它们在代谢途径和工业应用中也很重要。它们在病毒性疾病、凝血调节、癌症、心血管和神经退行性疾病中的关键作用, 使蛋白酶成为药物发现领域的突出目标。因此, 对所关注的蛋白酶 (pr) 的底物特异性的详细表征和抑制剂分析至关重要, 最好是通过快速、经济高效和坚固的生化检测1,2来完成, (三)有什么问题吗?
目前, 绝大多数应用于药物发现领域的复合分析的体外蛋白酶检测都是均匀的、基于荧光肽的、高通量筛选 (hts) 兼容的平台4。此外, 标记肽不仅适用于图书馆筛选, 而且为确定选定基板上的酶动力学参数提供了很好的工具。在其他情况下, 在无法标记基板的情况下, 基于分离的检测可以提供一种可能的解决方案来评估蛋白溶解反应3的动力学特性。
一般来说, 体外蛋白酶检测是基于两种类型的底物的使用: 短肽或整个蛋白质。在这些情况下, 如果短肽序列的裂解充分反映了裂解特性, 则适用以下标准方法: (i) 检查标准蛋白质底物, 如氧化胰岛素 b 链, (ii) 测试市售的其他蛋白酶的底物, (iii) 筛选由组合化学产生的合成和荧光标记的肽文库, 或 (iv) 使用遗传方法, 例如生物显示技术 5, 6。除了传统的分类外, 还可以使用其他新的平台来生成底物 (例如, 蛋白质衍生肽文库的形成7或特殊的遗传方法亚型, 如重组融合)基于蛋白质的底物8,9,10,11,12)。
上述各种基板和检测方法都有其各自的优势和局限性, 目前仍需要开发结合和改进已知平台优势的检测格式。在这里, 我们描述了一种基于分离的荧光蛋白酶检测协议, 该协议利用重组底物。这些融合蛋白由他的6和 mbp 标记融合到一个控制裂解位点的 tev pr, 其次是与 c 末端荧光蛋白 (fp) 直接连接的基板感兴趣的序列 (图 1a)。在 “克隆盒” 中, 可以通过对表达质粒的单一结扎反应来克隆感兴趣的裂解位点的 dna 序列编码, 而此前, 质粒已经通过限制性内切酶进行了线性化。
图 1:荧光蛋白酶测定的原理.(a) 显示了人体免疫缺陷病毒1型 (hiv-1) 蛋白酶对荧光底物及其裂解的示意图。箭头表示 hiv-1 蛋白酶 (vsqny * pivq) 的基质/衣壳裂解位点序列内的裂解位置。(b) 如工作流程图所示, 荧光基板可用于分析基于 ni-nta 磁珠的分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳的酶反应。请点击这里查看此图的较大版本.
尽管使用类似的重组蛋白亚层进行的蛋白质溶解检测–含有亲和性标签、蛋白溶解裂解位点和荧光蛋白–已经被描述为8,9,10, 该系统这里提出的打算整合和改进这些方法的优势。一个重要的区别是, 该检测平台中的融合蛋白底物配备 mbp, 以提高蛋白质溶解度13 , 并包含一个控制裂解位点的 tev prr。此外, 基板含有新一代荧光蛋白, 这些蛋白质具有高度稳定和单体形式, 以防止基板聚集。除了先前公布的 mTurquoise2 和 mTurquoise2 融合表14的应用外, 我们还展示了使用含有单分子增强黄色荧光蛋白 (m界定) 荧光标记的重组底物所给出的结果。在此, 我们证明了该系统与其他荧光蛋白的兼容性, 并代表了一些一般类型的结果, 可以通过蛋白酶检测获得。
重组融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3) 细胞中表达, 并以镍-硝基三乙酸 (ni-nta) 包覆磁琼脂-珠附着形式作为检测的底物。c 端裂解产物通过感兴趣的蛋白酶从珠子表面释放到上清液中。从磁珠中分离上清液 (含酶和裂解产物) 后, 可以测量荧光, 以确定酶的裂解特性。与前面描述的方法不同, 在这里介绍的系统中, 基板和 c 端裂解产品的数量是根据详细的基板校准过程进行唯一量化的。通过对检测样品的 sds-page 分析, 可以支持该检测系统;随后的荧光凝胶可视化可在电泳后或非变性荧光组分的凝胶再生后立即应用, 分别为 14。
“克隆盒式磁带” 的灵活性和结构允许在结构中插入各种序列的时间和经济高效的方式, 从而促进基板库的生成。由于所有的检测步骤都是自动和 hts 兼容的, 该系统可以特别吸引, 例如, 蛋白酶特异性测量和诱变研究, 也可以有效地用于工业蛋白酶抑制剂筛选和抗病毒药物的发展, 以及。
酶动力学参数 (k猫, km)可以通过所开发的基于分离的分析来确定;因此, 它可能适合进行单独的酶动力学测量, 如时间过程, 底物依赖, 和抑制研究。这证明重组融合蛋白底物为常用的合成寡肽底物提供了很好的替代品, 由于它们与多蛋白底物的高度相似性, 它们代表了自然发生的物质。更准确地进行酶-底物相互作用。
由于对蛋白水解酶进行了密集的工业和学术研究, 并不断需要相应快速且负担得起的与 hts 兼容的蛋白酶检测平台, 我们开发了一种基于磁珠的荧光蛋白酶测定。该检测方法是基于重组融合蛋白的使用, 可以是广泛使用的合成肽底物的新替代品。
在已发展的检测格式中, 融合蛋白底物被固定在镍螯合磁性琼脂糖珠的表面上。基板附件由 n 端提供他的核聚变蛋白的6个亲和标记, 直接融合到 mbp 标记中, 以方便折叠并提高基板13的水溶性.mbp 之后是 tev pr 的裂解位点和感兴趣的蛋白酶。前者可作为检测中的控制裂解位点, 而后者则可通过蛋白酶进行处理进行研究。裂解部位是可互换的;可将感兴趣的裂解位点的短 dsdna 序列编码插入表达质粒的柔性 “克隆盒” 中。重组融合蛋白在 c 端含有高度稳定的单体荧光蛋白标记, 从而能够检测到在蛋白溶解裂解释放的酶释放、荧光 c 端裂解产物的端点。图 1a)。在不同缓冲液中求解的纯化荧光完整基板也用于校准, 以评估基板和裂解产物的摩尔浓度。此外, 在荧光测定后, 也可以通过 sds-page 对检测成分进行分析。原生 (非变性) 和变性荧光蛋白都可以在凝胶中显示, 在电泳后或随后的凝胶再生后, 分别。这种额外的过程与传统的库马西明亮的蓝色污渍相结合, 可以有效地用于验证检测结果 (图 1b)。
检测过程包括简单、易于执行的低容量格式步骤, 这些步骤可以完全适应高通量自动环境。然而, 独立于手动或使用自动化系统进行检测, 检测的以下部分被认为是至关重要的, 在执行过程时需要特别注意。i)磁珠溶液的均匀性.在整个检测过程中, 无论是在净化还是清洗步骤中, 都必须使用均匀的磁珠溶液。特别是蛋白酶检测的可靠性在很大程度上取决于对附底磁珠 (samb) 库存溶液的正确引用。为了提高悬浮液和分散的有效性, 建议将珠子浓度设置在2% 至 10% (v/v) 之间。在样品制备过程中, 使用补充非离子洗涤剂 (如 triton x-100 或 tween 20) 的缓冲液, 最高可达 2%, 也可能会降低磁珠与塑料表面的粘附。如果将珠子悬浮液小心地涂在小瓶的底部, 而不是涂在样品管的壁上, 则可以避免珠子粘附在样品瓶的壁上。磁珠在酶反应过程中的均匀性也是至关重要的, 在孵育过程中, 磁珠以600转/分的速度连续晃动样品, 可以确保磁珠的均匀性。珠子被适当地分散在圆形或平底塑料制品中, 而不建议使用 v 底小瓶。图 4b中表示了由不正确的珠子均质引起的次优结果。ii) 反应样品的终止。 该方法的另一个优点是, 酶反应可以终止, 而不使用热变性处理或任何潜在的干扰化学剂15。通过使用传统的磁粉集中器, 只需将磁珠与反应混合物分离即可实现端接。当去除的反应缓冲液中含有活性酶和产生的 c 末端荧光裂解产物时, 未裂解的底物仍然附着在珠子上。由于反应缓冲液中存在活性酶, 因此需要仔细执行分离过程, 以进行可靠的端点检测。在将样品瓶放入集中器之前, 建议采用短旋转离心。将管材放入集中器后, 提供至少15秒的珠子收集。分离器的来回轻微移动可能有助于珠子的收集。请考虑, 在手动执行的分离过程中, 终止通常比开始反应需要更多的时间。因此, 如果需要将相同的孵育时间应用于所有样品, 则建议在启动之间延迟约2分钟。
所述蛋白溶解法的原理相对简单;然而, 该系统的多功能性是由灵活和稳定的基板结构保证。只有通过亲和性珠子与应用条件、试剂和添加剂的相容性, 才能限制检测的个别优化。根据制造商的协议, 我们还发现, 基板与 ni-nta 珠子表面的亲和力结合在 ph ≤6.515 时显著减弱。因此, 建议将基板空白样品与反应样品平行应用, 在评价结果时需要考虑基板的自发离解率。
在这种情况下, 由于使用了与珠子不兼容的成分或 ph 值较低, 无法进行磁珠基检测, 因此也可以应用纯化后的重组基板的溶液中消化。在这些情况下, 反应混合物可以通过电泳进行分析, 蛋白质可以根据所述协议在凝胶中可视化。为了研究蛋白质的蛋白质溶解活性, 溶液中的消化和凝胶检测的蛋白质也可能是荧光法的替代工具。设计的基板系统的一个新颖之处在于, 变性 sds-page 后应用凝胶内再生步骤。虽然原生 (非变性) 荧光蛋白在电泳过程中保留荧光, 但在变性时, 荧光性质被废除 (图 7b)。然而, 变性蛋白的荧光可以部分恢复从凝胶中去除 sds。因此, 使用变性条件分离反应成分, 不仅可以进行荧光鉴定, 而且可以识别基于分子量的分子量。与库莫西染色凝胶的分析相比, 荧光凝胶检测的另一个优点是, 根据荧光在凝胶中可以很容易地识别荧光蛋白 (见图 7)。如果在含有非荧光污染物或彼此分子量非常相似的蛋白质的样品中进行裂解反应, 这一点可能很重要。
使用类似设计的底物的蛋白酶检测已经在之前公布了 8,9, 10, 虽然这些情况下感兴趣的裂解位点也位于亲和力标签和荧光蛋白, 这里介绍的检测系统不仅重复了所描述的想法, 而且结合了以前平台的不同优势, 并完成了这些优点与进一步的改进: (i) 使用 mbp 融合合作伙伴, ii)存在一个 tev pr 控制裂解站点, iii) 使用新设计的单体 fp, 和 iv) 应用一个独特的基板校准程序。该检测本身特别设计用于以安全、时间和经济高效的方式进行酶特异性和动力学研究, 而无需昂贵的仪器。该方法旨在成为工业和学术研究目的的适当和负担得起的工具。由于表达质粒的 “克隆盒式” 的灵活性, 该系统可适用于快速、廉价的重组基板库生成。本文所描述的方法是一种可行的工具, 实现底物特异性, 酶诱变, 抑制研究, 也提供了一个替代工具, 执行酶动力学。该检测平台 (从细菌细胞破坏到动力学参数的确定) 可适应基于 hts 和自动化的环境, 并有可能应用于工业蛋白酶抑制剂筛选和/或抗病毒药物发展。此外, 竞争蛋白溶解检测的适应性也在我们实验室的未来范围内。在这种竞争分析中, 两个不同的子层–每个子层都包含与不同的 c 端荧光标记融合在一起的不同裂解部位–打算在同一裂解反应中同时使用, 以研究所研究的偏好给定目标序列的酶。此外, 在半胱氨酸蛋白酶的情况下, 使用一系列具有改良裂解位点序列的底物, 还在优化使用96孔板适应的检测表 (图 8) 进行突变筛选。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了 2.3.2-15-2001-00044 “pharmprot” 合作项目的部分支持, 并得到了匈牙利人的能力部高等教育机构卓越方案的资助。德布森大学生物技术专题项目。提交人感谢逆转录病毒生物化学实验室的成员在检测过程中提供的科学帮助, 并感谢他们在拍摄过程中的耐心 (特别是对 norbert k开发区, krisztina joónématúz 和 vanda toldi,出现在视频的背景中)。作者还要特别感谢 gedeon richter plc., 特别是 zoltán urbányi 博士允许 beáta bozóki 作为客座研究员在生物化学和分子生物学系的工作。提交人还要感谢德布森大学多媒体和电子学习技术中心的 györgy zsadányi、balázs tögyi、balázs pöstényi 和 zoltán király 在音频和视频方面提供的专业协助。生产。
10K Amicon tubes | Merck-Millipore | UFC501096 | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | M6250 | |
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid | Merck | 100063 | |
Agarose | SERVA | 11404.04 | |
Alpha Imager HP gel documentation system | ProteinSimple | ||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A3678 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A9518 | |
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge | Beckman Coulter | 392185 | |
Black half-area plates | Greiner bio-One | 675086 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | B0126 | |
CutSmart buffer (10x) | New England Biolabs | B7204S | For plasmid linearization (step 1.1.1) |
Dark Reader transilluminator | Clare Chemical Research | DR-45M | |
DNase I | New England Biolabs | M0303L | |
Dynamag-2 magnetic particle concentrator | Thermo Fischer Scientific | 12321D | |
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | C600003 | |
Ethanol | Merc-Millipore | 100983 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 798681 | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycerol | Merck | 356350 | |
Glycine | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | G7126 | |
High-Speed Plasmid Mini Kit | GeneAid | PD300 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 56750 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | AM9464 | |
Jouan CR 412 centrifuge | Jouan | CR412 | |
Labinco LD-76 Rotator | Labinco | 7600 | |
Luria-Bertani (LB) broth | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L3022 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L6876 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
MERCK eurolab ultrasonic bath | MERCK | USR54H | |
Millifuge Eppendorf spin centrifuge | Millipore | CT10 | |
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell | Bio-Rad | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T9281 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific | ||
NheI-HF restriction endonuclease | New England Biolabs | R3131L | |
Nickel(II) sulfate (NiSO4) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 656895 | |
Ni-NTA magnetic agarose beads | Qiagen | 36113 | |
Orbital shaker | Biosan | OS-20 | |
PacI restriction endonuclease | New England Biolabs | R0547L | |
PageBlue Protein Staining Solution | Thermo Fischer Scientific | 24620 | |
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P7626 | |
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes | Eppendorf | 22431102 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
Snijders Press-to-Mix shaker | Gemini | 34524 | |
Sodium-acetate trihydrate | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S7670 | |
Sodium-chloride | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S9888 | |
Sodium-hydroxide | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S5881 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fischer Scientific | S7563 | |
T4 DNA ligase | Promega | M180A | |
Thermo shaker | Biosan | TS-100 | with SC-24 accessory block |
Tris | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T1503 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P2287 | |
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter | Wallac Oy, Turku, Finland |