Summary
Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.
Abstract
Mammiferi ritmo inspiratorio è generata da una rete di un neurone in una regione del midollo chiamato il preBötzinger complex (pBC), che produce un segnale guida la contrazione ritmica dei muscoli inspiratori. Attività neurale ritmica il PBC e ha trasportato ad altre piscine neuronale per la muscolatura della respirazione può essere studiata utilizzando vari approcci, tra cui del blocco dell'en del nervo registrazioni e registrazioni di sezione trasversale in auto. Tuttavia, metodi precedentemente pubblicati non sono ampiamente descritti il processo di dissezione del tronco cerebrale-spinale del cavo in modo trasparente e riproducibile per gli studi futuri. Qui, presentiamo una panoramica completa di un metodo utilizzato riproducibile taglio fette ritmicamente-attivo del tronco cerebrale che contiene la circuiteria neuronale necessaria e sufficiente per la generazione e trasmissione inspiratori in auto. Questo lavoro si basa su protocolli di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale del cavo precedente per migliorare la probabilità di ottenere in modo affidabile fette praticabile e ritmicamente-attivo per la registrazione di un neurone uscita da pBC, neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e motoneuroni hypoglossal (XII MN). Il lavoro presentato si espande sulla precedenti metodi pubblicati fornendo illustrazioni dettagliate della dissezione, da cucciolo di ratto intera, fetta in vitro contenenti le radichette XII.
Introduction
La rete neurale respiratoria del tronco cerebrale fornisce un dominio fertile per comprendere le caratteristiche generali delle reti neurali ritmiche. In particolare, l'interesse è lo sviluppo di roditore neonatale respirazione e comprendere come si sviluppa il ritmo del respiro. Questo può essere fatto utilizzando un approccio multi-livello, tra cui in vivo animale intero pletismografia, in vitro del blocco dell'en del nervo registrazioni e in vitro affettare le registrazioni che contengono il generatore di ritmo di respirazione. Riduzionista in vitro en bloc e fetta registrazioni sono un metodo vantaggioso usare quando interrogare i meccanismi dietro rhythmogenesis respiratoria e circuiti neurali nella regione del tronco cerebrale-spinale del cavo di sviluppo di roditori. Lo sviluppo del sistema respiratorio comprende circa 40 tipi di cellule, caratterizzati da sparo modello, compresi quelli del centro respiratorio1,2. La rete respiratoria centrale comprende un gruppo di neuroni ritmicamente attivi che si trova in rostral midollo ventrolateral1,3. Rhythmogenesis respiratorio dei mammiferi è generato da un autorhythmic Interneurone rete soprannominato il preBötzinger complesso (pBC), che è stato localizzato sperimentalmente tramite sia fetta ed en bloc preparazioni a base di mammiferi neonatali tronco cerebrale-spinale cavi3,4,5,6,7,8. Questa regione serve una funzione simile al nodo senoatriale (SA) nel cuore e genera un sistema di cronometraggio inspiratori alla respirazione in auto. Da pBC, il ritmo inspiratorio è trasportato ad altre regioni del tronco cerebrale (tra cui il nucleo motore hypoglossal) e spinale motore piscine (come i motoneuroni frenici che guidano il diaframma)9.
L'attività ritmica può essere ottenuta utilizzando del tronco cerebrale del midollo spinale en bloc preparati o fette da una varietà di popolazioni di cellule, tra cui radichette nervo di C3-C5, radichette del nervo XII, nucleo motore hypoglossal (XII MN), neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e il pBC3,10,11,12. Mentre questi metodi di raccolta dei dati hanno avuto successo attraverso una manciata di laboratori, molti dei protocolli non sono presentati in un modo che è completamente riproducibile per nuovi ricercatori entrano nel campo. Ottenere praticabile e ritmicamente attivo en bloc e fetta preparazioni richiede un'acuta attenzione al dettaglio attraverso tutte le fasi della dissezione e protocollo di taglio fetta. Precedenti protocolli ampiamente descrivere le varie procedure di registrazione ed elettrofisiologia, ancora prive di dettagli nella parte più critica di ottenere una preparazione di tessuto vitale: eseguire la procedura di dissezione e fetta di tronco cerebrale-spinale.
In modo efficiente ottenere una preparazione di blocco o fetta ritmicamente-attivi e vitali en registrazioni di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale richiede che essere effettuati tutti i passaggi correttamente, accuratamente e rapidamente (in genere, l'intera procedura relative qui può essere eseguita in circa 30 min). Punti critici del protocollo elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale che precedentemente non sono stati ben descritti includono la dissezione delle radichette del nervo e la procedura per affettare il del vibratome. Questo protocollo è il primo a graduale comunicare visivamente la dissezione del tronco cerebrale-spinale per nuovi ricercatori ed esperti nel campo. Questo protocollo spiega anche accuratamente le tecniche chirurgiche, monumenti e altre procedure per assistere i futuri ricercatori nella standardizzazione fette e del blocco dell'en preparati per contenere il circuito esatto desiderato in ogni esperimento. Le procedure qui presentate possono essere utilizzatoin cuccioli neonatali mouse e del ratto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il seguente protocollo è stato accettato e approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) dell'Università di Loma Linda. Linee guida NIH per il trattamento etico degli animali sono seguite in tutti gli esperimenti su animali condotti in laboratorio. Tutti gli standard etici sono stati confermati da soggetti che svolgono questo protocollo.
1. soluzioni
-
Preparare il liquido spinale cerebrale artificiale (aCSF).
- Preparare aCSF fresco la sera prima di un esperimento in 1 L batch utilizzando la seguente ricetta: 7,250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO3 (25 mM), 0,069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0,247 g MgSO4 • 7 H2 O (1,0 mM) e g 5,410 D-glucosio (30 mM), g 0,221 CaCl2 • 2 H2O (1,5 mM). Aggiungere sempre il CaCl2 • 2 H2O Ultima.
- Sciogliere i componenti in 1 L di acqua deionizzata. Agitare per 20-30 min.
- Misurare il pH della aCSF e regolare a 7,40 ± 0,02 utilizzando piccoli volumi (in genere < 0,5 mL) di NaOH, KOH o HCl diluito.
Nota: ACSF preparati possono essere conservati in frigorifero (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) fino a tre giorni prima che la crescita batterica influisce sulla vitalità del tessuto durante un esperimento. Utilizzare 0,2 µm filtri per ridurre la contaminazione da funghi o batteri presenti in laboratorio, poiché gli esperimenti possono durare fino a 36 h. Per l'efficienza, la ricetta di aCSF descritta può essere scalata fino a 4 L lotti seguendo lo stesso protocollo e questo volume avrà una durata di fino a tre giorni di esperimenti.
2. preparazione della dissezione e Vibratome Rig
-
Impostare il lama.
- Utilizzare un fresco lamette a doppio taglio per il taglio di tessuti su un vibratomo. Lavare la lama con etanolo al 100% e risciacquare con acqua deionizzata prima di taglio o scattare la lama a metà e inserire la lama il montaggio pinza su del vibratome.
- Cambiare la lama ogni volta una nuova preparazione del tessuto è montata su vibratome per affettare o se taglia in lastra paraffina mentre affettare. Eventuali residui di paraffina renderà quasi impossibile per tagliare in modo netto attraverso tessuto neurale neonatale.
-
Impostare con cera di paraffina.
- Utilizzare qualsiasi stile incorporamento di cera di paraffina. Introdurre 10 g di incorporamento di media in un becher di vetro calore-tollerante e utilizzare basso calore per fondere le perle di cera di paraffina al liquido.
- Aggiungere circa 0,5 g di polvere di grafite e mescolare la soluzione accuratamente e uniformemente in paraffina liquida.
- Utilizzare una piccola lastra di plastica come il substrato per la paraffina. Tagliare un pezzo piccolo (0,5 - 1 cm di spessore e circa 2 x 2 cm2 ampia) di plastica (policarbonato o alluminio può anche essere usato). Utilizzare file di un macchinista per gratta e Vinci scanalature nella plastica blug farà in modo che la paraffina aderisce alla plastica.
Nota: In alternativa, utilizzare una siringa riscaldata di 18 G per inserire il foglio per assicurare che la miscela di paraffina-grafite aderisce alla plastica fori angolati. - Utilizzare il retro di un cotton-fioc per gocciolare la miscela paraffina-grafite sulla plastica ripetutamente immergendo l'applicatore nella miscela paraffina fusa-grafite, grondante liquami sul blocco in plastica, e costruendo la paraffina-grafite per circa 1,5 cm di spessore in cima la plastica.
- Una volta uno strato sufficientemente spesso del mix paraffina-grafite è depositato al momento del blocco, è possibile impostare il blocco da parte per raffreddare e quindi forma per accogliere il midollo del tronco cerebrale-spinale.
3. la dissezione e l'isolamento dei Neuraxis
- Eseguire amputate e dissezione iniziale.
Nota: animali utilizzati in questo studio possono variare in dimensioni da giorno embrionale 18 (E18) a giorno postnatale 10-20 nei topi o ratti che vanno da E18 a giorno postnatale 5/6. Ratti o topi di ceppo, trattamento o genere possono essere utilizzati, a seconda del design sperimentale. Eseguire l'anestesia e la dissezione preliminare sotto cappa aspirante poiché isoflurane è usata (0,25 mL in una camera di 25 mL).- Pesare il cucciolo e poi metterlo in una camera di anestesia contenente 0,25 mL di isoflurane collocata su un 2 x 2 pollici2 pezzo di garza. Dopo che l'animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia (verificato da punta pizzico con nessun riflesso di ritiro), perno l'animale su una piastra Petri riempita di paraffina o silicone elastomero.
Nota: Roditori neonatale possono essere anestetizzati anche via cryoanesthesia13,14, isoflurane vaporizzazione15, o iniezione16 bilanciato con ossigeno. - Posizionare il lato ventrale animale e fare un'incisione del midline da appena dietro gli occhi nella regione Mid-lombare della colonna vertebrale con una lama per bisturi numero 10 o 11 o forbici chirurgiche. Riflettere la pelle e decerebrate l'animale a livello della sutura parietale/occipital (Vedi Figura 1) e rimuovere la pelle transecting l'animale sotto il diaframma. Quindi rimuovere le braccia tagliando presso l'articolazione della spalla con le forbici o un bisturi.
- Una volta che la pelle viene rimosso, è possibile trasferire l'animale ad una camera di aspersione con elastomerin in silicone sul fondo per ulteriore dissezione e preparazione del midollo del tronco cerebrale-spinale.
- Bolla un serbatoio aCSF (flacone 500 mL-laterale) continuamente con fresco (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) aCSF e ossigenare con una miscela di 95% O2 e 5% CO2 (chiamato anche "carbogen"). Durante la dissezione, utilizzare aCSF refrigerati per svuotare periodicamente la camera, fornendo aCSF fresco ossigenato in tutto di isolamento del midollo del tronco cerebrale-spinale.
Nota: Globuli rossi può essere visto nelle arterie e vene rimanenti e, quando sufficientemente ossigenato, questi sono rosso brillante. - Utilizzare tubo per perfusione tramite flusso di gravità e un rubinetto di arresto, per in modo intermittente o continuo irrorare il tessuto con aCSF ossigenato (Bolo volume o via lento gocciolare utilizzando un rubinetto di arresto, circa 0,5 - 1,0 mL/min). Questo ossigena il tessuto e mantiene un campo chirurgico chiaro.
- Rimuovere i liquidi in eccesso quanto necessario dal sistema di filtrazione sotto vuoto di aspirazione.
- Eseguire la dissezione utilizzando un microscopio per dissezione. Un modello di zoom continuo è preferito per consentire la regolazione fine di ingrandimento e consentire una visualizzazione ottimale della regione di interesse durante ogni passaggio della dissezione.
Nota: Strumenti di microchirurgia raccomandati comprendono una gamma di pinze dentate, forcipe smussato, #5 pinze, pinze angolari, una gamma di micro-delucidazione: le forbici (primavera) e regolare insetto e pin micro-dissezione. - Esporre la sezione del cervello tramite linea mediana del cranio lungo la sutura sagittale poi pin giù i lembi riflessi con micro-dissezione pin e pin della colonna vertebrale verso l'estremità caudale al fondo coperto da silicone della camera di dissezione usando un 27 G ago.
Nota: Il resto della dissezione richiede un microscopio di dissezione per fornire la visualizzazione più chiara del tessuto e dei punti di riferimento utilizzati per garantire la massima probabilità di ottenere output ritmica fittizia su radichette craniche del tronco cerebrale e spinale radichette. Eseguire questi passaggi della dissezione utilizzando forbici di primavera medie o forbici iris e una pinzetta.
- Pesare il cucciolo e poi metterlo in una camera di anestesia contenente 0,25 mL di isoflurane collocata su un 2 x 2 pollici2 pezzo di garza. Dopo che l'animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia (verificato da punta pizzico con nessun riflesso di ritiro), perno l'animale su una piastra Petri riempita di paraffina o silicone elastomero.
- Trasferire prontamente il tronco isolato dell'animale ad una camera di dissezione aerato. Inserire il lato dorsale del tessuto fino con l'estremità rostrale (cervello) verso la parte anteriore della camera. Perno del tessuto sulle spalle e le estremità più caudale del midollo spinale.
- Praticare un'incisione sagittale attraverso il cranio seguendo la sutura parietale per evitare di danneggiare la corteccia e tronco cerebrale alla base del cranio.
Nota: Tessuto osseo neonatale non è completamente calcificata ed è molto fragile. Il tessuto osseo/sarà flessibile ad un grado, ma più severe rispetto al tessuto muscolare e connettivo circostante. - Utilizzare Media primavera o iris forbici per tagliare le suture occipitale del cranio, partire dalla sutura sagittale e procedendo lateralmente. Questo creerà "flap" del cranio che può essere riflessa e appuntato per ancorare la parte rostrale del cranio e fornire un po' di stabilità al tessuto (Vedi Figura 2A).
- Dopo aver riflettuto i lembi del cranio, tagliati il resto della corteccia cerebrale, lasciando la parte caudale del cervelletto (verme) relativamente intatto (Figura 2B).
- Praticare un'incisione sagittale attraverso il cranio seguendo la sutura parietale per evitare di danneggiare la corteccia e tronco cerebrale alla base del cranio.
- Eseguire laminectomia dorsale.
- Rimuovere la muscolatura che circonda il cranio e la colonna vertebrale utilizzando pinze e le forbici micro primavera. Rimuovere il tessuto lungo il lato dorsale della gabbia toracica, lasciando intatto, la gabbia toracica come questo sarà appuntato più tardi per ancorare il tessuto durante la laminectomia ventrale, riducendo al minimo la probabilità di danni al midollo spinale.
- Accuratamente tagliare via i processi laterali delle lamine vertebrali utilizzando forbici di primavera medie o forbici iris bene. Tagliare qualsiasi tessuto che ricopre il pons e midollo. I vermis, cervelletto, pons e inizio del midollo spinale sarà chiaramente visibile (Figura 2C).
- Eseguire il laminectomy ventrale.
- Abbassare il lato dorsale del tessuto e appuntarli la gabbia toracica e la fine più caudale della colonna vertebrale. Fissare la parte rostrale del tessuto usando le falde del cranio (Figura 3A).
- Rimuovere la metà ventrale della gabbia toracica, tra cui lo sterno e tutti gli organi addominali, utilizzando le stesse forbici e pinze. Sezionare la trasferta molli attaccato alla gabbia toracica esponendo le costole e il midollo spinale (Figura 3B).
- Rimuovere la lingua, esofago, trachea, laringe e tutti gli altri tessuti molli e muscolatura che ricopre la base del cranio e della colonna vertebrale (come si vede in Figura 3C).
- Sezionare il tessuto che ricopre il pallet duro. Identificare il palato duro individuando una piastra rettangolare dell'osso alla base del cranio con una rientranza a forma di V su di esso (Figura 3C). Tagliare lungo la linea mediana del palato, attentamente sollevarlo verso l'alto ed eseguire una resezione trasversale per rimuoverlo (Figura 4A).
- Iniziare un laminectomy ventrale eliminando lamine esponendo la superficie ventrale del tronco encefalico e il midollo spinale dalla prima vertebra cervicale alla vertebra toracica di circa 7 (T7) come si vede nella Figura 4B.
- In questa fase, le radichette ventrale sarà visibile. Utilizzando piccola micro-dissezione o forbici di primavera, prendersi cura di effettuare tagli più vicino le lamine e come si è lontani dall'origine delle radici al midollo spinale come possibile; evitare che allunga le radici.
- Snip 5-10 mm lungo entrambi i lati della colonna vertebrale alle lamine. Non tagliare troppo vicino al midollo spinale o nelle vertebre. Questo passaggio permette la rimozione delle vertebre cervicali per esporre il midollo spinale. Evitare di tagliare le radichette.
- Snip radichette circa 20-25 mm (bilateralmente) lungo la colonna vertebrale (circa T7). In tutta questa procedura evitare taglio nel midollo spinale e manipolare i bordi delle vertebre come si vede nella Figura 4C.
- Rimuovere C1, C2 e C3 con attenzione sollevando il bordo rostrale di ciascuna delle vertebre e cattura strettamente sotto l'osso. Il più vicino all'osso che il taglio è fatto, il più a lungo la radichetta. Uso agganciata o piegato forcipe per aiutare a raggiungere una presa salda su ogni vertebra cervicale rendendo tagli (Figura 4C).
- Una volta che la lunghezza desiderata del midollo spinale è isolata e dissecata dalla colonna vertebrale, fare un taglio trasversa per rimuovere il midollo spinale (Figura 5A eBdi Figura 5).
- Rimuovere il mater di dura.
Nota: isolato del tronco cerebrale-spinale può essere utilizzato per la registrazione del blocco dell'en in vitro come è stato precedentemente descritto3,7. Con il cavo del tronco cerebrale-spinale rimosso dalla colonna vertebrale, il dura deve essere rimosso per fornire un accesso ottimale per aspirazione elettrodi eseguire registrazioni dal taglio cranico e spinale rootles. Inoltre, la rimozione del dura rende possibile in modo pulito affettare il tronco cerebrale ed ottenere fette sottili ritmicamente attivi per la registrazione in vitro.- Attentamente il perno l'isolato del tronco cerebrale-spinale del cavo lato dorsale del tessuto fino per consentire l'accesso al dura che circonda il cranio rootles (Figura 5B). Pin deve essere applicato attraverso il margine laterale del tronco cerebrale, rostrale a radichette XII.
- Rimuovere la dura madre dalla superficie dorsale del tronco cerebrale sollevando il dura con una pinzetta (#5) al margine dorsale del dura e tagliato da laterale a mediale su tutta la lunghezza del tronco cerebrale con le forbici di primavera. Fare attenzione a non tagliare il tronco cerebrale stessa. Vasi sanguigni dalla superficie del tronco cerebrale di sollevare delicatamente e tagliare per evitare l'impedimento del vibratome lama durante il taglio del tronco cerebrale.
- Accuratamente sezionare dura dagli aspetti mediali e laterali del tronco cerebrale, come radichette del nervo cranico passano attraverso il dura e sono facilmente strappati via quando viene sollevata la dura madre. Ridurre al minimo la probabilità delle radichette essendo tirato fuori tagliando delicatamente intorno a loro con le forbici piccolo primavera.
- Capovolgere il midollo del tronco cerebrale-spinale in modo che la superficie ventrale rivolto verso l'alto e radichette craniche sono chiaramente visibili. Sezionare la dura madre dal lato dorsale del tronco cerebrale sollevando delicatamente il dura direttamente sopra l'area postrema, tagliando da rostrale a caudale. L'area postrema apparirà leggermente rosa a causa del gran numero di microcapillari che irrora di questa regione.
- Utilizzare un perno insetto bene in giro via qualsiasi residuo dura e rimuovere i restanti vasi sanguigni in prossimità di radichette cranici e cervicale.
4. fetta protocollo
- Dopo aver rimosso la dura madre, posizionare il tronco cerebrale al centro della piattaforma paraffina sul blocco di plastica (in appresso il "blocco di taglio"). Appuntare l'estremità caudale del tronco cerebrale attraverso il midollo spinale distale mediante spilli entomologici bene che sono stati tagliati a non più di 1 cm di lunghezza, come mostrato nella Figura 5C.
- Allineare il blocco di taglio paraffina-coperto con appuntato tronco cerebrale nel porta-blocco vibratome in modo che la lama tagli perpendicolari alla faccia rostrale del tronco cerebrale.
- Fare una sezione iniziale per rimuovere il tessuto irregolare, estraneo all'estremità più rostrale. Questo taglio iniziale può essere di 200-300 µm in genere ma accuratamente evitare la rimozione delle radichette cranici IX, X e XII. Questo passaggio in genere rivelerà l'estensione caudale del nucleo facciale (VII) e radichette glossopharyngeal e permette di allineare il tronco cerebrale, in modo che sua faccia è par-planare alla lama vibratome. Apportare piccole modifiche fino a ottenere una par-planarità e fare piccoli tagli per rimuovere il tessuto che è irregolare.
Nota: Radichette del glossofaringeo (IX) sarà visibile al bordo laterale del tronco cerebrale come uno taglia ogni fetta successivo, e questi forniscono un punto di riferimento per la distanza rostro-caudale a circuiti neurali del tronco cerebrale necessaria per la generazione di ritmo. Sul lato ventrale del tronco cerebrale, radichette hypoglossal (XII) dovrebbero anche essere visibile leggermente caudale al taglio volto mostrando le radichette IX. Un punto di riferimento finale sarà l'obex (il punto nel cervello umano in cui il quarto ventricolo si restringe per diventare il canale centrale del midollo spinale) sulla faccia dorsale del tronco cerebrale. Con questi tre punti di riferimento visibili, che il piano di taglio corretta è stabilito (Vedi Figura 6A) e una fetta di ritmicamente-attivo sarà ottenuta in modo affidabile. - Continuare a tagliare rostro-caudale fino a quando le radichette IX sono vicino alla superficie della superficie del taglio del tronco cerebrale.
- Fare riferimento alla Figura 6 per punti di riferimento e orientamento corretto. Regolare la paraffina-lastra nel morsetto vibratome in modo che l'angolo successivo del transection creerà una forma molto lieve "cuneo" per la fetta tagliata e tagliare fette di circa 100-200 µm fino a punti di riferimento descritti può essere visto chiaramente (Figura 6A).
Nota: Questa leggera zeppa di taglio aumenta il numero dei neuroni di motore XII catturato nella fetta e massimizza la probabilità di ottenere l'attività ritmica durante la registrazione. Utilizzando i punti di riferimento descritto (rostrale radichette del nervo glossopharyngeal bundle, radichette del nervo hypoglossal bundle, l'obex) farà in modo che la fetta riproducibile contiene almeno una grande porzione di pBC (Figura 6B). - Tagliare una fetta di 300-500 µm del tronco cerebrale da questi marcatori neuroanatomici rostrali per catturare la pBC e associati circuiti di trasmissione.
Nota: Una fetta di "ideale" conterrà la radichetta più rostrale del bundle hypoglossal radichetta per ottenere in modo affidabile attività inspiratoria senza ricorrere a registrazioni di superficie utilizzando un elettrodo di aspirazione sopra il ritmo-generazione/trasmissione loci entro il tronco cerebrale.
5. registrazione procedure
- Posizionare la fetta in una camera di registrazione, irrorare continuamente con aCSF (0,5 - 1,0 mL/min) e utilizzare elettrodi aspirazione o extracellulari per popolazione record attività da radichette XII o dalla pBC, XII PMNs o motoneuroni XII. Per le procedure di registrazione dettagliata, vedere precedenti pubblicazioni sull'elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale e patch di bloccaggio10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il metodo presentato qui consente un ricercatore interessato ad ottenere fette ritmicamente attivi del tronco cerebrale in modo riproducibile e affidabile tagliare una fetta valida, robusta che permette la registrazione di uscita motore fittizia per molte ore. Tutti gli elementi del circuito neurale minimamente necessarie per la generazione e trasmissione di ritmo inspiratorio può essere catturati in una fetta sottile utilizzando questo metodo. Questi elementi includono: preBötzinger complesso, premotoria neuroni di proiezione per i motoneuroni hypoglossal (pXII MNs) e neuroni di motori hypoglossal (XII MNs) e del nervo hypoglossal radichette. La pBC, XIIn e C4 radichette del nervo sono comunemente usati per le registrazioni di ritmo inspiratorio, come illustrato nella Figura 7.
Riuscito uso di questa procedura produrrà una preparazione di vitali e ritmicamente attivo en bloc in 10-15 min, o una fetta di ritmicamente-attivo in < 30 min. Dopo l'isolamento del blocco dell'en del tronco cerebrale-spinale o una fetta sottile, 15 min di equilibrazione nella camera di registrazione è sufficiente per la produzione di uscita motore fittizia. Nel caso la fetta, aumentando l'extracellulare [K +] a circa 8-9 mM produrrà robusta unità neurali che può durare per 24-36 ore nell'esperienza di questo laboratorio. La preparazione deve continuamente superfusi con carbogenated (95% O25% CO2) e riscaldata aCSF (~ 27 ° C). Dissezioni successo vengono eseguite rapidamente ed evitare di pizzicare, stretching o danneggiare le radichette nervo utilizzati per le registrazioni. Per risultati ottimali, tutti i passaggi della procedura vengono eseguiti rapidamente e il tessuto deve essere bagnato o continuamente irrorato con carbogenated aCSF quando si esegue la dissezione e l'isolamento del tessuto (come descritto sopra). Per vasti particolari riguardanti la neuroanatomia e la precise atlanti del tronco cerebrale, vedere il lavoro di Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 e colleghi. Il protocollo presentato qui è un metodo che si è dimostrata affidabile nel laboratorio dell'autore senior e questo rapporto fornisce un metodo grafico, passo dopo passo per generare queste fette basandosi solo su superficie monumenti visibili sul tronco cerebrale o entro il tronco cerebrale come dettagliato qui.
Figura 1 : Iniziale dissezione per l'estrazione del tronco cerebrale-spinale. (A) Anesthetized pup appuntato per dissezione. Le linee tratteggiate indicano le linee guida di incisione per incisione sagittale nella pelle e trasversale taglia caudale per gli occhi e sotto il diaframma. (B) guida per la rimozione della pelle e zampe anteriori da animale. (C) funzione dorsale del roditore dalla pelle. Linee tratteggiate indicano le linee guida di incisione per l'esposizione di cranio-patta "a conchiglia". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Fasi della laminectomia dorsale. (A) le linee tratteggiate indicano le linee guida di incisione per la rimozione di cervello. (B) risultato dopo la rimozione del tessuto. Linee tratteggiate indicano le linee guida di incisione per laminectomia dorsale. (C) Exposed del tronco cerebrale-spinale del cavo dopo laminectomia dorsale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Fasi della dissezione ventrale iniziale. (A) lato ventrale di un roditore dalla pelle con mozzata del forebrain e addome. Linee tratteggiate indicano le linee guida di incisione per rimuovere il processo di xyphoid e l'apertura della gabbia toracica per rimuovere successivamente gli organi della cavità addominale e toracica. Organi di cavità addominale e toracica (B) rimossi. (C) strutture orofaringea rimosse. Linee tratteggiate indicano le linee guida di incisione per la rimozione del palato duro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Fasi della laminectomia ventrale. Palato duro (A) e restante le parti del cranio. Incisione orientamenti indicano come rimuovere tessuto restante che circonda il midollo del tronco cerebrale-spinale. (B) prima vertebra cervicale (C1) esposto. (C) dimostrazione il sollevamento C1 e fare un taglio trasversa al corpo vertebrale per rimuoverlo. I nervi sono accuratamente tagliati a filo al lato dorsale del corpo vertebrale prima di rimuoverlo. Questa è la fase più critica nella dissezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Preparazione del tronco cerebrale-spinale per affettare. (A) C1-C3 rimosso dal midollo spinale. Linee guida incisione indicano dove recidere il midollo del tronco cerebrale-spinale del midollo caudale. (B) lato ventrale del midollo del tronco cerebrale-spinale con radichette del nervo con etichetta. Incisione orientamenti indicano il transection consigliato o rimanenti rostrale strutture presso il ponto-midollare prima della registrazione della regione del tronco cerebrale-spinale. (C) paraffina lastra installazione per affettare il del vibratome. La regione per affettare comprende tessuto tra i nervi cranici IX e XII. Non posizionare i micro-perni nella regione per affettare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Punti di riferimento utilizzati per ottenere fette con un intatto nucleo hypoglossal del motore ed il complesso di PreBötzinger. (A) vista trasversale del tronco cerebrale-spinale dopo taglio iniziale è stato fatto rostrale a radichette glossofaringeo (IX). Linea guida incisione indica il transection livello appena caudale al hypoglossal radichette (XII). (B) orientamento del blocco di paraffina da lama prima di tagliare una fetta contenente la pBC e nucleo motore hypoglossal. Creazione di un taglio di forma trapezoidale "zeppa" massimizza la probabilità di catturare abbastanza neuroni inspiratori nella fetta per ottenere l'attività ritmica durante la registrazione. Il cuneo includerà la pBC, i neuroni di premotor hypoglossal e i motoneuroni hypoglossal, che combinati insieme assicurano la circuiteria necessaria per trasmettere unità ritmica, che è un indice di rhythmogenesis delle vie respiratorie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Rappresentante registrazioni dalle preparazioni di blocco o fetta it. (A) integrato traccia dalla radichetta XII. (B) traccia integrata da pBC. Registrazione da pBC utilizzando una preparazione di blocco en richiederà una pinza cieca patch. (C) traccia integrata dalla radichetta di nervo C4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adattare il protocollo presentato qui in un blocco di it o fetta flusso di lavoro è vantaggiosa per i laboratori e studi che vorrebbero utilizzare entrambi del blocco dell'en del tronco cerebrale-spinale cavo e/o sottile fetta preparativi per registrazioni di elettrofisiologia. Il metodo di dissezione e fetta presentato, combinati con metodi precedentemente segnalati da altri17,18,19, permetterà la preparazione riproducibile di tessuto robusto e vitale che è ampiamente adattabile ad una gamma di esperimenti utilizzando il roditore hindbrain o del midollo spinale. La dissezione ha presentata è altamente dettagliata e include laminectomia dorsale e ventrale, nonché dettagli completi relativi all'orientamento del midollo del tronco cerebrale-spinale quando si prepara a tagliare fette. Il protocollo dettagliato di dissezione e fetta presentato consente al ricercatore di includere tutta la circuiteria necessaria per la generazione e trasmissione del ritmo inspiratorio. Le principali popolazioni neurali/strutture che può essere catturate utilizzando questo metodo includono: i neuroni di premotor hypoglossal, nucleo motore hypoglossal e il complesso di preBötzinger. Nota che le regioni del tronco cerebrale che contengono centrale CO2 sensori o espiratori digenerazione circuiti (RTN/pFRG) non sono inclusi nella preparazione dettagliata qui20,21. Una volta ottenuta la en bloc preparazione o fetta, attività ritmica può essere ottenuta mediante aspirazione elettrodi, elettrodi di superficie o metodi di registrazione singola cellula come unità extracellulare o metodi di patch di bloccaggio3,10 ,11.
L'obiettivo del presente protocollo è fornire un metodo chiaro, facile da seguire per la generazione di una preparazione del tronco cerebrale-spinale o una fetta sottile, ritmicamente-attiva. Questo protocollo deve essere prezioso per sia nuovi che esperti ricercatori interessati ad integrare il ritmico del tronco cerebrale/fetta preparati nel loro armamentario, come ci sono diversi passaggi critici dettagliate nell'ambito delle procedure che facilitano l'acquisizione di robusti, riproducibile e duraturo fette ritmicamente attivi.
Una volta che il ricercatore ha acquisito familiarità con l'identificazione dei punti di riferimento anatomici e le competenze necessarie per la dissezione, la velocità della dissezione aumenterà, e le procedure possono essere ottimizzate per ogni singolo ricercatore. Il protocollo dettagliato qui è stato insegnato all'autore senior (CGW) durante il suo lavoro di post-dottorato con Jeffrey Smith, il creatore del tronco cerebrale ritmica fetta preparazione3. Per garantire l'attività ritmica e vitalità in entrambe le fette ed en preparazioni di blocco, tutte le procedure per generare una fetta dovrebbero essere finite entro circa 30 min dall'inizio della procedura per una fetta nella camera di registrazione. Con perfusione continua, c'è un impatto molto limitato sulla vitalità del tessuto ma riducendo al minimo il tempo per la dissezione consente più di registrazione e acquisizione dati. Per gli studi delle vie respiratorie, una fetta che è sottile come circa 280 µm spessore3 avrà attività inspiratoria ritmica, robusto, ma fette possono variare fino a 550 µm17,18,19,22. Pratica attenta è necessaria per sviluppare le competenze necessarie per eseguire questa procedura e ridurre al minimo la variabilità di spessore e posizione rostrale caudale di ogni fetta. Inclusione o esclusione di determinate popolazioni di cellule influenzerà la qualità e la robustezza di attività ritmica ottenuta in registrazione successiva, sia eccitatori che inibitori nuclei nel tronco cerebrale possono pregiudicare la "qualità" del ritmo registrata dalla sezione 3.
Infine, è anche critico che aCSF è preparato esattamente secondo il protocollo ed è a livello20, temperatura e ossigenazione pH standardizzati. Anossici preparazioni non sarà attivi ritmicamente e influenzeranno dati raccolta21.
Ci sono diversi passaggi chiave nella procedura che facilitano un'acquisizione di investigatore dei preparati vitali e ritmicamente attivi. Durante la laminectomia ventrale, mantenendo intatta la gabbia toracica dorsale permette leva supplementare e fornisce più tessuto per proteggere la preparazione durante l'esecuzione l'isolamento relativamente delicata del midollo del tronco cerebrale-spinale dalla colonna vertebrale. La procedura dettagliata qui permetterà al ricercatore di facilmente produrre en bloc preparazioni o fettine sottili, quindi, dalla necessità, passaggi aggiuntivi sono dettagliate che la dissezione può essere omesso per ottenere solo una fetta sottile. Altri suggerimenti utili includono, durante l'esecuzione di laminectomia ventrale, è importante acquisire una salda presa sul corpo vertebrale per sollevarla verso l'alto mentre severing radichette del nervo. Una volta che il cavo del tronco cerebrale-spinale è stato dissecato ed estratto, il mater di dura ed il vasculature restante deve essere sezionate dalla superficie del tessuto neurale. Vasi sanguigni e dura sono difficili e può evitare che la lama del vibratome dal taglio di una fetta di pulito. Dissezione del dura non è vitale per la preparazione del blocco di it, ma è consigliata per ottimizzare l'accoppiamento del nervo-aspirazione elettrodo. Infine, attenta e metodica pratica nell'uso del vibratome è necessaria per il taglio di una fetta di pulito, riproducibile. Questo protocollo fornisce una lista molto completa di procedura dettagliata per la dissezione e la procedure di taglio. L'enfasi qui è quello di fornire un elenco dettagliato passo-passo per un ricercatore da utilizzare come una base affidabile e strumento di formazione da cui possono modificare procedure del loro laboratorio come necessario.
Nel complesso, questa metodologia rappresenta un'evoluzione di trenta-anno dei metodi di elettrofisiologia in vitro. Lo scopo di questa carta si concentra sulla standardizzazione del blocco dell'en e affettare le registrazioni del tronco cerebrale-spinale che vengono in genere utilizzate per studiare l'attività inspiratoria in ratti e topi di P0-P522. Tuttavia, questo processo di dissezione può essere utilizzato in una gamma di dimensioni degli animali, età e specie per una vasta gamma di studi, tra cui E18 ratti/topi, ratti neonatali e topi (giorni postnatali 0 a 6) e topi adulti. Gli studi futuri possono utilizzare i metodi presentati per ottimizzare i protocolli nelle specie ed età, permettendo studi interrogare i meccanismi nella generazione del ritmo o altro processo fisiologico attraverso entrambe le specie ed età. In definitiva, cambiando l'orientamento, spessore o posizione della sezione o del blocco dell'en preparazione influenzerà l'attività ritmica23. Una vasta letteratura è stata pubblicata in passato riguardante le popolazioni neurali catturato dalle procedure fetta e ci sono stereotassica ratto e topo atlanti disponibili per fornire ulteriori dettagli riguardanti i circuiti neurali discusso qui24, 25,26. Le procedure presentate qui forniscono dettagli esaurienti con illustrazioni chiare che consentono un nuovo investigatore imparare a tagliare fette ritmiche da punti di riferimento facilmente visibili sotto un laboratorio in ambito di dissezione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
S.B.P è un destinatario di un assegno di ricerca di Loma Linda University Summer Undergraduate.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B.
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al.
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).
