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Biology

Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/58833
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Poultry Science, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

En este trabajo, nuestro objetivo es describir el funcionamiento de la técnica de centrifugación del gradiente de densidad y su aplicación en la investigación de fisiología de la esperma.

Abstract

En reproducción sexual, un gameto masculino o espermatozoide se fusiona con un gameto femenino para lograr la fertilización. Sin embargo, un gran número de espermatozoides con capacidad de fertilización está obligado a interactuar con un gameto femenino para fertilización. Como tal, la capacidad fecundante de los espermatozoides individuales es fundamental para la reproducción acertada. Centrifugación de gradiente de densidad se ha utilizado durante décadas como un método reproducible, rápido, eficiente, eficaz y extremadamente adaptable para recoger sólo alta calidad esperma para ser utilizado en reproducción asistida. Los protocolos que hemos descrito en este documento se centran en la utilización de la técnica de gradiente de centrifugación (PDGC) de densidad discontinua de Percoll para aislar a tres poblaciones distintas de la esperma de gallo por su calidad. Hemos podido recoger espermatozoides de calidad, medio y bajo. También describimos protocolos reproducibles que implican determinación potencial de fertilidad de los espermatozoides mediante la evaluación de su viabilidad, movilidad y penetración. Colección de esperma por su calidad técnica PDGC sería útil con precisión y caracterizar bien esperma con diferencial fertilidad potencial.

Introduction

En los vertebrados, gametos masculinos someterse a intensa presión selectiva; por lo tanto la aptitud reproductiva de un hombre es fundamental para lograr la fertilización exitosa. Los machos de cualquier especie vertebrado dado deben ser capaces de producir espermatozoides en grandes cantidades y calidad suficiente para satisfacer las necesidades de fertilización. Células de la esperma, con una cabeza del espermatozoide y un flagelo, son las células más polarizadas en el cuerpo. También son muy heterogéneos en la calidad de los espermatozoides (vivo y muerto, morfológicamente normal y anormal e inmóvil, poco móvil y alta móvil), que se revela a través de la amplia variación en la eficiencia reproductiva de los machos. Cuanto mayor sea la proporción de espermatozoides de alta calidad, menos el número de apareamientos requerido con éxito fertilizar el óvulo. Sin embargo, para lograr la fertilidad, las células de espermatozoides morfológicamente normales dependen de propulsiva fuerzas generadas por sus flagelos al llegar al sitio de fertilización, así como para penetrar la zona pelúcida1 (ZP; en el caso de mamíferos) o perivitelino interior Layer2 (IPVL; en el caso de aves y reptiles) del óvulo después de la monta natural o inseminación artificial (IA). Determinación de esperma calidad es necesaria para el uso de tecnologías de reproducción asistida3 (arte) y selección de machos reproductores en AI programas4. Por otra parte, el éxito del arte únicamente depende de la precisa evaluación de la calidad del esperma. Ha desarrollado una serie de pruebas de laboratorio para determinar las características funcionales de los espermatozoides. Los parámetros más importantes son la morfología espermática, movilidad, viabilidad, capacitación (esperma aviar no requieren capacitación5), reacción acrosómica (AR; exocitosis y la liberación de una enzima proteolítica del acrosoma de la cabeza del espermatozoide), esperma penetración de la ZP o IPVL y fertilización6,7,8,9,10,11. Medidas de la fecundidad solo no proporcionan una evaluación exacta de la capacidad fecundante de espermatozoides población11. Medidas de los varios eventos previos a la fertilización de un óvulo permiten una representación adecuada del rendimiento de espermatocitos individual7.

La metodología desarrollada para la medición de función de la esperma es principalmente propios de cada especie. Por ejemplo, en los espermatozoides aviares, viabilidad, movilidad y penetración de la IPVL son los parámetros más comunes utilizados para evaluar la calidad de esperma8,11,12. El número de espermatozoides vivos en el eyaculado desempeña un papel crucial para la supervivencia de los espermatozoides debido a la presencia de un gran número de espermatozoides muertos en el eyaculado afecta la calidad de los espermatozoides. Esto aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno en el semen y produce daño oxidativo en el esperma vivo13. Movilidad de espermatozoides, la capacidad de movimiento flagelar de los espermatozoides aviares contra la resistencia a la temperatura corporal, es conocido por desempeñar un papel directo en el fertilización8. Está bien establecido que la movilidad se correlaciona positivamente con la fertilidad y es, por tanto, un determinante principal de fertilidad8. Sin embargo, un espermatozoide móvil también debe tener la capacidad de someterse a una AR y penetrar la IPVL11. Ensayos de penetración IPVL tengan en cuenta para cada esperma que participa en el proceso de fertilización11.

En la aplicación del arte, eyaculado generalmente se procesa con el fin de maximizar la concentración de espermatozoides de alta calidad y minimizar la concentración de espermatozoides de baja calidad. Después de la recolección de semen, la proporción de espermatozoides de alta calidad puede ser enriquecida a través de procedimientos de separación de espermatozoides utilizados en las prácticas de la industria y la investigación. Muchos de estos procedimientos se han desarrollado, con respectivas ventajas y limitaciones, pero todos utilizan la naturaleza heterogénea de recoger sólo los espermatozoides con alta capacidad fecundante de los espermatozoides. Estos procedimientos incluyen métodos de migración espermática, filtración de la columna de adherencia y densidad gradiente de centrifugación (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. entre las técnicas disponibles, la DGC se ha encontrado para ser muy sencilla, repetible, rentable y eficiente en el aislamiento de la mayor cantidad de esperma de alta calidad para uso en el arte con el objetivo de maximizar la probabilidad de fertilización14 , 15. Además, DGC no es perjudicial para la membrana de la célula de la esperma. En contraste, métodos de migración de esperma recogen espermatozoides sólo progresivamente móviles18,19, pero la cantidad de semen recogido es muy baja, lo que es ineficiente en la recolección de grandes volúmenes de esperma18, 20. filtración de columna de adherencia es muy eficiente en filtrado altamente móvil de la esperma del semen17; sin embargo, tiende a ser perjudicial para las membranas de espermatozoides20,21.

En la técnica de la DGC, el sustrato más utilizado para generar el gradiente de densidad es Percoll, que consiste en partículas de sílice coloidal cubiertas en polyvinylpryrolidone. Centrifugación gradiente de densidad de Percoll (PDGC) puede ser continua o discontinua pero un gradiente discontinuado es más comúnmente utilizado para alto rendimiento de aislamiento de espermatozoides móviles altamente13,16,20. En un gradiente discontinuo, bajo medios de densidad flotan en la superficie mayor densidad los medios de comunicación, crea un gradiente que aumenta en densidad de la parte superior a la parte inferior de un tubo cónico. Esto crea límites en la interfaz entre dos medios de diferente densidad. La eficacia de PDGC se deriva de dos factores: 1) la capacidad propulsora de espermatozoides individuales y 2) la tendencia de espermatozoides con alta integridad estructural a tener una mayor densidad. Espermatozoides con mayor movilidad son más capaces de cruzar de media densidad inferior y penetrar en un medio de densidad más alta. Espermatozoides de movilidad inferiores son más propensos a quedar atrapados en los límites creados por la interfaz entre medios de diferente densidad. Espermatozoides con movilidad y alta integridad estructural tienden a tener una densidad mayor muertos, anormales o bajos espermatozoides móviles. Cuando se aplica la fuerza centrífuga en PDGC, esto facilita el movimiento del esperma con densidades diferentes a su lugar respectivo en el gradiente.

En la práctica general, después de realizar la PDGC, se recoge el sedimento suave de espermatozoides con alta fertilidad potencial en la parte inferior del tubo cónico, y el resto se descarta. Sin embargo, una ventaja subutilizada de esta técnica es su capacidad para separar las células espermáticas en varios grupos basados en las diferencias de calidad. Para fines de investigación, separación de espermatozoides por grado de calidad utilizando la técnica PDGC permite el estudio de la calidad del esperma lo que respecta a las diferencias fisiológicas, de metabolómica y proteómica. Aquí, nuestro objetivo es detallar cómo puede utilizarse esta técnica para separar los espermatozoides por calidad, como demuestran estas diferencias en la calidad, utilizando previamente establecidas de eosina-nigrosina tinción vital para la viabilidad, análisis de Accudenz movilidad esperma IPVL Análisis de interacción para la penetración.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Georgia.

1. lavado mediante centrifugación tradicional

  1. Preparar la solución amortiguadora de fosfatos (PBS). Añadir 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4 a 800 mL de agua destilada (dH2O). Ajustar el pH a 7.4 con 0.1 N HCl y llevar la solución a 1 L con dH2O.
  2. Preparar el tampón de motilidad. Añadir 6,5 g de NaCl, 4,5 g de glucosa, 0,444 g de CaCl2 y 11,5 g de N - tris-[hidroximetil] ácido metil-2-amino-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido (TES) a 800 mL de dH2O. ajustar el pH a 7.4 con 1 M NaOH y traer la solución a 1 L con dH2O.
  3. Pipetear 0.5 mL de semen en un tubo de microcentrífuga de polipropileno. Añadir 1,0 mL de PBS y mezclar suavemente.
  4. Centrifugar a 1.500 x g por 10 min a temperatura ambiente (RT) y descarte el sobrenadante. Resuspender el sedimento de esperma con PBS hasta 1,5 mL.
  5. Centrifugar a 1.500 x g durante 10 min a RT. resuspender los espermatozoides con motilidad de pellets tampón hasta 0,5 mL.

2. realizar la técnica PDGC

Nota: Realice todo el proceso de PDGC a temperatura ambiente.

  1. Hacer 3,0 mL de 1,08 g/mL y 1,07 g/mL de Percoll soluciones en dos tubos separados.
    1. En un tubo de ensayo limpio, añadir 1,712 mL de 1,13 g/mL Percoll original a 0,3 mL de solución de NaCl al de 1,5 M. Añadir 0,988 mL de dH2O y mezclar por inversión suave para hacer 3,0 mL de un 1,08 g/mL densidad solución.
    2. En un tubo de ensayo limpio, añadir 1,482 mL de 1,13 g/mL Percoll original a 0,3 mL de solución de NaCl al de 1,5 M. Añadir 1,218 mL de dH2O y mezclar por inversión suave para hacer 3,0 mL de un 1,07 g/mL densidad solución.
  2. En un tubo de ensayo limpio, diluir 1.0 mL de semen muestra 1:2 con 2,0 mL de PBS. Mezclar suavemente por pipeteo.
  3. Extraiga con pipeta 3,0 mL de la solución de densidad 1,07 g/mL en un tubo cónico de 15 mL estéril. Con cuidado Extraiga con pipeta 3,0 mL de la solución de densidad de 1,08 g/mL por debajo de la solución de densidad 1,07 g/mL. Asegúrese de que las dos capas no se mezclan. Una forma de largo (9 in) pipeta Pasteur puede facilitar este paso.
  4. Extraiga con pipeta 3,0 mL de la muestra de semen diluido overtop el PDG. Para asegurar que la muestra de semen no se mezcla con el PDG, incline suavemente el tubo cónico que contenía el PDG en un ángulo de 45°. Pipetear la muestra a lo largo de la pared del tubo y permitir que fluya por el tubo y el PDG.
  5. Prepararse un tubo blanco para que coincida con la masa de la PDG con muestras superpuestas. Centrifugar los tubos a 1500 x g por 20 minutos tenga cuidado de mantener el gradiente discontinuo al mismo tiempo transferir los tubos desde el Banco al saldo y luego a la centrifugadora.
    Nota: No use el freno al final de la centrifugación.
  6. Observar los resultados. Asegurar que se han formado tres capas distintas de semen en el tubo, como se ve en la figura 1.
  7. Aspire capas aisladas de semen con una pipeta. Recoger primero la capa superior de esperma, el centro en segundo lugar de la capa y por último la pelotilla dura en la parte inferior del tubo. Transferencia de cada uno para un limpio y estéril de polipropilenotubo de microcentrífuga.
  8. Diluir cada muestra a 1,5 mL con PBS. Centrifugar a 1500 x g por 10 min.
  9. Retirar el sobrenadante. Reconstituir el sedimento de esperma con tampón de motilidad mediante pipeteo suave.
    Nota: Pueden utilizarse densidades alternativas a las necesidades del investigador. Determinar cantidades de ingredientes se utilizan con la siguiente ecuación, que v0 volumen de solución stock de la densidad, v es el volumen final de solución deseada, p es densidad de solución de densidad final deseada y p0 es la densidad de la densidad del stock solución:
    Equation 1
    Siempre use 0,3 mL de 1,5 M de NaCl en la preparación de las soluciones de densidad a la concentración de NaCl de la solución salina fisiológica.

3. determinar la calidad del esperma

  1. Calcular la concentración espermática como describió anteriormente22.
  2. Realizar eosina-nigrosina vital la coloración descrita12 con las siguientes modificaciones:
    1. Preparar 100 μl de solución de esperma en una concentración de 1 x 108 células/mL.
    2. Extraiga con pipeta 50 μl de solución de espermatozoides en un tubo de microcentrífuga de polipropileno que contiene un volumen igual de tinción eosina-nigrosina. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    3. Los borrones de transferencia lugar 20 μl gota de la muestra de esperma manchada en un extremo de un portaobjetos de vidrio y unte uniformemente en una manera similar a la utilizada para la sangre. Deje secar al aire los portaobjetos embarrados a temperatura ambiente durante 3-5 min.
    4. Observar el frotis en el microscopio. Contar el número de espermatozoides vivos (no mancha) y espermatozoides muertos (teñidos de color rosa) y calcular el porcentaje de espermatozoides vivos.
  3. Realizar el análisis Accudenz, validado previamente para que los espermatozoides de pollo, para evaluar objetivamente los espermatozoides movilidad8 con las siguientes modificaciones:
    1. Pipetee 1,0 mL de solución 6% ensayo en cubetas de poliestireno, como se ilustra en la figura 2. Incubar a 41 ° C.
      Nota: 41 ° C se utiliza para que coincida con la temperatura interna de una gallina. La temperatura de incubación debe coincidir con el tracto reproductor femenino de la especie investigada.
    2. Superposición de la solución de ensayo precalentado con 100 μl de muestra de semen a una concentración de 5 x 108 células/mL.
    3. Lugar la cubeta que contiene el overlaid muestra de esperma en el espectrofotómetro. Registre el valor de absorbancia a 550 nm.
  4. Realizar el ensayo de penetración de la IPVL como se describió anteriormente11 con las siguientes modificaciones:
    1. Cortar un trozo (0,5 x 0,5 cm) de región de disco no germinal de la IPVL intacto.
    2. Ajustar la concentración espermática a 4 x 106 células/mL
    3. Incubar espermatozoides en tampón de motilidad con IPVL en un frasco pequeño de vidrio durante 15 min a 37 ° C, como se ilustra en la figura 3.
    4. Sumerja la pieza IPVL 3% NaCl para detener la interacción entre la IPVL y esperma.
    5. Montar la pieza IPVL en un portaobjetos y la tinción con reactivo de Schiff de 10 min después de la fijación con formalina al 10% durante 20 s.
    6. Observar la IPVL bajo un microscopio para esperma exitoso agujeros de penetración y contar el número de todos los agujeros visibles por 0.25 mm2 con 40 aumentos.

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Representative Results

La técnica PDGC resultó en separación distinta de tres capas de esperma por grado de calidad a través de todos los parámetros. Esperma se separa en una capa de alta calidad por debajo de la mayor solución de densidad, una capa de calidad media entre la mayor y una solución de menor densidad y una capa de baja calidad por encima de la solución de menor densidad. Estas diferencias en calidad se evidencian mediante claras diferencias en la viabilidad (figura 4), movilidad (figura 5) y penetración (figura 6). Espermatozoides aislados de la capa de la alta calidad de lo PDG exhibieron aumentos en los tres parámetros en relación a los de la muestra lavada tradicionalmente. Esas capas señaló como medio y baja calidad con separación mediante PDGC presentación moderada y dramática, respectivamente, disminuye en todos los parámetros de prueba.

Figure 1
Figura 1 : Aislamiento de esperma con calidad diferencial, utilizando PDGC. Superposición de 3 mL de solución de esperma en la solución preparada de PDG. Centrifugar a 1500 x g durante 20 min recoge tres grupos distintos de esperma con baja, media y alta calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Determinación de la movilidad de esperma mediante ensayo de Accudenz. Recubrimiento 100 μl de muestra de semen en una solución de análisis de 6% en una cubeta. Incubar a 41 ° C por 5 min registro la movilidad de los espermatozoides en función de la absorbancia a 550 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Un modelo de formación de los agujeros de penetración de espermatozoides en la IPVL. Incubar los espermatozoides con una pequeña sección de IPVL a 37 ° C durante 15 minutos. Al entrar en contacto con la IPVL, espermatozoides se unen con la IPVL, experimentan una reacción acrosómica y penetrar la IPVL, creando agujeros de penetración. Contar el número de agujeros de penetración y medir la penetrabilidad de los espermatozoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Viabilidad de esperma según lo determinado por la coloración vital eosina-nigrosina. Imágenes digitales con eosina-nigrosina tinción vital de los espermatozoides obtenidos a través de un proceso de lavado tradicional (A) y PDGC (B, bajo espermatozoides móviles; C, medio espermatozoides móviles; D: alta espermatozoides móviles). Barra de escala = 50 μm con 40 aumentos. Coloración rosada indica espermatozoides muertos que han tomado con hematoxilina-eosina. Los datos fueron sometidos a ANOVA unidireccional, seguido por la prueba de Tukey-Kramer. Barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Los valores se presentan como la media ± SEM (n = 5). a-d Valores sin un superíndice común difiere (P < 0,05). Espermatozoides aislados por PDGC en grupos de bajo, medio y alta calidad (E) revelan diferencias significativas en el porcentaje de viabilidad, 66.0 ± 4.7, 77,0 ± 8,9 y 92.8 ± 3.4, respectivamente. Esperma lavada por métodos tradicionales muestra un 81,6 ± 4,9% viabilidad, más baja que el grupo de alta calidad pero más alto que los grupos de mediana y baja calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Movilidad de la esperma según lo determinado por análisis de Accudenz. Valores de absorbancia actúan como medida proxy para la movilidad de la esperma en evaluación por el análisis de Accudenz. Los datos fueron sometidos a ANOVA unidireccional, seguido por la prueba de Tukey-Kramer. Barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Los valores se presentan como la media ± SEM (n = 5). a-d Valores sin un superíndice común difiere (P < 0,05). Espermatozoides aislados en grupos de bajo, medio y alta calidad mediante la técnica PDGC exhibieron baja marcadamente diferente (0.11 ± 0.03), medio (0,34 ± 0.01) y altos valores de absorbancia (0.87 ± 0,03), respectivamente. Espermatozoides por métodos tradicionales exhiben una absorbancia de 0.71 ± 0.03, una absorbancia menor que la del grupo de alta calidad, pero mayor que la de los grupos de mediana y baja calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Penetración de la esperma según lo determinado por análisis de interacción interna esperma perivitelino capa (IPVL). Imágenes digitales mostrando en vitro la formación de agujeros en la superficie de la IPVL por espermatozoides de pollo (4 x 106 células/mL) durante la incubación en buffer de motilidad a 37 ° C por 15 minutos representan de micrografías IPVL penetrado por el espermatozoide sometido lavado tradicional (A) y esperma de baja (B), medio (C) y alta (D) grupos de PDGC. Barra de escala = 50 μm con 40 aumentos. Los datos fueron sometidos a ANOVA unidireccional, seguido por la prueba de Tukey-Kramer. Barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Los valores se presentan como la media ± SEM (n = 5). a-d Valores sin un superíndice común difiere (P < 0,05). El número de orificios de penetración por 0.25 mm2 (E) diferenció entre los espermatozoides aislados de los diferentes gradientes de los medios de la densidad. Espermatozoides aislados en grupos de bajo, medio y alta calidad por PDGC producen un bajo (24.40 ± 1.1), medio (33.20 ± 1.4) y alto (51.20 ± 1.3) número de agujeros de penetración, respectivamente. Los espermatozoides lavados utilizando el método tradicional producen agujeros de penetración 1,8 ± 46,40, un valor menor que el grupo de alta calidad pero más alto que los grupos de mediana y baja calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Fertilidad no sólo determina la rentabilidad de la producción animal, sino que también actúa como un medio de selección natural de especies de existencia. Es de la última función de una célula de la esperma fertilizar un óvulo. El oviducto de una hembra selecciona sólo los espermatozoides más aptos para asegurar la fertilización del óvulo23,24. In vitro los estudios también han revelado una estrecha correlación entre rasgos cualitativos espermatozoides y fertilización éxito4,11,23,24. Fertilidad reducida se asocia con baja calidad de esperma4,11,25. Como tal, requiere un procesamiento de semen para el mejoramiento de la calidad del esperma. En el arte, PDGC se ha aplicado para recoger sólo los espermatozoides de alta calidad para complementar la fertilidad de los seres humanos y animales importantes agrícola13,16,20,26. Con esta técnica, sin embargo, demostramos una técnica suave, no invasiva de la separación de bajo, medio y alta calidad de la esperma en el modelo de gallina doméstica.

El protocolo presentado de PDGC, cuando se realiza correctamente, permite la separación de espermatozoides de alta calidad no sólo, sino también una separación efectiva de esperma de calidad baja y media. El grado de éxito de PDGC depende de una cuidadosa preparación del gradiente discontinuo así como igualmente cuidadosa colección de capas aisladas. Diámetro del tubo cónico utilizado también influye en el éxito de PDGC. Hemos observado que un mayor diámetro de tubo resulta en la menor eficiencia de la técnica. Es importante que PDGC se realiza a temperatura ambiente con el fin de mantener la integridad del PDG. Las muestras previamente refrigeradas deben ajustarse a la temperatura ambiente antes de ponerlos en el PDG. El problema más común que puede observarse después de realizar PDGC es ineficiente separación; las capas aisladas no será distintas uno del otro. Si este problema se produce, además de abordar los pasos críticos anteriores, pueden corregirse reduciendo la dilución de la muestra, aumentando los volúmenes de densidad soluciones y garantizar los volúmenes de las soluciones utilizadas son iguales.

PDGC es muy adaptable. Puede utilizarse cualquier rango de densidad entre 1.00 y 1,13 g/mL para la preparación del gradiente. Hemos encontrado que soluciones de 1,07 1,08 g/mL densidad funcionan bien para la separación de los espermatozoides de pollo por calidad, pero estas densidades pueden necesitar un ajuste para otros tipos de muestras o experimental. El número de soluciones de densidad en el gradiente también puede ajustarse para adaptarse a las necesidades del experimentador. El número de grupos de calidad aislado siempre será uno más que el número de soluciones de densidad utilizados.

PDGC es mucho más efectivo que otros métodos de separación de la muestra en situaciones donde las cantidades grandes de la muestra son necesarios13,16,20,26. Ensayos de migración eficaz separan los espermatozoides de calidad más alto una muestra18,19, pero no se pueden utilizar para resolver la muestra cualquier aún más. Ensayos de migración también son incapaces de preparar grandes volúmenes de muestra18,20. Ensayos de adherencia columna separan eficazmente grandes volúmenes de muestra17; sin embargo, el proceso es perjudicial para la calidad de la esperma recopilada, hacer la confirmación de los grupos de calidad después de la separación difícil20,21. PDGC, sin embargo, tiene sus propias limitaciones. En el caso de espermatozoides mamíferos, no debe utilizarse para la preparación de muestras para fertilización in vitro , debido a la posible contaminación con endotoxinas27. El efecto de Percoll contaminación con endotoxinas no se ha investigado en otras clases de animales. Rendimiento de esperma no es afectada por endotoxinas, lo que significa que el PDGC es aún apropiada para fines de investigación.

Colección de semen por su calidad mediante la técnica PDGC será instrumental para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo estudios fisiológicos de la esperma, metabolómica, investigación transcriptómicos, proteómicos. Aplicación de esta técnica contribuirá al descubrimiento de biomarcadores de calidad de la esperma para el uso en programas de mejoramiento de la fertilidad asistida por marcadores.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Ninguno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accudenz Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA AN7050
Percoll  Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA P7828
Schiff’s reagent Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 3952016
TES Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA T1375
Eosin Y Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA E4009
Nigrosin Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 198285
ST 40R Centrifuge  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter, Brea, CA, USA No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope Olympus America Inc., PA, USA No catalogue is found

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References

  1. Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
  2. Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
  3. Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
  4. Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).
  5. Howarth, B. Jr An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
  6. Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
  7. Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
  8. Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
  9. Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
  10. Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
  11. Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
  12. Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
  13. Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
  14. Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927 (2013).
  15. Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
  16. Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
  17. Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
  18. Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World's Poultry Science Association Proceedings. , Cambridge University Press. (2010).
  19. Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
  20. Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).
  21. Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
  22. Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
  23. Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
  24. Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
  25. Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
  26. Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
  27. Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).

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Biología número 141 esperma movilidad gradiente de densidad discontinua
Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad
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Ahammad, M. U., Jarrell, Z. R.,… More

Ahammad, M. U., Jarrell, Z. R., Benson, A. P. Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (141), e58833, doi:10.3791/58833 (2018).

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