Summary
이 프로토콜 모두 시각적으로 통신 brainstem 척수 준비 하 고 포괄적인 단계별 방식 brainstem 가로 조각의 준비를 명확히. 그것은 재현성을 증가 하 고 brainstem의 호흡 영역에서 신경 출력 기록 가능한, 오래 지속, 컬 활성 분할 영역 취득의 가능성을 강화 하도록 설계 되었습니다.
Abstract
포유류 inspiratory 리듬의 모 수는 preBötzinger를 복잡 한 전화 (pBC), 운전 inspiratory 근육의 리듬 수축 신호를 생성 하는 영역에 신경 네트워크에서 생성 됩니다. 리듬 신경 활동 pBC에서 생성 하 고 호흡의 근육 신경 녹음 및 가로 분할 녹음 일괄적 포함 하 여 다양 한 방법을 사용 하 여 공부 될 수 드라이브에 다른 신경 풀에. 그러나, 이전에 게시 방법을 설명 되지 않은 광범위 하 게 brainstem 척수 해 부 과정 미래 연구에 대 한 투명 하 고 재현 가능한 방식. 여기, 우리 사용 reproducibly 리듬-액티브 brainstem 조각을 생성 하 고 전송 inspiratory 드라이브에 대 한 필요 하 고 충분 한 신경 회로 포함 하는 방법의 포괄적인 개요를 제시. 이 작품은 pBC, hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 신경의 출력을 기록에 대 한 실용적이 고 컬 활성 분할 영역을 안정적으로 얻기의 가능성을 향상 시키기 위해 이전 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜 구축 및 hypoglossal 모터 신경 (XII 미네소타)입니다. 제시 하는 작품 XII rootlets를 포함 하는 생체 외에서 슬라이스를 전체 쥐 강아지에서 해 부의 상세한, 단계별로 그림을 제공 하 여 이전 게시 된 방법에 따라 확장 합니다.
Introduction
Brainstem의 호흡 신경망 리듬 신경 네트워크의 일반적인 특성을 이해 하기 위한 비옥한 도메인을 제공 합니다. 특히, 관심 신생아 설치류 호흡 및 호흡 리듬을 개발 하는 방법을 이해의 개발 이다. 이 비보 전체 동물 plethysmography, 체 외에서 일괄적 신경 녹음, 포함 한 다단계 접근 방식을 사용 하 고 생체 외에서 수 있습니다 호흡 리듬 생성기를 포함 하는 녹음을 슬라이스. 시험관 en 블록 및 슬라이스 녹음에서 reductionist 호흡기 rhythmogenesis 및 설치류 개발의 brainstem 척수 영역에서 신경 회로 뒤에 메커니즘을 심문 할 때 사용 하는 유리한 방법입니다. 개발 호흡기 약 40 세포 유형을, 패턴, 중앙 호흡기1,2의 포함을 발사 하 여 특징을 포함 한다. 중앙 호흡기 네트워크 rostral ventrolateral 모1,3에 위치한 컬 활성 뉴런의 그룹을 포함 합니다. 포유류의 호흡기 rhythmogenesis 생성 되는 autorhythmic에서 interneuron 네트워크 불리는 복잡 한 preBötzinger (pBC), 되었습니다 통해 실험적으로 지역화 신생아 포유류의 조각 및 en 블록 준비 brainstem 척추 코드3,,45,6,,78. 이 지역에에서 동방 마디 (SA)에 비슷한 기능을 제공 하 고 드라이브 호흡을 inspiratory 타이밍 시스템을 생성 합니다. PBC에서 inspiratory 리듬 brainstem (hypoglossal 모터 핵 포함) 및 척추 모터 풀 (예: 격 막 드라이브 인할지 모터 뉴런)9의 다른 지역에 수행 됩니다.
리듬 활동 brainstem 척수 en 블록 준비 또는 다양 한 c 3-c 5 신경 rootlets, XII 신경 rootlets를 포함 하는 세포 인구에서에서 분할 영역을 사용 하 여 얻을 수 있습니다 hypoglossal 모터 핵 (만 12 세), hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 그리고 pBC3,10,,1112. 데이터 수집의 이러한 방법은 실험실의 소수에 걸쳐 성공 했습니다, 여러 프로토콜 하지 새로운 연구 분야를 입력에 대 한 완벽 하 게 재현할 수 있는 방식으로 표시 됩니다. 취득 가능한 컬 활성 en 블록 슬라이스 준비는 해 부와 슬라이스 절단 프로토콜의 모든 단계를 통해 세부 사항에 급성 주의가 필요 합니다. 이전 프로토콜 광범위 하 게 설명 하는 다양 한 기록 절차와 전기 생리학, 아직 실행 가능한 조직 준비의 가장 중요 한 부분에 세부 부족: brainstem 척수 해 부 및 조각 절차를 수행.
제대로, 신중 하 게, 그리고 신속 하 게 모든 단계를 수행 수 해야 효율적으로 얻기 컬 활성 및 가능한 en 블록 또는 슬라이스 준비 brainstem 척수 전기 생리학 기록 (일반적으로, 전체 절차 관련 여기 있을 수 있습니다 약 30 분에서 수행). 있다 하지 이전 잘 설명 하는 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜의 중요 한 포인트 포함 신경 rootlets 및 조각화 절차는 vibratome에의 해 부. 이 프로토콜 stepwise 첫 번째는 새로운 연구와 분야에서 전문가 위한 brainstem 척수 해 부에 시각적으로 의사 소통입니다. 이 프로토콜도 철저 하 게 외과 기술, 랜드마크, 및 조각 및 각 실험에서 원하는 정확한 회로 포함 하는 준비 일괄적 표준화에 미래 연구자를 지원 하기 위해 다른 절차를 설명 합니다. 쥐와 쥐 신생아 강아지에 여기에 제시 된 절차를 사용할 수 있습니다.
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Protocol
다음 프로토콜 허용 되어 있으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) Loma Linda 대학에 의해 승인. 동물의 윤리적인 처리를 위한 NIH 가이드라인은 실험실에서 수행 하는 모든 동물 실험에서 따 랐 다. 모든 윤리는이 프로토콜을 수행 하는 개인에 의해 확정 했다.
1입니다. 솔루션
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인공 뇌 척추 액체 (실제)을 준비 합니다.
- 신선한 실제 1 L 일괄 처리는 다음을 사용 하 여 실험 하기 전에 저녁 준비 제조 법: 7.250 g NaCl (124 m m), 0.224 g KCl (3mm) 2.100 g NaHCO3 (25 m m), 0.069 g NaH2포4 • H2O (0.5 m m), 0.247 g MgSO4 • 7 H2 O (1.0 m m), 그리고 5.410 g D-포도 당 (30mm) 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1.5 m m). 항상 마지막 CaCl2 • 2 H2O를 추가 합니다.
- 이온을 제거 된 물 1 L에 구성 요소를 분해. 20-30 분 저 어.
- 실제의 pH를 측정 하 고 7.40 ± 0.02로 조정 작은 볼륨을 사용 하 여 (일반적으로 < 0.5 mL) 희석 NaOH, KOH, 또는 HCl의.
참고: 준비 된 실제 냉장고 (4 ° C, pH 7.40 ± 0.02)에 3 일 전에 세균 성장에 영향을 미치는 실험 동안 조직의 생존을 저장할 수 있습니다. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 이후 실험 36 h까지 지속 될 수 있다 균 류 또는 박테리아는 실험실에 의해 오염 줄이기 위해. 효율성을 위해 설명 실제 제조 법 4 L 배치 다음과 같은 프로토콜 조절 수 있습니다 그리고이 볼륨의 실험까지 3 일 동안 지속 됩니다.
2입니다. 해 부 및 Vibratome 장비 준비
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블레이드를 설정 합니다.
- vibratome에 절단 조직에 대 한 신선한 양 날 면도날을 사용 합니다. 100% 에탄올과 블레이드를 세척 하 고 절단 또는 반 블레이드 스냅 및 장착 블레이드 삽입 클램프는 vibratome에 전에 이온된 물으로 린스.
- 때마다 새로운 조직 준비 부 러 뜨 리 vibratome에 장착 하거나 자르는 동안 파라핀 석판으로 인하 하는 경우 블레이드를 변경 합니다. 파라핀 잔여물은 신생아 신경 조직을 통해 깔끔하게 잘라 거의 불가능 하 게 됩니다.
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파라핀 왁 스 슬 래 브를 설정 합니다.
- 어떤 포함 스타일 파라핀 왁 스를 사용 합니다. 열에 강한 유리 비 커에 미디어를 포함의 10 g을 배치 하 고 낮은 열을 사용 하 여 녹아 액체 파라핀 왁 스 구슬.
- 흑연 분말의 약 0.5 g을 추가 하 고 액체 파라핀으로 솔루션을 철저 하 게 하 고 균일 하 게 혼합.
- 기판으로는 파라핀에 대 한 작은 플라스틱 슬 래 브를 사용 합니다. 플라스틱의 작은 (0.5-1 ㎝ 두께 약 2 cm2 넓은 x 2) 조각을 삭감 (폴 리카 보 네이트 또는 알루미늄도 사용할 수 있습니다). 기계공의 파일 스크래치 홈을를 사용 하 여 플라스틱 asthis에서 파라핀 플라스틱에 준수 보장에.
참고: 또는 온수 18 G 피하 주사 바늘을 사용 하 여 파라핀 흑연 혼합물은 플라스틱에 부합 되도록 시트에 각된 구멍을 배치. - 목화 제보 주걱의 뒷면을 사용 하 여 반복적으로 녹은 파라핀-흑연 혼합물으로 주걱을 찍기, 떨어지는 플라스틱 블록에 슬러리 및 건물에 파라핀 흑연 플라스틱에 파라핀 흑연 혼합물을 똑 플라스틱 위에 두께 약 1.5 c m.
- 파라핀-흑연 혼합의 충분히 두꺼운 층 블록에 입금 됩니다, 일단 냉각 하 고 다음 brainstem 척수에 맞게 모양 블록 옆으로 설정 합니다.
3. 해 부의 및 절연은 Neuraxis
- 초기 해 부 및 anesthetization을 수행 합니다.
참고: 이 연구에 사용 된 동물 데 생 후 10-20, 쥐 또는 쥐 E18에서 출생 후 일에 이르기까지 배아 하루 18 (E18)에서 크기에서 범위 수 있습니다 5/6. 쥐 또는 쥐 긴장, 치료, 또는 성별 사용할 수 있습니다, 실험적인 디자인에 따라. Isoflurane (25 mL 챔버에 0.25 mL) 사용은 마 취와 증기 두건 아래 예비 해 부를 수행 합니다.- 강아지의 무게를 다음 isoflurane에 거 즈의 2 인치2 조각 x 2의 0.25 mL를 포함 하는 마 취 약 실에 넣습니다. 동물 (아니 철수 반사와 발가락 핀치에 의해 확인) 마 취의 수술 평면에 도달 하면, 핀 페 트리 접시에 동물 파라핀 또는 실리콘 탄성으로 가득 합니다.
참고: Cryoanesthesia13,14, isoflurane 증발15를 통해 또한 신생아 설치류를 취 수 또는 주입16 평형 산소. - 동물 복 부 측을 아래로 두십시오 고 중간 절 개를에서 바로 눈 뒤에 중간 요 추 지역에 척추의 숫자 10 또는 11 메스 블레이드 또는 수술가 위. 피부를 반영 하 고 정수 리/후 두 봉합의 수준에서 동물 decerebrate ( 그림 1참조) 하 고 횡 경 막 아래 동물 transecting 피부를 제거. 그런 다음가 위 또는 메스 어깨 관절에서 절단 하 여 무기를 제거 합니다.
- 일단 피부 제거, 동물 실리콘 elastomerin 추가 해 부 및 brainstem 척수의 준비에 대 한 아래쪽으로 관류 챔버에 전송.
- 냉장 (4 ° c, pH 7.40 ± 0.02) 실제 저수지 (500 mL 사이드 포트 병)을 지속적으로 거품 실제 95% O2 , 5% CO2 ("carbogen" 라고도 함)의 혼합물으로 산화 하는 고. 해 부, 동안 냉장된 실제 사용 하 여 주기적으로 플러시 brainstem 척수의 격리를 통해 신선한 산소 실제를 제공 하는 챔버.
참고: 적혈구는 나머지 동맥과 정 맥에서 볼 수 있습니다 그리고 때 충분히 산소, 이들은 밝은 빨강. - 하 중력 흐름 관류를 통해 튜브와는 자 지를 일시적으로 사용 하거나 지속적으로 산소 실제 (bolus 볼륨 또는 통해 느린 똑은 자 지, 약 0.5-1.0 mL/min를 사용 하 여)와 조직 perfuse. 이 조직 산화 제 고 분명 수술 필드를 유지 합니다.
- 진공 흡입 여과 시스템에서 필요에 따라 과잉 체액을 제거 합니다.
- 절 개 해 현미경을 사용 하 여 수행 합니다. 지속적인 확대 모델 확대의 정밀한 조정을 허용 하는 해 부의 각 단계 동안 관심 영역의 최적의 시각화 선호 된다.
참고: 미세 도구 권장 이빨된 조직 집게, 무뚝뚝한 겸 자, #5 집게, 각된 티슈 포 셉, 범위를 포함 한 다양 한 마이크로 해 부가 위 (봄이 위), 그리고 일반 곤충과 마이크로 해 부 핀. - 따라 화살 봉합 두개골의 중간 라인 섹션을 통해 뇌를 노출 그리고 마이크로 해 부 핀 반사 플랩 아래 핀 27 G를 사용 하 여 해 부 챔버의 실리콘 커버 하단에 꼬리 끝에 척추를 고정 바늘입니다.
참고: 해 부의 나머지는 해 부 현미경을 조직 및 brainstem의 두개골 rootlets 및 척추 rootlets 리듬 움직이다 출력을 얻기의 최대 가능성을 보장 하는 데 사용 하는 건축물의 깨끗 한 보기를 제공 하기 위해 필요 합니다. 매체 봄이 위 또는 아이리스가 위 및 미세 집게를 사용 하 여 해 부의 다음이 단계를 수행 합니다.
- 강아지의 무게를 다음 isoflurane에 거 즈의 2 인치2 조각 x 2의 0.25 mL를 포함 하는 마 취 약 실에 넣습니다. 동물 (아니 철수 반사와 발가락 핀치에 의해 확인) 마 취의 수술 평면에 도달 하면, 핀 페 트리 접시에 동물 파라핀 또는 실리콘 탄성으로 가득 합니다.
- 동물의 고립 된 트렁크 화난된 해 부 챔버를 신속 하 게 전송. 상공 회의소의 전면에 직면 하 고 rostral 끝 (뇌)와 조직 등 사이드를 놓습니다. 핀 어깨와 척수의 대부분 꼬리 끝에 조직.
- 외피와 brainstem 밑에 두개골의 손상을 방지 하려면 정수 리 봉합 다음 두개골을 통해 절 개를 중간에 화살을 확인 합니다.
참고: 신생아 뼈 조직 이다 하지 완전히 석 회화 이며 매우 취 성. 뼈/조직 정도, 유연 하지만 주변 결합 조직과 근육 보다 강하다는 것입니다. - 매체 봄 또는 홍 채가 위를 사용 하 여 화살 봉합에서 시작 하 고 노력 하 고 옆으로 두개골의 후 두 봉합을 싹 둑. 이 두개골을 반영 하 고 두개골의 rostral 부분을 고정 하 고 조직에 몇 가지 안정성을 제공 하는 고정 된 수의 "날개"를 만들 것입니다 ( 그림 2A참조).
- 대뇌 피 질의 나머지를 잘라 두개골 플랩 반영 후 소 뇌 (vermis) 상대적으로 그대로의 꼬리 부분 (그림 2B) 떠난다.
- 외피와 brainstem 밑에 두개골의 손상을 방지 하려면 정수 리 봉합 다음 두개골을 통해 절 개를 중간에 화살을 확인 합니다.
- 등 쪽 laminectomy를 수행 합니다.
- 두개골 및 척추 열 마이크로 봄이 위와 집게를 사용 하 여 근육을 제거 합니다. 그대로 흉 곽, 복 부 laminectomy, 척수 손상의 기회를 최소화 하는 동안 조직 앵커 나중 고정 됩니다이 흉 곽의 등 쪽 측에 따라서 조직을 제거 합니다.
- 신중 하 게 중간 봄이 위 또는 정밀한 아이리스가 위를 사용 하 여 척추 하기의 측면 프로세스를 떨어져 싹 둑. 멀리 어떤 조직 overlying 폰 스 및 모 수 컷. Vermis, 소 뇌, 폰 스, 및 척수의 시작은 지금 명확 하 게 보이는 (그림 2C) 됩니다 합니다.
- 복 부 laminectomy를 수행 합니다.
- 조직 등 쪽을 거절 하 고 흉 곽과 척추의 가장 꼬리 끝에 핀. 두개골 플랩 (그림 3A)를 사용 하 여 조직의 rostral 측을 고정 합니다.
- 흉 곽, 흉 골 및 동일한가 위와 집게를 사용 하 여 모든 복 부 장기 등의 복 부 절반을 제거 합니다. 흉 곽 갈비와 척수 (그림 3B) 노출에 연결 된 멀리 부드러운 조직 해 부.
- 혀, 식도, 기관지, 후 두, 그리고 모든 다른 부드러운 조직 및 근육 (로 그림 3C에서 본) 두개골 및 척추의 기지를 overlying 제거 합니다.
- 하드 팔레트 overlying 조직 해 부. (그림 3C)에 V 모양의 들여쓰기와 두개골의 기지에 뼈의 사각형 접시를 찾아서 하드 미각을 확인 합니다. 미각의 중간 선 따라, 조심 스럽게 위쪽으로 리프트 잘라내어 제거 합니다(그림 4)를잘라 가로 수행.
- 그림 4B에서 보듯이 약 흉부 척추 7 (T7)을 첫 번째 자 궁 경부 척추에서 brainstem 그리고 척수의 복 부 표면 노출 하기를 제거 하 여 복 부 laminectomy를 시작 합니다.
- 이 단계에서 복 부 rootlets 표시 됩니다. 만들고 상처를 하기에 가까운 뿌리의 근원에서 멀리 가능한; 척수에 주의 using 작은 마이크로 해 부 또는 봄이 위, 뿌리를 스트레칭 하지 마십시오.
- 캡처를 하기에서 척추의 양쪽을 따라 5-10 mm. 자르지 않는다 너무 가까이 척수 또는 척추. 이 단계에는 척수를 폭로 자 궁 경부 척추의 제거 수 있습니다. rootlets 절단 하지 마십시오.
- (양측) 척추 (약 T7) 따라 rootlets 약 20-25 m m를 캡처. 이 절차를 통해 척수에 절단을 방지 하 고 그림 4C에서 보듯이 척추의 가장자리를 조작 합니다.
- 신중 하 게 운동 각 척추의 rostral 가장자리와 밀접 하 게 뼈 아래 캡처 C1, C2, c 3를 제거 합니다. 뼈를 잘라 만든 것입니다, 더 이상는 rootlet에 가까운. 사용 하 여 연결 또는 겸 인하 (그림 4C)를 만드는 동안 각 자 궁 경부 척추에 확고 한 그립을 달성을 돕기 위해 구 부 러.
- 척수의 원하는 길이로 절연 척추 칼럼에서 해 부 일단 가로 상처 (그림 5A 및 그림 5B) 척수를 제거를 확인 합니다.
- Dura mater를 제거 합니다.
참고: 앞에서 설명한3,7되었습니다 일괄적 생체 외 녹음에 격리 brainstem 척수를 사용할 수 있습니다. Brainstem-척수 척추 칼럼에서 제거와 함께 경질 흡입 전극 두개골과 척추 컷에서 녹음을 수행을 위한 최적의 액세스 rootles 제공 하기 위해 제거 되어야 합니다. 또한, 경질의 제거 깔끔하게 brainstem를 슬라이스 하 고 생체 외 녹음 컬 활성 얇은 슬라이스를 얻을 수 있습니다.- 신중 하 게 격리 brainstem 척추는 두개골을 둘러싼 경질에 대 한 액세스를 허용 하도록 최대 조직 등 쪽 코드 핀 (그림 5B) rootles. 핀의 brainstem, XII rootlets rostral 측면 여백 통해 적용 되어야 한다.
- 경질의 등 쪽 여백에 좋은 집게 (#5)와 두 라를 들어올려 brainstem의 등 쪽 표면에서 경질을 제거 하 고 잘 봄이 위 brainstem의 길이 걸쳐 측면 중간에서 잘라. 자체 brainstem에 절단을 피하기 위해 주의 해야 합니다. 부드럽게 brainstem 표면에서 혈관 들어올린 때 brainstem 단면 vibratome 블레이드의 장애를 피하기 위해 잘라.
- 신중 하 게 두개골 신경 rootlets 경질을 통과 하 고는 쉽게 찢 어 떨어져 경질 들어올리면 brainstem의 중간과 측면 측면에서 경질 해 부. 부드럽게 그들 주위 작은 봄이 위 절단에 의해 뽑아 되 고 rootlets의 가능성을 최소화 합니다.
- 복 부 표면 위를 향하도록 하 고 두개골 rootlets는 명확 하 게 볼 수 있도록 brainstem 척수를 플립. Rostral에서 꼬리를 절단 지역 postrema 바로 위에 두 라를 부드럽게 들어올려 brainstem의 등 쪽 측에서 경질 해 부. 지역 postrema microcapillaries이이 지역 perfusing의 큰 숫자 때문에 약간 분홍색 표시 됩니다.
- 좋은 곤충 핀을 사용 하 여 모든 나머지 dura 멀리 애타게 하 고 두개골 및 자 궁 경부 rootlets에 가까운 근접에서 남아 있는 혈관을 제거.
4. 슬라이스 프로토콜
- 제거한 후에 경질, brainstem 플라스틱 블록 ("절단 블록" 라 함)에 파라핀 플랫폼의 중앙에 놓습니다. 그림 5C와 같이 길이 1 cm 이상의 손질 되었습니다가 좋은 곤충 핀을 사용 하 여 원심 척수를 통해 brainstem의 꼬리 끝을 고정 합니다.
- 블레이드 brainstem의 rostral 얼굴에 수직을 상처에 vibratome 블록 홀더 고정된 brainstem와 파라핀 덮여 절단 블록을 맞춥니다.
- 초기 슬라이스 rostral 대부분 끝에 고르지 못한, 외부 조직을 제거를 확인 합니다. 이 초기 컷 200-300 µ m 일반적으로 그러나 신중 하 게 피하기 위해 IX, X와 XII 두개골 rootlets의 제거 될 수 있습니다. 이 단계는 얼굴 핵 (7 세)와 glossopharyngeal rootlets의 꼬리 정도 밝힐 것입니다 일반적으로 하 고 그것의 얼굴은 파 vibratome 블레이드 평면 brainstem 정렬 가능 하 게. 작은 조정을 필요한 파 하면 보장 하는 조직을 제거 하는 작은 상처 합니다.
참고: 한 인하 각 연속 조각 그리고 brainstem 신경 회로 리듬 생성에 필요한 rostro 꼬리 거리에 대 한 랜드마크를 제공 하는이 Glossopharyngeal (IX) rootlets brainstem의 측면 가장자리에 표시 됩니다. Brainstem의 복 부 측에 hypoglossal rootlets (XII)도 볼 수 있어야 IX rootlets 보여주는 컷된 얼굴에 약간 꼬리. 최종 랜드마크 brainstem의 지 얼굴에 obex를 4 심 되는 척수의 중앙 채널 좁은 인간의 두뇌에 (포인트)를 될 것입니다. 참조의 이러한 세 가지 포인트 표시, 올바른 가공 면은 설립 (참조 그림 6A)와 컬 활성 슬라이스를 안정적으로 얻어질 것입니다. - IX rootlets brainstem의 컷된 얼굴의 표면 근처까지 절단 rostral-꼬리를 계속 합니다.
- 랜드마크와 올바른 방향 그림 6 을 참조 하십시오. Vibratome 클램프에 파라핀-슬 래 브 transection의 다음 각도 컷 슬라이스 매우 약간의 "쐐기" 모양을 만들 하 고 랜드마크 설명 될 때까지 약 100-200 µ m의 조각을 삭감 조정 (그림 6A)를 명확 하 게 본.
참고: 이 약간의 쐐기 절단 조각에서 XII 모터 신경의 수를 증가 하 고 녹음 중 리듬 활동을 얻기의 가능성을 극대화. 랜드마크를 사용 하 여 설명 (rostral rootlets glossopharyngeal 신경 번들, hypoglossal 신경 번들는 obex에서에서 rootlets에서에서) 슬라이스 reproducibly pBC (그림 6B)의 적어도 큰 부분을 포함 하는 것을 보장 한다. - PBC를 잡으려고이 rostral 신경 해부학 표식에서 brainstem의 300-500 µ m 슬라이스를 자르고 전송 회로 관련.
참고: "이상적인" 슬라이스를 안정적으로 표면 녹음 내 리듬 생성/전송 loci 흡입 전극 사용에 지 하지 않고 inspiratory 활동 hypoglossal rootlet 번들의 가장 rostral rootlet 포함는 brainstem입니다.
5. 기록 절차
- 분할 녹음 실에서 실제 (0.5-1.0 mL/min)와 지속적으로 perfuse 놓고 XII rootlets 또는 pBC, XII PMNs 또는 XII motoneurons에서 흡입 또는 세포 외 전극 기록 인구 활동을 사용 합니다. 자세한 기록 절차에 대 한 brainstem 척수 전기 생리학에 이전 간행물을 참조 하 고 클램핑10,11패치.
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Representative Results
여기에 제시 된 방법 연구원을 reproducibly 하 고 확실 하 게 많은 시간 움직이다 모터 출력의 녹음을 허용 하는 실행 가능한, 강력한 조각을 잘라 brainstem의 리듬 활성 슬라이스를 취득에 관심이 있습니다. 모든 생성 하 고 전송 inspiratory 리듬에 대 한 최소한 필요한 신경 회로 요소는이 메서드를 사용 하 여 얇은 조각에서 캡처할 수 있습니다. 이러한 요소를 포함: 복잡 한 preBötzinger, hypoglossal 모터 신경 (pXII MNs)에 투영 premotor 신경 hypoglossal 모터 신경 (XII MNs), 및 hypoglossal 신경 rootlets. PBC, XIIn, 및 C4 신경 rootlets 일반적으로 사용 됩니다 inspiratory 리듬 녹음, 그림 7에서 볼 수 있듯이.
이 절차의 성공적인 사용은 10-15 분, 실용적이 고 컬 활성 en 블록 준비 또는 컬 활성 조각에 생산할 예정 이다 < 30 분. 일괄적 brainstem-척수 또는 얇은 슬라이스의 격리, 후 녹음 실에서 재래식의 15 분은 거짓 모터 출력의 생산에 대 한 충분 합니다. 슬라이스, 경우 증가 세포 외 [K +] 약 8-9 mm이 연구소의이 경험에서 24 ~ 36 h에 대 한 마지막 수 있는 강력한 신경 드라이브를 생산할 예정 이다. 준비는 지속적으로 superfused carbogenated (95% O2/5% CO2)와 온수 실제 이어야 한다 (~ 27 ° C). 성공 해 신속 하 게 수행 되 고 곤란, 스트레칭, 또는 손상 신경 rootlets 녹음에 사용을 피하십시오. 최적의 결과 대 한 절차의 모든 단계는 신속 하 게 수행 하 고 조직 목욕 하거나 해 부 및 조직 격리 (위에서 설명한) 대로 수행할 때 carbogenated 실제와 함께 끼얹는다 지속적으로 해야 합니다. 광범위 한 세부 neuroanatomy 및 brainstem의 정확한 지도 관한, Ruangkittisakul 외13,14, Ballanyi15 , 동료의 작업을 참조 하십시오. 여기에 제시 된 프로토콜 입증 된 신뢰할 수 있는 고위 작가 실험실에서 한 방법 이며이 보고서 표면 랜드마크 brainstem에 또는 내에서 볼 수에 의존이 분할 영역을 생성 하기 위한 그래픽, 단계별 방법을 제공 합니다 brainstem으로 여기 자세한.
그림 1 : 초기 brainstem 척수 추출에 대 한 해 부. (A) Anesthetized 강아지 해 부에 대 한 고정. 파선 피부에 화살 절 개에 대 한 절 개 지침 나타내고 가로 눈 하 고 횡 경 막 아래 꼬리 인하 합니다. (B) 동물에서 피부와 앞 발을 제거 하기 위한 가이드. (C) 피부 설치류의 등 쪽 양상. 점선된 라인 절 개 해골-플랩 "조가 비" 노출에 대 한 지침을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 지 laminectomy의 단계. (A) 파선 뇌를 제거 하기 위한 절 개 지침을 나타냅니다. 조직을 제거 후 (B) 결과. 파선 등 laminectomy에 대 한 절 개 지침을 나타냅니다. (C) 노출 brainstem 척추 등 laminectomy 다음 코드로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 초기 복 부 해 부의 단계. (A) 잘린된 개와 복 부 피부 쥐의 복 부 측. 파선은 xyphoid 프로세스를 제거 하 고 흉 곽 이후에 복 부와 흉 강 장기를 제거 하 여에 대 한 절 개 지침을 나타냅니다. (B) 복 부 및 흉부 구멍 기관 제거. (C) Oropharyngeal 구조 제거입니다. 파선 하드 미각 제거에 대 한 절 개 지침을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 복 부 laminectomy의 단계. (A) 하드 구개 그리고 남은 해골 부품 제거. 절 개 지침 brainstem 척수를 둘러싼 남아 있는 조직을 제거 하는 방법을 나타냅니다. (B) 첫 번째 자 궁 경관 척추 (C1) 노출. (C) 시범 C1 해제 고 가로 컷 척추 몸 만들기에 그것을 제거. 신경은 신중 하 게 잘라 플러시 척추 몸의 등 쪽 측에 그것을 제거 하기 전에. 이것은 해 부의 가장 중요 한 단계 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 부 러 뜨 리 brainstem 척수의 준비. (A) C1-C3 척수에서 제거. 절 개 지침 위치 꼬리 척수에서 척수 brainstem 서버를 나타냅니다. (B) 레이블이 신경 rootlets와 brainstem 척수의 복 부 쪽. 절 개 지침 권장된 transection 또는 남은 斗 brainstem 척수 영역에서 녹음 하기 전에 골 수에서 rostral 구조를 나타냅니다. (C) 파라핀 슬라브는 vibratome에 조각화에 대 한 설정. 조각화 지역 포함 두개골 신경 IX와 12 세 사이 조직이 되어 있습니다. 조각화 지역으로 마이크로 핀을 배치 하지 마십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 그대로 hypoglossal 모터 핵 및 PreBötzinger 복잡 한 조각을 얻기 위해 사용 하는 건축물. (A)의 brainstem 척수 후 초기 컷 glossopharyngeal (IX) rootlets rostral 가로 보기. 절 개 지침 transection 레벨 hypoglossal (XII) rootlets에 그냥 꼬리를 나타냅니다. (B) pBC와 hypoglossal 모터 핵 포함 하는 슬라이스를 절단 하기 전에 블레이드 파라핀 블록의 방향. 사다리꼴 "쐐기" 모양 컷을 생성할 녹음 중 리듬 활동을 얻기 위해 조각에 충분 한 inspiratory 뉴런의 가능성을 최대화 합니다. 쐐기는 pBC, hypoglossal premotor 신경 및 hypoglossal 모터 신경, 호흡기 rhythmogenesis의 색인은 리듬 드라이브를 전송 하기 위해 필요한 회로 공동으로 제공 하는 포함 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : En 블록 또는 슬라이스 준비에서 대표적인 녹음. (A) 12 세 rootlet에서 통합된 추적. (B) pBC에서 통합된 추적. PBC에서 녹음 장 님 패치 클램프 필요 en 블록 준비를 사용 하 여. C4 신경 rootlet에서 (C) 통합된 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
En 블록으로 여기에 제시 된 프로토콜 적응 또는 슬라이스 워크플로 실험실 용 유리 이며 얇은 중 일괄적 brainstem-척수를 활용 하 고 싶은 연구 슬라이스 전기 생리학 기록에 대 한 준비. 해 부와 슬라이스 방법 제시, 방법과 다른 사람에 의해 이전에 보고 된17,,1819결합, 널리의 범위에 적응할 수 있는 강력 하 고 가능한 조직의 재현할 준비 하면 실험 설치류 hindbrain 또는 척수를 사용 하 여입니다. 제시 해 부 매우 상세 하 고 분할 영역을 준비할 때 brainstem 척수의 방향에 관한 광범위 한 정보 뿐 아니라 등 쪽과 복 부 laminectomy를 포함 합니다. 상세한 해 부와 슬라이스 프로토콜 제시 생성 및 inspiratory 리듬의 전송에 필요한 모든 회로 포함 하는 연구원을 수 있습니다. 주요 신경 인구/구조를이 방법을 사용 하 여 캡처할 수 포함: hypoglossal premotor 신경, hypoglossal 모터 핵, 그리고 복잡 한 preBötzinger. 참고 중앙 공동2 센서 또는 내쉬는 숨 리듬 생성 회로 (RTN/pFRG)를 포함 하는 brainstem의 지역 준비에 포함 되지 않은 자세한 여기20,21. 일단 en 블록 준비 또는 슬라이스 얻은 되었습니다, 리듬 활동 얻을 수 있습니다 흡입 전극, 표면 전극, 또는 extracellular 단위 또는 패치 클램핑 방법3,10 같은 단일 세포 기록 방법을 사용 하 여 ,11.
이 프로토콜의 목표 brainstem 척수 준비 또는 얇은, 컬 활성 슬라이스를 생성 하기 위한 명확 하 고, 따라 하기 쉬운 방법을 제공 하는 것입니다. 이 프로토콜 해야 그들의 armamentarium에 리듬 brainstem/슬라이스 준비 통합에 관심이 모두 경험과 새로운 연구에 귀중 한 몇 가지 중요 한 단계의 캡처를 용이 하 게 하는 프로시저 내에서 선발 강력 하 고, 재현성, 고 긴-지속적인 리듬 활성 조각
연구원은 해부학 적 랜드마크와 해 부에 대 한 필요한 기술을 식별과 편안 하 게 되었다, 일단 해 부의 속도, 증가 하 고 각 개별 조사 절차를 최적화할 수 있습니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 제프리 스미스, 리듬 brainstem 슬라이스 준비3의 원조로 그의 박사 후 작업 동안 수석 저자 (CGW)에 진행 되었다. 되도록 리듬 활동 및 슬라이스 및 en에 생존 블록 준비, 약 30 분 이내 처음부터 절차의 녹음 실에서 한 조각에 슬라이스를 생성 하는 모든 절차를 완료 합니다. 지속적인 관류, 조직 생존 능력에 거의 영향을 있다 하지만 더 이상 녹화 및 데이터 수집에 대 한 허용 해 부에 대 한 시간을 최소화. 호흡 연구, 대 한 약 280 μ m 두께3 얇은 조각 리듬, 강력한 inspiratory 활동 하지만 조각 최대 550 µ m17,18,,1922범위 수 있습니다. 이 절차를 수행 하 고 두께 각 조각의 rostral 꼬리 위치에 있는 가변성을 최소화 하는 데 필요한 기술을 개발 하 주의 연습 필요 합니다. 품질 및 견고성 나중 brainstem에 흥분 성의 억제 핵 조각 에서에서 기록 된 리듬의 "품질"에 영향을 수 있는 녹음에 리듬 활동의 포함 또는 제외 하는 특정 세포 인구 영향 3.
마지막으로, 그것은 또한 그 실제 정확 하 게 프로토콜에 따르면, 준비 되 고 표준화 된 pH20, 온도 및 산소 수준에 중요 한. 무산 소 준비 리듬 활성화 되지 않습니다 하 고 데이터 컬렉션21에 영향을 미칠 것입니다.
실용적이 고 리듬 활성화 준비의 탐정 캡처를 용이 하 게 하는 절차에서 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 복 부 laminectomy 동안 등 흉 곽을 그대로 유지 여분 차입 자본 이용을 허용 하 고 척추 칼럼에서 brainstem 척수의 상대적으로 섬세 한 격리를 수행 하는 동안 준비를 보호 하기 위한 더 많은 티슈를 제공 합니다. 여기서 설명 하는 단계 허용 쉽게 생산 en 블록 준비 또는 얇게 되므로, 필요성에 의해 추가 단계 조사는 상세한 해 부는 그냥 얇은 슬라이스를 생략할 수 있습니다. 다른 유용한 팁 포함, 복 부 laminectomy 수행 하는 동안 신경 rootlets severing 하는 동안 그것을 위쪽으로 해제 척추 신체에 확고 한 그립을 얻을 하는 것이 중요 하다. Brainstem 척수 해 부 되 고 추출 후 dura mater 및 나머지 맥 관 구조 해야 합니다 수 해 부 신경 조직의 표면에서. 혈관 고 경질 힘든 깨끗 한 슬라이스 절단에서 vibratome 블레이드를 방지할 수 있습니다. 경질의 해 부 엉 블록 준비에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 신경 흡입 전극 커플링을 최적화 하는 것이 좋습니다. 마지막으로,는 vibratome의 사용에 신중 하 고 질서 있는 실천은 깨끗 하 고 재현할 수 조각 절단 필요 합니다. 이 프로토콜 절 개 및 절단 절차에 대 한 자세한 내용은의 매우 포괄적인 목록을 제공합니다. 여기에 강조 신뢰할 수 있는 기초 및 훈련 도구는 수정 그들의 실험실의 절차 필요에 따라 사용 하는 수 사관에 대 한 단계별 자세한 목록을 제공 하는.
전반적으로,이 방법론 생체 전기 생리학의 방법의 30 년 진화를 나타냅니다. 이 종이의 범위는 일괄적의 표준화에 초점을 맞추고 및 brainstem 척수 녹음 P0 P5 쥐 및 쥐22inspiratory 활동 공부에 일반적으로 사용 되는 슬라이스. 그러나,이 해 부 과정 동물 크기, 연령, 및 연구, E18 쥐/생쥐, 신생아 쥐 및 쥐 (출생 후 0 ~ 6), 일 성인 쥐 등의 다양 한 종족의 범위에 걸쳐 활용 될 수 있습니다. 미래 연구는 종 및 연령대, 프로토콜을 합리화 하 종 및 연령대에 걸쳐 리듬 생성 또는 다른 생리 적 과정에 메커니즘을 심문 하는 연구를 수 있도록 제시 하는 방법을 사용할 수 있습니다. 궁극적으로, 방향, 간격, 또는 위치는 슬라이스 또는 일괄적 변경 준비 리듬 활동23좌우할 것 이다. 광범위 한 문학 과거에 출판 된 슬라이스 절차에 의해 캡처하고 stereotaxic 쥐 및 마우스 atlases 신경 회로 관하여 더 자세히 논의 여기24, 제공할 수 있다 신경 인구에 관하여 25,26. 여기에 제시 된 절차 범위 해 부 실험실에서 랜드마크에서 리듬 조각을 쉽게 볼 수를 삭감 하는 법을 배워야 새로운 탐정을 허용 하는 명확한 삽화와 함께 광범위 한 정보를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
S.B.P은 Loma Linda 대학 여름 학부 연구 화목의 받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
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