Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8⁺ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Summary

Vi beskriver här ett protokoll för att undersöka cytotoxiciteten hos föraktiverade CD8⁺ T celler mot cancerceller genom att upptäcka apoptotiska cancer celler via realtid mikroskopi. Detta protokoll kan undersöka mekanismerna bakom myeloida cell-inducerad T cell dämpning och utvärdera föreningar som syftar till att påfyllning av T celler via blockad av suppressiv myeloisk immunceller.

Abstract

Potentiering av tumör-dödande förmåga CD8⁺ T celler i tumörer, tillsammans med deras effektiva tumör infiltration, är en nyckelfaktor för framgångsrik immunterapier. Flera studier har visat att tumören infiltrerar myeloida celler (t.ex. myeloisk-derived suppressor-celler (MDSCs) och tumör-associerad makrofager (TAMs)) undertrycka cytotoxiciteten hos CD8⁺ T-celler i den tumör närmiljön och den inriktning dessa reglerande myeloida celler kan förbättra immunterapi. Här presenterar vi ett in vitro-test system för att utvärdera immun suppressiv effekterna av monocytic-MDSCs och TAMs på tumör-dödande förmåga CD8⁺ T celler. I detta syfte vi först odlade naiva mjälten CD8⁺ T celler med anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar i närvaro eller frånvaro av suppressor celler och samtidig odlade sedan föraktiverade T-cellerna med målet cancerceller i närvaro av en fluorogenic kaspas-3 substrat. Fluorescens från substratet i cancerceller upptäcktes av realtid fluorescensmikroskopi som en indikator på T-cell induceras tumör cell apoptos. I denna analys, kan vi identifiera ökningen av tumör cell apoptos av CD8⁺ T celler och dess bekämpande av före kultur med TAMs eller MDSCs. Denna funktionella analys är användbar för att undersöka CD8⁺ T cell undertryckande mekanismer av reglerande myeloida celler och identifierande druggable mål att övervinna det via high throughput screening.

Introduction

Det är känt att CD8⁺ T celler kan eliminera tumörceller när de utövar sin fulla cytotoxicitet. Efter aktivering av T-cell receptor (TCR), CD8⁺ T celler föröka sig och differentiera till cytotoxiska effektor celler. Den utökade och aktiveras CD8⁺ T celler utsöndrar cytotoxiska granulat, inklusive perforin och granzymes, som överförs till målceller och initiera olika lytisk vägar såsom kaspas-3 medierad apoptos¹. CD8⁺ T celler kan också inducera tumör cell apoptos genom att aktivera receptorer på målceller, såsom receptorer för tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), första apoptos signal ligand (FasL) eller TNF-relaterade apoptos-inducerande ligand (TRAIL). Dessutom den aktiveras CD8⁺ T celler utsöndrar interferon-γ (IFN-γ) som kan undertrycka tumör cell spridning och öka känsligheten för tumörcellerna att CD8⁺ T celler via Uppregleringen av FasL receptor¹. Tanke på potentialen för CD8⁺ T tumör dödande förmåga, flera strategier för att öka deras cytotoxicitet (t.ex. checkpoint-hämmare, cancer vaccination och överföring av chimära antigen receptorn (bil) uttrycker T-celler) har fastställts och visat betydande terapeutiska effekter på vissa typer av cancer². Ackumulerande bevis antyder dock att tumör-infiltrera immuna celler såsom regulatoriska T-celler, myeloid-derived suppressor celler (MDSCs) och tumör-associerad makrofager (TAMs) kan undertrycka CD8⁺ T cell funktioner och begränsa effekten immunterapier^3,4,5. För att förbättra sådan immunterapier, det är viktigt att förstå hur immun suppressor celler gräns CD8⁺ T cell cytotoxicitet. Identifiering av CD8⁺ T cell undertryckande mekanismer samt druggable mål att övervinna det, krävs utveckling och utnyttjande av in vitro-analyser.

Guld standard metoden att mäta CD8⁺ T cell cytotoxicitet är krom utgåva analysen där utsläpp av radioaktiva sonden (⁵¹Cr), från målet celler som är lyserat av CD8⁺ T celler, är beslutsam⁶. Denna analys har dock flera nackdelar inklusive relativt låg känslighet, hög bakgrund, oförmåga att upptäcka tidiga apoptotiska händelser, farliga förfogande problem och begränsad kompatibilitet med automatiserad vätskehantering och upptäckt att stödja högre genomströmning applikationer. En annan vanlig metod är flödescytometrisk flödesanalyser där apoptos av målceller tumör upptäcks av annexin V bindande⁷. I denna analys är det möjligt att upptäcka andra parametrar såsom mål celldöd med propidium jodid (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) och effektor cellaktivering indikeras av CD107a eller CD69 uttryck, förutom apoptos i målcellerna⁷ . Denna analys kräver dock stort antal suppressor-celler jämfört med krom utgåva analysen. Det kräver också den lösgörande och uppdelning av vidhäftande målceller och detta kan snedvrida resultaten. Faktiskt, krom release assay eller flöde flödescytometrisk analys används inte ofta att undersöka suppressor cell effekter på T-cellfunktioner. I stället mätning av T-cell spridning anges genom utspädning av ett fluorescerande färgämne (t.ex. CFSE) förinstallerad i T-celler är ofta används för att utvärdera hämning av CD8⁺ T-cellsfunktion av suppressor celler. Identifiering av IFN-γ-produktion från odlade T-celler är en annan vanlig metod för att utvärdera effekterna av suppressor celler på T-cell aktivering^8,9. Men resultaten från dessa analyser inte nödvändigtvis korrelerar till målcellen dödande förmåga av CD8⁺ T celler.

Vi presenterar här ett alternativt funktionellt test för att utvärdera effekterna av suppressor celler, särskilt makrofager i metastaserande tumörer, på cytotoxiciteten hos CD8⁺ T celler. Denna metod bestämmer cytotoxiciteten hos CD8⁺ T celler, pre odlade med eller utan suppressor cellerna i närvaro av anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar, genom att upptäcka tumör cell apoptos, indikeras av fluorescens från en fluorogenic kaspas-3 substratet⁶ använder automatiserad time-lapse mikroskopi (figur 1). Detta protokoll har flera fördelar jämfört med andra metoder. den kräver endast ett litet antal celler, möjliggör detektering av vidhäftande tumörcelldöd med hög känslighet, kan bilden effektor-to-target interaktion i realtid och är mottagliga för high throughput screening.

I detta protokoll används metastas-associerade makrofager (MAMs) och deras stamfader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isolerade från metastaserande tumörer hos möss som suppressor celler. I musmodeller av metastaserande bröstcancer, kännetecknas en distinkt befolkning av makrofager som F4/80^högLy6G^–CD11b^högLy6C^låg ackumuleras i lungan som innehåller metastaserande tumörer. Detta makrofag befolkningen sällan återfinns i den normala lungan och således kallas metastaser-associerade makrofager (MAMs)¹⁰. I dessa mus-modeller, en annan myeloisk cell befolkningen, definieras som F4/80^högLy6G^–CD11b^högLy6C^hög, ackumuleras också huvudsakligen i metastaserande lungcancer där det ger upphov till MAMs¹¹. Baserat på deras egenskaper, kan de CD11b^högLy6C^hög MAM stamceller representera M-MDSCs¹².

Protocol

Alla förfaranden som inbegriper möss utfördes i enlighet med licensierad tillstånd från UK Home Office (P526C60B3). Information om kommersiella reagenser och utrustning listas i Tabell för material.

1. beredning av målceller som uttrycker röd fluorescerande protein i sina kärnor

1. Skaffa en target mus cancer cellinje från en lämplig källa.
   Obs: I detta protokoll används en mycket metastaserande derivat av E0771 mus mjölkkörtlar tumör celler (E0771-LG)¹³ . Föräldrarnas E0771 celler härstammar från C57BL/6 möss¹⁴.
2. Tina och upprätthålla en injektionsflaska med E0771-LG celler med Dulbeccos modifierade Eagles Medium (DMEM) inklusive 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS) i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO₂.
   Obs: Det bör bekräftas att celler är negativa för mycoplasma. I detta syfte kultur E0771 celler (eller celler som skall testas) för 2-3 dagar som beskrivits ovan (i frånvaro av antibiotika och antimykotika), samla 500 μL av odlingsmedium. Centrifugera mediet vid 12,419 x g för 60 s för att eliminera cellfragment och överför supernatanten till nya rör. Bestämma mycoplasma kontaminering med hjälp av ett kommersiellt tillgängliga mycoplasma testkit (se Tabell av material) och/eller PCR-¹⁵ efter tillverkarens anvisningar.
3. Utsäde 5 x 10³ E0771-LG celler per långt in en 12-väl plattan och kultur cellerna med 10% (v/v) FBS-DMEM över natten i en inkubator på 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO₂.
   Obs: Om spridning av målceller är låg (populationsfördubblingstid mer än 36 h), antalet celler kan ökas till 1 x 10⁴.
4. Ersätta mediet med 1 mL 10% (v/v) FBS-DMEM inklusive 10 μg/mL polybrene och tillsätt 25 μl av lentiviral partiklar (1 x 10⁶ TU/mL) kodning en nukleär begränsad röd fluorescerande protein (mKate2, se Tabell för material).
5. Odla cellerna för 24 h i en inkubator på 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO₂.
6. Ersätta mediet med 10% (v/v) FBS-DMEM och odla cellerna för 24-48 h i en inkubator på 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO₂.
7. Ersätta mediet med 10% (v/v) FBS-DMEM inklusive 1 μg/mL puromycin när celler börjar uttrycka röd fluorescerande protein, och odla cellerna tills de är 80-90% konfluenta.
   Obs: Koncentrationen av puromycin kommer att skilja mellan mål celltyper och bör optimeras med hjälp av un-transfekterade celler.
8. Subkultur överlevande celler för 1-3 gångar med 10% (v/v) FBS-DMEM inklusive 1 μg/mL puromycin och frysa bestånd i ett lagringssystem för flytande kväve vapor fas fram till användning.

2. isolering av suppressor celler från tumörer hos möss

Obs: I detta protokoll, suppressor celler (dvs MAMs och M-MDSCs) är isolerade från lungan som innehåller metastaserande tumörer fastställt E0771-LG celler. Villkor för vävnad dissociation och cell sortering bör optimeras för att isolera cellerna från olika vävnader.

1. Injicera 1 x 10⁶ cancerceller (E0771-LG) i svansen ven syngena (C57BL/6), kvinnlig, 7-10 vecka gamla möss.
2. Efter 14 dagar, isolera lungan som innehåller metastaserande tumörer och preparering av encelliga från perfunderade lungorna via enzymatisk nedbrytning som tidigare beskrivits¹¹.
   Obs: I detta protokoll, injiceras fyra möss med cancerceller och deras metastaserande lungor kombineras för att erhålla tillräcklig suppressor-celler.
3. Inkubera de enda cellsuspensioner med antimus CD16/CD32 antikropp i 30 min på isen, och fläckar med fluorescerande antikroppar mot CD45, F4/80, CD11b, Ly6C och Ly6G (se Tabell för material) för en annan 30 min^{10,11 , 13}.
4. Tvätta de färgade cellerna en gång med 1 mL PBS som innehåller 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), och åter centrifugerade cell med 500-1000 μL av PBS som innehåller 2% (w/v) BSA.
5. Lägg till 3 μM av DAPI, och sortera M-MDSCs (DAPI^–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^högLy6C^hög) och MAMs (DAPI^–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^hög Ly6C^låg) använder en cell sorterare (kompletterande Figur1).
   Obs: Tröskeln till Ly6C nivå att skilja MAMs (Ly6C^låg) och M-MDSCs (Ly6C^hög) är baserat på det av bosatta alveolära makrofager (RMAC). Renhet av sorterade cellerna mäts via flödescytometri med en förväntad renhetsgrad av mer än 90%.
6. Att resuspendera sorterade cellerna med 400 μL av DMEM som innehåller 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1% (v/v) icke-essentiell aminosyra, 1 mM natrium pyruvat, och 50 nM 2-merkaptoetanol (kallas berikad-DMEM, E-DMEM).
7. Räkna antalet levande celler som använder den Trypan blå utslagning metod¹⁶ och justera till 2 x 10⁶ celler/mL med E-DMEM.
8. Hålla cellerna på is fram till användning.

3. isolering av CD8⁺ T celler från mjälten hos möss

1. Isolera mjälte från en mus som är syngena till målet cancer cell linje (dvs C57BL/6 möss i detta protokoll) enligt följande:
   1. Avliva djuret av CO₂ inandning.
   2. Placera djuret en ren dissekering styrelsen och torka huden med 70% (v/v) etanol.
   3. Skär bukhuden med sax för att exponera mjälte
   4. Isolera mjälten, som ligger sämre till magen, och placera det i en tub innehållande 5 mL iskallt PBS.
2. Använda inre kolven av en steril 5 mL spruta, slipa mjälten på en 100 μm cell SIL på en 50 mL tub.
3. Passera filtret med totalt 10 mL PBS cellerna.
4. Centrifugera cellsuspension vid 337 x g i 5 min och Aspirera supernatanten.
5. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS med 2 mM EDTA och 0,5% (w/v) BSA (kör buffert) och filtrera genom en sil med 40 μm i cellen.
6. Räkna antalet levande cell och justera till 1 x 10⁸ celler/mL med hjälp av rinnande bufferten.
   Obs: Håll en liten delmängd av celler som före berikning prov för en renhetskontroll.
7. Berika för CD8⁺ T celler med hjälp av ett negativt urval kit och en magnetisk sorterare (se Tabell för material).
   1. Överföra 1 x 10⁸ (1 mL) av splenocytes celler till en 5 mL polystyren runda-botten röret.
   2. Tillsätt 50 μL av biotinylerade antikroppar och odla i rumstemperatur i 10 min.
   3. Tillsätt 125 μl av streptividin konjugerat magnetiska pärlor och odla i rumstemperatur i 5 min.
   4. Tillsätt 1.325 mL kör buffert och blanda försiktigt genom pipettering.
   5. Placera röret i magneten och inkubera vid rumstemperatur för 2,5 min.
   6. Plocka upp magneten, och häll berikad cellsuspensionen i en ny tub.
8. Omsuspendera berikad cellerna med 200 μL av E-DMEM (i.e., DMEM innehållande 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1% (v/v) icke-essentiell aminosyra, 1 mM natrium pyruvat och 50 nM 2-merkaptoetanol).
9. Räkna antalet levande celler och justera till 2 x 10⁶ celler/mL med E-DMEM. Hålla cellerna vid 37 ° C i en CO₂ inkubator fram till användning.
   Obs: Håll en liten delmängd av celler som efter anrikning prov för en renhetskontroll.
10. Bestämma renheten av CD8⁺ T celler av flödescytometri enligt följande:
    1. Ta 1 x 10⁴ celler från före berikning (steg 3.6) eller efter anrikning (steg 3,9) prover och justera total volym varje 100 μL med rinnande buffert.
    2. Inkubera de enda cellsuspensioner med antimus CD16/CD32 antikropp i 30 min på isen, och fläckar med fluorescerande antikroppar mot CD45, CD3, CD4 och CD8 (se Tabell för material) för en annan 30 min.
    3. Tvätta de färgade cellerna med 500 μL av PBS som innehåller 2% (w/v) BSA och åter centrifugerade cell med 500-1000 μL av PBS som innehåller 2% (w/v) BSA.
11. Lägga till 3 μM av DAPI och bestämma procentandelen av CD3⁺CD4^–CD8⁺ celler i den totala CD45⁺ cell befolkningen.

4. aktivering och expansion av den isolerade CD8⁺ T celler

1. Alikvotens 1 x 10⁵ celler per 50 μL CD8⁺ T celler (bereddes i steg 3,9) i brunnar i en U-botten 96 brunnar tallrik.
2. Lägg till 1 x 10⁵ celler per 50 μL suppressor celler (bereddes i steg 2,7) eller 50 μL av E-DMEM i brunnar.
3. Förbereda aktiveringen medium som består av E-DMEM, 4 x 10⁴ U/mL granulocytkolonistimulerande faktor 1 (CSF-1), 240 U/mL interleukin-2 (IL-2), 8 μg/mL antimus CD3ε antikropp och 16 μg/mL antimus CD28-antikropp.
   Obs: CSF-1 krävs inte för T-cellsaktivering, men är avgörande för överlevnad av suppressor celler i detta protokoll (dvs MAMs och M-MDSCs). Således finns det kvar i samtidig kulturen av T-celler med målet cancerceller att upprätthålla konsekvens i odlingsbetingelser. Eftersom CSF-1 finns i nano-molar koncentrationer i alla vävnader och krävs för monocyt/makrofag livskraft in vivo är ett fysiologiska sammanhang för dessa celler.
4. Tillsätt 50 μL av aktiveringen medium (steg 4.3) och 50 μL av E-DMEM med eller utan reagenser testas.
5. Placera plattan i en inkubator på 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO₂ och odla cellerna i 4 dagar.

5. inställning av samtidig kultur av target cells med föraktiverade CD8⁺ T celler

1. Tillsätt 30 μl av 1: 100 utspädda tillväxtfaktor-reducerad lösliga basalmembranet matris (Tabell för material) i brunnar av platt bottenplattan med 96 brunnar lämplig för mikroskopi och inkubera vid 37 ° C i en CO₂ inkubator för minst 1 h.
2. Förbereda målcellerna (dvs. E0771-LG celler som uttrycker kärn-begränsad röd fluorescerande protein).
   1. Inkubera målceller med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA i rumstemperatur i 1 min och skörda cellerna av mild pipettering.
   2. Tillsätt 9 mL DMEM inklusive 10% (v/v) FBS och centrifugera cellsuspension vid 337 x g i 5 min.
   3. Slamma upp cellerna med 500 μL av E-DMEM och räkna antalet levande celler.
      Obs: Innan räkna målceller, filtrera cellerna genom en 40μm cell SIL att producera enstaka cellsuspension.
   4. Justerar tätheten till 2 x 10⁴ celler/mL (= 1 x 10³ celler per 50 μL) genom att lägga till E-DMEM och hålla cellerna på is.
3. Förbereda effektor celler (dvs föraktiverade CD8⁺ T celler).
   1. Återsuspendera cellerna i en brunn av plattan med 96 brunnar (steg 4,5) grundligt genom pipettering och överföring av flytande CD8⁺ T celler in i en ny 1,5 mL tub.
      Obs: MAMs och M-MDSCs tätt följer väl och är inte fristående vid de pipettering.
   2. Att samla in resterande celler, tillsätt 200 μl av PBS i brunnen och överföra in röret i steg 5.3.1.
   3. Tvätta cellerna med 1 mL E-DMEM en gång (Centrifugera vid 337 x g) för 5 min, aspirera och Kassera supernatanten), och resuspendera dem med 100 μL av E-DMEM.
   4. Räkna antalet levande celler (med metoden trypan blå utslagning), justera densiteten till 1,6 x 10⁵ celler/mL (= 4 x 10³ celler/25 μL) och hålla cellerna på is.
4. Aspirera basalmembranet matrisen från varje brunn av plattan i steg 5.1.
5. Tillsätt 1 x 10³ celler/50 μL av målceller (steg 5.2.4) i varje brunn och blanda väl.
   Obs: För att undvika kanteffekter på grund av avdunstning av medium, endast inre 60 brunnarna av 96 väl plattan kan användas för analys.
6. Tillsätt 25 μL av E-DMEM inklusive 4 x 10³ U/mL IL-2 och 10 μM fluorogenic kaspas-3 substrat (se Tabell för material).
7. Tillsätt 4 x 10³ celler/25 μL av CD8⁺ T celler (5.3.4 steg) i lämpliga brunnar och blanda väl.
   Obs: Förekomsten av alltför många celler i en brunn försvårar analysen. I denna modell, en 4:1 effektor: mål baserat (totala cell nummer 5 x 10³ celler per brunn) var optimal, men ett 8:1-förhållande var suboptimal. Brunnar som innehåller följande fyra kontroller är nödvändiga för att hjälpa med dataanalys: rikta celler på tätheten används för samtidig kultur brunnarna (1 x 10³ celler per brunn) i medium med och utan kaspas-3 substrat, effektor celler (1 x 10³ celler / väl) i medium med och utan kaspas-3 substrat.
8. Tillsätt 200 μL av PBS eller sterilt vatten i alla tomma brunnar (särskilt brunnar i periferin av plattan) för att minska avdunstning av medium från experimentell wells.
9. Ställa in plattan i time-lapse fluorescens Mikroskop som hålls vid 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO₂.
   Obs: Skaka plattan i en cross-mönster att fördela alla celler jämnt, och sedan låta plattan att förbli i rumstemperatur på en plan yta för 10-20 min innan du överför till inkubatorn.

6. imaging av celler

Obs: Detaljerad bild förvärv inställningar varierar med Mikroskop och fluorophores används; följande allmänna förvärv parametrar bör användas för optimalt resultat.

1. Använda en lämplig autofokus rutin på mikroskopet, förvärva bilder som täcker minst 25% av den totala ytan i varje experimentella väl av plattan med 96 brunnar.
2. Ställ mikroskopet att förvärva bilder i faskontrast samt en fluorescerande kanal som är lämplig för det kärn-begränsad röd fluorescerande proteinet (mKate2) och en fluorescerande kanal som är lämplig för den gröna fluorogenic aktiverat kaspas-3 substrat (med magnetiseringen på 488 nm) (figur 2).
3. Ta bilder i experimentell brunnar i faskontrast och 2 fluorescerande kanalerna varje 1 till 3 h för minst 72 h.

7. bildanalys med bild analys programvara

Obs: Detaljerad bild analys inställningar varierar med den programvara som används (se Tabell för material); följande allmänna analyser bör användas för optimalt resultat.

1. Avgöra om spektral un-blandning krävs att separera den fluorescerande signal som avges av målet cellkärnor från som som avges av apoptotiska kärnor och vid behov ställa in en analys protokoll att åstadkomma detta;
   1. Visa en kontrollbrunnen innehållande endast målcellerna (mkate2-märkt) i medium utan kaspas-3 substrat i grön fluorescerande kanalen.
   2. Observera om grön fluorescens som avges av den röda kärnor (kärnor visas gröna)
   3. Om grön fluorescens framgår i kärnor, den spektrala unmixing åtkomstkontroll i avbildningsprogrammet och öka andelen red bort från grönt tills den gröna signalen försvinner (vår erfarenhet, detta är vanligtvis 6-7% för ljusa mKate2 fluorescens).
   4. Om grön fluorescens inte framgår i några kärnor, ingen spektrala minoriteter är nödvändigt.
      Obs: Denna spektrala unmixing korrigering testet kan också utföras med en brunn av målceller i medium innehållande kaspas-3 substrat. Dock finns det oftast en mycket låg nivå av spontana apoptos i målcellerna (mindre än 10%), vilket resulterar i några mål cellkärnan avger grön fluorescens på grund av aktivering av kaspas-3 i stället för fluorescens blöda igenom. Sanna fluorescens blöda igenom märks under dessa förhållanden när grön fluorescens framgår i alla kärnor.
   5. Visa en kontroll brunn innehållande endast effektor celler (kärnor omärkt) i medium utan kaspas-3 substrat i röda och gröna kanalen individuellt.
   6. Observera om antingen grön eller röd fluorescens som avges av atomkärnor. Om varken röd eller grön fluorescens framgår i de enskilda kanalerna är ingen spektrala minoriteter nödvändigt.
      Obs: I vår erfarenhet, musen CD8⁺ T celler inte auto-fluorescerande och därför ingen spektrala minoriteter är nödvändigt för dessa celler. Spektral unmixing korrigering testet kan också utföras med hjälp av en väl effektor celler i medium innehållande kaspas-3 substrat. Dock finns det oftast någon form av spontan apoptos resulterar i effektor cellkärna avger grön fluorescens på grund av aktivering av kaspas-3. Sanna fluorescens blöda igenom märks under dessa förhållanden när grön fluorescens framgår i alla kärnor.
2. Använda en fluorescens bakgrund subtraktion metod (t.ex. TopHat), med relevanta parametrar för provet, för att lösa fluorescerande objekt i båda fluorescerande kanaler.
   Obs: I den gröna kanalen vi använt TopHat (kärnor radie = 10,0 µm, grön fluorescens tröskelvärde = 0.7 grön kalibrering enheter). I den röda kanalen vi använde TopHat (kärnor radie = 10,0 µm, röd fluorescens tröskelvärde = 0,5 röd kalibrering enheter).
3. Använda lämpliga parametrar för edge-delning för att lösa individuella fluorescerande atomkärnor.
   Obs: Vi använde inte kanten uppdelning i kanalen grön eller röd fluorescens.
4. Använda bilder i den röda kanalen från brunnarna som innehåller endast målcellerna (med kaspas-substrat) för att bestämma den minsta storleken av målet atomkärnor.
   Obs: Vi använde 80 µm².
5. Använda bilder i den gröna kanalen från brunnarna som innehåller endast effektor celler (med kaspas-substrat) för att avgöra den genomsnittliga storleken på apoptotiska effektor atomkärnor.
   Obs: Enda apoptotiska effektor atomkärnor varierade mellan 40 – 80 µm² i dessa experiment.
6. Ställa in en analysförfarandet för att räkna antalet fluorescerande mål cellkärna med hjälp av en lämplig minsta storlek begränsning (t.ex. minsta areal, minsta diameter) (figur 2, target detection mask).
   Obs: Vi använde ett minsta atomkärnor område (röd fluorescens) = 80 µm².
7. Ställa in en analys förfarande att räkna antalet apoptotiska kärnor som är större än den genomsnittliga storleken apoptotiska effektor atomkärnor (figur 2, storlek begränsas apoptos mask).
   Obs: Storlek filter var satt till 80 µm² (dvs. bara områden av grön fluorescens större än denna storlek räknades, alltså exklusive enda apoptotiska effektor kärnor). Med hjälp av dessa parametrar ökar precisionen i analysen i räknar apoptotiska mål cellkärnor även om vissa aggregat av apoptotiska effektor celler får räknas.
8. Ställa in en analys procedur att räkna antalet apoptotiska målceller genom att räkna kärnor där röd fluorescerande signal (från steg 7,6) och storlek-begränsad grön fluorescerande signal (från steg 7,7) betydligt Co lokalisera (figur 2, R /G överlappning mask).
   Obs: En lämplig samtidig lokalisering kan variera från 30% till 100% av genomsnittsstorleken mål atomkärnor. Överlappning storlek filter var satt till 40 µm².
9. Bestämma antalet cellkärnor apoptotiska mål såväl som antal mål cellkärnor i brunnarna för varje experimentella villkor under hela tiden.

8. dataanalys med hjälp av beräkning och grafritande programvara

1. Diagram antalet apoptotiska mål cellkärnor som erhölls i steg 7,9 under hela tiden för de experimentella brunnarna. Om flera brunnar användes för varje experimentella villkor, grafiskt presentera resultatet som medelvärde ± standardavvikelse.
2. Beräkna den apoptotiska fraktionen av målceller befolkning genom att dividera antalet apoptotiska celler i varje brunn med antal målceller i varje brunn vid varje tidpunkt.
3. Diagram resultaten i steg 8,2.
4. Bestäm arean under kurvan (AUC) för varje kurva. Den topp apoptotiska bråkdel av befolkningen för varje kurva kan också bestämmas samt den tidpunkt vid vilken toppen sker, om så önskas. Avgöra om AUC fastställas för de experimentella förhållandena är betydligt olika använda lämpliga statistiska tester.
   Obs: Oparat t-test med Welchs korrigering tillämpades på AUC resultaten.

Representative Results

Denna metod bygger på enkel samtidig kultur av målet cancerceller med effektor CD8⁺ T celler som har funnits före odlade med eller utan suppressor celler i närvaro av anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar. Den upptäcker CD8⁺ T cell-inducerad cancer cell apoptos över tid efter samtidig kultur, vilket möjliggör utvärdering av effekter av suppressor celler på cytotoxicitet av CD8⁺ T celler.

Normalt, cancerceller öka grön fluorescens i sina kärnor efter aktivering av en kärn-targeting kaspas biosensor när dessa celler gör kontakt med CD8⁺ T celler som är föraktiverade av antikroppar i avsaknad av suppressor celler ( Figur 3. Kompletterande Movie 1). Grön fluorescens från kaspas underlaget var detekterbar för minst 15 h efter apoptos inleddes. Några spontana apoptos av effektor CD8⁺ T celler observerades också över tiden även om dessa celler odlades i isolering (figur 4; Kompletterande filmen 2). Dock atomkärnor storlekar av CD8⁺ T cellerna är mindre än de av cancerceller och således apoptotiska 'effektor' celler kan uteslutas från apoptotiska 'target' blodkroppar med en storlek begränsning bild analysmetod (figur 2 och figur 4). Men vissa mål cancerceller visar en liten rundad form utan grön fluorescens, påverkar detta inte analysen eftersom dessa celler genomgår Mitos i stället för apoptos (kompletterande Movie 3), och därmed är undantagna från apoptotiska 'mål' blodkroppar av en röd/grön överlappning mask (kompletterande figur 2). Spontan apoptos av målet cancerceller finns ibland även i den enda kulturen (kompletterande Movie 3). Men samtidig kulturen i målet cancer celler med föraktiverade CD8⁺ T cells ökad tumör cell apoptos över nivåerna av spontana apoptos i monokultur av cancerceller (figur 4). Generellt när du använder en optimala förhållandet mellan mål cancerceller till effektor celler, kan en topp i antalet apoptotiska mål cancerceller observeras (figur 5A). Denna topp är mer distinkta när data uttrycks som den apoptotiska fraktionen av cell målpopulationen (figur 5B). I detta experiment nådde den basala apoptos av målet tumörceller 24 h (med apoptotiska bråkdel = 0,08), men CD8⁺ T cell-inducerad apoptos nådde en högsta nivå på 17 h (med apoptotiska bråkdel = 0,66).

Vidare fann vi att CD8⁺ T celler före inkuberas med MAMs eller M-MDSCs kunde göra kontakt med målet cancerceller men denna kontakt tycktes resultera i färre fall av cancer cell apoptos jämfört CD8⁺ T celler föraktiverade utan suppressor celler (figur 3 och figur 4. ” Kompletterande Movie 4 och kompletterande film 5). Även om CD8⁺ T celler före inkuberas med myeloida celler ibland inducerad cancer cell apoptos, fanns det också några spridning av mål cancerceller som inte har stimulerats för att genomgå apoptos under tiden den experiment (kompletterande film 6). Konsekvent med dessa fynd, peak fraktionen av apoptotiska cancerceller odlade med CD8⁺ T celler före inkuberas med myeloida celler (apoptotiska bråkdel = 0,38 på 23 h för MDSC-E och 0,25 på 20 h för MAM-E) var betydligt lägre än för cancerceller odlade med CD8⁺ T celler som inte fanns före ruvade med suppressor celler (figur 6).

Figur 1: ett system som visar experimentella förfarandet. Naiva mjälten CD8⁺ T celler odlas med anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar med eller utan metastaser-associerade makrofager (MAMs) eller monocytic-myeloisk-härledda suppressor celler (M-MDSCs). Efter 4 dagar, flytande CD8⁺ T celler samlas in och samtidig odlade med målet cancerceller i närvaro av fluorogenic kaspas-3 substrat. Apoptotiska cancerceller upptäcks under realtid fluorescensmikroskopi. Bilderna har förvärvats med en levande cell-imaging platform (se Tabell för material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: identifiering av apoptotiska målceller skiljer sig från apoptotiska effektor celler. Översta raden: bild förvärv i den röda kanalen möjliggör identifiering av mål cellkärnorna av target detection mask (rosa analys mask). Mellersta raden: bilder som förvärvats i den gröna kanalen indikerar apoptotiska effektor och målet celler. Minneskanalläge begränsade apoptos mask (teal analys mask; större än 80 µm²) tillåter enda apoptotiska effektor celler som ska uteslutas från analysen. Nedersta raden: komposit bilder kopplade röda och gröna kanalerna med fas kontrast bild (vänster) eller röd/grön överlappar mask (höger). Identifiering av samtidig lokaliserade, storlek-begränsad grön fluorescens med röd fluorescens (gula analys mask), tillåter mer korrekt upptäckt av apoptotiska mål atomkärnor (gula pilspets) genom att utesluta aggregat av apoptotiska effektor celler (vit pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Samspelet mellan CD8⁺ T celler och cancerceller. Stillbilder från representativa time-lapse filmer av E0771-LG_NLR målcellerna (T) Co odlade med effektor CD8⁺ T celler (E) på 4:1 effektor/målgrupper baserat. MDSC-E och MAM-E anger effektor celler före inkuberas med M-MDSCs och MAMs respektive. Sammansatta bilder (inklusive bilder från fas kontrast, röda och gröna kanalerna) visas. Pilspetsar spårar samma celler genom olika områden och tidpunkter. Gula pilspetsar: ett mål som associeras med effektorer och genomgår apoptos, vit pilspetsar: ett mål som associerar med effektorer men inte genomgår apoptos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Påvisande av apoptotiska cancerceller. Representativa områden utvinns ur time-lapse filmer vid 18 h efter imaging. Sammansatta bilder (vänster; fas kontrast, röda och gröna kanalerna) och bilder från red kanal utan (i mitten) eller med (höger) röd-gröna överlappning mask (gul) visas. Gula prickar i den högra kolumnen representerar apoptotiska cancerceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: CD8⁺ T cell-inducerad cancer cell apoptos. (A) antalet apoptotiska cancerceller odlade med effektor C8⁺ T-celler på olika effektor-målet förhållande (E:T). (B) apoptotiska bråkdel av cell målpopulationen. Uppgifterna är medel ± SD. genomsnittlig area under kurvan (AUC) visas också. Oparade t-test med Welchs korrigering användes för att analysera AUC. * P < 0,0001 jämfört med E:T = 0:1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Effekter av tumör-infiltrera myeloida celler på cytotoxicitet av CD8⁺ T celler. (A) antalet apoptotiska cancerceller (mål: T) odlade med C8⁺ T celler (effektor: E) på 4:1 E:T förhållande. CD8⁺ T celler odlades redan i frånvaro (svart cirkel) eller förekomst av monocytic-myeloisk-härledda suppressor celler (MDSC-E: blå cirkel) eller metastas-associerade makrofager (MAM-E: röd cirkel). Data är medel ± SD. (B) apoptotiska bråkdel av cell målpopulationen. Uppgifterna är medel ± SD. menar AUC visas också. Oparade t-test med Welchs korrigering användes för att analysera AUC. * P < 0,0001 jämfört T endast, ^#P < 0,0001 jämfört med E + T. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1. Gating strategi att isolera suppressor celler från metastaserad lungcancer. (A) representativa dot tomter att isolera monocytic myeloisk-derived suppressor celler (M-MDSCs) och metastas-associerade makrofager (MAMs). Tröskeln till Ly6C nivå att skilja MAMs (Ly6C^låg) och M-MDSCs (Ly6C^hög) är baserat på det av bosatta alveolära makrofager (RMAC). (B) renheten av de sorterade M-MDSCs (CD45⁺Ly6G^–CD11b⁺Ly6C^hög) och MAMs (CD45⁺Ly6G^–CD11b⁺Ly6C^låg). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande figur 2. Representativa bilder av mitotiska målceller. Stillbilder från representativa time-lapse filmer av mål E0771-LG_NLR cell mono-kultur. Överst: sammansatta bilder inklusive bilder från fas kontrast, röda och gröna kanalerna. Botten: sammansatta bilder (röda och gröna kanalerna) med röd-gröna överlappning mask. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande figur 3. Effekter av tumör-infiltrera myeloida celler om spridning av CD8⁺ T celler. (A) representativa histogram som visar utspädning av fluorescerande märkning med CFSE i CD8⁺ T celler. Naiva mjälten CD8⁺ T celler var isolerade som beskrivs i protokollet-3 och märkt med 5 µM av CFSE vid 37 ° C i 15 min. Märkt T-cellerna var odlade i närvaro av IL-2 och anti-CD3/CD28 aktivera antikroppar med eller utan myeloida celler som beskrivs i protokoll 4. Efter 4 dagar upptäcktes grön fluorescens i T-celler av flödescytometer. (B) Division index av CD8⁺ T celler beräknas som tidigare beskrivna¹⁷. Data är medel ± SEM. * P < 0,01 jämfört med kontroll, ^#P < 0,05 jämfört med αCD3/CD28 Ab. vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 1. Film av figurerna 3 och 4. E + T. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 2. Film av figurerna 3 och 4. Effektor (E). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 3. Film av figurerna 3 och 4. Mål (T). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 4. Film av figurerna 3 och 4. MDSC-E + T. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 5. Film av figurerna 3 och 4. MAM-E + T. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film 6. Film av figurerna 3 och 4. MAM-E + T (spridning). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Denna metod är baserad på två separata samtidig kultur steg: samtidig odling CD8⁺ T celler med potentiella suppressor-celler, och samtidig odling av 'konditionerade' CD8⁺ T celler med målet tumörceller (figur 1). Det första steget för samtidig kultur är ganska liknande den för CD8⁺ T cell spridning analyser används vanligen för att bestämma effekten av suppressor celler på CD8⁺ T-cellsfunktion. Dock korrelerar T cell spridning inte alltid med deras cytotoxicitet. Exempelvis har vi funnit det samtidig kulturen med M-MDSCs eller MAMs ökade snarare än minskade spridningen av CD8⁺ T celler i närvaro av CD3/CD28 aktivera antikroppar (kompletterande figur 3), medan dessa pre luftkonditionerade CD8⁺ T-celler visat minskad cytotoxicitet mot målet cancerceller (figur 4, figur 5, figur 6). Dessa resultat betona vikten av utvärdering av funktionell aktivitet, framgår av målet cancer cell apoptos, erbjuds av denna CD8⁺ T cell cytotoxicitet analys.

I denna analys, vi har identifierat att CD8⁺ T celler kräver ca 15 h av samtidig kultur för att framkalla maximal apoptos av E0771-LG mus mjölkkörtlar tumörceller (figur 5). Denna försening kan bero på eftersläpning mellan första kontakten av effektor celler med mål och medföljande immun synaps bildas, samt tid som krävs för att framkalla apoptotiska signaler i mål mätt av aktivering av kaspas-3 (kompletterande film 1 ). Vi har även identifierat som antalet apoptotiska tumörceller nått en platå efter 24 h, vilket förmodligen beror på avskaffandet av mål av T-celler och/eller fluorescerande signalförlust från döda celler. Denna kapacitet att identifiera tiden av peak apoptos är en stor fördel med denna analys eftersom fastställandet av en optimal tidpunkt är viktigt för lämpliga jämförelser mellan olika förhållanden. I vårt fall till exempel skillnaden i cytotoxicitet mellan kontroll CD8⁺ T celler och MDSC/MAM-utbildas CD8⁺ T celler var mycket större på 15-18 h jämfört med 72 h (figur 5), och således en slutpunkt experimentera med en 72 h inkubationstid skulle ge missvisande resultat.

Denna metod gör det också möjligt för visualisering av realtid effektor-to-target cell interaktion, vilket skulle ge större insikter i mekanismen bakom begränsad cytotoxiciteten hos CD8⁺ T celler före inkuberas med suppressor celler. Till exempel, vi konstaterade att CD8⁺ T celler före inkuberas med M-MDSCs eller MAMs stött och interagerat med målet tumörceller men inducerade inte alltid apoptos (kompletterande film 4, kompletterande film 5, kompletterande film 6). Även om vi inte kvantifiera denna händelse, vore det genomförbart och intressant att kvantifiera och jämföra andelen möten och deras interaktion tid i samband med induktion av apoptos. En annan stor fördel är att den här metoden kräver ett litet antal celler (t.ex., 1 x 10³ mål) och 4 x 10³ effektor celler per brunn. I själva verket kan detta protokoll vara ytterligare miniatyriserade för plattan med 384 brunnar format om så önskas. Denna analys är därför lämplig för high throughput screening och experiment där cell nummer är begränsade som in vitro- tester med dyrbara celler härstammar från in vivo eller ex vivo prover.

Däremot, är en begränsning av nuvarande analysen förekomsten av betydande antal döda effektor celler i vissa förhållanden. För att öka träffsäkerheten i skilja apoptos mål cancerceller från det av effektor CD8⁺ T-celler, atomkärnor av målet celler är märkta och en nuclei storlek begränsning (som utesluter effektor celler) används för dataanalys i detta assay (figur 2). Det finns dock vissa fall där överlagring av aggregat av (gröna) apoptotiska CD8⁺ T celler till cancerceller icke-apoptotiska mål, som kan blanda ihop resultaten. Denna begränsning kan mildras genom användning av en död cell borttagning kolumn på effektor celler före samarbete kultur med målet tumörceller, förutsatt att tillräckligt antal effektor celler finns tillgängliga. Med mer komplexa mikroskopi system, kan det också vara möjligt att minska den falska positiva signalen genom märkning effektor CD8⁺ T celler med en fluorophore skiljer sig från målet cellen atomkärnor och fluorogenic kaspas-3 substrat.

Hittills har detta protokoll har använts för att undersöka antigen icke-specifik aktivering av CD8⁺ T celler. Även om MDSCs och TAMs i den tumör mikromiljö undertrycka T cellfunktioner genom antigen icke-specifika mekanismer, undertrycka MDSCs i perifera lymfoida vävnader T-cell svar i en antigen specifika sätt¹⁸. För att undersöka immun suppressiv funktioner sådana celltyper, en in vitro-spridning analys använder CD8 celler⁺ T från OT-1 transgena möss används ofta. I denna analys, OT-1 T-cellerna (uttrycker äggalbumin (OVA) specifik T-cells receptor) Co odlas med suppressor MDSCs i närvaro av OVA peptider, som är tillämpligt för den första kulturen i våra cytotoxicitet analys (i.e., aktivering av T-celler i närvaron eller frånvaron av dämpning). Det är också möjligt att manipulera mål cancerceller att uttrycka ägg, som kan framkalla antigen-specifika cancer cell dödande av OT-1 T-celler. Analysen möjliggör därför även utredning av MAM/MDSC-medierad dämpning av antigen-specifika T-cellsaktivering. Det är också möjligt att tillämpa den analysmetod för att undersöka mänskliga celler, aktiveringen antikroppar mot humant CD3 och CD28 är kommersiellt tillgängliga, och ett protokoll att isolera mänskliga TAMs från kliniska prover har varit etablerade¹⁹.

Sammantaget denna analys är ganska mångsidig och kan användas för att undersöka cytotoxiciteten hos andra immunceller typer. För närvarande i våra labb, det utvidgas för att undersöka antigen-beroende cell cytotoxicitet under olika förhållanden och är också utvecklas för high throughput screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
12-Well Cell Culture Plate	Freiner Bio-One	665-180
1x PBS	Gibco	14190-094
2-mercaptethanol	Sigma	M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube	FALCON	352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )	Costar	3799	Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom)	Nunc	165305	Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody	BIO-RAD	MCA497A647	Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody	Biolegend	100730	Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody	Biolegend	102111	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody	Biolegend	100314	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100236	Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody	Biolegend	128026	Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum Albmin	Sigma	A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon)	FALCON	352360	To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon)	FALCON	352340	To filter the lung digestion
DAPI	Biolegend	422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium	Gibco	41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit	StemCell Technologies	19853
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100406	Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use	Gibco	A1596-01	Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent	Essen BioScience	4476	Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		Analysis software
L-Glutamine (100X)	Gibco	A2916801
Lung Dissociation Kit	Miltenyi	130-095-927	Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
Non-essential amino acid (100X)	Gibco	11140-035
NucView488	Biotium	10403	Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127607	Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101216	Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen Strep	Gibco	15140-122	Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103132	Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma	H9268
Puromycin	Gibco	A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301
Recombinant murine IL-2	Peprotech	212-12	Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X)	Gibco	11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	101320
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)  : Green channel excitation: 440 - 480 nm  : Green channel emission: 504 - 544 nm  : Red channel excitation: 565-605 nm  : Red channel emission: 625 - 705 nm