Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8⁺ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Summary

Vi beskriver her en protokoll for å undersøke cytotoksisitet av pre-aktivert CD8⁺ T celler mot kreftceller ved å registrere apoptotisk kreft celler via sanntid mikroskopi. Denne protokollen kan undersøke mekanismene bak myelogen celle-indusert T celle undertrykkelse og evaluere forbindelser å fylle T celler via blokade av undertrykkende myelogen immunceller.

Abstract

Potensiering av svulst-drapet evne til CD8⁺ T celler i svulster, sammen med deres effektiv svulst infiltrasjon, er nøkkelen til vellykket immunotherapies. Flere studier har indikert at svulsten infiltrere myeloide celler (f.eks myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs) og svulst-assosiert makrofager (TAMs)) undertrykke cytotoksisitet av CD8⁺ T celler i svulst microenvironment og at målretting disse regulatoriske myeloide celler kan forbedre immunotherapies. Her presenterer vi en i vitro analysen system for å vurdere immun undertrykkende effekter av monocytic-MDSCs og TAMs på svulst-drapet evne til CD8⁺ T celler. Dette vi først kultivert naive splenic CD8⁺ T celler med anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer i tilstedeværelse eller fravær av suppressor cellene, og deretter co kultivert pre-aktivert T cellene mål kreftceller i nærvær av en fluorogenic caspase-3 substrat. Fluorescens fra underlaget i kreftcellene ble oppdaget av sanntids fluorescens mikroskopi som en indikator på T-celle indusert svulst celle apoptose. I denne analysen, kan vi oppdage økningen av svulst celle apoptose av CD8⁺ T celler og sin undertrykkelse av pre kultur med TAMs eller MDSCs. Denne funksjonelle analysen er nyttig for å undersøke CD8⁺ T celle undertrykkelse mekanismer av regulatoriske myeloide celler og identifisere druggable mål å overvinne den via høy gjennomstrømning screening.

Introduction

Det er kjent at CD8⁺ T celler kan eliminere kreftceller når de utøve sine full cytotoksisitet. Etter aktivering av T-celle reseptor (TCR), CD8⁺ T celler spredning og differensiere i cytotoksiske Effektor celler. Utvidet og aktivert CD8⁺ T celler skiller cytotoksiske korn, inkludert perforin og granzymes, som overføres til målcellene og starte ulike lytisk trasé som caspase-3 mediert apoptose¹. CD8⁺ T celler kan også indusere svulst celle apoptose av reseptorer på målet celler, for eksempel reseptorer for tumor nekrose faktor-α (TNF-α), første apoptose signal ligand (FasL) eller TNF-relaterte apoptose-inducing ligand (sti). Videre aktivert CD8⁺ T celler skiller interferon-γ (IFN-γ) som kan undertrykke svulst celle spredning og øke sensitiviteten av kreftceller til CD8⁺ T celler via opp-regulering av FasL reseptor¹. Gitt potensialet for CD8⁺ T svulst drapet evne, flere strategier for å øke deres cytotoksisitet (f.eks checkpoint hemmere, kreft vaksinasjon og adopsjon overføring av chimeric antigen reseptor (bil) uttrykker T celler) har blitt etablert og vist signifikant terapeutisk effekt på visse typer kreft². Men samler bevis antyder at svulsten-infiltrere immunceller som regulatoriske T-celler, myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs), og svulst-assosiert makrofager (TAMs) kan undertrykke CD8⁺ T celle funksjoner og begrense effekten immunotherapies^3,4,5. For å forbedre slike immunotherapies, er det viktig å forstå hvordan immun suppressor cellene grense CD8⁺ T celle cytotoksisitet. Identifikasjon av CD8⁺ T celle undertrykkelse mekanismer samt druggable mål å overvinne den, vil kreve utvikling og utnyttelse av in vitro analyser.

Metoden gullstandarden måle CD8⁺ T celle cytotoksisitet er krom utgivelsen analysen der utgivelsen av radioaktivt sonden (⁵¹Cr), fra målet celler som er lysed av CD8⁺ T celler er bestemt⁶. Denne analysen har imidlertid flere ulemper inkludert relativt lav følsomhet, høye, manglende evne til å oppdage tidlig apoptotisk hendelser, farlig disposisjon problemer og begrenset kompatibilitet med automatisert flytende håndtering og gjenkjenning for å støtte programmer med høyere ytelse. En annen vanlig metode er flyt cytometric analyser som apoptose av mål kreftceller oppdages av annexin V bindende⁷. I denne analysen er det mulig å oppdage andre parametere som mål celledød bruker propidium iodide (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og effektor celle aktivering angitt av CD107a eller CD69 uttrykk, i tillegg til apoptose i målcellene⁷ . Denne analysen krever imidlertid stort antall suppressor cellene sammenlignet med krom utgivelsen analysen. Det krever også løsgjøring og disaggregation av tilhenger målcellene og dette kan påvirke resultatene. Faktisk krom slipper analysen eller flyt cytometric analysen brukes vanligvis ikke til å undersøke suppressor celle effekter på T celle funksjoner. I stedet måling av T-celle spredning angitt av fortynning av en fluorescerende farge (f.eks CFSE) pre-lastet inn T celler brukes ofte til å evaluere hemming av CD8⁺ T celle funksjon av suppressor cellene. Oppdagelsen av IFN-γ produksjon fra kulturperler T-celler er en annen metode å evaluere effekten av suppressor cellene på T celle aktivering^8,9. Men resultatene fra disse analyser ikke nødvendigvis samsvarer målcellen drepe evnen til CD8⁺ T celler.

Vi presenterer her en alternativ funksjonell analyse for å vurdere effekten av suppressor cellene, spesielt makrofager i metastatisk svulster, på cytotoksisitet av CD8⁺ T celler. Denne metoden angir cytotoksisitet av CD8⁺ T celler, pre kultivert med eller uten suppressor cellene i nærvær av anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer, ved å registrere svulst celle apoptose, angitt av fluorescens fra en fluorogenic caspase-3 substrat⁶ bruke automatisert time-lapse mikroskopi (figur 1). Denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med andre metoder; det krever bare et lite antall celler, gjør påvisning av tilhenger svulst celledød med høy følsomhet, kan bildet sanntid effektor til mål interaksjon og er mottakelig for høy gjennomstrømning screening.

I denne protokollen brukes metastasering-assosiert makrofager (mammaer) og deres stamfar monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isolert fra metastatisk svulster i mus som suppressor cellene. I musen modeller for metastatisk brystkreft, forskjellige innbyggere makrofager preget som F4/80^høyLy6G^-CD11b^høyLy6C^lav akkumuleres i lungene som inneholder metastatisk svulster. Denne macrophage befolkningen er sjelden funnet i normale lungene og dermed kalles metastasering-assosiert makrofager (mammaer)¹⁰. I disse musen modeller, en annen myelogen celle befolkningen, definert som F4/80^høyLy6G^-CD11b^høyLy6C^høy, også tjener hovedsakelig i metastatisk lungene hvor det gir stige til mammaer¹¹. Basert på deres egenskaper, representere CD11b^høyLy6C^høy MAM progenitor celler M-MDSCs¹².

Protocol

Alle prosedyrer som involverer mus ble utført i samsvar med lisensiert tillatelse fra UK Home Office (P526C60B3). Informasjon om kommersielle reagenser og utstyr er oppført i Tabellen for materiale.

1. utarbeidelse av målet celler som uttrykker røde fluorescerende protein i deres kjerner

1. Få en mål musen kreft cellen linje fra en riktig kilde.
   Merk: I denne protokollen, et svært metastatisk derivat E0771 musen mammary tumor celler (E0771-LG)¹³ brukes. Foreldre E0771 cellene kommer fra C57BL/6 mus¹⁴.
2. Tine og vedlikeholde ampuller med E0771-LG celler med Dulbeccos endret Eagles Medium (DMEM) med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS) i en celle kultur inkubator på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO₂.
   Merk: Det skal bekreftes at cellene er negativt for mycoplasma. Dette kultur E0771 cellene (eller celler skal testes) i 2-3 dager som beskrevet ovenfor (i fravær av antibiotika og antimycotics), samle 500 μL kultur medium. Sentrifuge middels på 12,419 x g for 60 s å eliminere celle rusk og overføre nedbryting til nye rør. Bestemme mycoplasma forurensning ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig mycoplasma test kit (se Tabell for materiale) og/eller PCR¹⁵ følge instruksjonene fra produsenten.
3. Frø 5 x 10³ E0771-LG celler per brønn i en 12-vel plate og kultur cellene med 10% (v/v) FBS-DMEM over natten i en inkubator på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO₂.
   Merk: Hvis spredning av målcellene er lav (befolkning dobling gang større enn 36 h), antall celler kan økes til 1 x 10⁴.
4. Erstatt medium med 1 mL av 10% (v/v) FBS-DMEM inkludert 10 μg/mL polybrene og tilsett 25 μL av lentiviral partikler (1 x 10⁶ TU/mL) koding en kjernefysisk begrenset røde fluorescerende protein (mKate2, se Tabellen for materiale).
5. Kultur celler for 24 timer i en inkubator på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO₂.
6. Erstatt medium med 10% (v/v) FBS-DMEM og kultur celler for 24-48 timer i en inkubator på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO₂.
7. Erstatt medium med 10% (v/v) FBS-DMEM inkludert 1 μg/mL puromycin når celler begynner å uttrykke røde fluorescerende protein og kultur cellene til de er 80-90% confluent.
   Merk: Konsentrasjonen av puromycin vil være forskjellig mellom målet cellen og bør optimeres bruke un transfekterte celler.
8. Subkultur den gjenlevende celler for 1-3 passasjer med 10% (v/v) FBS-DMEM inkludert 1 μg/mL puromycin, og cryopreserve aksjer i et flytende nitrogen damp fase lagringssystem før bruk.

2. isolering av suppressor cellene fra svulster i mus

Merk: I denne protokollen, suppressor cellene (dvs. mammaer og M-MDSCs) er isolert fra lungene som inneholder metastatisk svulster etablert av E0771-LG celler. Forhold til vevet dissosiasjon og celle sortering skal være optimalisert for å isolere cellene fra ulike vev.

1. Injisere 1 x 10⁶ celler (E0771-LG) i halen fotsporene til syngeneic (C57BL/6), kvinnelige, 7-10 uke gamle mus.
2. Etter 14 dager, isolere lungene som inneholder metastatisk svulster og forberede encellede suspensjoner fra perfused lungene via enzymatisk fordøyelsen som beskrevet tidligere¹¹.
   Merk: I denne protokollen, fire mus er injisert kreftceller og lungene metastatisk kombineres for å få tilstrekkelig suppressor cellene.
3. Inkuber enkeltcelle suspensjoner med anti-musen CD16/CD32 antistoff i 30 min på is, og flekker med fluorescerende antistoffer mot CD45, F4/80, CD11b, Ly6C og Ly6G (se Tabell for materiale) for en annen 30 min^{10,11 , 13}.
4. Vask farget cellene gang med 1 mL av PBS som inneholder 2% (w/v) bovin serum albumin (BSA), og å suspendere celle pellets med 500-1000 μL PBS som inneholder 2% (w/v) BSA.
5. Legge til 3 μM av DAPI og sortere M-MDSCs (DAPI^-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^-CD11b^høyLy6C^høy) og mammaer (DAPI^-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^-CD11b^høy Ly6C^lav) bruker celle sortering (supplerende figur 1).
   Merk: Terskelen til Ly6C nivå å skille mammaer (Ly6C^lav) og M-MDSCs (Ly6C^høy) er basert på bosatt alveolar makrofager (RMAC). Renheten av sorterte cellene måles via flowcytometri med en forventet renhet på mer enn 90%.
6. Resuspend sortert cellene med 400 μL DMEM som inneholder 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1% (v/v) ikke-essensielle aminosyren, 1 mM natrium pyruvate, og 50 nM 2-mercaptoethanol (kalt beriket-DMEM, E-DMEM).
7. Teller antallet lever celler med Trypan blå utelukkelse metoden¹⁶ og justere til 2 x 10⁶ celler/mL med E-DMEM.
8. Holde cellene på is til bruk.

3. isolering av CD8⁺ T celler fra milten av mus

1. Isolere milten fra en mus som er syngeneic til målet kreft cellen linje (dvs. C57BL/6 mus i denne protokollen) som følger:
   1. Euthanize dyret av CO₂ innånding.
   2. Plasser dyr på en ren disseksjon bord og tørke huden med 70% (v/v) etanol.
   3. Kutt abdominal huden ved hjelp av saks for å avsløre milten
   4. Isolere milten, som befinner seg underlegne magen, og plasser den i et rør som inneholder 5 mL av iskalde PBS.
2. Bruker indre stempelet til en steril 5 mL sprøyte, grind milten på en 100 μm celle sil på en 50 mL tube.
3. Cellene passere filteret totalt 10 mL PBS.
4. Sentrifuge celle suspensjon 337 x g i 5 min og Sug opp nedbryting.
5. Resuspend celle pellet i 1 mL av PBS inneholder 2 mM EDTA og 0,5% (w/v) BSA (kjører buffer) og filtrere gjennom en 40 μm celle sil.
6. Antall levende celle og justere til 1 x 10⁸ celler/mL bruker kjører bufferen.
   Merk: Holde en liten aliquot av celler som en pre berikelse prøve for en renheten sjekk.
7. Berike for CD8⁺ T celler ved hjelp av en negativ utvalg kit og magnetiske sortering (se Tabell for materiale).
   1. Overføre 1 x 10⁸ (1 mL) splenocytes cellene slik 5 mL polystyren runde bunn.
   2. Tilsett 50 μL av biotinylated antistoffer og ruge ved romtemperatur for 10 min.
   3. Tilsett 125 μL av streptavidin konjugert magnetiske perler og ruge ved romtemperatur for 5 min.
   4. Legg 1.325 mL kjører buffer, og bland forsiktig av pipettering.
   5. Sett røret i magneten og ruge ved romtemperatur for 2,5 min.
   6. Plukk opp magneten og hell beriket celle suspensjon i en ny tube.
8. Resuspend beriket cellene med 200 μL av E-DMEM (i.e., DMEM som inneholder 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1% (v/v) ikke-essensielle aminosyren, 1 mM natrium pyruvate og 50 nM 2-mercaptoethanol).
9. Teller antallet lever celler og justere til 2 x 10⁶ celler/mL med E-DMEM. Hold cellene på 37 ° C i en CO₂ inkubator før bruk.
   Merk: Holde en liten aliquot av celler som en post berikelse prøve for en renheten sjekk.
10. Bestemme renheten av CD8⁺ T celler av flowcytometri som følger:
    1. Ta 1 x 10⁴ celler fra før berikelse (trinn 3.6) eller etter berikelse (trinn 3.9) prøver og justere totale volumet av hver til 100 μL bruker kjører buffer.
    2. Inkuber enkeltcelle suspensjoner med anti-musen CD16/CD32 antistoff i 30 min på is, og flekker med fluorescerende antistoffer mot CD45, CD3, CD4 og CD8 (se Tabell for materiale) for en annen 30 min.
    3. Vask farget cellene med 500 μL PBS som inneholder 2% (w/v) BSA, og å suspendere celle pellets med 500-1000 μL PBS som inneholder 2% (w/v) BSA.
11. Legge til 3 μM av DAPI og finne ut prosentandelen av CD3⁺CD4^-CD8⁺ celler i den totale CD45⁺ celle befolkningen.

4. aktivisering og utvidelse av den isolerte CD8⁺ T celler

1. Aliquot 1 x 10⁵ celler per 50 μL CD8⁺ T celler (forberedt i trinn 3.9) i brønner av en U-bunn 96-brønns plate.
2. Legge til 1 x 10⁵ celler per 50 μL suppressor cellene (forberedt i trinn 2.7) eller 50 μL av E-DMEM i brønnene.
3. Forberede aktivering medium som består av E-DMEM, 4 x 10⁴ U/mL koloni-stimulerende faktor 1 (CSF-1), 240 U/mL interleukin-2 (IL-2), 8 μg/mL anti-musen CD3ε antistoffer og 16 μg/mL anti-musen CD28 antistoff.
   Merk: CSF-1 er ikke nødvendig for T celle aktivering, men er avgjørende for overlevelse av suppressor cellene i denne protokollen (dvs. mammaer og M-MDSCs). Dermed er det beholdt i T-celler med målet cellene til å beholde konsekvensen i oppdrettsforholdene co kultur. Siden CSF-1 er funnet i nano-molar konsentrasjonene i alle vev og kreves for monocytt/macrophage levedyktighet i vivo, er dette en fysiologisk kontekst for disse cellene.
4. Tilsett 50 μL av aktivisering medium (trinn 4.3) og 50 μL av E-DMEM med eller uten reagenser skal testes.
5. Plasser platen i en inkubator på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO₂ og kultur cellene for 4 dager.

5. oppsett av co kultur målet celler med pre-aktivert CD8⁺ T celler

1. Legge til 30 μL av 1: 100 utvannet vekst faktor-redusert løselig kjelleren membran matrix (Tabell for materiale) i brønnene flat bunn 96-brønns plate egnet for mikroskopi og ruge på 37 ° C i en CO₂ inkubator minst 1t.
2. Forberede målcellene (dvs. E0771-LG celler uttrykke kjernefysiske begrenset røde fluorescerende protein).
   1. Inkuber målcellene med 1 mL av 0,05% trypsin/EDTA ved romtemperatur for 1 min, og høste celler av mild pipettering.
   2. Legg 9 mL DMEM inkludert 10% (v/v) FBS, og sentrifuge celle suspensjon 337 x g i 5 min.
   3. Nytt suspendere cellene med 500 μL E-DMEM, og Tell antallet lever celler.
      Merk: Før telling målcellene, filtrere cellene gjennom en 40μm celle sil å produsere enkeltcelle suspensjon.
   4. Juster tettheten til 2 x 10⁴ celler/mL (= 1 x 10³ celler per 50 μL) ved å legge til E-DMEM, og holde cellene på is.
3. Forberede Effektor celler (dvs. pre-aktivert CD8⁺ T celler).
   1. Resuspend cellene i en brønn av 96-brønns plate (trinn 4.5) grundig av pipettering og overføring av flytende CD8⁺ T celler i en ny 1,5 mL tube.
      Merk: Mammaer og M-MDSCs tett overholder brønnen og er ikke koblet fra av den pipettering.
   2. Samle gjenværende celler, legge til 200 μL av PBS i brønnen og overføre til røret i trinn 5.3.1.
   3. Vaske cellene med 1 mL av E-DMEM en gang (sentrifuger 337 x g) i 5 min, Sug opp og kaste nedbryting), og resuspend dem med 100 μL E-DMEM.
   4. Teller antallet lever celler (ved hjelp av metoden trypan blå utelukkelse), Juster tettheten til 1,6 x 10⁵ celler/mL (= 4 x 10³ celler/25 μL) og holde cellene på is.
4. Sug opp kjelleren membran matrix fra hver brønn av platen i trinn 5.1.
5. Tilsett 1 x 10³ celler/50 μL av målcellene (trinn 5.2.4) i hver brønn og bland godt.
   Merk: For å unngå kanteffekter på grunn av fordamping av medium, bare indre 60 brønnene på 96 godt platen bør brukes for analyse.
6. Legg til 25 μL E-DMEM inkludert 4 x 10³ U/mL IL-2 og 10 μM fluorogenic caspase-3 substrat (se Tabell for materiale).
7. Legge til 4 x 10³ celler/25 μL CD8⁺ T celler (trinn 5.3.4) i passende brønner og bland godt.
   Merk: Tilstedeværelsen av for mange celler i et godt gjør analysen vanskeligere. I denne modellen, en 4:1 effektor: målet forhold (total-celle nummer 5 x 10³ celler/vel) var optimal, men en 8:1-forhold var suboptimal. Brønner som inneholder følgende fire kontroller er nødvendig for å hjelpe med dataanalyse: målet celler ved tetthet brukes for co kultur brønnene (1 x 10³ celler/vel) i medium med og uten caspase-3 underlaget, Effektor celler (1 x 10³ celler / Vel) i medium med og uten caspase-3 substrat.
8. Tilsett 200 μL PBS eller sterilt vann i alle tomme brønner (spesielt wells i utkanten av platen) for å redusere fordampning av medium fra experimental brønner.
9. Stille inn platen i time-lapse fluorescens mikroskop som vedlikeholdes på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO₂.
   Merk: Riste platen i et kryss-mønster å distribuere alle celler jevnt, og deretter la platen skal være i romtemperatur på flatt underlag for 10-20 minutter før du overfører til inkubator.

6. imaging cellene

Merk: Detaljert bilde oppkjøpet innstillingene varierer med mikroskopet og fluorophores brukes; følgende generelle oppkjøpet parametere bør brukes for optimale resultater.

1. Bruker en passende autofokus rutine på mikroskopet, hente bilder som dekker minst 25% av det samlede arealet i hver eksperimentelle godt av 96-brønns plate.
2. Satt mikroskop for å hente bilder i kontrast samt en fluorescerende kanal egnet for kjernefysisk begrenset røde fluorescerende protein (mKate2) og en fluorescerende kanal egnet for den grønne fluorogenic aktivert caspase-3 substrat (med eksitasjon på 488 nm) (figur 2).
3. Ta bilder i eksperimentell brønner i fase kontrast og 2 fluorescerende kanaler hver 1 til 3 h minst 72 h.

7. bildeanalyser med analyseprogramvare

Merk: Detaljert bildeinnstillinger varierer avhengig av programvaren som brukes (se Tabell for materiale); Følgende generell analyse bør anvendes for optimale resultater.

1. Fastslå om spectral un miksing er nødvendig å skille fluorescerende signalet fra målet cellen kjerner fra som slippes ut av apoptotisk kjerner og eventuelt sette opp en analyse protokoll å oppnå dette.
   1. Vis en kontroll godt som inneholder bare målcellene (mkate2-merket) i medium uten caspase-3 underlaget i den grønne fluorescerende kanalen.
   2. Observere om grønne fluorescens slippes av røde kjerner (kjerner vises grønne)
   3. Hvis grønne fluorescens i kjerner, få tilgang til spectral unmixing kontrollen i tenkelig programvare og øke prosentandelen av rød fjernet fra grønt til grønne signalet forsvinner (i vår erfaring, dette er vanligvis 6-7% for lyse mKate2 fluorescens).
   4. Hvis grønne fluorescens ikke er synlig i noen kjerner, er ingen spectral unmixing nødvendig.
      Merk: Denne spectral unmixing korreksjon testen kan også utføres ved hjelp av en godt av målcellene i medium som inneholder caspase-3 substrat. Men er det vanligvis et svært lavt nivå av spontane apoptose i målcellene (mindre enn 10%), som resulterer i noen målet cellen kjerner emitting grønne fluorescens på grunn av aktivering av caspase-3 i stedet for fluorescens blø gjennom. Sant fluorescens blø gjennom er tydelig under disse forholdene når grønne fluorescens er tydelig i alle kjerner.
   5. Vise en kontroll som også inneholder bare Effektor celler (kjerner umerkede) i medium uten caspase-3 underlaget i røde og grønne kanalen individuelt.
   6. Observere om grønn eller rød fluorescens slippes av kjerner. Hvis verken røde eller grønne fluorescens i enkeltkanalene er ingen spectral unmixing nødvendig.
      Merk: I vår erfaring, musen CD8⁺ T celler er ikke auto-fluorescerende og dermed ingen spectral unmixing er nødvendig for disse cellene. Denne spectral unmixing korreksjon testen kan også utføres ved hjelp av en godt Effektor celler i medium som inneholder caspase-3 substrat. Det er imidlertid vanligvis noen grad av spontane apoptose resulterer i effektor celle kjerner emitting grønne fluorescens på grunn av aktivering av caspase-3. Sant fluorescens blø gjennom er tydelig under disse forholdene når grønne fluorescens er tydelig i alle kjerner.
2. Bruke en fluorescens bakgrunn subtraksjon metode (f.eks TopHat), med relevante parametere for prøven, løse fluorescerende objektene i begge fluorescerende kanaler.
   Merk: I den grønne kanalen brukt vi TopHat (kjerner radius = 10,0 µm, grønne fluorescens terskelen = 0,7 grønne kalibrering enheter). I den røde kanalen vi brukt TopHat (kjerner radius = 10,0 µm, røde fluorescens terskelen = 0,5 røde kalibrering enheter).
3. Bruke riktige parameterne for kanten-deling for å løse enkelte fluorescerende kjerner.
   Merk: Vi brukte ikke kanten deling i grønn eller rød fluorescens kanalen.
4. Bruke bilder i den røde kanalen fra brønnene som inneholder bare målcellene (med caspase substrat) for å finne den minste størrelsen på målet kjerner.
   Merk: Vi brukte 80 µm².
5. Bruke bilder i den grønne kanalen fra brønnene som inneholder bare Effektor celler (med caspase substrat) for å fastslå den gjennomsnittlige størrelsen på apoptotisk effektor kjerner.
   Merk: Single apoptotisk effektor kjerner fra 40 – 80 µm² i disse eksperimentene.
6. Sette opp en analyse-prosedyre for å telle antall fluorescerende målet cellen kjerner bruker en passende minimumsstørrelsen begrensning (f.eks minimum området, minimumsdiameteren) (figur 2, målet oppdagelsen maske).
   Merk: Vi brukte et minimum kjerner område (rød fluorescens) = 80 µm².
7. Definere en analyse-prosedyre for å telle antall apoptotisk kjerner som er større enn betyr størrelsen på apoptotisk effektor kjerner (figur 2, størrelse begrenset apoptose maske).
   Merk: Størrelse filter ble satt til 80 µm² (dvs. bare områder av grønne fluorescens større enn denne ble telt, dermed unntatt én apoptotisk effektor kjerner). Disse parameterne øker nøyaktigheten av analysen i teller apoptotisk målet cellen kjerner selv om noen aggregater apoptotisk Effektor celler kan telles.
8. Sette opp en analyse-prosedyre å telle antall apoptotisk målet celler ved å telle kjerner hvor rød fluorescerende signal (fra trinn 7.6) og størrelse-begrenset grønt fluorescerende signal (fra trinn 7.7) betydelig co lokalisere (figur 2, R /G overlapping maske).
   Merk: En passende co lokalisering kan variere fra 30% til 100% av gjennomsnittlig målet kjerner. Overlapping størrelse filter ble satt til 40 µm².
9. Bestem antallet apoptotisk målet cellen kjerner samt antall målet cellen kjerner i brønnene for hvert eksperimentelle vilkår gjennom hele tiden.

8. dataanalyse ved hjelp av beregning og grafiske programvare

1. Vise antall apoptotisk målet cellen kjerner fikk i trinn 7.9 gjennom hele tiden de eksperimentelle brønner. Hvis flere brønner ble brukt for hver eksperimentelle betingelse, grafisk presentere resultatene som betyr ± standardavvik.
2. Beregne apoptotisk delen av befolkningen i målcellene ved å dele antall apoptotisk celler i hver brønn på antall målcellene i hver brønn på hvert tidspunkt.
3. Vise resultatene i trinn 8.2.
4. Bestemme området under kurven (AUC) for hver kurve. Topp apoptotisk andel av befolkningen for hver kurve bestemmes også samt tidspunktet der toppen oppstår, om ønskelig. Fastslå om AUC bestemt for eksperimentelle forhold er vesentlig annerledes bruker passende statistiske tester.
   Merk: Kortet t-test med welchs korreksjon ble brukt AUC resultatene.

Representative Results

Denne metoden er basert på enkel co kultur av målet kreftceller med effektor CD8⁺ T celler som har vært pre kultivert med eller uten suppressor cellene i nærvær av anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer. Den oppdager CD8⁺ T celle-indusert kreft celle apoptose over tid etter co kultur, dermed muliggjør evaluering av virkningene av suppressor cellene på cytotoksisitet av CD8⁺ T celler.

Vanligvis kreftceller øke grønne fluorescens i sine atomkjerner etter aktivering av en kjernefysisk målretting caspase biosensor når disse cellene ta kontakt med CD8⁺ T celler som er pre-aktivert av antistoffer i fravær av suppressor cellene ( Figur 3; Sekvenser komplementære filmen 1). Grønne fluorescens fra caspase underlaget var synlig minst 15 h etter apoptose ble startet. Noen spontan apoptose av effektor CD8⁺ T celler ble også observert over tid selv om disse cellene ble kultivert isolert (Figur 4; Sekvenser komplementære filmen 2). Imidlertid kjerner størrelser CD8⁺ T celler er mindre enn kreftceller og dermed apoptotisk 'effektor' celler kan bli ekskludert fra apoptotisk 'mål' celle teller av en størrelse begrensningen bildet analysemetode (figur 2 og Figur 4). Selv om noen mål kreftceller viser en liten avrundet form uten grønne fluorescens, påvirke dette ikke analyse som disse cellene gjennomgår mitose i stedet for apoptose (supplerende Movie 3), og dermed er utelukket fra apoptotisk "mål" cellen teller av en rød/grønn overlapping (supplerende figur 2). Spontan apoptose av mål kreftceller finnes sporadisk i enkelt kultur (supplerende Movie 3). Imidlertid co kultur målet kreft celler med pre-aktivert CD8⁺ T celler økt svulst celle apoptose over nivåene av spontane apoptose i monokultur av kreftceller (Figur 4). Vanligvis når du bruker en optimal ratio på målet celler Effektor celler, kan en topp i antall apoptotisk mål kreftceller observeres (figur 5A). Denne toppen er tydeligere når dataene er uttrykt som apoptotisk brøkdel av cellen målgruppen (figur 5B). I dette eksperimentet de basale apoptose av mål kreftceller nådde 24 h (med apoptotisk brøkdel = 0,08), men CD8⁺ T celle-indusert apoptose nådd maksimalt nivå på 17 h (med apoptotisk brøkdel = 0,66).

Vi fant videre at CD8⁺ T celler pre inkubert med mammaer eller M-MDSCs kan gjøre kontakt mål kreftceller, men denne kontakten syntes å føre til færre tilfeller av kreft celle apoptose sammenlignet CD8⁺ T celler pre-aktivert uten Suppressor cellene (Figur 3 og Figur 4; Sekvenser komplementære filmen 4 og supplerende film 5). Selv om CD8⁺ T celler pre inkubert med myeloide celler sporadisk indusert kreft celle apoptose, det var også noen spredning av målet celler som ikke har blitt stimulert gjennomgå apoptose løpet tid av den eksperiment (supplerende filmen 6). Samsvar med disse funnene, topp brøkdel av apoptotisk kreftceller kultivert med CD8⁺ T celler pre inkubert med myeloide celler (apoptotisk brøkdel = 0,38 på 23t for MDSC-E og 0,25 på 20 h MAM-e) var betydelig lavere enn kreftceller kultivert med CD8⁺ T celler som ikke var pre inkubert med suppressor cellene (figur 6).

Figur 1: et oppsett som viser den eksperimentelle prosedyren. Naive splenic CD8⁺ T celler er kultivert med anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer med eller uten metastasering-assosiert makrofager (mammaer) eller monocytic-myelogen-avledet suppressor cellene (M-MDSCs). Etter 4 dager, flytende CD8⁺ T celler er samlet og co kultivert mål kreftceller i nærvær av fluorogenic caspase-3 substrat. Apoptotisk kreftceller oppdages under sanntid fluorescens mikroskopi. Bilder vist anskaffet bruk en levende celle-imaging plattform (se Tabell for materiale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Identifikasjon av apoptotisk målcellene forskjellig fra apoptotisk Effektor celler. Øverste rad: bildeopptak i den røde kanalen kan identifikasjonen av målet cellen kjerner av målet gjenkjenning (rosa analyse maske). Midtre rad: bilder i den grønne kanalen angi apoptotisk mål og Effektor celler. Asize begrenset apoptose maske (Blågrønn analyse maske; større enn 80 µm²) kan enkelt apoptotisk Effektor celler skal utelates fra analyse. Nederste rad: kompositt bilder flettede røde og grønne kanaler med fase kontrast bilde (venstre) eller rød/grønn overlapper maske (høyre). Identifikasjon av samlokalisert, størrelse-begrenset grønne fluorescens med røde fluorescens (gul analyse maske), kan mer nøyaktig oppdagelse av apoptotisk mål kjerner (gul pilspiss) ved å ekskludere aggregater apoptotisk Effektor celler (hvit pilspisser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Samspillet mellom CD8⁺ T celler og kreftceller. Stillbilder fra representant time-lapse filmer av målet E0771-LG_NLR celler (T) co kultivert med effektor CD8⁺ T celler (E) på 4:1 effektor/target ratio. MDSC-E og MAM-E angir Effektor celler pre inkubert med M-MDSCs og mammaer henholdsvis. Sammensatte bilder (inkludert bilder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler) vises. Pilspisser sporer de samme cellene gjennom de ulike feltene og tidspunkt. Gul pilspisser: et mål som knytter effektor og gjennomgår apoptose, hvit pilspisser: et mål som knytter effektor men gjennomgår apoptose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: gjenkjenning av apoptotisk kreftceller. Representant felt utvunnet fra time-lapse filmer på 18 h etter bildebehandling. Sammensatte bilder (venstre, fase kontrast, røde og grønne kanaler) og bilder fra røde kanalen uten (midten) eller masken (gul) vises med (høyre) rød/grønn overlapping. Gule prikker i høyre kolonne representerer apoptotisk kreftceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: CD8⁺ T celle-indusert kreft celle apoptose. (A) antall apoptotisk kreftceller kulturperler med effektor C8⁺ T celler på ulike effektor målet forhold (E:T). (B) apoptotisk brøkdel av cellen målgruppen. Dataene er betyr ± SD. mener området under kurven (AUC) vises også. Unpaired t-test med welchs korreksjon ble brukt til å analysere AUC. * P < 0,0001 sammenlignet med E:T = 0:1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Effekter av svulst-infiltrere myeloide celler på cytotoksisitet av CD8⁺ T celler. (A) antall apoptotisk kreftceller (mål: T) kultivert med C8⁺ T celler (effektor: E) på 4:1 av E:T forhold. CD8⁺ T celler ble pre kultivert i fravær (svart sirkel) eller tilstedeværelse av monocytic-myelogen-avledet suppressor cellene (MDSC-E: blå sirkel) eller metastasering-assosiert makrofager (MAM-E: rød sirkel). Dataene er ± SD. (B) apoptotisk brøkdel av cellen målgruppen. Dataene er betyr ± SD. mener AUC vises også. Unpaired t-test med welchs korreksjon ble brukt til å analysere AUC. * P < 0,0001 forhold til T, ^#P < 0,0001 sammenlignet med E + T. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1. Gating strategi å isolere suppressor cellene fra metastatisk lungene. (A) representant dot tomter å isolere monocytic myelogen-avledet suppressor cellene (M-MDSCs) og metastasering-assosiert makrofager (mammaer). Terskelen til Ly6C nivå å skille mammaer (Ly6C^lav) og M-MDSCs (Ly6C^høy) er basert på bosatt alveolar makrofager (RMAC). (B) renheten av de sorterte M-MDSCs (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^høy) og mammaer (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^lav). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Representant bilder av mitotisk målcellene. Stillbilder fra representant time-lapse filmer av målet E0771-LG_NLR celle mono-kultur. Topp: kompositt bilder inkludert bilder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler. Bunnen: sammensatte bilder (rød og grønn kanaler) med rød/grønn overlappe maske. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3. Effekter av svulst-infiltrere myeloide celler på spredning av CD8⁺ T celler. (A) representant histogrammer viser fortynning av fluorescerende merking med CFSE i CD8⁺ T celler. Naive splenic CD8⁺ T celler ble isolert som beskrevet i Protocol-3 og merket med 5 µM av CFSE på 37 ° C i 15 min. De merkede T-cellene var kulturperler i nærvær av IL-2 og anti-CD3/CD28 aktivere antistoffer med eller uten myeloide celler som beskrevet i protokoll 4. Etter 4 dager, ble grønne fluorescens i T celler oppdaget av flyt cytometer. (B) divisjon indeks over CD8⁺ T celler beregnet som beskrevet tidligere¹⁷. Data er betyr ± SEM. * P < 0,01 sammenlignet kontroll, ^#P < 0,05 sammenlignet med αCD3/CD28 Ab. Klikk her for å laste ned denne filen.

Sekvenser komplementære filmen 1. Film av tall 3 og 4; E + T. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende film 2. Film av tall 3 og 4; Effektor (E). Klikk her for å laste ned denne filen.

Sekvenser komplementære filmen 3. Film av tall 3 og 4; Mål (T). Klikk her for å laste ned denne filen.

Sekvenser komplementære filmen 4. Film av tall 3 og 4; MDSC-E + T. Klikk her for å laste ned denne filen.

Sekvenser komplementære filmen 5. Film av tall 3 og 4; MAM-E + T. Klikk her for å laste ned denne filen.

Sekvenser komplementære filmen 6. Film av tall 3 og 4; MAM-E + T (spredning). Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne metoden er basert på to separate co kultur trinn: co dyrking CD8⁺ T celler med potensielle suppressor cellene og co dyrking av pre-betinget CD8⁺ T celler med mål kreftceller (figur 1). Steg 1 co kultur er ganske ligner CD8⁺ T celle spredning analyser vanligvis brukes til å fastslå effekten av suppressor cellene på CD8⁺ T celle-funksjonen. Men samsvarer T celle spredning ikke alltid med deres cytotoksisitet. For eksempel vi har funnet at co kultur med M-MDSCs eller mammaer økt i stedet for redusert spredning av CD8⁺ T celler i nærvær av CD3/CD28 aktivere antistoffer (supplerende figur 3), mens disse pre betinget CD8⁺ T-celler viste redusert cytotoksisitet mot målet celler (Figur 4, figur 5, figur 6). Disse resultatene markere betydningen av evalueringen av funksjonelle aktiviteten, dokumentert av målet kreft celle apoptose, som denne CD8⁺ T celle cytotoksisitet analysen.

I denne analysen, har vi identifisert som CD8⁺ T celler krever ca 15 h co kultur for å indusere maksimal apoptose av E0771-LG musen mammary kreftceller (figur 5). Denne forsinkelsen kan skyldes lag mellom første kontakt Effektor celler med mål samt tilhørende immun synapse dannelse og tiden det tar å indusere apoptotisk signaler i mål målt ved aktivering av caspase-3 (supplerende film 1 ). Vi har også identifisert som antall apoptotisk tumorceller nådd et platå etter 24 h, som er trolig på grunn av eliminering av mål av T-celler og/eller tap av fluorescerende signal fra døde celler. Denne evnen til å identifisere av topp apoptose er en stor fordel av denne analysen siden bestemmelse av en optimal tidspunkt er viktig for riktig sammenligninger mellom ulike forhold. I vårt tilfelle for eksempel forskjellen i cytotoksisitet mellom kontroll CD8⁺ T celler og MDSC/MAM-utdannede CD8⁺ T celler var mye større på 15-18 h sammenlignet med 72 h (figur 5), og dermed et sluttpunkt eksperimentere med en 72 h inkubasjonstid ville gi misvisende resultater.

Denne metoden kan også visualisering av sanntids effektor til mål celle interaksjon, som gir bedre innsikt i mekanismen underliggende begrenset cytotoksisitet av CD8⁺ T celler pre inkubert med suppressor cellene. For eksempel vi observerte at CD8⁺ T celler pre inkubert med M-MDSCs eller mammaer oppdaget og interaksjon med mål kreftceller, men ikke alltid få apoptose (supplerende Movie 4, utfyllende film 5, utfyllende filmen 6). Selv om vi ikke tallfeste denne hendelsen, ville det være mulig og interessant å kvantifisere og sammenligne andelen møter og samhandling tiden sammen med apoptose induksjon. En annen stor fordel er at denne metoden krever et lite antall celler (f.eks 1 x 10³ mål) og 4 x 10³ Effektor celler per brønn. Faktisk kan denne protokollen videre miniatyriserte for 384-vel plate format hvis ønskelig. Derfor er denne analysen egnet for høy gjennomstrømning screening og eksperimenter der cellen tallene er begrenset som i vitro testing ved bruk av dyrebare celler avledet fra i vivo eller ex vivo prøver.

På den annen side, er en begrensning av gjeldende analysen tilstedeværelsen av betydelig antall døde Effektor celler i noen forhold. For å øke nøyaktigheten i atskillende apoptose av mål kreftceller enn effektor CD8⁺ T celler, kjerner i målet celler er merket og en kjerner størrelsesbegrensningen (som utelukker Effektor celler) brukes for dataanalyse i dette analysen (figur 2). Men er det noen tilfeller der overlegg av aggregater av (grønn) apoptotisk CD8⁺ T celler på ikke-apoptotisk mål kreftceller, som kan forvirre resultatene. Denne begrensningen kan begrenses ved bruk av en død celle fjerning kolonne på Effektor celler før co kultur med mål kreftceller, forutsatt at tilstrekkelig antall Effektor celler er tilgjengelig. Med mer komplekse mikroskopi systemer, det kan også være mulig å redusere falske positive signalet ved merking effektor CD8⁺ T celler med en fluorophore forskjellig fra målet cellen kjerner og fluorogenic caspase-3 underlaget.

Så langt denne protokollen blitt benyttet for å undersøke antigen uspesifisert aktivering av CD8⁺ T celler. Selv om MDSCs og TAMs i svulst microenvironment undertrykke T celle funksjoner gjennom antigen uspesifisert mekanismer, undertrykke MDSCs i perifere lymfoide vev T celle svar i en antigen bestemt måte¹⁸. Undersøke immun undertrykkende funksjoner slik celletyper, i vitro spredning analysen bruker CD8⁺ T celler fra OT-1 transgene mus er vanlig. I denne analysen, OT-1 T-celler (uttrykke ovalbumin (OVA) bestemt T-celle reseptor) er co kultivert med suppressor MDSCs i nærvær av OVA peptider som gjelder for den første kulturen i analysen vår cytotoksisitet (i.e., aktivering av T celler i tilstedeværelse eller fravær av suppressors). Det er også mulig å manipulere mål kreftceller å uttrykke OVA, som kan indusere antigen-spesifikke kreft cellen dreping av OT-1 T celler. Derfor vil analysen også aktivere undersøkelse av MAM/MDSC-mediert undertrykkelse av antigen-spesifikke T celle aktivering. Det er også mulig å bruke analysen for å undersøke menneskelige celler, aktivisering antistoffer mot CD3 og CD28 er kommersielt tilgjengelig, og en protokoll for å isolere menneskelige TAMs fra klinisk prøver har vært etablert¹⁹.

Kollektivt denne analysen er ganske allsidig og kan brukes til å undersøke cytotoksisitet andre immun celletyper. Foreløpig i våre laboratorier, det blir utvidet for å undersøke antigen-avhengig celle cytotoksisitet under ulike forhold, og er også utviklet for høy gjennomstrømning screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
12-Well Cell Culture Plate	Freiner Bio-One	665-180
1x PBS	Gibco	14190-094
2-mercaptethanol	Sigma	M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube	FALCON	352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )	Costar	3799	Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom)	Nunc	165305	Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody	BIO-RAD	MCA497A647	Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody	Biolegend	100730	Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody	Biolegend	102111	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody	Biolegend	100314	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100236	Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody	Biolegend	128026	Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum Albmin	Sigma	A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon)	FALCON	352360	To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon)	FALCON	352340	To filter the lung digestion
DAPI	Biolegend	422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium	Gibco	41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit	StemCell Technologies	19853
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100406	Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use	Gibco	A1596-01	Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent	Essen BioScience	4476	Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		Analysis software
L-Glutamine (100X)	Gibco	A2916801
Lung Dissociation Kit	Miltenyi	130-095-927	Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
Non-essential amino acid (100X)	Gibco	11140-035
NucView488	Biotium	10403	Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127607	Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101216	Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen Strep	Gibco	15140-122	Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103132	Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma	H9268
Puromycin	Gibco	A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301
Recombinant murine IL-2	Peprotech	212-12	Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X)	Gibco	11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	101320
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)  : Green channel excitation: 440 - 480 nm  : Green channel emission: 504 - 544 nm  : Red channel excitation: 565-605 nm  : Red channel emission: 625 - 705 nm