Summary
本稿では、密度勾配遠心法と精子の生理学的研究への応用のパフォーマンスについて説明を目指します。
Abstract
有性生殖、雄性配偶子または精子細胞は、受精させる雌性配偶子の融合します。ただし、受精を保障する雌性配偶子と対話する能力を肥やすことで精子の数が多いが必要。など、個々 の精子の受精能力は、正常な再生のため重要です。密度勾配遠心法は、生殖補助医療に使用される質の高い精子だけを収集する再現性の高い、高速、効率的、効果的な非常に適応可能である方法として数十年間利用されています。我々 はここに記載されているプロトコルはその品質によってオンドリの精子の 3 つの異なる集団を隔離する不連続パーコール密度勾配遠心法 (PDGC) 技術の活用に焦点を当てます。低、中、高品質の精子を収集することができました。生存率、モビリティ、および透過性を評価することにより精子の決定の不妊の可能性を伴う再現性のあるプロトコルについて述べる。PDGC 技術を使用してその品質によって精子のコレクションは正確に有用であるし、徹底的に差分不妊治療の可能性と精子を特徴付けます。
Introduction
脊椎動物、雄性配偶子を受ける強烈な選択圧;したがって男性の生殖のフィットネス、成功受精を達成するために極めて重要です。すべての脊椎動物種の男性は、受精のニーズを満たすために十分な品質と大量に精子細胞を生成できる必要があります。精子細胞、精子頭部と、鞭毛を持つは、体内で最も偏光セルです。また、精子の質の非常に異質です (ライブと死んで、形態学的正常と異常、および不動、低モバイル、高モバイル)、男性の生殖効率の変動幅を明らかには。なるほどの正常に卵子を受精に必要な交配の数は減りますが、質の高い精子の割合。しかし、不妊治療を達成するために形態学的に正常精子細胞はオスミウム酸1を浸透するも受精のサイトに到達する彼らの鞭毛によって生成された推進力に頼る (ZP 哺乳類の場合) または内部囲レイヤー2 (IPVL の鳥類と爬虫類の場合) 次の自然交配または人工授精 (AI) 卵子の。精子を決定する品質は生殖補助医療技術3 (アート) で使用するために必要な AI で使用される繁殖の男性の選択プログラム4。その一方で、アートの成功はもっぱら精子の質の正確な評価に依存します。多くの検査は精子の機能の特性を決定する開発されています。最も重要なパラメーターは、精子形態、生存率、モビリティ、精子 (鳥精子受精5は必要ありません)、精子、精子先体反応 (AR; エキソサイトーシスと精子頭部の先体からの蛋白分解酵素の放出)ZP や IPVL、受精6,7,8,9,10,11の浸透。不妊治療だけでの対策では、精子人口11の受精能力の正確な評価は提供しません。受精卵が受精に至るまでいくつかのイベントの対策個別精母細胞7のパフォーマンスの適切な表現を可能にします。
精子機能を測定するために開発された方法論は、主に種特異的です。たとえば、鳥の精子の生存率、移動性および IPVL の浸透、精子品質8,11,12を評価するために使用される最も一般的なパラメーター。射精のライブ精子の数は、死者の精子精液中の多数の存在が精子の質に影響するので精子の生存のための重要な役割を果たしています。これは、精液における活性酸素種の生産を高め、ライブ精子13に酸化的損傷を引き起こします。精子移動、体の温度、抵抗に対して鳥精子の鞭毛運動のための能力は、受精8について持って来ることで直接的な役割を再生する知られています。モビリティが不妊とは正の相関し、は、したがって、不妊治療8の主要な決定要因は、定着します。ただし、モバイルの精子には AR を受けると IPVL11を貫通する能力も必要です。IPVL 浸透アッセイ受精11の過程で関与するすべての精子を考慮に入れます。
アートのアプリケーションで射精は通常質の高い精子の濃度を最大化し、低品質の精子の濃度を最小限にするために処理されます。精液の採取後、業界と研究実践でよく使用される精子分離手順高品質精子の割合を濃縮することができます。これらの手順の多くが開発されているすべてをそれぞれの利点と制限事項が、すべては異種精子受精能力の高い精子だけを収集する性質を利用します。精子の移行方法、遵守列ろ過密度勾配遠心法 (DGC)14,15,16,17,18,19などの手順,20します利用可能な技術の中で DGC 非常にシンプルでコスト効果の高い、反復可能で受精14のチャンスを最大化することを目標にアート用高品質精子の最大の量を分離することで効率的に発見されました。,15します。 さらに、DGC は精子細胞膜に有害ではないです。対照的に、精子の移行方法収集だけ徐々 にモバイル精子18,19, が収集した精子の量が非常に低く、大量の精子18,の収集に非効率的なこと20. 付着列ろ過は精液17から機動性の高い精子をフィルタ リングで非常に効率的ただし、精子膜20,21に害がある傾向にあります。
密度勾配を生成するための最も一般的に使用される基板は、DGC 技術 Percoll polyvinylpryrolidone でコーティングしたコロイド状シリカ粒子から成っています。連続または不連続パーコール密度勾配遠心法 (PDGC) を指定できますが、不連続勾配は機動性の高い精子13,16,20の高収率分離でよく使用されます。不連続勾配の低い密度メディアに浮かんで高密度メディア、円錐管の底に上から密度が増加するグラデーションを作成します。これは異なる密度の 2 つのメディア間のインターフェイスに境界を作成します。PDGC の効率は 2 つの要因から派生した: 1) 個々 の精子細胞と 2) 密度が増加する構造的整合性が高い精子細胞の傾向の推進能力。高いモビリティと精子、低密度メディアからクロスし、高密度メディアに浸透することができます。低い機動性精子は異なる密度の媒体間のインターフェイスによって作成された境界に閉じ込めになるより可能性があります。高い構造健全性とモビリティの精子細胞は死んで、異常または低のモバイル精子細胞より高い密度を持っている傾向があります。PDGC で遠心力を適用すると、グラデーションの各場所に密度の異なる精子の動きこれ容易になります。
一般的な実習で PDGC を実行すると後は、円錐管の下部に潜在的な高い出生に精子の柔らかいペレットを収集すると、し、残りの部分は破棄されます。しかし、この手法の活用の利点は品質の違いに基づいていくつかのグループに精子細胞を分けるその機能です。研究用 PDGC 技術を活用した品質の程度によって精子の分離それは生理学的、メタボローム、プロテオームの違いに関係、精子の質の研究できます。モビリティ、および精子 IPVL 以前に確立されたエオシン nigrosin 生存率、生体染色、Accudenz の試金を使用して品質のこれらの違いを示すと同様、別の精子の品質によって、この手法を使用する方法の詳細をここでは、目指す透過性の相互作用アッセイ。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージアの大学によって承認されています。
1. 伝統的なの遠心分離を用いた洗浄
- リン酸緩衝液 (PBS) を準備します。8.0 g nacl、KCl、1.44 g Na2HPO4と KH2PO4 800 mL の蒸留水 (dH2O) 0.24 g の 0.2 g を追加します。0.1 N HCl を使用して 7.4 に pH を調整し、dH2o. を使用して 1 L にソリューションをもたらす
- 運動性バッファーを準備します。追加, 塩化ナトリウム 6.5 g、4.5 g グルコース、0.444 g CaCl2と N - トリス-[ヒドロキシメチル] 11.5 g のメチル-2-アミノ-ethanesulfonic 酸 (TES) dH2O. 800 mL に 1 M NaOH を使用して 7.4 に pH を調整して dH2o. を使用して 1 L にソリューションをもたらす
- ポリプロピレン微量遠心チューブに精液の 0.5 mL のピペットします。1.0 mL の PBS を加え、軽く混ぜます。
- 室温 (RT) で 10 分間 1,500 × g で遠心分離し、上澄みを廃棄します。PBS で精子ペレットを再懸濁します 1.5 mL。
- 1,500 × g で RT。 精子が運動でペレットを再懸濁しますで 10 分間遠心するバッファー 0.5 mL です。
2. PDGC テクニックを実行します。
注: は、室温で PDGC の全体のプロセスを実行します。
- 2 つの個別のチューブで 1.08 g/mL と 1.07 g/mL の Percoll ソリューションの 3.0 mL を作る。
- きれいな試験管に 1.13 g/mL の 1.712 mL 追加 1.5 M NaCl 溶液 0.3 mL を元 Percoll。DH2O の mL の 0.988、1.08 g/mL の 3.0 mL 密度ソリューションにするため穏やかな逆転によって混ぜます。
- きれいな試験管に追加 1.13 g/mL の 1.482 mL 1.5 M NaCl 溶液 0.3 mL を元 Percoll。DH2O の mL の 1.218、1.07 g/mL の 3.0 mL 密度ソリューションにするため穏やかな逆転によって混ぜます。
- きれいな試験管に 2.0 mL の PBS と精液サンプル 1:2 の 1.0 mL を希釈します。ピペットで穏やかに混合します。
- 滅菌 15 mL の円錐管に 1.07 g/mL 密度液 3.0 mL をピペットで移しなさい。慎重にピペット 1.07 g/mL の濃度溶液下 1.08 グラム/mL の密度液 3.0 mL。2 つの層が混合しないことを確認します。長い形式 (9 インチ) パスツール ピペットやすくできますこの手順。
- ピペット 3.0 mL 希釈精液サンプルの頭上に、PDG。精液サンプルは、PDG と混ざらないように傾斜 45 ° の角度で PDG を含む円錐管が優しく。ピペットで移しなさい、管の壁に沿ってサンプルとダウン チューブや、PDG をフローことができます。
- オーバーレイされるサンプルで PDG の質量に合わせて空チューブを準備します。1500 x g で両方のチューブを遠心分離機、20 分がバランスし、遠心分離機管のベンチから転送中不連続勾配を維持するために注意してください。
注: は、遠心分離の終わりにブレーキを使用しないでください。 - 結果を確認します。図 1に見られるようにチューブに 3 つの明瞭な精液層を形成していることを確認します。
- ピペット層分離精液を吸い出しなさい。精液の最上位のレイヤーを最初に集め、中間層の第二に、最新の管の下部にハードのペレット。清潔で滅菌ポリプロピレンにそれぞれ転送遠心チューブ。
- 各サンプルを PBS で 1.5 mL を希釈します。10 分間 1500 × g で遠心分離機します。
- 上清を注ぐ。穏やかなピペッティングによる精子運動性バッファーにペレットを再構築します。
注: 代替の密度は調査官のニーズに合わせて使えます。V0がストック密度ソリューションのボリュームを次の式で使用される成分の量使用、v ソリューション、p の最終巻は望まれる最終密度解決の密度、p0はストックの密度の密度決定します。解決方法:
常に生理食塩液の NaCl 濃度に合わせて密度溶液の調製で 1.5 M の NaCl の 0.3 mL を使用します。
3. 精子の質を決定します。
- 精子濃度は22を前述を計算します。
- エオシン nigrosin 重要な上記12以下の変更として染色を実行します。
- 1 x 10 の8セル/mL の濃度で精子溶液 100 μ L を準備します。
- ピペット 50 μ L nigrosin エオシン染色の等量を含むポリプロピレン微量遠心チューブに精子ソリューションの。室温で 5 分間混合物を孵化させなさい。
- 20 μ L スライド ガラスの一端に汚された精子サンプルのドロップして、血液の使用と同様の方法で均一に塗る場所を塗ります。3-5 分間室温でまみれてスライドを風乾します。
- 顕微鏡下で塗抹標本を観察します。ライブ精子 (汚れ無し) と (ピンク染色) 死者の精子の数をカウントし、ライブ精子の割合を算出します。
- Accudenz 試金は、以前に鶏精子、精子移動8以下の変更を客観的に評価するための検証を実行します。
- ポリスチレン キュヴェット、図 2に示すように 6% アッセイ液 1.0 mL をピペットで移しなさい。41 ° c. に孵化させなさい
メモ: 41 ° C は、鶏の内部の温度を一致するように使用されます。培養温度は、調査されている種の女性の生殖器官を一致させてください。 - 5 x 10 の8セル/mL の濃度で精液サンプルを 100 μ l 添加と予熱分析ソリューションをオーバーレイします。
- キュベット含まれている場所には、分光光度計で精子サンプルが重なって表示されます。550 で吸光度値記録 nm。
- ポリスチレン キュヴェット、図 2に示すように 6% アッセイ液 1.0 mL をピペットで移しなさい。41 ° c. に孵化させなさい
- 前述11以下の変更として IPVL 浸透分析を実行します。
- そのまま IPVL の非胚ディスク領域の一部 (0.5 × 0.5 cm) をカットします。
- 4 x 106セル/ml 精子濃度を調整します。
- 図 3に示すようは、37 ° C で 15 分間の小さなガラスの瓶に IPVL と運動バッファーで精子を孵化させなさい。
- 3% の IPVL 部分を浸す塩化ナトリウム IPVL と精子の相互作用を停止します。
- 顕微鏡のスライドと次の 20 の 10% ホルマリンで固定 10 分シフの試薬で汚れ IPVL ピースをマウント s。
- 二穴責め成功した精子を顕微鏡下で IPVL を観察し、40 倍の倍率で 0.25 mm2あたりのすべての目に見える穴の数をカウントします。
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Representative Results
PDGC 技術は、すべてのパラメーターの間で品質の程度によって精子の 3 つの層をはっきりと分離で起因しました。精子は高密度ソリューションより高いと低密度ソリューションと上記の低密度ソリューション低品質層間媒体品質層高品質レイヤーに分離します。これらの品質に違いは生存率 (図 4)、移動 (図 5) および浸透 (図 6) の明確な違いが証明されています。PDG の高品質の膜から分離した精子は、それらの伝統的洗浄標本を基準にしてすべての 3 つのパラメーターの増加を展示しました。指摘している PDGC による分離時に中・低品質表示中等度および劇的なそれぞれ、これらのレイヤーは、すべてテスト パラメーターの間で減少します。
図 1: PDGC を使用して差分の質と精子の分離します。精子液調製した PDG 溶液 3 mL をオーバーレイします。1500 x g で 20 分間遠心は、低、中、高品質で精子の 3 つの明瞭なグループを収集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Accudenz のアッセイを用いた精子モビリティの測定。キュベットで 6% 分析ソリューション精子サンプルの 100 μ L をオーバーレイします。550 で吸光度の関数として, 5 分レコード移動精子の 41 ° C で nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: IPVL の精子侵入穴の形成のモデル。15 分の 37 ° C で IPVL の小さなセクションで精子を孵化させなさい。IPVL、IPVL、精子細胞バインドとの接触時に先体反応を受けるし、貫通穴を作成する、IPVL を浸透します。浸透穴の数をカウントし、精子の透過性を測定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: エオシン nigrosin 生体染色による精子の生存率。(A) と PDGC (B ・低運動性精子の伝統的な洗浄のプロセスを通じて得られた精子のエオシン nigrosin 生体染色を示すデジタル顕微鏡C、中程度の運動性精子です。D、高運動性精子)。スケール バー = 40 倍の倍率で 50 μ m。ピンク染色エオシン染色を取り上げている死者の精子を示します。データは、テューキー Kramer テスト続いて一方向の分散分析に供した。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を示します。値は、平均 ± SEM として表示 (n = 5)。a ~ d一般的な上付き異なるなしの値 (P 0.05 <)。低、中、高品質のグループ (E) に PDGC によって分離した精子は、77.0 ± 8.9 と 92.8 ± 3.4、66.0 ± 4.7, 生存率割合に有意差をそれぞれ表示されます。従来の方法で洗浄した精子は、高品質のグループよりも中・低品質グループよりも高い 81.6 ± 4.9% 生存、下を表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: Accudenz 分析により評価した精子の移動。吸光度値は Accudenz 法による評価で精子モビリティのプロキシとして機能です。データは、テューキー Kramer テスト続いて一方向の分散分析に供した。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を示します。値は、平均 ± SEM として表示 (n = 5)。a ~ d一般的な上付き異なるなしの値 (P 0.05 <)。PDGC 法による低, 中, 高品質のグループに分離した精子はそれぞれ著しく異なる低 (0.11 ± 0.03)、媒体 (0.34 ± 0.01)、高 (0.87 ± 0.03) 吸光度値を展示しました。従来の方法で洗浄した精子は、0.71 ± 0.03、媒体および低品質グループよりも高いが、高品質グループのそれより低い吸光度吸光度を出展しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 囲卵腔内精子層 (IPVL) の相互作用アッセイにより評価した精子の透過性。15 分顕微鏡写真表現を受けた精子が貫通 IPVL 37 ° C で運動バッファーで潜伏中に鶏精子 (4 × 106セル/mL) で、IPVL の表面に穴の生体外で形成を示すデジタル顕微鏡伝統的な洗浄 (A) と低 (B)、ミディアム (C) および高品質 (D) グループから PDGC から精子。スケール バー = 40 倍の倍率で 50 μ m。データは、テューキー Kramer テスト続いて一方向の分散分析に供した。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を示します。値は、平均 ± SEM として表示 (n = 5)。a ~ d一般的な上付き異なるなしの値 (P 0.05 <)。密度メディアの異なるグラデーションから分離した精子の間に 0.25 mm2 (E) あたり貫通穴の数が異なっていた。PDGC によって低、中、高品質のグループに分離した精子は、それぞれ低 (24.40 ± 1.1)、媒体 (33.20 ± 1.4) と貫通穴数が多い (51.20 ± 1.3) を生産しました。伝統的なメソッドを使用して洗浄した精子は生産 46.40 ± 1.8 貫通穴、中・低品質グループよりも高い高品質のグループより低い値です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
不妊治療は、動物生産の収益性を決定するだけでなく、存在のための種の自然淘汰の手段としても機能します。精子細胞の究極の機能は、卵子を受精することです。女性の卵管は卵子23,24の受精を保障するためにそれらの適者生存精子のみを選択します。生体外研究も質的な精子と受精成功4,11,23,24間密接な相関関係を明らかにしました。減らされた豊饒は精子4,11,25の質の悪さに関連付けられます。そのため、精子の質の改善のための精液の処理が必要と。アート、PDGC は人間および農学上重要な動物13,16,20,26の豊饒を補完する質の高い精子だけを収集するために適用されています。我々 は、この手法を使用して、しかし、低、中、高品質国産鶏モデルで精子を分離する穏やかな、非侵襲的手法を実証しました。
PDGC、正しく実行されるときの提案するプロトコルでは、だけでなく質の高い精子の分離だけでなく、低・中品質精子の効果的な分離をことができます。PDGC の成功の度合いは不連続勾配の入念な準備と同様、均等に分離層の注意コレクションに依存します。使用される円錐形の管の直径は、PDGC の成功も影響します。我々 より大きい管の直径が技術の低下の効率の結果を観察しました。PDG の整合性を維持するために、室温で PDGC を行うことが重要です。以前冷蔵サンプルは、PDG に置かれる前に部屋の温度に調整する必要があります。PDGC の実行後観察可能性が最も一般的な問題は、非効率的な分離;分離層は互いに区別できません。上記の重要な手順をアドレス指定に加えて、この問題が発生した場合サンプル希釈を減らすことによって修正される場合があります、ボリュームを増加密度のソリューションは、使用し使用液量の確保が等しい。
PDGC は非常に適応可能であります。1.00 1.13 g/mL と密度を任意の範囲は、グラデーションの準備のために使えます。我々 は、1.07 と 1.08 g/mL の密度ソリューションは品質によって鶏精子の分離のためによく働くが、これらの密度は他のサンプルの種類や実験の目的のため調整が必要を発見しました。グラデーションで密度ソリューションの数は、実験者のニーズに合わせて調整可能性があります。分離された質の高いグループの数は常に 1 つ使用密度ソリューションの数以上。
PDGC は、大量のサンプルの状況でサンプル分離の代替方法よりもはるかに効果的な必要13,16,20,26です。移行の試金は効果的にサンプル18,19から最高品質の精子を分離、さらに、サンプルを解決するのには使用できません。移行の試金は、またサンプル18,20の大ボリュームを準備することができます。付着列アッセイの大量サンプル17の効果的な識別します。ただし、プロセスは分離困難な20,21後の質の高いグループの確認、収集、精子の品質に有害。ただし、PDGC は、独自の制限があります。哺乳動物の精子の場合それ使用しないでください体外受精では、エンドトキシンから27の可能な汚染のためにサンプルの準備のため。Percoll エンドトキシン混入の効果ない他の動物クラスで調べた。精子のパフォーマンスは、PDGC はまだ研究の目的に適した意味エンドトキシンの影響を受けません。
PDGC 技術を使用してその品質によって精子のコレクションは、精子の生理学的研究、メタボローム、トランスクリプトーム、プロテオーム研究を含むアプリケーションの広い範囲のため尽力されます。この技術の応用は、精子の質マーカーによる不妊改善プログラムで使用するためのバイオ マーカーの発見に貢献します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
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