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Cancer Research

इन विट्रो में के वास्तविक समय का पता लगाने ट्यूमर सेल Apoptosis सीडी 8 द्वारा प्रेरित+ टी कोशिकाओं ट्यूमर घुसपैठ माइलॉयड कोशिकाओं की प्रतिरक्षा दमन कार्यों का अध्ययन करने के लिए

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/58841
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 3,4
1Royal (Dick) School of Veterinary Studies and Roslin Institute, University of Edinburgh, 2MRC Centre for Reproductive Health, University of Edinburgh, 3Edinburgh Phenotypic Assay Centre, University of Edinburgh, 4Cancer Research UK Edinburgh Centre, MRC Institute of Genetics, Molecular Medicine, University of Edinburgh
* These authors contributed equally

Summary

हम यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए cytotoxicity की जांच पूर्व सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं के खिलाफ कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने के द्वारा अपोप्तोटिक कैंसर कोशिकाओं के माध्यम से वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी. इस प्रोटोकॉल माइलॉयड सेल के पीछे तंत्र की जांच कर सकते हैं-प्रेरित टी सेल दमन और प्रतिरक्षा दमन माइलॉयड कोशिकाओं की नाकाबंदी के माध्यम से टी कोशिकाओं की भरपाई के उद्देश्य से यौगिकों का मूल्यांकन ।

Abstract

ट्यूमर के Potentiation-हत्या की क्षमता के ट्यूमर में सीडी 8+ टी कोशिकाओं, उनके कुशल ट्यूमर घुसपैठ के साथ-साथ, सफल immunotherapies का एक प्रमुख तत्व है । कई अध्ययनों से संकेत दिया है कि ट्यूमर माइलॉयड कोशिकाओं घुसपैठ (उदाहरण के लिए, माइलॉयड-व्युत्पंन दमन कोशिकाओं (MDSCs) और ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs)) सीडी 8 के cytotoxicity को दबाने+ ट्यूमर microenvironment में टी कोशिकाओं, और है कि लक्ष्यीकरण इन विनियामक माइलॉयड कोशिकाओं immunotherapies सुधार कर सकते हैं । यहां, हम एक इन विट्रो परख प्रणाली में मौजूद monocytic के प्रतिरक्षा दमन प्रभाव का मूल्यांकन-MDSCs और ट्यूमर पर TAMs की हत्या की क्षमता सीडी 8+ टी कोशिकाओं । इस अंत करने के लिए, हम पहले विरोधी के साथ भोली प्लीहा सीडी 8+ टी कोशिकाओं CD3/CD28 उपस्थिति या दमन कोशिकाओं के अभाव में एंटीबॉडी को सक्रिय करने, और फिर सह-संस्कृति एक fluorogenic की उपस्थिति में लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के साथ पूर्व सक्रिय टी कोशिकाओं caspase-3 सब्सट्रेट. कैंसर की कोशिकाओं में सब्सट्रेट से प्रतिदीप्ति टी सेल प्रेरित ट्यूमर सेल apoptosis के एक संकेतक के रूप में वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया गया था. इस परख में, हम सफलतापूर्वक TAMs या MDSCs के साथ पूर्व संस्कृति द्वारा सीडी 8+ टी कोशिकाओं और इसके दमन द्वारा ट्यूमर सेल apoptosis की वृद्धि का पता लगा सकते हैं । इस कार्यात्मक परख सीडी 8+ विनियामक माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा टी सेल दमन तंत्र की जांच और druggable लक्ष्य की पहचान करने के लिए यह उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के माध्यम से उबरने के लिए उपयोगी है ।

Introduction

यह ज्ञात है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं ट्यूमर कोशिकाओं को समाप्त कर सकते हैं जब वे अपने पूर्ण cytotoxicity डालती. टी सेल रिसेप्टर (TCR) के सक्रियकरण के बाद, सीडी 8+ टी कोशिकाओं पैदा करना और साइटोटोक्सिक प्रभाव कोशिकाओं में अंतर. विस्तारित और सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं साइटोटोक्सिक granules, perforin और granzymes, कि लक्ष्य कोशिकाओं में स्थानांतरित कर रहे हैं और इस तरह lytic-3 मध्यस्थता caspase1के रूप में विभिन्न apoptosis रास्ते आरंभ सहित स्रावित. सीडी 8+ टी कोशिकाओं को भी इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक के लिए रिसेप्टर्स के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं, पर रिसेप्टर्स सक्रिय द्वारा ट्यूमर कोशिका apoptosis प्रेरित कर सकते हैं-α (TNF-α), पहले apoptosis संकेत ligand (FasL), या TNF से संबंधित apoptosis-उत्प्रेरण ligand (ट्रेल). इसके अलावा, सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं इंटरफेरॉन स्रावित-γ (IFN-γ) कि ट्यूमर सेल प्रसार को दबाने और सीडी 8 रिसेप्टर1के विनियमन के माध्यम से FasL+ टी कोशिकाओं के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं । सीडी 8+ टी ट्यूमर हत्या की क्षमता के लिए क्षमता को देखते हुए, कई रणनीतियों उनके cytotoxicity को बढ़ावा देने के लिए (जैसे, चौकी अवरोधकों, कैंसर टीकाकरण, और chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) एक्सप्रेस टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण) की स्थापना की गई है और2कैंसर के कुछ प्रकार पर महत्वपूर्ण उपचारात्मक प्रभाव दिखाया । हालांकि, सबूत जमा पता चलता है कि ट्यूमर-ऐसी नियामक टी कोशिकाओं, माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (MDSCs), और ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ सीडी 8+ टी सेल कार्यों को दबा सकते है और प्रभावकारिता को प्रतिबंधित की immunotherapies3,4,5. ऐसे immunotherapies को सुधारने के लिए यह समझना जरूरी है कि प्रतिरक्षा दमन कोशिकाओं की सीमा सीडी 8+ टी कोशिका cytotoxicity कैसे होती है. सीडी 8 की पहचान+ टी सेल दमन तंत्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से druggable लक्ष्य इसे दूर करने के लिए, के विकास और उपयोग में इन विट्रो परख की आवश्यकता होगी ।

सीडी 8+ टी सेल cytotoxicity को मापने के सोने के मानक विधि क्रोमियम रिलीज परख जिसमें रेडियोधर्मी जांच (५१Cr), लक्ष्य कोशिकाओं है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं द्वारा लीजड ड है से जारी है,6निर्धारित है । हालांकि, इस परख अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता, उच्च पृष्ठभूमि सहित कई कमियां है, जल्दी अपोप्तोटिक घटनाओं, खतरनाक निपटान की समस्याओं का पता लगाने में असमर्थता, और स्वचालित तरल हैंडलिंग के साथ और सीमित संगतता का पता लगाने के लिए समर्थन उच्च प्रवाह अनुप्रयोगों । एक अंय आम विधि प्रवाह cytometric विश्लेषण जिसमें लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के apoptosis annexin V बाध्यकारी7द्वारा पता चला है । इस परख में, यह लक्ष्य सेल मौत propidium आयोडाइड (PI) या 7-aminoactinomycin डी (7-AAD) और प्रभाव सेल सक्रियकरण CD107a या CD69 अभिव्यक्ति, लक्ष्य कोशिकाओं में apoptosis के अलावा द्वारा संकेत का उपयोग कर के रूप में अंय मानकों का पता लगाने के लिए संभव है7 . हालांकि, इस परख क्रोमियम जारी परख की तुलना में दमन कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है । यह भी अनुयाई लक्ष्य कोशिकाओं की टुकड़ी और विसमुच्चय की आवश्यकता है और यह परिणाम पूर्वाग्रह कर सकते हैं । दरअसल, क्रोमियम जारी परख या प्रवाह cytometric परख सामांयतः टी सेल कार्यों पर दमन सेल प्रभाव की जांच के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । इसके बजाय, टी सेल प्रसार की माप एक फ्लोरोसेंट डाई के कमजोर पड़ने से संकेत (जैसे, CFSE) पूर्व टी कोशिकाओं में लोड अक्सर दमन कोशिकाओं द्वारा सीडी 8+ टी कोशिका समारोह के निषेध का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कल्चरल टी कोशिकाओं से IFN-γ उत्पादन का पता लगाना एक अन्य मानक विधि टी सेल सक्रियकरण8,9पर दमन कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है । हालांकि, इन परख से परिणाम जरूरी लक्ष्य सेल सीडी 8+ टी कोशिकाओं की हत्या की क्षमता को सहसंबंधी नहीं है ।

हम यहां मौजूद एक वैकल्पिक कार्यात्मक परख दमन कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, विशेष रूप से मेटास्टेटिक ट्यूमर में मैक्रोफेज, सीडी 8 के cytotoxicity पर+ टी कोशिकाओं । इस विधि सीडी 8+ टी कोशिकाओं के cytotoxicity निर्धारित करता है, के साथ या विरोधी CD3/CD28 की उपस्थिति में शमन करनेवाला कोशिकाओं के बिना पूर्व संस्कृति, ट्यूमर कोशिका apoptosis का पता लगाने के द्वारा, एक प्रतिदीप्ति fluorogenic से caspase द्वारा संकेत-3 सब्सट्रेट6 स्वचालित समय चूक माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल अंय तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं; यह केवल कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है, उच्च संवेदनशीलता के साथ अनुयाई ट्यूमर कोशिका मृत्यु का पता लगाने में सक्षम बनाता है, छवि वास्तविक समय प्रभाव के लिए लक्ष्य बातचीत कर सकते हैं और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है.

इस प्रोटोकॉल में, मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड मैक्रोफेज (MAMs) और उनके जनक monocytic-MDSCs (एम-MDSCs) चूहों में मेटास्टेटिक ट्यूमर से अलग किया जाता है दमन कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । मेटास्टेटिक स्तन कैंसर के माउस मॉडल में, F4 के रूप में विशेषता मैक्रोफेज की एक अलग आबादी/80उच्चLy6G-CD11bउच्चLy6C मेटास्टेटिक ट्यूमर युक्त फेफड़ों मेंकम जमा । इस मैक्रोफेज जनसंख्या अक्सर सामांय फेफड़ों में पाया जाता है और इस तरह मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड मैक्रोफेज (MAMs)10कहा जाता है । इन माउस मॉडल में, एक और माइलॉयड कोशिका आबादी, F4 के रूप में परिभाषित/80उच्चLy6G-CD11b उच्च Ly6C उच्च, भी मेटास्टेटिक फेफड़ों में मुख्य रूप से जमा जहां यह MAMs11को जन्म देता है । उनकी विशेषताओं के आधार पर, CD11bउच्चLy6Cउच्च MAM जनक कोशिकाओं एम-MDSCs12का प्रतिनिधित्व हो सकता है ।

Protocol

चूहों को शामिल सभी प्रक्रियाओं ब्रिटेन के गृह कार्यालय (P526C60B3) से लाइसेंस अनुमति के अनुसार आयोजित किया गया । वाणिज्यिक रिएजेंट और उपकरणों के बारे में जानकारी सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।

1. लक्ष्य कोशिकाओं है कि उनके नाभिक में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस की तैयारी

  1. एक उचित स्रोत से एक लक्ष्य माउस कैंसर सेल लाइन प्राप्त करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, E0771 माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं (E0771-LG)13 के एक उच्च मेटास्टेटिक व्युत्पंन किया जाता है । पैतृक E0771 कोशिकाओं C57BL/6 चूहों14से उत्पंन ।
  2. गल और ३७ डिग्री सेल्सियस, ९५% आर्द्रता, और 5% सह2में एक सेल संस्कृति मशीन में 10% (वी/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) सहित Dulbecco के संशोधित ईगल्स माध्यम (DMEM) के साथ E0771-एलजी कोशिकाओं की एक शीशी बनाए रखने ।
    नोट: यह है कि कोशिकाओं माइकोप्लाज्मा के लिए नकारात्मक है की पुष्टि की जानी चाहिए । यह अंत करने के लिए, संस्कृति E0771 कोशिकाओं (या कोशिकाओं का परीक्षण किया जा करने के लिए) ऊपर वर्णित के रूप में 2-3 दिनों के लिए (एंटीबायोटिक्स और antimycotics के अभाव में), संस्कृति माध्यम के ५०० μL इकट्ठा । ६० एस के लिए १२,४१९ x g पर मध्यम केंद्रापसारक को सेल मलबे को खत्म करने और नए ट्यूबों में supernatant हस्तांतरण । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइकोप्लाज्मा परीक्षण किट का उपयोग करके माइकोप्लाज्मा संदूषण का निर्धारण करें ( सामग्री तालिकादेखें) और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर15 /
  3. बीज 5 x 103 E0771-एक 12 में अच्छी तरह से प्रति एलजी कोशिकाओं-प्लेट, और संस्कृति 10% (v/वी) FBS-DMEM एक मशीन में रातोंरात पर ३७ डिग्री सेल्सियस, ९५% आर्द्रता, और 5% सह2के साथ कोशिकाओं ।
    नोट: यदि लक्ष्य कोशिकाओं की प्रसार दर कम है (जनसंख्या दोहरीकरण समय से अधिक ३६ ज), कोशिकाओं की संख्या को बढ़ाया जा सकता है 1 x 104.
  4. मध्यम को 10% की 1 मिलीलीटर (v/v) FBS-DMEM सहित 10 μg/एमएल polybrene के साथ बदलें और μL कणों के 25 lentiviral जोड़ें (1 x 106 TU/एक परमाणु प्रतिबंधित लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग (mKate2, सामग्री की तालिकाको देखें) ।
  5. संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस, ९५% आर्द्रता, और 5% सह2में एक मशीन में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं ।
  6. 10% के साथ मध्यम बदलें (v/v) FBS-DMEM और संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 24-48 ज के लिए कोशिकाओं, ९५% आर्द्रता, और 5% सह2।
  7. 10% के साथ मध्यम बदलें (v/v) FBS-DMEM 1 μg सहित/एमएल puromycin जब कोशिकाओं को लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस शुरू, और संस्कृति कोशिकाओं जब तक वे 80-90% धाराप्रवाह हैं ।
    नोट: puromycin की सांद्रता लक्ष्य कक्ष प्रकारों के बीच भिंन होगी और अन-transfected कक्षों का उपयोग करके ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए ।
  8. उपसंस्कृति 10% के साथ 1-3 मार्ग के लिए जीवित कोशिकाओं (वी/वी) FBS-DMEM सहित 1 μg/एमएल puromycin, और एक तरल नाइट्रोजन भाप चरण भंडारण प्रणाली में cryopreserve स्टॉक का उपयोग करें ।

2. चूहों में ट्यूमर से दमन कोशिकाओं का अलगाव

नोट: इस प्रोटोकॉल में, दमन कोशिकाओं (यानी, MAMs और एम-MDSCs) E0771-LG कोशिकाओं द्वारा स्थापित मेटास्टेटिक ट्यूमर युक्त फेफड़ों से अलग कर रहे हैं. ऊतक पृथक्करण और कोशिका छंटाई के लिए शर्तों अलग ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

  1. सुई 1 x 106 कैंसर कोशिकाओं (E0771-एलजी) syngeneic की पूंछ नस में (C57BL/6), महिला, 7-10 सप्ताह पुराने चूहों ।
  2. 14 दिनों के बाद, मेटास्टेटिक ट्यूमर युक्त फेफड़ों को अलग और एंजाइमी पाचन के माध्यम से perfused फेफड़ों से एकल सेल निलंबन तैयार के रूप में पहले11वर्णित है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, चार चूहों कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन रहे हैं और उनके मेटास्टेटिक फेफड़ों पर्याप्त दमन कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संयुक्त कर रहे हैं.
  3. विरोधी के साथ एकल सेल निलंबन-माउस CD16/CD32 एंटीबॉडी बर्फ पर 30 मिनट के लिए, और CD45 को फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग, F4/80, CD11b, Ly6C, और Ly6G ( सामग्री की तालिकाको देखें) के लिए एक और 30 मिनट10,11 , 13.
  4. 2% (डब्ल्यू/v) युक्त पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार सना हुआ कोशिकाओं को धो गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), और फिर से निलंबित सेल गोली के साथ 500-1000 μL से युक्त 2% (डब्ल्यू/वी) BSA ।
  5. DAPI की 3 माइक्रोन जोड़ें, और क्रमबद्ध करें M-MDSCs (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11bउच्चLy6Cउच्च) और MAMs (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11bउच्च Ly6Cकम) एक सेल सॉर्टर (अनुपूरक चित्रा 1) का उपयोग कर ।
    नोट: Ly6C स्तर की दहलीज MAMs भेद करने के लिए (Ly6Cकम) और एम MDSCs (Ly6Cउच्च) निवासी वायुकोशीय मैक्रोफेज (RMAC) की है कि पर आधारित है. हल कोशिकाओं की पवित्रता से अधिक ९०% की एक उंमीद की शुद्धता के साथ प्रवाह cytometry के माध्यम से मापा जाता है ।
  6. 20% (v/v) FBS युक्त DMEM के ४०० μL के साथ सॉर्ट की गई कक्ष पुनर्निलंबित करें, 1% (v/v) पेनिसिलिन/streptomycin, 2 मिमी L-glutamine, 1% (v/v) गैर-आवश्यक अमीनो अम्ल, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और ५० एनएम 2-mercaptoethanol (नामक समृद्ध-DMEM, ई-DMEM).
  7. Trypan नीले बहिष्करण विधि16 का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं की संख्या की गणना और ई-DMEM के साथ 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल को समायोजित करें ।
  8. उपयोग तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।

3. चूहों की तिल्ली से सीडी 8+ टी कोशिकाओं का अलगाव

  1. तिल्ली को लक्ष्य कैंसर सेल लाइन (यानी, C57BL/6 चूहों इस प्रोटोकॉल में) के लिए syngeneic है एक माउस से इस प्रकार के रूप में अलग:
    1. सह2 साँस लेना द्वारा पशु Euthanize ।
    2. एक साफ विच्छेदन बोर्ड पर पशु प्लेस और ७०% के साथ त्वचा पोंछ (v/
    3. पेट की त्वचा काट कैंची का उपयोग करने के लिए तिल्ली बेनकाब
    4. तिल्ली को अलग, जो पेट के लिए अवर स्थित है, और यह एक ट्यूब में जगह बर्फ ठंडा पंजाबियों की 5 मिलीलीटर युक्त.
  2. एक बाँझ 5 मिलीलीटर सिरिंज के भीतरी गोताख़ोर का उपयोग करना, एक ५० एमएल ट्यूब पर सेट १०० माइक्रोन सेल छलनी पर तिल्ली पीस.
  3. पंजाब के कुल 10 मिलीलीटर का उपयोग करके फ़िल्टर के माध्यम से कक्षों को पास करें ।
  4. 5 मिनट के लिए ३३७ x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक, और supernatant महाप्राण ।
  5. 2 मिमी EDTA और ०.५% (डब्ल्यू/वी) BSA (चल बफर) और एक ४० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर युक्त पंजाब के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
  6. लाइव सेल नंबर की गणना और चल रहे बफर का उपयोग कर 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल को समायोजित करें ।
    नोट: एक शुद्धता जांच के लिए एक पूर्व संवर्धन नमूना के रूप में कोशिकाओं की एक छोटी aliquot रखें ।
  7. एक नकारात्मक चयन किट और एक चुंबकीय सॉर्टर ( सामग्री की तालिकाको देखें) का उपयोग कर सीडी 8+ टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध ।
    1. 1 x 108 (1 एमएल) splenocytes कोशिकाओं के एक 5 मिलीलीटर polystyrene गोल नीचे ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
    2. biotinylated एंटीबॉडी के ५० μL जोड़ें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    3. streptavidin संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की १२५ μL जोड़ें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    4. चल बफर के १.३२५ मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण ।
    5. चुंबक में ट्यूब प्लेस, और २.५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    6. चुंबक उठाओ, और एक नया ट्यूब में समृद्ध सेल निलंबन डालना ।
  8. ई-DMEM के २०० μL के साथ समृद्ध कोशिकाओं को पुनः निलंबित (यानी, DMEM जिसमें 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) पेनिसिलिन/streptomycin, 2 मिमी L-glutamine, 1% (v/v) गैर-आवश्यक अमीनो अम्ल, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और ५० एनएम 2-mercaptoethanol) शामिल हैं ।
  9. लाइव कोशिकाओं की संख्या की गणना और ई-DMEM के साथ 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए समायोजित करें । ३७ ° c में एक सह2 मशीन में कोशिकाओं का उपयोग करें जब तक रखें ।
    नोट: एक शुद्धता जाँच के लिए एक पद-संवर्धन नमूना के रूप में कोशिकाओं की एक छोटी aliquot रखें.
  10. सीडी 8+ टी कोशिकाओं की शुद्धता का निर्धारण निम्नानुसार प्रवाह cytometry द्वारा:
    1. 1 एक्स ले लो पूर्व संवर्धन (३.६ कदम) या पद संवर्धन (चरण ३.९) नमूनों से 104 कोशिकाओं और बफर चलाने का उपयोग कर १०० μL के लिए प्रत्येक की कुल मात्रा समायोजित करें ।
    2. विरोधी के साथ एकल सेल निलंबन-माउस CD16/CD32 एंटीबॉडी बर्फ पर 30 मिनट के लिए, और CD45 के लिए फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग, CD3, CD4, और सीडी 8 ( सामग्री की तालिकाको देखें) एक और 30 मिनट के लिए ।
    3. 2% से युक्त पंजाबियों के ५०० μL के साथ सना हुआ कोशिकाओं को धो (डब्ल्यू/वी) BSA, और फिर से निलंबित सेल गोली के साथ 500-1000 μL के 2% युक्त (डब्ल्यू/वी) BSA ।
  11. DAPI के 3 माइक्रोन जोड़ें, और कुल CD45+ सेल जनसंख्या में CD3+CD4–सीडी 8+ कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण ।

4. सक्रियण और अलग सीडी 8+ टी कोशिकाओं का विस्तार

  1. Aliquot 1 x 105 कोशिकाओं प्रति ५० μL सीडी 8+ टी कोशिकाओं (चरण ३.९ में तैयार) एक U-नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली के कुओं में ।
  2. जोड़ें 1 x 105 कक्ष प्रति ५० μL शमन कक्ष (२.७ चरण में तैयार) या ५० μL ई के कुओं में DMEM ।
  3. सक्रियकरण मध्यम है कि ई-DMEM के होते है तैयार, 4 x 104 U/एमएल कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर 1 (सीएसएफ-1), २४० यू/एमएल interleukin-2 (IL-2), 8 μg/एमएल एंटी माउस CD3ε एंटीबॉडी, और 16 μg/एमएल एंटी माउस CD28 एंटीबॉडी ।
    नोट: सीएसएफ-1 टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन इस प्रोटोकॉल (यानी, MAMs और एम-MDSCs) में दमन कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, यह सह संस्कृति की स्थिति में निरंतरता बनाए रखने के लिए लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के साथ टी कोशिकाओं की संस्कृति में रखा गया है । चूंकि सीएसएफ-1 सभी ऊतकों में नैनो-दाढ़ सांद्रता में पाया जाता है और vivo में monocyte/मैक्रोफेज व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है, यह इन कोशिकाओं के लिए एक शारीरिक संदर्भ है ।
  4. ५० μL सक्रियण मध्यम (चरण ४.३) और ५० μL ई-DMEM के साथ या बिना एजेंट का परीक्षण करने के लिए जोड़ें ।
  5. एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस, ९५% आर्द्रता में थाली प्लेस, और 5% सह2 और संस्कृति 4 दिनों के लिए कोशिकाओं ।

5. पूर्व सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ लक्ष्य कोशिकाओं की सह संस्कृति की स्थापना

  1. 1:100 पतला वृद्धि कारक के 30 μL जोड़ें-कम घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका) फ्लैट नीचे के कुओं में ९६-अच्छी तरह से सूक्ष्म के लिए उपयुक्त थाली, और एक सह में ३७ ° c में मशीन डिग्री सेल्सियस से कम 1 ज ।
  2. लक्ष्य कोशिकाओं को तैयार (यानी, E0771-एलजी परमाणु प्रतिबंधित लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस कोशिकाओं) ।
    1. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ०.०५% trypsin/EDTA के 1 मिलीलीटर के साथ लक्ष्य कोशिकाओं की मशीन, और कोमल pipetting द्वारा कोशिकाओं फसल ।
    2. 10% (v/v) FBS सहित DMEM के 9 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए ३३७ x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
    3. ई-DMEM के ५०० μL वाले कक्षों को पुन: निलंबित करें, और लाइव कक्षों की संख्या गिनना.
      नोट: लक्ष्य कक्षों की गणना करने से पहले, एकल कक्ष निलंबन का उत्पादन करने के लिए ४० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से कक्षों को फ़िल्टर करें.
    4. घनत्व को समायोजित करने के लिए 2 x 104 कोशिकाओं/एमएल (= 1 x 103 ५० μL प्रति कोशिकाओं) ई-DMEM जोड़कर, और कोशिकाओं को बर्फ पर रखें ।
  3. प्रभाव कोशिकाओं (यानी, पूर्व सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं) तैयार करते हैं ।
    1. pipetting द्वारा अच्छी तरह से ९६-well थाली (चरण ४.५) की एक अच्छी तरह से कोशिकाओं में resuspend, और फ्लोटिंग सीडी 8+ टी कोशिकाओं एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण ।
      नोट: MAMs और M-MDSCs कसकर अच्छी तरह से पालन करें और pipetting से अलग नहीं हैं ।
    2. शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, अच्छी तरह से और कदम 5.3.1 में ट्यूब में स्थानांतरण में पंजाब के २०० μL जोड़ें ।
    3. धोने की कोशिकाओं के साथ 1 ई-DMEM एक बार (३३७ x gपर केंद्रापसारक) 5 मिनट, महाप्राण और supernatant त्याग के लिए), और उंहें १०० ई के साथ resuspend-DMEM ।
    4. लाइव कोशिकाओं की संख्या गिनती (trypan नीले अपवर्जन विधि का उपयोग करके), घनत्व को समायोजित १.६ x 105 कोशिकाओं/एमएल (= 4 x 103 कोशिकाओं/25 μL), और बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
  4. महाप्राण चरण ५.१ में प्लेट की एक अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ।
  5. 1 x 103 कोशिकाओं/लक्ष्य कोशिकाओं के 50 μL जोड़ें (चरण 5.2.4) एक अच्छी तरह से और मिश्रण में अच्छी तरह से ।
    नोट: मध्यम के वाष्पीकरण के कारण बढ़त प्रभाव से बचने के लिए, केवल भीतरी ६० कुओं के ९६ अच्छी तरह से प्लेट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  6. 4 x 103 U/mL IL-2 और 10 माइक्रोन fluorogenic caspase-3 सब्सट्रेट ( सामग्री की तालिकाको देखें) सहित ई-DMEM के 25 μL जोड़ें ।
  7. जोड़ें 4 x 103 कोशिकाओं/सीडी 8+ टी कोशिकाओं के 25 μL उपयुक्त कुओं में (कदम 5.3.4) और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    नोट: एक अच्छी तरह से बहुत अधिक कोशिकाओं की उपस्थिति विश्लेषण अधिक कठिन बना देता है । इस मॉडल में, एक 4:1 प्रभाव: लक्ष्य अनुपात (कुल सेल संख्या 5 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) इष्टतम था, लेकिन एक 8:1 अनुपात इष्टतम था । निम्न चार नियंत्रण युक्त कुओं डेटा विश्लेषण के साथ सहायता करने के लिए आवश्यक हैं: सह संस्कृति कुओं के लिए इस्तेमाल घनत्व पर लक्ष्य कोशिकाओं (1 एक्स 103 कोशिकाओं/well) मध्यम के साथ और बिना caspase-3 सब्सट्रेट, प्रभाव कोशिकाओं (1 एक्स 103 कोशिकाओं /well) के साथ और caspase-3 सब्सट्रेट के बिना माध्यम में ।
  8. सभी खाली कुओं (विशेष रूप से कुओं को प्लेट की परिधि पर) में पंजाबियों या बाँझ पानी के २०० μL जोड़ें प्रयोगात्मक कुओं से मध्यम के वाष्पीकरण को कम करने के लिए ।
  9. एक समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप कि ३७ डिग्री सेल्सियस, ९५% आर्द्रता, और 5% सह2पर बनाए रखा है में थाली सेट ।
    नोट: एक क्रॉस-पैटर्न में थाली हिला सभी कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए, और फिर थाली मशीन को स्थानांतरित करने से पहले 10-20 मिनट के लिए एक सपाट सतह पर कमरे के तापमान पर रहने के लिए अनुमति देते हैं ।

6. कोशिकाओं की इमेजिंग

नोट: विस्तृत छवि अधिग्रहण सेटिंग्स माइक्रोस्कोप और इस्तेमाल किया fluorophores के साथ भिन्न हो जाएगा; निंनलिखित सामांय अधिग्रहण मापदंडों इष्टतम परिणामों के लिए नियोजित किया जाना चाहिए ।

  1. माइक्रोस्कोप पर एक उचित आत्म ध्यान दिनचर्या का उपयोग करना, ९६-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से में कुल सतह क्षेत्र के कम से 25% कवर छवियों को प्राप्त ।
  2. सेट माइक्रोस्कोप के लिए चरण इसके विपरीत में छवियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक फ्लोरोसेंट परमाणु प्रतिबंधित लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उपयुक्त चैनल (mKate2) और एक फ्लोरोसेंट हरी fluorogenic सक्रिय caspase के लिए उपयुक्त चैनल-3 सब्सट्रेट (के साथ उत्तेजना पर ४८८ एनएम) (चित्रा 2) ।
  3. प्रायोगिक कुओं में चरण इसके विपरीत में छवियों पर कब्जा और 2 फ्लोरोसेंट चैनल हर 1 से 3 घंटे के लिए कम से ७२ ज ।

छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 7 छवि विश्लेषण

नोट: विस्तृत छवि विश्लेषण सेटिंग्स उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ भिन्न होंगी ( सामग्री तालिकादेखें); निम्न सामान्य विश्लेषण कार्यविधि इष्टतम परिणामों के लिए नियोजित किया जाना चाहिए ।

  1. वर्णक्रमीय संयुक्त राष्ट्र के मिश्रण है कि अपोप्तोटिक नाभिक द्वारा उत्सर्जित से लक्ष्य सेल नाभिक द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेत अलग करने के लिए आवश्यक है कि क्या निर्धारित है और यदि आवश्यक हो, यह पूरा करने के लिए एक विश्लेषण प्रोटोकॉल सेट;
    1. ग्रीन फ्लोरोसेंट चैनल में caspase-3 सब्सट्रेट के बिना मध्यम में केवल लक्ष्य कोशिकाओं (mkate2-लेबल) युक्त नियंत्रण देखें.
    2. गौर हरी प्रतिदीप्ति लाल नाभिक (नाभिक हरी दिखाई) द्वारा उत्सर्जित किया जा रहा है कि क्या
    3. यदि ग्रीन प्रतिदीप्ति नाभिक में स्पष्ट है, इमेजिंग सॉफ्टवेयर में वर्णक्रमीय मिश्रण नियंत्रण का उपयोग और ग्रीन से हटा लाल रंग का प्रतिशत बढ़ाने जब तक हरी संकेत गायब हो जाता है (हमारे अनुभव में, यह आमतौर पर 6-7% उज्ज्वल mKate2 के लिए है प्रतिदीप्ति) ।
    4. यदि हरे प्रतिदीप्ति किसी भी नाभिक में स्पष्ट नहीं है, कोई वर्णक्रमीय मिश्रण आवश्यक है ।
      नोट: यह वर्णक्रमीय मिश्रण सुधार परीक्षण भी caspase-3 सब्सट्रेट युक्त मध्यम में लक्ष्य कोशिकाओं का एक कुआं का उपयोग कर बाहर किया जा सकता है । हालांकि, वहां आम तौर पर लक्ष्य कोशिकाओं में सहज apoptosis के एक बहुत ही कम स्तर (10% से कम), कुछ लक्ष्य सेल में जिसके परिणामस्वरूप हरी प्रतिदीप्ति caspase-3 के सक्रियण के कारण के माध्यम से प्रतिदीप्ति खून उत्सर्जक नाभिक । सच प्रतिदीप्ति खून के माध्यम से इन शर्तों के तहत स्पष्ट है जब हरी प्रतिदीप्ति सभी नाभिक में स्पष्ट है ।
    5. व्यक्तिगत रूप से लाल और हरे चैनल में caspase-3 सब्सट्रेट के बिना मध्यम में केवल एक ही प्रभाव कोशिकाओं (नाभिक unlabel्ड) युक्त नियंत्रण देखें ।
    6. या तो हरी या लाल प्रतिदीप्ति नाभिक द्वारा उत्सर्जित किया जा रहा है कि निरीक्षण । यदि न तो लाल और न ही हरी प्रतिदीप्ति अलग चैनल में स्पष्ट है कोई वर्णक्रमीय मिश्रण आवश्यक है ।
      नोट: हमारे अनुभव में, माउस सीडी 8+ टी कोशिकाओं ऑटो फ्लोरोसेंट नहीं कर रहे हैं और इस प्रकार कोई वर्णक्रमीय मिश्रण इन कोशिकाओं के लिए आवश्यक है. यह वर्णक्रमीय मिश्रण सुधार परीक्षण भी caspase-3 सब्सट्रेट युक्त मध्यम में एक अच्छी तरह से प्रभाव कोशिकाओं का उपयोग कर बाहर किया जा सकता है । हालांकि, वहां आमतौर पर सहज apoptosis के कुछ स्तर पर प्रभाव कोशिका नाभिक उत्सर्जक हरी प्रतिदीप्ति caspase के सक्रियकरण के कारण-3 । सच प्रतिदीप्ति खून के माध्यम से इन शर्तों के तहत स्पष्ट है जब हरी प्रतिदीप्ति सभी नाभिक में स्पष्ट है ।
  2. दोनों फ्लोरोसेंट चैनलों में फ्लोरोसेंट वस्तुओं को हल करने के लिए, नमूना के लिए प्रासंगिक मापदंडों के साथ एक प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि घटाव विधि (जैसे, TopHat), का प्रयोग करें ।
    नोट: ग्रीन चैनल में हम TopHat (नाभिक त्रिज्या = १०.० µm, ग्रीन प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड = ०.७ हरी अंशांकन इकाइयों) का इस्तेमाल किया । लाल चैनल में हम TopHat (नाभिक त्रिज्या = १०.० µm, लाल प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड = ०.५ लाल अंशांकन इकाइयों) का इस्तेमाल किया ।
  3. व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट नाभिक को हल करने के लिए बढ़त बंटवारे के लिए उपयुक्त मापदंडों का प्रयोग करें ।
    नोट: हम हरे या लाल प्रतिदीप्ति चैनल में बढ़त बंटवारे का उपयोग नहीं किया ।
  4. केवल लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त कुओं से लाल चैनल में छवियों का उपयोग करें (caspase सब्सट्रेट के साथ) लक्ष्य नाभिक का न्यूनतम आकार निर्धारित करने के लिए.
    नोट: हम ८० µm2का इस्तेमाल किया ।
  5. अपोप्तोटिक प्रभाव नाभिक के औसत आकार का निर्धारण करने के लिए (caspase सब्सट्रेट के साथ) केवल प्रभाव कोशिकाओं से युक्त कुओं से ग्रीन चैनल में छवियों का उपयोग करें.
    नोट: एकल अपोप्तोटिक प्रभाव नाभिक से लेकर ४० – ८० µm2 इन प्रयोगों में.
  6. एक उचित ंयूनतम आकार प्रतिबंध (उदाहरण के लिए, ंयूनतम क्षेत्र, ंयूनतम व्यास) (चित्रा 2, लक्ष्य जांच मास्क) का उपयोग फ्लोरोसेंट लक्ष्य सेल नाभिक की संख्या गिनने के लिए एक विश्लेषण प्रक्रिया सेट करें ।
    नोट: हम एक ंयूनतम नाभिक क्षेत्र (red प्रतिदीप्ति) = ८० µm2इस्तेमाल किया ।
  7. अपोप्तोटिक नाभिक की संख्या की गणना करने के लिए एक विश्लेषण कार्यविधि सेट करें जो अपोप्तोटिक effecter नाभिक (चित्र 2, आकार प्रतिबंधित apoptosis मास्क) के माध्य आकार से बड़ी होती है ।
    नोट: आकार फिल्टर ८० µm2 के लिए सेट किया गया था (यानी, केवल इस आकार से बड़े हरे प्रतिदीप्ति के क्षेत्रों गिने थे, इस प्रकार एकल अपोप्तोटिक प्रभाव नाभिक को छोड़कर). अपोप्तोटिक प्रभाव कोशिकाओं के कुछ समुच्चय गिना जा सकता है, हालांकि इन मापदंडों का उपयोग अपोप्तोटिक लक्ष्य सेल नाभिक गिनती में विश्लेषण की सटीकता बढ़ जाती है.
  8. अपोप्तोटिक लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या गिनती नाभिक जहां लाल फ्लोरोसेंट संकेत (७.६ कदम से) और आकार से प्रतिबंधित हरी फ्लोरोसेंट संकेत (७.७ कदम से) की गणना करने के लिए एक विश्लेषण प्रक्रिया सेट करें गौरतलब है कि सह-information (चित्रा 2, आर /G ओवरलैप मास्क) ।
    नोट: एक उपयुक्त सह स्थानीयकरण 30% से लक्ष्य नाभिक का माध्य आकार का १००% से लेकर हो सकता है । ओवरलैप आकार फ़िल्टर ४० µm2के लिए सेट किया गया था ।
  9. अपोप्तोटिक लक्ष्य कक्ष नाभिक की संख्या के साथ-साथ पूरे समय पाठ्यक्रम पर प्रत्येक प्रायोगिक शर्त के लिए कुओं में लक्ष्य कोशिका नाभिक की संख्या निर्धारित करें.

8. डेटा गणना और रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण

  1. ग्राफ अपोप्तोटिक लक्ष्य सेल नाभिक प्रयोगात्मक कुओं के लिए पूरे समय पाठ्यक्रम पर कदम ७.९ में प्राप्त की संख्या । यदि एकाधिक कुओं प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए इस्तेमाल किया गया, रेखांकन मतलब ± मानक विचलन के रूप में परिणाम प्रस्तुत करते हैं ।
  2. प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक कुआं में लक्ष्य कक्षों की संख्या में अपोप्तोटिक कक्षों की संख्या को विभाजित करके लक्ष्य कक्षों की जनसंख्या के अपोप्तोटिक अंश की गणना करें.
  3. ग्राफ चरण ८.२ में प्राप्त परिणामों ।
  4. प्रत्येक वक्र के लिए वक्र (ईमेज) के तहत क्षेत्र निर्धारित करें । प्रत्येक वक्र के लिए जनसंख्या का शिखर अपोप्तोटिक अंश भी निर्धारित किया जा सकता है और साथ ही समय बिंदु जिस पर चोटी होती है, यदि वांछित हो. निर्धारित करें कि क्या ईमेज प्रायोगिक शर्तों के लिए निर्धारित काफी अलग उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षणों का उपयोग कर रहे हैं ।
    नोट: वेल्च के सुधार के साथ ख़राब t-परीक्षण ईमेज परिणामों पर लागू किया गया था ।

Representative Results

यह विधि सरल सह पर आधारित है सीडी 8 प्रभाव के साथ लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं की संस्कृति+ टी कोशिकाओं है कि पूर्व किया गया है के साथ या विरोधी की उपस्थिति में शमन करनेवाला कोशिकाओं के बिना संस्कृति-CD3/CD28 सक्रिय एंटीबॉडी । यह सीडी 8+ टी सेल प्रेरित कैंसर सेल apoptosis समय के बाद सह संस्कृति का पता लगाता है, इस प्रकार सीडी 8+ टी कोशिकाओं के cytotoxicity पर दमन कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन सक्षम करने से ।

आमतौर पर, कैंसर की कोशिकाओं को एक परमाणु-लक्ष्यीकरण caspase जब इन कोशिकाओं सीडी 8+ टी कोशिकाओं है कि पूर्व है दमन कोशिकाओं के अभाव में एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय कर रहे है के साथ संपर्क बनाने के बाद अपने नाभिक में हरी प्रतिदीप्ति वृद्धि ( चित्रा 3; अनुपूरक फिल्म 1) । caspase सब्सट्रेट से हरी प्रतिदीप्ति apoptosis शुरू किया गया था के बाद कम से कम 15 ज के लिए detectable था । प्रभाव सीडी 8+ टी कोशिकाओं के कुछ सहज apoptosis भी समय के साथ मनाया गया था भले ही इन कोशिकाओं अलगाव में संस्कृति थे (चित्रा 4; अनुपूरक फिल्म 2) । हालांकि, सीडी 8+ टी कोशिकाओं के नाभिक आकार के कैंसर की कोशिकाओं की तुलना में छोटे है और इस प्रकार ' अपोप्तोटिक ' प्रभाव कोशिकाओं एक आकार प्रतिबंध छवि विश्लेषण विधि (चित्रा 2 और चित्रा 4) द्वारा अपोप्तोटिक ' लक्ष्य ' सेल गिनती से बाहर रखा जा सकता है । हालांकि कुछ लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं हरी प्रतिदीप्ति के बिना एक छोटे गोल आकार दिखाने के लिए, यह विश्लेषण को प्रभावित नहीं करता है के रूप में इन कोशिकाओं का बँटवारा के दौर से गुजर रहे है बजाय apoptosis (अनुपूरक फिल्म 3), और इस तरह अपोप्तोटिक से बाहर रखा गया है ' लक्ष्य ' एक लाल/हरे ओवरलैप मास्क (अनुपूरक आंकड़ा 2) द्वारा सेल काउंट्स । लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं के सहज apoptosis कभी भी एकल संस्कृति (अनुपूरक फिल्म 3) में पाया जाता है । हालांकि, सह पूर्व सक्रिय सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं की संस्कृति कैंसर कोशिकाओं के monoculture में सहज apoptosis के स्तर (चित्रा 4) के ऊपर ट्यूमर सेल apoptosis वृद्धि हुई है । आम तौर पर, जब प्रभाव कोशिकाओं के लिए लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं का एक इष्टतम अनुपात का उपयोग कर, अपोप्तोटिक लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं की संख्या में एक चोटी देखा जा सकता है (चित्र 5 ए) । यह चोटी अधिक अलग है जब डेटा लक्ष्य सेल जनसंख्या (चित्रा 5B) के अपोप्तोटिक अंश के रूप में व्यक्त किया जाता है । इस प्रयोग में बेसल apoptosis लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के 24 ज पर नुकीला (अपोप्तोटिक अंश = ०.०८ के साथ), लेकिन सीडी 8+ टी सेल प्रेरित apoptosis 17 ज में एक अधिकतम स्तर पर पहुंच (अपोप्तोटिक अंश के साथ = ०.६६) ।

हम आगे पाया गया कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं पूर्व MAMs या M-MDSCs के साथ गर्मी लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं के साथ संपर्क बना सकते हैं, लेकिन इस संपर्क के कैंसर सेल apoptosis के कम उदाहरणों में परिणाम के लिए सीडी 8+ टी कोशिकाओं की तुलना में पहले सक्रिय के बिना लग रहा था शमन कक्ष (चित्रा 3 और चित्रा 4; अनुपूरक फिल्म 4 और अनुपूरक मूवी 5) । हालांकि सीडी 8+ टी कोशिकाओं पूर्व माइलॉयड कोशिकाओं के साथ पहले कभी कैंसर कोशिका apoptosis प्रेरित, वहां भी लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं है कि के समय पाठ्यक्रम के दौरान apoptosis से गुजरना नहीं उत्तेजित किया गया है के कुछ प्रसार किया गया प्रयोग (अनुपूरक मूवी 6) । इन निष्कर्षों के साथ संगत, अपोप्तोटिक कैंसर सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ संस्कृति के शिखर अंश प्री-माइलॉयड कोशिकाओं के साथ-मशीन (अपोप्तोटिक अंश = ०.३८ पर 23 MDSC के लिए एच ई और ०.२५ में 20 MAM के लिए एच ई) कैंसर की कोशिकाओं की तुलना में काफी कम था सीडी 8 के साथ प्रसंस्कृत+ टी कोशिकाओं जो पूर्व नहीं थे दमन कोशिकाओं (चित्रा 6) के साथ मशीन ।

Figure 1
चित्रा 1: एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया दिखा योजना । भोली प्लीहा सीडी 8+ टी कोशिकाओं विरोधी CD3/CD28 के साथ या बिना मेटास्टेसिस-संबद्ध मैक्रोफेज (MAMs) या monocytic-माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (एम-MDSCs) को सक्रिय करने के साथ संस्कृति रहे हैं । 4 दिनों के बाद, फ्लोटिंग सीडी 8+ टी कोशिकाओं और एकत्र कर रहे है fluorogenic caspase-3 सब्सट्रेट की उपस्थिति में लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति । अपोप्तोटिक कैंसर कोशिकाओं को वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत पता चला रहे हैं । दिखाया छवियां एक जीवित सेल इमेजिंग मंच का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया ( सामग्री की तालिकाको देखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अपोप्तोटिक प्रभाव कोशिकाओं से अलग अपोप्तोटिक लक्ष्य कोशिकाओं की पहचान. शीर्ष पंक्ति: लाल चैनल में छवि प्राप्ति लक्ष्य डिटेक्शन मास्क (गुलाबी विश्लेषण मास्क) द्वारा लक्ष्य कक्ष नाभिक की पहचान की अनुमति देता है । मध्य पंक्ति: ग्रीन चैनल में अधिग्रहीत छवियों अपोप्तोटिक प्रभाव और लक्ष्य कोशिकाओं का संकेत. Asize प्रतिबंधित apoptosis मास्क (चैती विश्लेषण मास्क; से अधिक ८० µm2) एकल अपोप्तोटिक प्रभाव कोशिकाओं विश्लेषण से बाहर रखा जा करने के लिए अनुमति देता है । निचली पंक्ति: संयुक्त छवियों चरण कंट्रास्ट छवि (बाएँ) या लाल/हरी ओवरलैप मास्क (दाएँ) के साथ लाल और हरे चैनलों विलय कर दिया । लाल प्रतिदीप्ति (पीला विश्लेषण मास्क) के साथ सह-स्थानीयकृत, आकार-प्रतिबंधित हरी प्रतिदीप्ति की पहचान, arrowhead प्रभाव कोशिकाओं के समुच्चय को छोड़कर अपोप्तोटिक लक्ष्य नाभिक (yellow अपोप्तोटिक) का अधिक सटीक पता लगाने की अनुमति देता है (सफ़ेद ऐरोहेड) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सीडी 8+ टी कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं के बीच बातचीत । प्रतिनिधि समय-चूक लक्ष्य E0771-LG_NLR कोशिकाओं (टी) के सह के साथ प्रसंस्कृत के प्रभाव से सीडी 8+ टी कोशिकाओं (ई) पर 4:1 प्रभाव/ MDSC-e और MAM-e संकेत प्रभाव कोशिकाओं एम के साथ पूर्व--MDSCs और MAMs क्रमशः । मिश्रित छवियां (चरण कंट्रास्ट, लाल और हरे चैनल से छवियां सहित) दिखाई जाती हैं । ऐरोहेड विभिंन क्षेत्रों और समय बिंदुओं के माध्यम से एक ही कोशिकाओं को ट्रैक कर रहे हैं । पीला ऐरोहेड: एक लक्ष्य है कि प्रभाव के साथ सहयोगियों और बहोत apoptosis, व्हाइट ऐरोहेड: एक लक्ष्य है कि प्रभाव के साथ सहयोगियों लेकिन apoptosis से गुजरना नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: अपोप्तोटिक कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने । प्रतिनिधि समय से निकाले गए क्षेत्रों-इमेजिंग के बाद 18 एच में चूक फिल्में । संयुक्त छवियों (बाएँ; चरण कन्ट्रास्ट, लाल और हरे चैनल) और बिना लाल चैनल से छवियों (मध्य) या के साथ (दाएँ) लाल/हरे ओवरलैप मास्क (पीला) दिखाया जाता है. सही कॉलम में पीले डॉट्स अपोप्तोटिक कैंसर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सीडी 8+ टी सेल प्रेरित कैंसर सेल apoptosis । (क) अपोप्तोटिक कैंसर की संख्या C8+ टी कोशिकाओं के साथ भिंन प्रभाव पर प्रभाव को लक्षित अनुपात (E:T) । (ख) लक्ष्य सेल जनसंख्या के अपोप्तोटिक अंश । डेटा मतलब है ± एसडी. वक्र (ईमेज) के तहत मतलब क्षेत्र भी दिखाया गया है । वेल्च के सुधार के साथ ख़राब टीपरीक्षण ईमेज का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । * P < 0.0001 की तुलना में E:T = 0:1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: ट्यूमर के प्रभाव-सीडी 8+ टी कोशिकाओं के cytotoxicity पर माइलॉयड कोशिकाओं घुसपैठ. (ए) अपोप्तोटिक कैंसर कोशिकाओं की संख्या (लक्ष्य: टी) C8+ टी कोशिकाओं के साथ संस्कृति (प्रभाव: ई) E:T अनुपात के 4:1 पर । सीडी 8+ टी कोशिकाओं के अभाव में पूर्व-कल्चरित थे (ब्लैक सर्कल) या monocytic की उपस्थिति-माइलॉयड-व्युत्पंन दमन कोशिकाओं (MDSC-e: ब्लू सर्कल) या मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड मैक्रोफेज (MAM-e: लाल वृत्त) । डेटा मतलब है ± एसडी. (ख) लक्ष्य सेल जनसंख्या के अपोप्तोटिक अंश । डेटा मतलब है ± एसडी । मतलब ईमेज भी दिखाया गया है । वेल्च के सुधार के साथ ख़राब टीपरीक्षण ईमेज का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । * p < 0.0001 की तुलना में t केवल, #p < 0.0001 की तुलना म E + t. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 1 । गेटिंग रणनीति मेटास्टेटिक फेफड़ों से दमन कोशिकाओं को अलग करने के लिए । (क) प्रतिनिधि डॉट भूखंड monocytic माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (एम-MDSCs) और मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड मैक्रोफेज (MAMs) को अलग करने के लिए । MAMs (Ly6Cकम) और एम-MDSCs (Ly6Cहाई) को भेद करने के लिए Ly6C स्तर की दहलीज उस निवासी वायुकोशीय मैक्रोफेज (RMAC) पर आधारित है । (ख) क्रमबद्धि की गई एम-MDSCs की पवित्रता (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Cउच्च) और MAMs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Cकम). कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा 2 । mitotic लक्ष्य कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियां । लक्ष्य E0771-LG_NLR सेल मोनो संस्कृति के प्रतिनिधि समय चूक फिल्मों से अब भी । Top: चरण कंट्रास्ट, लाल और हरे चैनल से छवियों सहित समग्र छवियां । नीचे: मिश्रित छवियां (लाल और हरे रंग के चैनल) लाल/ कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा 3 । ट्यूमर के प्रभाव-सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रसार पर माइलॉयड कोशिकाओं घुसपैठ । (क) प्रतिनिधि सीडी 8+ टी कोशिकाओं में CFSE के साथ फ्लोरोसेंट लेबलिंग के कमजोर पड़ने दिखा हिस्टोग्राम । भोली प्लीहा सीडी 8+ टी कोशिकाओं प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अलग-3 और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर CFSE के 5 µ एम के साथ लेबल थे । लेबल टी कोशिकाओं IL-2 और विरोधी CD3/CD28 के साथ या माइलॉयड कोशिकाओं के रूप में प्रोटोकॉल 4 में वर्णित के बिना एंटीबॉडी को सक्रिय करने की उपस्थिति में प्रसंस्कृत थे । 4 दिनों के बाद, टी कोशिकाओं में ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रवाह cytometer द्वारा पता लगाया गया था । (ख) सीडी 8+ टी कोशिकाओं के विभाजन सूचकांक के रूप में पहले वर्णित17गणना की । डेटा का अर्थ है ± SEM. * p < 0.01 नियंत्रण की तुलना में, #p < 0.05 αCD3/CD28 एबी की तुलना में । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फिल्म 1. आंकड़ों की फिल्म 3 और 4; ई + टी । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फिल्म 2. आंकड़ों की फिल्म 3 और 4; प्रभाव (ङ) । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फिल्म 3. आंकड़ों की फिल्म 3 और 4; लक्ष्य (टी) । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फिल्म 4. आंकड़ों की फिल्म 3 और 4; MDSC-ई + टी । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक मूवी 5. आंकड़ों की फिल्म 3 और 4; MAM-ई + टी । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फिल्म 6. आंकड़ों की फिल्म 3 और 4; MAM-ई + टी (प्रसार) । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

इस विधि दो अलग सह संस्कृति कदम पर आधारित है: सह संवर्धन सीडी 8+ संभावित शमन कोशिकाओं के साथ टी कोशिकाओं, और सह संवर्धन लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ' पूर्व वातानुकूलित ' सीडी 8+ टी कोशिकाओं (चित्रा 1) । पहले सह संस्कृति कदम काफी सीडी 8+ टी सेल प्रसार परख सामांयतः सीडी 8+ टी सेल समारोह पर दमन कोशिकाओं के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल के लिए इसी तरह की है । हालांकि, टी सेल प्रसार हमेशा उनके cytotoxicity के साथ सहसंबंधी नहीं है । उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि एम-MDSCs या MAMs के साथ सह-संस्कृति CD3/CD28 सक्रिय एंटीबॉडी (अनुपूरक आंकड़ा 3) की उपस्थिति में सीडी 8+ टी कोशिकाओं के कम प्रसार के बजाय वृद्धि हुई है, जबकि इन पूर्व वातानुकूलित सीडी 8+ टी कोशिकाओं लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं (चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6) के खिलाफ कम cytotoxicity का प्रदर्शन किया । इन परिणामों कार्यात्मक गतिविधि के मूल्यांकन के महत्व पर प्रकाश डाला, लक्ष्य कैंसर सेल apoptosis द्वारा सबूत, इस सीडी 8+ टी सेल cytotoxicity परख द्वारा की पेशकश की ।

इस परख में, हम की पहचान की है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं की आवश्यकता लगभग 15 एच के सह संस्कृति के क्रम में E0771 के अधिकतम apoptosis-एलजी माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 5) प्रेरित करने के लिए । इस देरी लक्ष्य के साथ और प्रतिरक्षा synapse गठन के साथ प्रभाव कोशिकाओं के प्रारंभिक संपर्क के बीच अंतराल के कारण हो सकता है, साथ ही लक्ष्य में अपोप्तोटिक संकेतों को प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय के रूप में caspase-3 के सक्रियण द्वारा मापा (अनुपूरक फिल्म 1 ). हम यह भी पहचान लिया है कि अपोप्तोटिक ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या में 24 घंटे के बाद एक पठार तक पहुंच है, जो शायद टी कोशिकाओं और/या मृत कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट संकेत के नुकसान के उंमूलन के कारण है । इस क्षमता पीक apoptosis के समय की पहचान करने के लिए एक इष्टतम समय बिंदु के निर्धारण के बाद से इस परख का एक बड़ा लाभ है विभिंन स्थितियों के बीच उचित तुलना के लिए महत्वपूर्ण है । हमारे मामले में उदाहरण के लिए, नियंत्रण सीडी 8+ टी कोशिकाओं और MDSC/MAM-शिक्षित सीडी 8+ टी कोशिकाओं के बीच cytotoxicity में अंतर बहुत बड़ा था 15-18 ज की तुलना में ७२ ज (चित्रा 5), और इस प्रकार एक समापन बिंदु प्रयोग एक ७२ एच मशीन अवधि का उपयोग भ्रामक परिणाम निकलेगा ।

इस विधि भी वास्तविक समय प्रभाव के दृश्य में सक्षम बनाता है-लक्ष्य सेल संपर्क है, जो सीडी 8 के सीमित cytotoxicity अंतर्निहित तंत्र में अधिक से अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा+ टी कोशिकाओं पूर्व दमन कोशिकाओं के साथ मशीन । उदाहरण के लिए, हमने देखा है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं पूर्व एम के साथ-MDSCs या MAMs सामना करना पड़ा और लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत की लेकिन हमेशा apoptosis (अनुपूरक फिल्म 4, अनुपूरक फिल्म 5, अनुपूरक फिल्म 6) प्रेरित नहीं किया । यद्यपि हम इस घटना नहीं है, यह संभव हो सकता है और दिलचस्प है और यों तो मुठभेड़ों के अनुपात और apoptosis प्रेरण के साथ संबंध में उनके संपर्क समय की तुलना होगा । एक और प्रमुख लाभ यह है कि इस विधि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, 1 x 10 लक्ष्य के3 और 4 x 10 ठीक प्रति प्रभाव कोशिकाओं के3 ) । वास्तव में, इस प्रोटोकॉल ३८४-अच्छी तरह प्लेट प्रारूप के लिए आगे लघुकृत अगर वांछित हो सकता है । इसलिए, इस परख उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग और प्रयोगों के लिए उपयुक्त है जहां सेल नंबर ऐसे इन विट्रो में vivo या पूर्व vivo नमूनों से व्युत्पंन कीमती कोशिकाओं का उपयोग कर परीक्षण के रूप में सीमित हैं ।

दूसरी ओर, वर्तमान परख की सीमा कुछ स्थितियों में मृत प्रभाव कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या की उपस्थिति है । आदेश में है कि प्रभाव सीडी 8+ टी कोशिकाओं से लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के भेद apoptosis में सटीकता को बढ़ाने के लिए, लक्ष्य कोशिकाओं के नाभिक लेबल और एक नाभिक आकार प्रतिबंध (जो प्रभाव कोशिकाओं को छोड़ता है) इस में डेटा विश्लेषण के लिए लागू किया जाता है परख (चित्रा 2) । हालांकि, कुछ उदाहरण है जहां के समुच्चय के ओवरले (green) अपोप्तोटिक सीडी 8+ टी कोशिकाओं पर गैर-अपोप्तोटिक लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं है, जो परिणाम मिल सकता है । यह सीमा प्रभाव कोशिकाओं पर एक मृत कोशिका हटाने स्तंभ के उपयोग से कम किया जा सकता है, लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति से पहले, प्रभाव कोशिकाओं के पर्याप्त संख्या संभालने उपलब्ध हैं । अधिक जटिल माइक्रोस्कोपी प्रणालियों के साथ, यह भी प्रभाव सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ एक fluorophore लक्ष्य सेल नाभिक और fluorogenic caspase-3 सब्सट्रेट से अलग लेबलिंग द्वारा झूठी सकारात्मक संकेत को कम करने के लिए संभव हो सकता है.

अब तक, इस प्रोटोकॉल सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रतिजन गैर विशिष्ट सक्रियण की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है । हालांकि MDSCs और TAMs ट्यूमर microenvironment में प्रतिजन गैर विशिष्ट तंत्र के माध्यम से टी सेल फ़ंक्शन को रोकें, परिधीय लसीकावत् ऊतकों में MDSCs एक प्रतिजन विशिष्ट तरीके से18टी सेल प्रतिक्रियाओं को रोकें । इस तरह के सेल प्रकार के प्रतिरक्षा शमन कार्यों की जांच करने के लिए, एक इन विट्रो प्रसार परख सीडी 8 का उपयोग+ OT से टी कोशिकाओं-1 ट्रांसजेनिक चूहों आमतौर पर प्रयोग किया जाता है । इस परख में, OT-1 टी कोशिकाओं (व्यक्त ovalbumin (ओवा) विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर) का सह-कल्चरल हैं, जो हमारे cytotoxicity परख (यानी, में टी कोशिकाओं के सक्रियकरण के लिए पहली संस्कृति के लिए लागू है, ओवा पेप्टाइड्स की उपस्थिति में दमन MDSCs के साथ उपस्थिति या दमन की अनुपस्थिति) । यह भी लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए संभव है ओवा व्यक्त करने के लिए, जो प्रतिजन-विशिष्ट कैंसर कक्ष OT-1 टी कोशिकाओं द्वारा हत्या पैदा कर सकते हैं । इसलिए, परख antigen-विशिष्ट T कक्ष सक्रियण के MAM/MDSC-मध्यस्थ दमन की जांच भी सक्षम करेगा । यह भी मानव कोशिकाओं की जांच करने के लिए परख लागू करने के लिए संभव है, के रूप में मानव CD3 और CD28 के खिलाफ सक्रियकरण एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और एक प्रोटोकॉल नैदानिक नमूनों से मानव TAMs को अलग करने के लिए स्थापित किया गया है19.

सामूहिक रूप से, यह परख काफी बहुमुखी है और अंय प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के cytotoxicity की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान में, हमारी प्रयोगशालाओं में, यह विभिन्न स्थितियों के तहत antigen-निर्भर सेल cytotoxicity की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा रहा है और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए भी विकसित किया जा रहा है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को वेलकम ट्रस्ट (101067/z/13/z (JWP) से अनुदान द्वारा समर्थित था, 109657/z/15/z (tk), 615KIT/J22738 (tk), यूके), और MRC (MR/N022556/1 (JWP, TK), यूके) । एनओसी और DDS राष्ट्रीय Phenotypic स्क्रीनिंग सेंटर Phenomics डिस्कवरी पहल और कैंसर रिसर्च यूके (एनओसी) से समर्थन स्वीकार

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA (1X) Gibco 25300-054
12-Well Cell Culture Plate Freiner Bio-One 665-180
1x PBS Gibco 14190-094
2-mercaptethanol Sigma M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube FALCON 352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) Costar 3799 Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom) Nunc 165305 Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody BIO-RAD MCA497A647 Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody Biolegend 100730 Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102111 Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody Biolegend 100314 Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100236 Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody Biolegend 128026 Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum Albmin Sigma A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon) FALCON 352360 To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon) FALCON 352340 To filter the lung digestion
DAPI Biolegend 422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium Gibco 41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell Technologies 19853
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody Biolegend 100406 Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use Gibco A1596-01 Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent Essen BioScience 4476 Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM Essen BioScience Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A Essen BioScience Analysis software
L-Glutamine (100X) Gibco A2916801
Lung Dissociation Kit Miltenyi 130-095-927 Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-318
Non-essential amino acid (100X) Gibco 11140-035
NucView488 Biotium 10403 Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody Biolegend 127607 Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody Biolegend 101216 Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen Strep Gibco 15140-122 Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody Biolegend 103132 Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268
Puromycin Gibco A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Recombinant murine IL-2 Peprotech 212-12 Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X) Gibco 11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend 101320
 : Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)
 : Green channel excitation: 440 - 480 nm
 : Green channel emission: 504 - 544 nm
 : Red channel excitation: 565-605 nm
 : Red channel emission: 625 - 705 nm

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १४३ apoptosis कैंसर सेल सीडी 8+ टी सेल cytotoxicity प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज
इन विट्रो में के वास्तविक समय का पता लगाने ट्यूमर सेल Apoptosis सीडी 8 द्वारा प्रेरित<sup>+</sup> टी कोशिकाओं ट्यूमर घुसपैठ माइलॉयड कोशिकाओं की प्रतिरक्षा दमन कार्यों का अध्ययन करने के लिए
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Kitamura, T., Doughty-Shenton, D.,… More

Kitamura, T., Doughty-Shenton, D., Pollard, J. W., Carragher, N. O. Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells. J. Vis. Exp. (143), e58841, doi:10.3791/58841 (2019).

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