Summary

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Published: March 23, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.

Abstract

Mammiferi ritmo inspiratorio è generata da una rete di un neurone in una regione del midollo chiamato il preBötzinger complex (pBC), che produce un segnale guida la contrazione ritmica dei muscoli inspiratori. Attività neurale ritmica il PBC e ha trasportato ad altre piscine neuronale per la muscolatura della respirazione può essere studiata utilizzando vari approcci, tra cui del blocco dell’en del nervo registrazioni e registrazioni di sezione trasversale in auto. Tuttavia, metodi precedentemente pubblicati non sono ampiamente descritti il processo di dissezione del tronco cerebrale-spinale del cavo in modo trasparente e riproducibile per gli studi futuri. Qui, presentiamo una panoramica completa di un metodo utilizzato riproducibile taglio fette ritmicamente-attivo del tronco cerebrale che contiene la circuiteria neuronale necessaria e sufficiente per la generazione e trasmissione inspiratori in auto. Questo lavoro si basa su protocolli di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale del cavo precedente per migliorare la probabilità di ottenere in modo affidabile fette praticabile e ritmicamente-attivo per la registrazione di un neurone uscita da pBC, neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e motoneuroni hypoglossal (XII MN). Il lavoro presentato si espande sulla precedenti metodi pubblicati fornendo illustrazioni dettagliate della dissezione, da cucciolo di ratto intera, fetta in vitro contenenti le radichette XII.

Introduction

La rete neurale respiratoria del tronco cerebrale fornisce un dominio fertile per comprendere le caratteristiche generali delle reti neurali ritmiche. In particolare, l’interesse è lo sviluppo di roditore neonatale respirazione e comprendere come si sviluppa il ritmo del respiro. Questo può essere fatto utilizzando un approccio multi-livello, tra cui in vivo animale intero pletismografia, in vitro del blocco dell’en del nervo registrazioni e in vitro affettare le registrazioni che contengono il generatore di ritmo di respirazione. Riduzionista in vitro en bloc e fetta registrazioni sono un metodo vantaggioso usare quando interrogare i meccanismi dietro rhythmogenesis respiratoria e circuiti neurali nella regione del tronco cerebrale-spinale del cavo di sviluppo di roditori. Lo sviluppo del sistema respiratorio comprende circa 40 tipi di cellule, caratterizzati da sparo modello, compresi quelli del centro respiratorio1,2. La rete respiratoria centrale comprende un gruppo di neuroni ritmicamente attivi che si trova in rostral midollo ventrolateral1,3. Rhythmogenesis respiratorio dei mammiferi è generato da un autorhythmic Interneurone rete soprannominato il preBötzinger complesso (pBC), che è stato localizzato sperimentalmente tramite sia fetta ed en bloc preparazioni a base di mammiferi neonatali tronco cerebrale-spinale cavi3,4,5,6,7,8. Questa regione serve una funzione simile al nodo senoatriale (SA) nel cuore e genera un sistema di cronometraggio inspiratori alla respirazione in auto. Da pBC, il ritmo inspiratorio è trasportato ad altre regioni del tronco cerebrale (tra cui il nucleo motore hypoglossal) e spinale motore piscine (come i motoneuroni frenici che guidano il diaframma)9.

L’attività ritmica può essere ottenuta utilizzando del tronco cerebrale del midollo spinale en bloc preparati o fette da una varietà di popolazioni di cellule, tra cui radichette nervo di C3-C5, radichette del nervo XII, nucleo motore hypoglossal (XII MN), neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e il pBC3,10,11,12. Mentre questi metodi di raccolta dei dati hanno avuto successo attraverso una manciata di laboratori, molti dei protocolli non sono presentati in un modo che è completamente riproducibile per nuovi ricercatori entrano nel campo. Ottenere praticabile e ritmicamente attivo en bloc e fetta preparazioni richiede un’acuta attenzione al dettaglio attraverso tutte le fasi della dissezione e protocollo di taglio fetta. Precedenti protocolli ampiamente descrivere le varie procedure di registrazione ed elettrofisiologia, ancora prive di dettagli nella parte più critica di ottenere una preparazione di tessuto vitale: eseguire la procedura di dissezione e fetta di tronco cerebrale-spinale.

In modo efficiente ottenere una preparazione di blocco o fetta ritmicamente-attivi e vitali en registrazioni di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale richiede che essere effettuati tutti i passaggi correttamente, accuratamente e rapidamente (in genere, l’intera procedura relative qui può essere eseguita in circa 30 min). Punti critici del protocollo elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale che precedentemente non sono stati ben descritti includono la dissezione delle radichette del nervo e la procedura per affettare il del vibratome. Questo protocollo è il primo a graduale comunicare visivamente la dissezione del tronco cerebrale-spinale per nuovi ricercatori ed esperti nel campo. Questo protocollo spiega anche accuratamente le tecniche chirurgiche, monumenti e altre procedure per assistere i futuri ricercatori nella standardizzazione fette e del blocco dell’en preparati per contenere il circuito esatto desiderato in ogni esperimento. Le procedure qui presentate possono essere utilizzatoin cuccioli neonatali mouse e del ratto.

Protocol

Il seguente protocollo è stato accettato e approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) dell’Università di Loma Linda. Linee guida NIH per il trattamento etico degli animali sono seguite in tutti gli esperimenti su animali condotti in laboratorio. Tutti gli standard etici sono stati confermati da soggetti che svolgono questo protocollo. 1. soluzioni Preparare il liquido spinale cerebrale artificiale (aCSF). Preparare aCSF fresco la…

Representative Results

Il metodo presentato qui consente un ricercatore interessato ad ottenere fette ritmicamente attivi del tronco cerebrale in modo riproducibile e affidabile tagliare una fetta valida, robusta che permette la registrazione di uscita motore fittizia per molte ore. Tutti gli elementi del circuito neurale minimamente necessarie per la generazione e trasmissione di ritmo inspiratorio può essere catturati in una fetta sottile utilizzando questo metodo. Questi elementi includono: preBötzinger co…

Discussion

Adattare il protocollo presentato qui in un blocco di it o fetta flusso di lavoro è vantaggiosa per i laboratori e studi che vorrebbero utilizzare entrambi del blocco dell’en del tronco cerebrale-spinale cavo e/o sottile fetta preparativi per registrazioni di elettrofisiologia. Il metodo di dissezione e fetta presentato, combinati con metodi precedentemente segnalati da altri17,18,19, permetterà la preparazione riproducibile d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.B.P è un destinatario di un assegno di ricerca di Loma Linda University Summer Undergraduate.

Materials

NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

References

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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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