头脊髓和薄片体外制备心律失常活性
Summary
该方案既直观地传达脑干脊髓的准备, 并阐明脑干横向切片的准备工作, 一个全面的逐步的方式。它的目的是提高重现性, 并提高获得可行的, 持久的, 有节奏的活性切片记录神经输出从脑干的呼吸区域的可能性。
Abstract
哺乳动物的吸气节律是由髓质区域的神经元网络产生的, 称为前 Bötzinger 复合体 (pBC), 它产生一个信号, 推动吸气肌肉的节律收缩。在 pBC 中产生并携带到其他神经元池以驱动呼吸肌肉组织的艺术神经活动可以使用各种方法进行研究, 包括整块神经记录和横向切片记录。然而, 以前公布的方法并没有广泛地描述脑干细胞-脊髓解剖过程以透明和可重复的方式为未来的研究。在这里, 我们提出了一个全面的概述的方法, 用于可重现切割节奏活跃脑干切片包含必要和足够的神经元电路产生和传输吸气驱动器。这项工作建立在以前的脑干-脊髓电生理方案的基础上, 以提高可靠地获得可行和有节奏活性的切片记录 pBC 的神经元输出, 舌下前运动神经元 (XII pMN),低性腺运动神经元 (XII MN)。所介绍的工作扩展了以前公布的方法, 提供了详细的, 逐步的插图解剖, 从整个老鼠小狗, 体外切片含有十二根。
Introduction
脑干呼吸神经网络为了解节律神经网络的一般特征提供了一个肥沃的领域。特别是, 兴趣是新生儿啮齿类动物呼吸的发展和了解呼吸节律是如何发展的。这可以使用多级方法, 包括体内整体动物胸腔造影, 体外的群内神经记录, 以及包含呼吸节律发生器的体外切片记录。体外还原法和切片记录是在询问发育中啮齿类动物脑脊髓区呼吸节律发生和神经回路背后的机制时使用的一种有利方法。发育中的呼吸系统包括大约40种细胞类型, 其特点是射击模式, 包括中央呼吸1,2的细胞类型。中央呼吸网络包括一组有节奏的活跃神经元,位于南边外侧髓质 1,3。哺乳动物呼吸节律发生是由一个被称为前 Bötzinger 复合体 (pBC) 的自心律失常网络产生的, 该网络通过新生儿哺乳动物的切片和整体制剂进行了局部实验脑干脊髓 3,4,5, 6,7,8。这个区域的功能类似于心脏的窦房结 (SA), 并产生一个吸气计时系统来驱动呼吸。从 pBC, 吸气节律被带到脑干的其他区域 (包括舌下运动核) 和脊髓运动池 (如驱动隔膜的肾上腺运动神经元)9.
节律活动可通过脑髓整体制备或切片从各种细胞群, 包括 C3-c5 神经根, 十二神经根, 下运动核 (XII mn), 下腔运动神经元 (XII pMN), 以及pbc3,10,11,12。虽然这些数据收集方法在少数实验室都是成功的, 但许多协议的提出方式并不能完全再现进入该领域的新研究人员。要获得可行的和有节奏的活跃的整体和切片准备工作, 需要通过解剖和切片方案的所有步骤, 非常注意细节。以前的协议广泛地描述了各种记录程序和电生理学, 但缺乏细节, 在获得一个可行的组织准备最关键的部分: 执行脑干脊髓解剖和切片程序。
有效地获得节奏活跃和可行的整体或切片准备脑干脊髓电生理记录要求正确、仔细和快速地执行所有步骤 (通常情况下, 这里相关的整个过程可以是在大约30分钟内完成)。脑干-脊髓电生理协议的临界点, 以前没有很好地描述包括神经根子的解剖和在振动体上的切片过程。该方案是第一个逐步视觉沟通脑脊髓解剖为新的研究人员和专家在该领域。该协议还详细解释了手术技术、地标和其他程序, 以帮助未来的研究人员标准化切片和整体准备, 以包含每个实验所需的确切电路。这里介绍的程序可以在老鼠和老鼠新生幼崽。
Protocol
以下协议已被洛玛·琳达大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 接受并批准。在实验室进行的所有动物实验都遵循国家卫生研究院关于动物伦理治疗的准则。执行本协议的个人维护了所有道德标准。 1. 解决方案 准备人工脑脊液 (aCSF)。 在1升的实验前的晚上, 使用以下配方准备新鲜的 aCSF: 7.250 g Nocl (124 mM), 0.224 g KCl (3 mM), 2.100 g NaHCO3 (25 mm), 0.0…
Representative Results
这里介绍的方法允许研究人员有兴趣获得有节奏的活跃的脑干切片可重现和可靠地削减一个可行的, 可靠的切片, 将允许记录虚构的电机输出数小时。使用这种方法, 可以在薄片中捕获产生和传输吸气节律所需的最低限度的神经电路元件。这些元素包括: 前 Bötzinger 复合体, 投射到舌下运动神经元 (pXII MNs) 和舌下运动神经元 (XII Mn), 和舌下神经根子。pBC、Xin 和 C4 神经根常用?…
Discussion
将这里介绍的协议改编成一个整体或切片工作流程, 对于希望利用整体脑脊髓和薄片制剂进行电生理记录的实验室和研究是有利的。所提出的解剖和切片方法, 加上其他人先前报告的方法 17, 18,19, 将允许可重复地制备坚固和可行的组织, 广泛适应一系列使用啮齿类动物后脑或脊髓的实验。解剖是非常详细的, 包括背侧和腹侧椎板?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
s. b. p. 是洛玛琳达大学暑期本科生研究奖学金的获得者。
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
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Cite This Article
Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).