여기, 우리 N 터미널 hexahistidine/맥 아당 의무적인 단백질 및 형광 단백질 융합 재조합 기판 니켈 nitrilotriacetic의 표면에 부착 된 최근에 개발한 효소 분석 플랫폼의 상세한 절차를 제시 산 자기 agarose 구슬입니다. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 분석 결과 샘플의 후속에 젤 분석 또한 제공 됩니다.
프로 테아 제는 생명체의 여러 생물 학적 경로 병 인; 그들의 필수적인 역할 때문에 집중적으로 공부 효소 따라서, 그들은 중요 한 약 대상입니다. 우리는 재조합 융합 단백질 기판의 사용에 따라 분해 활동의 수사에 대 한 분석 결과 자기 agarose 구슬-기반 플랫폼을 개발 했습니다. 이 분석 결과 시스템의 사용을 설명 하기 위해 한 프로토콜은 1 (hiv-1) 효소 인간 면역 결핍 바이러스 종류의 예제에 제공 됩니다. 도입된 분석 결과 플랫폼 프로 테아 제, mutagenesis, 운동, 금지, 또는 구체적 연구, 효소 활동 측정 등의 생 화 확 적인 특성에 효율적으로 이용 될 수 있다 그리고 그것은 높은 처리량에 적합 있을 수 있습니다. 기판 검사 또는 다른 분해 효소에 적용할 수 있습니다.
이 분석 결과 시스템에 적용 된 기판 포함 N 맨끝 hexahistidine (그6)과 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 태그, 담배에 대 한 분열 사이트 엣지 바이러스 (TEV)와 에이즈-1 프로 테아 제, C 터미널 형광 단백질. 기판 대장균 세포에 효율적으로 일어날 수 있다 그리고 니켈 (Ni)-킬레이트-코팅된 비즈를 사용 하 여 쉽게 정화. 분석 결과, 동안 비드 연결 된 기판의 분해 절단 fluorimetry에 의해 측정 될 수 있는 형광 분열 파편의 석방을 이끌어 낸다. 또한, 분열 반응 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석할 수 있습니다. 에 젤 renaturation 분석 결과 구성 요소에 대 한 프로토콜 부분 renaturation 형광 단백질의 분자량 및 형광에 따라 그들의 감지 하면 설명도 되어 있습니다.
분해 효소는 대사 경로 및 산업 어플리케이션에 그들의 중요성 때문에 가장 집중적으로 조사 효소 그룹에 속한다. 바이러스 성 질병에 그들의 중요 한 역할, 혈액 응고, 암의 규칙 및 심장 혈관 및 신경 퇴행 성 질환 약물 발견의 분야에서 저명한 대상 프로 테아 제를 만드는. 따라서, 기질 특이성의 상세한 특성 및 관심의 프로 테아 제 (PR)의 프로 파일링 억제제 중추 이며 선호, 비용 효율, 빠르고 강력한 생 화 확 적인 분석 실험1,2,에 의해 수행 됩니다. 3.
요즘, 복합 프로 파일링에 대 한 신약의 분야에 적용 하는 체 외 효소 분석 실험의 대부분은 균질, 형광 펩타이드 기반 및 높은 처리량 검열 (HTS)-호환 플랫폼4. 또한, 레이블이 지정 된 펩 티 드만 라이브러리 심사, 적합 하지 않습니다 하지만 그들은 또한 선택 된 기판에 운동 매개 변수 효소의 결정에 대 한 훌륭한 도구를 제공. 다른 경우에, 어디는 기판의 라벨은 불가능, 분리 기반 분석 분해 반응3의 운동 특성을 평가 하기 위해 가능한 솔루션을 제공할 수 있습니다.
일반적으로, 체 외 효소 분석 실험 기반 기판의 두 종류의 사용: 짧은 펩 티 드 또는 전체 단백질. 어디 짧은 펩 티 드 순서의 분열 분열 속성을 충분히 반영, 이러한 경우에 다음과 같은 표준 방법을 적용 됩니다: (i) 테스트 산화 된 인슐린 B-체인, (ii) 같은 표준 단백질 기질 검사 조합 화학, 또는 (iv)에 의해 만들어진 합성 하 고 붙일 레이블 펩타이드 라이브러리 심사 다른 프로 테아 제, (iii)의 상용 기판 유전자 방법을 사용 하 여, 예를 들면, 생물학 표시 기술5, 6. 기존의 분류 외 다른 새로운 플랫폼도 있습니다 기판 생성 (예를 들어, 대형 프로테옴 파생 된 펩타이드 라이브러리7 또는 재조합 융합 같은 유전 방법의 특별 한 하위의 단백질 기반 기판8,9,10,,1112).
위에서 언급 한 기판 형식 및 분석 실험의 모두 그들의 자신의 이점 및 한계, 그리고 분석 결과 형식 결합 또는 알려진된 플랫폼의 장점을 향상의 개발은 여전히 수요. 여기 우리는 재조합 형 기질을 이용 하는 형광 효소 분리 기반 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 그의6 과 MBP 태그 TEV 홍보, 뒤에의 C-터미널 형광 단백질 (FP) (그림 1A)에 직접 연결 된 기판 시퀀스의 제어 분열 사이트에 융합이 융해 단백질에 의하여 이루어져 있다. 복제는 ‘복제 카세트’로 관심의 분열 사이트에 대 한 코딩 DNA 순서의 이전 금지 endonucleases 여 선형화 된 식 플라스 미드에 단일 결 찰 반응에 의해 수행할 수 있습니다.
그림 1: 형광 효소 분석 실험의 원리. 프로 테아 제 (A) 형광 기판 및 인간 면역 결핍 바이러스 1 형에 의해 그것의 분열의 도식 표현 (HIV-1) 표시 됩니다. 에이즈-1 효소의 매트릭스/capsid 분열 사이트 시퀀스 내에서 분열 위치를 표시 하는 화살표 (VSQNY * PIVQ). (B)는 형광 기판 분석 하 효소 반응 Ni-NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 의해 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 뿐만 아니라, 워크플로 다이어그램에서와 같이 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
분해 분석 실험 기판-포함 하는 선호도 태그, 분해 분열 사이트 및 형광 단백질이 이미 유사한 재조합 단백질을 사용 하 여 설명 하 고 있지만8,,910, 시스템 제시 여기 통합 하 고이 방법의 장점에 개선 계획 이다. 중요 한 차이점은이 분석 결과 플랫폼 융합 단백질 기질 단백질 용 해도13 강화 TEV PRs에 대 한 제어 분열 사이트를 포함 하는 MBP 갖추고 있습니다. 또한,는 기판 새로운 세대 형광 단백질, 매우 안정 되 고 기판 집계 방지 단위체 양식을 포함 합니다. MTurquoise2 및 mApple 융합 형태14의 이전 게시 된 응용 프로그램, 게다가 여기 우리 또한 표시는 단위체를 포함 하는 재조합 형 기판의 사용에 의해 주어진 결과 향상 노란 형광 성 단백질 (mEYFP) 형광 태그. 이로써 우리 다른 형광 단백질 시스템의 호환성을 보여 하 고 몇 가지 일반적인 유형의 효소 분석 실험에 의해 취득 될 수 있는 결과 나타냅니다.
재조합 융합 단백질 대장균 BL21(DE3) 세포에 표현 되 고 니켈 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) 분석 결과 대 한 기판으로 사용 되는-자기-agarose-구슬-첨부 양식 코팅. C 터미널 분열 제품 관심의 효소에 의해 분열 시 상쾌한에 구슬 표면에서 해방 됩니다. 자석 구슬에서 (포함 하는 효소 분열 제품) 상쾌한 분리 후 형광 효소의 분열 속성 확인을 측정할 수 있습니다. 앞에서 설명한 방법을 달리 여기, 시스템에 기판 및 C 터미널 분열 제품의 양은 유일 하 게 정량 상세한 기판 교정 절차에 따라. 분석 결과 시스템 분석 결과 샘플;의 SDS 페이지 분석에 의해 지원 될 수 있습니다. 후속 형광에 젤 시각화는 전기 이동 법 또는 nondenatured 및 변성 형광 구성 요소, 각각14-젤 renaturation 즉시 적용할 수 있습니다.
유연성과 구조 ‘복제 카세트’의 다양 한 구성으로 시퀀스의 시간 및 비용 효율적인 삽입을 허용 하 고, 따라서 기판 라이브러리의 생성을 촉진. 모든 분석 결과 단계는 자동화 및 HTS 호환, 이후 시스템 매력적 일 수 있다 특히, 예를 들어, 효소 특이성 측정 및 mutagenesis 연구, 또는 그것은 또한 활용 될 수 있습니다 효과적으로 산업 protease 억제제 심사에 대 한 및/또는 항 바이러스 약물 개발입니다.
효소 활동적인 매개 변수 (k고양이, Km) 개발된 분리 기반 분석 결과;에 의해 결정 될 수 있다 따라서, 그것은 적당 한 시간 코스, 기판에 따라 다릅니다, 그리고 억제 연구 등 개별 효소 활동적인 측정을 수행 수 있습니다. 이 자주 활용된 합성 펩타이드 기판에 대 한 좋은 대안을 제공 하는 재조합 융합 단백질 기질 때문에 높은 유사성에 대 한 그들의 polyprotein 기판에, 그들은 자연스럽 게 발생 대표 증명 효소-기질 상호 작용 더 정확 하 게.
분해 효소의 집중 산업 및 학술 조사 및 급속 하 고 저렴 한 HTS 호환 효소 분석 플랫폼에 대 한 일정 한 수요 적절 하 게, 우리가 개발한 자석 구슬-기반 형광 효소 분석 결과입니다. 분석 결과 널리 활용된 합성 펩 티 드 기질에 새로운 대안이 될 수 있는 재조합 융합 단백질의 사용을 기반으로 합니다.
개발된 시험 형식에서 융합 단백질 기판은 Ni 킬레이트 코팅 자석 agarose 구슬의 표면에 움직일 수 있습니다. 기판 첨부 파일 그의6 선호도 태그 직접 접는 촉진 하 고 기판13의 물 가용성을 향상 MBP 태그 융합은 융합 단백질의 N 맨끝에 의해 제공 됩니다. MBP은 TEV PR의 분열 사이트와 관심의 효소에 선행 된다. 전 수 역할 분석 결과에서 제어 분열 사이트 조사를 효소에 의해 처리 될 수 있습니다 후자의. 분열이 사이트는 상호 교환; 관심의 분열 사이트에 대 한 코딩 짧은 dsDNA 시퀀스는 결 찰에 의해 식 플라스 미드의 유연한 ‘복제 카세트’에 삽입할 수 있습니다. 재조합 융합 단백질 효소 해방, 형광 C 터미널 분열 제품 분해 분열 ( 따라 발표의 끝점 검출을 가능 하 게 C 터미널, 매우 안정적인, 단위체 형광 단백질 태그 포함 그림 1A). 다른 버퍼에 해결 정화 형광 그대로 기판 기판 및 분열 제품의 어 금 니 농도 평가 하기 위해 교정도 사용 됩니다. 또한, fluorimetry, 후 분석 결과 구성 요소 분석할 수 있습니다 SDS 페이지 뿐만 아니라. 두 기본 (nondenatured)와 변성된 형광 성 단백질 구상 될 수 있다는 젤에는 전기 이동 법 후 즉시 또는 다음에 젤 renaturation 후 각각. 이 추가 절차에 함께 한 기존의 Coomassie 화려한 블루 얼룩-5 월 시험 결과 (그림 1B)의 확인에 대 한 효율적으로 사용할 수 있습니다.
높은 처리량 자동 환경에 완전히 적응 될 수 있는 한 낮은 볼륨 형식 간단 하 고 쉬운-을-실행 단계 분석 결과 절차에 의하여 이루어져 있다. 그러나, 독립적으로 수동으로 또는 자동화 시스템 분석 결과 수행, 분석 결과의 다음과 같은 부분으로 간주 됩니다 하지 중요 되며 절차를 수행 하는 동안 특별 한 주의 필요로. i) 자석 구슬 솔루션의. 균질 자석 구슬 솔루션 분석 결과, 모두 정화와 세척 단계에 걸쳐 사용 되어야 한다. 특히, 효소 분석 실험의 안정성 강하게에 따라 제대로 aliquoting 기판 부착 자석 구슬 (SAMB) 재고 솔루션. 서 스 펜 션 및 분산의 효과 증가 하기 위하여 2%와 10% (v/v) 사이의 구슬 농도 설정 하는 것이 좋습니다. 샘플 준비, 사용 하는 동안 버퍼 (예: 트라이 톤 X-100 또는 트윈 20) 비 세제까지 보충의 2%도 플라스틱 표면에 자석 구슬의 부착 저하 될 수 있습니다. 샘플 튜브의 벽에 구슬의 부착 구슬 정지 샘플 튜브의 벽에 대신에 튜브의 바닥을 신중 하 게 적용 되는 경우에 피할 수 있습니다. 효소 반응 동안 자석 구슬의 동질성 또한 중요 하 고 지속적으로 부 화 시 600 rpm에서 샘플을 떨고에 의해 지켜질 수 있다. V-하단 튜브의 사용 권장 하지 않습니다 동안 비즈는 제대로 둥근 또는 플랫 플라스틱 그릇에 분산 됩니다. 부적 절 한 비드 균질으로 인 한 차선의 결과 그림 4B에서 표시 됩니다. 2) 반응 샘플의 해지입니다. 방법의 또 다른 이점은 이다 효소 반응 열 변성 치료 또는 어떤 잠재적으로 방해 화학15의 사용 없이 종료 될 수 있습니다. 종료 자석 구슬 기존의 마그네틱 입자 집중 장치를 사용 하 여 반응 혼합물에서 분리 하 여 수행할 수 있습니다. 제거 반응 버퍼에 포함 되어 있는 활성 효소 생성 된 C 터미널 형광 분열 제품 uncleaved 기판 구슬에 연결 된 남아 있다. 반응 버퍼에 활성 효소의 존재로 인해 분리 절차를 신뢰할 수 있는 끝점 검출을 위한 신중 하 게 수행 해야 합니다. 집중 장치에 샘플 튜브를 배치 하기 전에 짧은 회전 원심 분리를 적용 하는 것이 좋습니다. 집중 장치에 튜브를 삽입 후 적어도 15 제공 수집 구슬에 대 한 s. 뒤로-및-앞뒤 구분의 약간의 운동 구슬의 수집을 용이 하 게 수 있습니다. 분리를 수동으로 수행된 하는 동안 종료 일반적으로 더 많은 시간이 걸립니다 보다는 반응의 개시 하는 것을 고려 하시기 바랍니다. 따라서, 약 2 분 등록 지연이 좋습니다는 식 이라고 사이 동일한 보육 시간 모든 샘플에 적용 하는 경우.
설명된 분해 분석 결과의 원리는 비교적 간단 하다; 그러나, 시스템의 유연 하 고 안정적인 기판 구조 보장 합니다. 분석 결과의 개별 최적화 선호도 구슬의 적용된 조건, 시 약, 첨가제와의 호환성만 제한 될 수 있습니다. 계약 제조 업체의 프로토콜, 우리 또한 그 Ni NTA 구슬 표면에 기판의 선호도 바인딩 실질적으로 약화 pH ≤에 6.515발견. 따라서 기판 빈 샘플 반응 견본을 병렬을 적용 하는 것이 좋습니다 그리고 자발적인 기판 분리의 속도 결과의 평가 도중 고려 될 필요가 있다.
어디 자기 구슬-기반 분석 구슬-호환 되지 않는 구성 요소 또는 낮은 산도의 사용으로 인해 수행할 수 없습니다, 이러한 경우에 순화 된 재조합 형 기판의 솔루션에 소화도 적용할 수 있습니다. 이러한 경우에 반응 혼합물은 전기 이동 법에 의해 분석 될 수 있다 고 설명된 프로토콜에 따라 젤에 단백질을 구상 될 수 있다. 분해 활동을 조사, 솔루션에서 소화 및 단백질의 젤에서 검출 될 수 있습니다 fluorimetry의 대체 도구. 설계 기판 시스템의 참신은 SDS 페이지를 변성 시키기 후에 젤 renaturation 단계의 응용 이다. 네이티브 (nondenatured) 형광 단백질 전기 이동 법 동안 그들의 형광을 유지 하는 동안 변성 (그림 7B) 시 형광 속성은 폐지 됩니다. 그러나, 변성된 단백질의 형광 젤에서 SDS의 제거에 의해 부분적으로 복구할 수 있습니다. 따라서, 변성 조건을 사용 하 여 반응 컴포넌트의 분리 가능 하 게 형광 기반 뿐만 아니라 분자 무게-기반 식별. Coomassie 스테인드 젤의 분석에 비해 형광에서 젤 탐지의 또 다른 장점은 이다 (네이티브 또는 renatured) 형광 단백질은 쉽게 그들의 형광에 따라 젤에 확인할 수 있습니다 ( 그림 7참조). 분열 반응 nonfluorescent 오염 물질을 포함 하는 샘플에서 수행 하는 경우 또는 매우 닮은 서로 분자 무게 단백질이 중요 한 수 있습니다.
효소 분석 실험을 사용 하 여 유사 하 게 설계 된 기판에 이미 출판 이전8,,910, 그리고 비록 이러한 경우에 대 한 관심의 분열이 사이트는 또한 선호도 태그 사이 형광 단백질, 제시 하는 분석 결과 시스템 여기 뿐만 아니라 기술된 아이디어를 반복 하지만 이전 플랫폼의 다른 장점 결합 한 고도 더 개선 완료: i) MBP 융합 파트너의 활용 ii)는 TEV 홍보 제어 분열 사이트, iii의 존재) 새로 설계 된 단위체 FPs, 및 iv를 사용 하 여) 독특한 기판 교정 절차의 응용 프로그램. 자체 분석 결과 특히 효소 특이성 및 운동 연구, 비싼 계측에 대 한 필요 없이 시간 및 비용 효율적인 방법으로 안전에 유용 하도록 설계 되었습니다. 메서드는 두 산업 및 학술 연구 목적 적합 하 고 저렴 한 도구 될 목적 이다. ‘복제 카세트’ 식 플라스 미드의 유연성으로 인해 시스템 재조합 기판 라이브러리의 신속 하 고 저렴 한 세대에 대 한 적합 한 수 있습니다. 여기 설명된 분석 결과 기질 특이성, 효소 mutagenesis의 구현에 대 한 가능한 도구 이며, 억제 연구 하 고, 또한, 효소 활동을 수행 하는 다른 도구를 제공. (운동 매개 변수의 결심에 세균성 세포 파쇄)에서 분석 결과 플랫폼 HTS 및 자동화 기반 환경에 적응 시킬 수 있다 하 고, 산업 protease 억제제 검사 및 항 바이러스 약물에 잠재적으로, 적용 될 수 있습니다. 개발입니다. 또한, 경쟁력 있는 베이스에 대 한 분석 결과의 적응은 또한 우리의 실험실의 범위 미래에. 같은 경쟁 분석 결과, 다른 C 터미널 형광 태그-는 조사는 연구의 기본 설정 같은 분열 반응에 동시에 사용할 수를 융합 두 다른 기판 각 포함 하는 다른 분열 사이트 주어진된 대상 시퀀스에 대 한 효소입니다. 또한, 96 잘 접시 적응 분석 결과 양식 (그림 8)의 사용은 또한 되 고 최적화 돌연변이 검사 수정된 분열 사이트 시퀀스 시스테인 프로 테아 제 경우 기판의 시리즈를 사용 하 여.
The authors have nothing to disclose.
이 작품 GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “PHARMPROT 팀” 프로젝트에 의해 부분적으로 지원 되었고, 또한,의 프레임 워크 내에서 고 등 교육 기관 우수 프로그램의 부의 인간 수 용량, 헝가리에 의해 융자는 데브레첸 대학의 생명 공학 주제 프로그램입니다. 저자는 실험실의 Retroviral 생화학 분석 결과 개발 하는 동안 그들의 과학적인 도움 및 또한 (특히 하 Norbert Kassay에 Joóné Matúz Vanda 톨디, 분석 결과 촬영 하는 동안 그들의 인내심에 대 한 구성원에 대 한 감사 누가 게재 동영상의 배경에서). 저자 또한 특별 감사 Gedeon 리히터 Plc., 생화학의 부 고 손님 연구원으로 분자 생물학의 Beáta Bozóki의 작동 허용을 위한 박사 졸탄 Urbányi 특히 말을 싶습니다. 저자 또한 오디오 및 비디오에 전문적인 도움을 위한 멀티미디어 및 데브레첸의 대학교의 E-러닝 기술 센터에서 죄르지 Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi, 및 졸탄 Király 그들의 감사 하 고 싶습니다. 생산입니다.
10K Amicon tubes | Merck-Millipore | UFC501096 | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | M6250 | |
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid | Merck | 100063 | |
Agarose | SERVA | 11404.04 | |
Alpha Imager HP gel documentation system | ProteinSimple | ||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A3678 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A9518 | |
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge | Beckman Coulter | 392185 | |
Black half-area plates | Greiner bio-One | 675086 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | B0126 | |
CutSmart buffer (10x) | New England Biolabs | B7204S | For plasmid linearization (step 1.1.1) |
Dark Reader transilluminator | Clare Chemical Research | DR-45M | |
DNase I | New England Biolabs | M0303L | |
Dynamag-2 magnetic particle concentrator | Thermo Fischer Scientific | 12321D | |
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | C600003 | |
Ethanol | Merc-Millipore | 100983 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 798681 | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycerol | Merck | 356350 | |
Glycine | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | G7126 | |
High-Speed Plasmid Mini Kit | GeneAid | PD300 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 56750 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | AM9464 | |
Jouan CR 412 centrifuge | Jouan | CR412 | |
Labinco LD-76 Rotator | Labinco | 7600 | |
Luria-Bertani (LB) broth | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L3022 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L6876 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
MERCK eurolab ultrasonic bath | MERCK | USR54H | |
Millifuge Eppendorf spin centrifuge | Millipore | CT10 | |
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell | Bio-Rad | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T9281 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific | ||
NheI-HF restriction endonuclease | New England Biolabs | R3131L | |
Nickel(II) sulfate (NiSO4) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 656895 | |
Ni-NTA magnetic agarose beads | Qiagen | 36113 | |
Orbital shaker | Biosan | OS-20 | |
PacI restriction endonuclease | New England Biolabs | R0547L | |
PageBlue Protein Staining Solution | Thermo Fischer Scientific | 24620 | |
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P7626 | |
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes | Eppendorf | 22431102 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
Snijders Press-to-Mix shaker | Gemini | 34524 | |
Sodium-acetate trihydrate | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S7670 | |
Sodium-chloride | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S9888 | |
Sodium-hydroxide | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S5881 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fischer Scientific | S7563 | |
T4 DNA ligase | Promega | M180A | |
Thermo shaker | Biosan | TS-100 | with SC-24 accessory block |
Tris | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T1503 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P2287 | |
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter | Wallac Oy, Turku, Finland |