Summary

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Published: March 23, 2019
doi:

Summary

Este protocolo visualmente se comunica a preparação de tronco cerebral-medular e clarifica a preparação de fatias transversais de tronco cerebral de uma forma abrangente e passo a passo. Ele foi projetado para aumentar a reprodutibilidade e aumentar a probabilidade de se obter fatias ritmicamente ativo, viáveis e duradouras, para gravar saída neural das regiões respiratórias do tronco cerebral.

Abstract

Mamíferos ritmo inspiratório é gerado a partir de uma rede neuronal em uma região da medula chamada o preBötzinger complex (pBC), que produz um sinal que está dirigindo a contração rítmica dos músculos inspiratórios. Atividade neural rítmica gerado no pBC e transportadas para outros pools neuronais para a musculatura da respiração pode ser estudada usando várias abordagens, incluindo em bloco, gravações de nervo e gravações de fatia transversal de carro. No entanto, os métodos publicados anteriormente não extensivamente descrita o processo de dissecção de tronco cerebral-medular de forma transparente e reprodutível para estudos futuros. Aqui, apresentamos uma visão abrangente de um método usado para reproducibly cortar fatias de tronco cerebral ritmicamente ativo contendo os circuitos neuronais necessários e suficientes para geração e transmissão de movimentação inspiratória. Este trabalho se baseia nos protocolos de eletrofisiologia anterior da medula espinhal-tronco cerebral para aumentar a probabilidade de obtenção confiável fatias viáveis e ritmicamente ativo para gravar saída neuronal do pBC, neurônios cortéx hipoglosso (XII pMN), e neurônios hipoglosso (XII MN). O trabalho apresentado expande-se sobre métodos publicados anteriores, fornecendo ilustrações detalhadas, passo a passo da dissecação, de filhote de rato inteiro, a fatia in vitro que contém as raízes do XII.

Introduction

A rede neural respiratória do tronco cerebral fornece um domínio fértil para compreender as características gerais das redes neurais rítmicas. Em particular, o interesse está no desenvolvimento de roedores neonatal respirando e compreender como se desenvolve o ritmo da respiração. Isto pode ser feito usando uma abordagem multi-nível, incluindo na pletismografia de todo animal vivo, in vitro, em bloco, gravações de nervo e in vitro fatia gravações que contenham o gerador de ritmo de respiração. Reducionista em vitro en bloc e fatia gravações são um método vantajoso usar quando interrogando os mecanismos subjacentes rhythmogenesis respiratória e circuitos neurais na região da medula espinhal-tronco cerebral do desenvolvimento de roedores. O sistema respiratório em desenvolvimento inclui aproximadamente 40 tipos de células, caracterizados por padrão, incluindo as do centro respiratório1,2a disparar. A rede respiratória central inclui um grupo de neurônios ritmicamente ativos localizado na medula ventrolateral rostral1,3. Rhythmogenesis respiratório dos mamíferos é gerado de um autorhythmic interneurônio rede apelidado o complexo de preBötzinger (pBC), que foi localizado experimentalmente através de tanto fatia e en bloc preparações à base de mamíferos neonatal tronco cerebral-espinhal cabos de3,4,5,6,7,8. Esta região tem uma função semelhante ao nó sinoatrial (SA) no coração e gera um sistema de tempo inspiratório a respiração de unidade. Partir do pBC, o ritmo inspiratório é transportado para outras regiões do tronco cerebral (incluindo o núcleo motor hipoglosso) e piscinas de motor da coluna vertebral (tais como os neurônios motores frênico que impulsionam o diafragma)9.

Atividade rítmica pode ser obtida usando o tronco encefálico medula espinhal pt bloco preparações ou fatias de uma variedade de populações de células, incluindo as raízes nervosas de C3-C5, raízes do nervo XII, núcleo motor hipoglosso (XII MN), neurônios cortéx hipoglosso (XII pMN), e o pBC3,10,11,12. Enquanto esses métodos de coleta de dados foram bem sucedidos em um punhado de laboratórios, muitos dos protocolos não são apresentados de uma forma que é totalmente reproduzível para novos pesquisadores entrando em campo. Obter viável e ritmicamente ativo en bloc e fatia preparações requer uma atenção aguda ao detalhe por todos os passos da dissecação e protocolo de corte fatia. Protocolos anteriores extensivamente descrever os vários procedimentos de gravação e eletrofisiologia, ainda falta o detalhe na parte mais crítica de obter uma preparação do tecido viável: executar o procedimento de dissecção e fatia de tronco cerebral-medular.

Eficientemente obter preparação ritmicamente ativo e viável en bloc ou fatia gravações de eletrofisiologia do tronco cerebral-medular requer que todas as etapas ser executada corretamente, com atenção e rapidamente (normalmente, todo o procedimento relacionado aqui pode ser realizada em cerca de 30 min). Pontos críticos do protocolo de eletrofisiologia de tronco cerebral-medular que não foram previamente bem descritos incluem a dissecação das raízes nervosas e do procedimento de corte sobre o vibratome. Este protocolo é o primeiro a gradual comunicar visualmente a dissecação de tronco cerebral-medular para novos pesquisadores e especialistas na área. Este protocolo também completamente explica técnicas cirúrgicas, Marcos e outros procedimentos para ajudar futuros pesquisadores em padronizar as fatias e em bloco de preparações que contêm os circuitos exato desejado em cada experimento. Os procedimentos apresentados aqui podem ser usados em filhotes neonatais tanto o rato e o rato.

Protocol

O seguinte protocolo foi aceito e aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Loma Linda e institucional Cuidado Animal. Diretrizes do NIH para o tratamento ético dos animais são seguidas em todos os experimentos animais realizados em laboratório. Todos os padrões éticos foram sustentados por indivíduos realizar este protocolo. 1. soluções Prepare-se fluido espinal cerebral artificial (aCSF). Preparar aCSF fresco à noite antes de um ex…

Representative Results

O método apresentado aqui permite que um pesquisador interessado em obter fatias ritmicamente ativas de tronco cerebral reproducibly e confiantemente cortar uma fatia robusta, viável que permitirá a gravação de saída motor fictícia por muitas horas. Todos os elementos de circuito neural minimamente necessário para geração e transmissão de ritmo inspiratório podem ser capturados em uma fatia fina usando esse método. Esses elementos incluem: o complexo preBötzinger, cortéx ne…

Discussion

Adaptação do protocolo aqui apresentado em um bloco de pt ou fatia fluxo de trabalho é vantajoso para os laboratórios e estudos que gostam de utilizar também em bloco tronco cerebral-medular e/ou fina fatia preparações para as gravações de eletrofisiologia. O método de dissecação e fatia apresentado, combinado com métodos anteriormente relatados por outros17,18,19, permitirá a preparação pode ser reproduzida de t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.B.P é um destinatário de uma bolsa de pesquisa graduação do Loma Linda University verão.

Materials

NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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