Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Voorbereiding van ritmisch-actief In Vitro neonatale knaagdier hersenstam-ruggenmerg en dun plakje

doi: 10.3791/58870 Published: March 23, 2019

Summary

Dit protocol zowel visueel communiceert de hersenstam-ruggenmerg voorbereiding en de voorbereiding van de hersenstam dwarse segmenten verduidelijkt in een uitgebreide stapsgewijze manier. Het werd ontworpen om de reproduceerbaarheid verhogen en de kans voor het verkrijgen van levensvatbare, langdurig, ritmisch-actieve segmenten voor het opnemen van neurale uitvoer uit de luchtwegen gebieden van de hersenstam te verbeteren.

Abstract

Zoogdieren inspiratory ritme is gegenereerd vanuit een neuronale netwerk in een regio van de medulla genoemd de preBötzinger complexe (pBC), die produceert een signaal rijden de ritmische samentrekking van inspiratory spieren. Ritmische neurale activiteit gegenereerd in de pBC en droeg naar andere neuronale zwembaden om te rijden die de musculatuur van de ademhaling kan worden bestudeerd met behulp van verschillende benaderingen, waaronder en bloc zenuw opnames en transversale segment opnames. Echter, eerder gepubliceerde methoden hebben niet uitvoerig beschreven de hersenstam-ruggenmerg dissectie proces op een transparante en reproduceerbare wijze voor toekomstige studies. Hier presenteren we een uitgebreid overzicht van een methode die wordt gebruikt om reproducibly ritmisch-actieve hersenstam segmenten met de noodzakelijke en voldoende neuronale circuits voor het genereren en verzenden inspiratory station. Dit werk bouwt voort op eerdere hersenstam-ruggenmerg electrofysiologie protocollen ter verbetering van de kans op een betrouwbare manier verkrijgen van levensvatbare en ritmisch-actieve segmenten voor het opnemen van neuronale output van de pBC, hypoglossal premotor neuronen (XII pMN), en hypoglossal motorische neuronen (XII MN). Het werk gepresenteerd breidt op eerdere gepubliceerde methoden door het verstrekken van gedetailleerde, stapsgewijze illustraties van de dissectie, van hele rat pup, naar in-vitro segment met de XII worteltjes.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het respiratoire neurale netwerk van de hersenstam biedt een vruchtbare domein voor het begrijpen van de algemene kenmerken van ritmische neurale netwerken. Met name is het belang bij de ontwikkeling van neonatale knaagdier ademhaling en begrijpen hoe het ritme van de ademhaling ontwikkelt. Dit kan worden gedaan met behulp van een multi-level aanpak, met inbegrip van in vivo hele dierlijke plethysmography, in vitro en bloc zenuw opnames, en in vitro slice opnames die de ademhaling ritme generator bevatten. Reductionistische in vitro nl blok en segment-opnamen zijn een voordelige methode moet worden gebruikt bij het ondervragen van de mechanismen achter respiratoire rhythmogenesis en neurale circuits in de hersenstam-ruggenmerg regio knaagdieren te ontwikkelen. De ontwikkelende ademhalingswegen omvat ongeveer 40 soorten cellen, gekenmerkt door middel van verhitting patroon, met inbegrip van die van de centrale respiratoire1,2. Het centrale respiratoire netwerk omvat een groep van ritmisch actieve neuronen gelegen in de rostraal ventrolateral medulla1,3. Zoogdieren respiratoire rhythmogenesis wordt gegenereerd uit een autorhythmic interneuron netwerk genaamd de complexe preBötzinger (pBC), die is gelokaliseerd experimenteel via zowel nl als segment blok preparaten van neonatale zoogdier hersenstam-spinal glaskoord3,4,5,6,7,8. Deze regio serveert een vergelijkbare functie naar het sinoatrial knooppunt (SA) in het hart en genereert een inspiratory timing systeem station ademhaling. Van de pBC gebeurt het inspiratory ritme aan andere gebieden van de hersenstam (met inbegrip van de hypoglossal motor kern) en spinale motor zwembaden (zoals de phrenic motorische neuronen die het middenrif rijden)9.

Ritmische activiteit kan worden verkregen met behulp van de hersenstam ruggenmerg nl blok preparaten of segmenten uit een verscheidenheid van cel bevolking, met inbegrip van C3-C5 zenuw worteltjes, XII zenuw worteltjes, hypoglossal motor nucleus (XII MN), hypoglossal premotor neuronen (XII pMN), en de pBC3,10,11,12. Terwijl deze methoden voor het verzamelen van gegevens over een handvol laboratoria succesvol zijn geweest, zijn veel van de protocollen niet gepresenteerd op een manier die volledig kunnen worden gereproduceerd voor nieuwe onderzoekers in het veld invoeren. Verkrijgen van levensvatbare en ritmisch actieve nl blok en segment voorbereidingen vereist een acute aandacht voor detail door alle stappen van de dissectie en segment snijden protocol. Eerdere protocollen uitgebreid beschrijven de verschillende opname procedures en electrofysiologie, maar gebrek aan detail in het meest kritische deel van het verkrijgen van een levensvatbare weefsel voorbereiding: uitvoeren van de hersenstam-ruggenmerg dissectie en segment procedure.

Efficiënt hersenstam-ruggenmerg electrofysiologie opnamen verkrijgen een ritmisch-actieve en levensvatbare nl blok of segment voorbereiding vereist dat alle stappen correct, zorgvuldig en snel worden uitgevoerd (meestal de hele procedure gerelateerde hier kan uitgevoerd in ongeveer 30 min). Kritische punten van de hersenstam-ruggenmerg electrofysiologie protocol die niet zijn eerder goed beschreven zijn onder meer de dissectie van zenuw worteltjes en de segmenteringshulplijnen procedure op de vibratome. Dit protocol is de eerste stapsgewijze communiceren visueel de dissectie van de hersenstam-ruggenmerg voor zowel nieuwe onderzoekers en deskundigen op dit gebied. Dit protocol wordt ook grondig uitgelegd chirurgische technieken, monumenten en andere procedures bij toekomstige onderzoekers segmenten en de en bloc preparaten bevatten de exacte circuits gewenst in elk experiment standaardiseren. De procedures die hier gepresenteerd kunnen worden gebruikt in zowel rat en muis neonatale pups.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het volgende protocol is aanvaard en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Loma Linda University. NIH richtsnoeren voor de ethische behandeling van dieren worden gevolgd bij alle dierproeven uitgevoerd in het laboratorium. Alle ethische normen werden bevestigd door individuen uitvoeren van dit protocol.

1. oplossingen

  1. Bereiden van kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (aCSF).
    1. Bereiden van verse aCSF de avond voor een experiment in 1 L partijen met behulp van het volgende recept: 7.250 g NaCl (124 mM), 0.224 g KCl (3 mM), 2.100 g NaHCO3 (25 mM), 0.069 g NaH2PO4 • H2O (0.5 mM), 0.247 g MgSO4 • 7 H2 O (1,0 mM), en 5.410 g D-glucose (30 mM), 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1,5 mM). Altijd toevoegen de CaCl2 • 2 H2O laatst.
    2. Los de bestanddelen in 1 L gedeïoniseerd water. Roer gedurende 20-30 min.
    3. Meten van de pH van de aCSF en passen aan 7.40 ± 0,02 kleine volumes gebruiken (meestal < 0,5 mL) verdund NaOH, KOH of HCl.
      Opmerking: Bereide aCSF kan worden opgeslagen in de ijskast (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) omhoog tot drie dagen voordat de bacteriële groei heeft gevolgen voor de levensvatbaarheid van het weefsel tijdens een experiment. 0,2 µm filters gebruiken ter beperking van verontreiniging door schimmels of bacteriën aanwezig in het laboratorium aangezien experimenten maximaal 36 uur kunnen duren. Het recept van de aCSF beschreven kan worden opgeschaald naar 4 L partijen na hetzelfde protocol voor efficiëntie, en dit volume zal duren voor maximaal drie dagen van experimenten.

2. voorbereiding van de dissectie en Vibratome Rig

  1. Mes instellen.
    1. Gebruik een verse tweesnijdend scheermesjes voor snijden weefsel op een vibratome. Wassen van de mes met 100% ethanol en spoel af met gedeïoniseerd water voordat knippen of breuk van het mes in de helft en invoegen van het mes in de montage klem op de vibratome.
    2. Wijzig het blad telkens een nieuw weefsel preparaat is gemonteerd op de vibratome voor het snijden of als het snijdt in de paraffine plaat tijdens het snijden. Alle residuen van paraffine maakt het bijna onmogelijk te snijden netjes door neonatale zenuwweefsel.
  2. Paraffine slab instellen.
    1. Gebruik paraffine insluiten-stijl. Plaats van 10 g van het inbedden van media in een bekerglas van warmte-tolerante glas en gebruik van laag vuur smelten de kralen paraffine tot vloeistof.
    2. Voeg ongeveer 0,5 g grafiet poeder en meng de oplossing grondig en uniform in de vloeibare paraffine.
    3. Gebruik een kleine kunststof plaat als het substraat voor de paraffine. Knip een stukje van de kleine (0.5 - 1 cm dik en ongeveer 2 x 2 cm2 groot) van plastic (polycarbonaat of aluminium kan ook worden gebruikt). Een machinist's bestand gebruiken om kras groeven in de plastic asthis ervoor zorgen zal dat de paraffine houdt zich aan de plastic.
      Opmerking: Ook gebruiken een verwarmde 18 G hypodermische naald schuine gaten in het blad om ervoor te zorgen dat het mengsel van paraffine-graphite houdt zich aan de plastic plaatsen.
    4. Gebruik de achterkant van een katoen-tip applicator te druppelen van het mengsel van paraffine-graphite op de plastic door herhaaldelijk de applicator dompelen in het mengsel van gesmolten paraffine-graphite, druipend van de drijfmest op het kunststof blok, en de opbouw van de paraffine-graphite te ongeveer 1,5 cm dikte op de top van de plastic.
    5. Zodra een voldoende dikke laag van de paraffine-graphite mix wordt gestort op het blok, stelt u het blok opzij afkoelen en vervolgens vorm aan de hersenstam-ruggenmerg.

3. dissectie en isolatie van de Neuraxis

  1. Het uitvoeren van eerste dissectie en afstomping.
    Opmerking:
    dieren die worden gebruikt in deze studie kunnen variëren in grootte van embryonale dag 18 (E18) tot postnatale dag 10-20 in muizen of ratten variërend van E18 postnatale dag 5/6. Ratten of muizen van elke stam, behandeling of geslacht kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de proefopzet. Anesthesie en voorlopige dissectie in een zuurkast uitvoeren aangezien Isofluraan (0,25 mL in een kamer van 25 mL) wordt gebruikt.
    1. Weeg de pup en plaats het dan in een cupje van de anesthesie met 0,25 mL Isofluraan geplaatst op een 2 x 2 inch2 -delig van gaas. Nadat het dier bereikt een chirurgische vliegtuig van anesthesie (gecontroleerd door teen snuifje met geen terugtrekking reflex), pin het dier op een petrischaal gevuld met paraffine of silicone-elastomeer.
      Opmerking: Neonatale knaagdieren kunnen ook verdoofd worden via cryoanesthesia13,14, Isofluraan verdamping15, of injectie16 in evenwicht gebracht met zuurstof.
    2. Plaats de dierlijke ventrale zijde naar beneden en maakt een middellijn insnijding van net achter de ogen naar de mid lumbale regio van de wervelkolom met een nummer 10 of 11 scalpel blad of chirurgische scharen. Weerspiegelen van de huid en decerebrate van het dier op het niveau van de pariëtale/occipitale hechtdraad (Zie Figuur 1) en verwijder de huid transecting het dier onder het middenrif. Verwijder vervolgens de armen door te snijden op het schouder-gewricht met schaar of een scalpel.
    3. Zodra de huid is verwijderd, overbrengen in het dier een perfusie-kamer met siliconen elastomerin de bodem voor verdere dissectie en voorbereiding van de hersenstam-ruggenmerg.
    4. Een aCSF reservoir (flacon 500 mL kant-poort) continu Bubble met gekoeld (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) aCSF en zuurstof met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2 (ook wel "carbogen" genoemd). Gebruik tijdens de dissectie, gekoeld aCSF te spoelen regelmatig de zaal, het verstrekken van vers zuurstofrijk aCSF in de gehele isolatie van de hersenstam-ruggenmerg.
      Opmerking: Rode bloedcellen kan worden gezien in de resterende slagaders en aders en, wanneer voldoende zuurstof, dit zijn helder rood.
    5. Met zwaartekracht-flow perfusie via buizen en een afsluiter, met tussenpozen of continu perfuse het weefsel met zuurstofrijk aCSF (bolus volume of via traag drip met behulp van een afsluiter, ongeveer 0,5 - 1,0 mL/min). Dit oxygenates het weefsel en onderhoudt een duidelijk chirurgische veld.
    6. Verwijder de overtollige vloeistoffen zoals vacuüm zuignap filtratiesysteem nodig.
    7. Het uitvoeren van de dissectie met behulp van een Microscoop ontleden. Een continue zoom model heeft de voorkeur om fijnafstelling van vergroting en optimale visualisatie van de regio van belang tijdens elke stap van de dissectie toestaan.
      Opmerking: Microchirurgie tools aanbevolen omvatten een scala van getande weefsel pincet botte pincet, #5 pincet, schuine weefsel pincet, een aantal ontrafeling van micro schaar (voorjaar schaar), en regelmatige insect en micro-ontrafeling pinnen.
    8. Blootstellen van de hersenen via middellijn sectie van de schedel langs de Sagittaal hechtdraad dan pin omlaag de gereflecteerde kleppen met micro-ontrafeling pinnen en spelden van de wervelkolom caudal eind aan de siliconen bedekte bodem van de kamer van de dissectie met een 27 G naald.
      Opmerking: De rest van de dissectie vereist een dissectie Microscoop om de duidelijkste weergave van de weefsels en monumenten die zijn gebruikt om de maximale kans voor het verkrijgen van ritmische fictieve uitvoer op de craniale worteltjes van de hersenstam en ruggenmerg worteltjes. Voer deze stappen uit van de dissectie met middellange voorjaar schaar of iris schaar en fijne pincet.
  2. Snel overbrengen in de geïsoleerde stam van het dier een belucht dissectie kamer. Plaats de dorsale zijde van weefsel omhoog met de rostraal einde (hersenen) naar de voorkant van de kamer. PIN het weefsel aan de schouders en de meest caudal einde van het ruggenmerg.
    1. Maak een mid-Sagittaal incisie via de schedel na de pariëtale Sutuur (geologie) om te voorkomen beschadiging van de cortex en de hersenstam ten grondslag liggen aan de schedel.
      Opmerking: Neonatale botweefsel is niet volledig verkalkt en is zeer broos. Het botweefsel/zullen flexibel in een mate, maar harder dan de omliggende bindweefsel en spierweefsel.
    2. Hiermee kunt u dat middelgrote lente of iris schaar snip de occipital hechtingen van de schedel, begint bij de Sagittaal hechtdraad en lateraal werken. Dit zal leiden tot "flappen" van de schedel dat kan worden weerspiegeld en gespeld te verankeren de rostraal deel van de schedel en enige stabiliteit aan het weefsel te verstrekken (Zie Figuur 2).
    3. Na als gevolg van de kleppen van de schedel, afgesneden van de rest van de hersenschors, het verlaten van het caudal gedeelte van het cerebellum (vermis) relatief intact (Figuur 2B).
  3. Dorsal laminectomie uit te voeren.
    1. Verwijder de spieren rond de schedel en de wervelkolom met behulp van micro voorjaar schaar en pincet. Het verwijderen van weefsel langs de dorsale zijde van de ribbenkast, waardoor de ribbenkast intact, zoals dit zal later worden gespeld als anker van het weefsel tijdens de ventrale laminectomie, minimaliseren van de kans op schade aan het ruggenmerg.
    2. Zorgvuldig snip weg de zijdelingse processen van de wervel laminae met middellange voorjaar schaar of fijne iris schaar. Elk weefsel overliggende de pons en de medulla weg knippen. De vermis cerebellum, pons en begin van het ruggenmerg zullen nu duidelijk zichtbaar (Figuur 2C).
  4. Ventrale laminectomie uit te voeren.
    1. De dorsale zijde van weefsel zet en pin aan de ribbenkast en de meest caudal einde van de wervelkolom. PIN de rostraal kant van het weefsel naar beneden met behulp van de schedel kleppen (Figuur 3A).
    2. Verwijder de ventrale helft van de ribbenkast, met inbegrip van het borstbeen en alle buikorganen, met behulp van dezelfde schaar en pincet. Ontleden weg zacht weefsel gehecht aan de ribbenkast bloot van de ribben en het ruggenmerg (Figuur 3B).
    3. Verwijder de tong, slokdarm, luchtpijp, strottenhoofd, en alle andere weke delen en de basis van de schedel en de wervelkolom overliggende (zoals in afbeelding 3C) de daaraan gehechte spiermassa.
    4. Ontleden weefsel overliggende de harde pallet. Het harde verhemelte identificeren door het lokaliseren van een rechthoekige plaat van bot aan de onderkant van de schedel met een V-vorm inspringing op het (Figuur 3C). U snijdt langs de middellijn van het gehemelte zorgvuldig naar boven tillen en uitvoeren van een dwarse snede te verwijderen (Figuur 4A).
    5. Allereerst dat een ventrale laminectomie laminae bloot het ventrale oppervlak van de hersenstam en het ruggenmerg van het eerste cervicale wervel naar ongeveer thoracale wervel 7 (T7) zoals te zien in Figuur 4Bverwijderen.
    6. In dit stadium zal de ventrale worteltjes zichtbaar worden. Kleine micro-dissectie of voorjaar schaar gebruikt, zorg te snoeien zo dicht mogelijk bij de laminae en zo ver van de oorsprong van de wortels op het ruggenmerg mogelijk; Vermijd het uitrekken van de wortels.
    7. Knipsel 5-10 mm langs beide zijden van de wervelkolom op de laminae. Niet te dicht op gesneden het ruggenmerg of in de wervels. Deze stap kan verwijdering van de cervicale wervels het ruggenmerg bloot te stellen. Vermijd het snijden van de worteltjes.
    8. Snip worteltjes ongeveer 20-25 mm (bilateraal) langs de wervelkolom (ongeveer T7). Gedurende deze procedure voorkomen dat snijden in het ruggenmerg en manipuleren van de randen van de wervels zoals te zien in Figuur 4C.
    9. Verwijder C1, C2 en C3 door zorgvuldig opheffing van de rostraal rand van elk van de wervels en snipping nauw onder het bot. De dichter tot op het bot dat de snede wordt gemaakt, hoe langer het worteltje. Gebruik verslaafd of gebogen van de verlostang om te helpen bereiken van een stevige grip op elke cervicale wervel terwijl bezuinigen (Figuur 4C).
    10. Zodra de gewenste tijdsduur van het ruggenmerg is geïsoleerd en ontleed van de wervelkolom, maken een dwarse snede te verwijderen van het ruggenmerg (Figuur 5A en 5 figuurB).
  5. Verwijder de dura mater.
    Opmerking:
    het geïsoleerde hersenstam-ruggenmerg kan worden gebruikt voor de en bloc in vitro opname, zoals al eerder beschreven3,7. Met de hersenstam-ruggenmerg verwijderd uit de wervelkolom moet de dura om optimale toegang voor zuig elektroden voor het uitvoeren van opnamen uit de cut craniale en spinale rootles worden verwijderd. Bovendien, maakt verwijdering van de dura het mogelijk om netjes snijd de hersenstam en ritmisch actieve dunne plakjes voor in vitro opname te verkrijgen.
    1. Zorgvuldig rootles pin de geïsoleerde hersenstam-spinal cord weefsel dorsale zijde omhoog toegang te verlenen tot de omringende de craniale dura (Figuur 5B). Pinnen moeten worden toegepast door middel van de laterale rand van de hersenstam, rostraal van de XII worteltjes.
    2. De dura uit het dorsale oppervlak van de hersenstam te verwijderen door het opheffen van de dura met fijne pincet (#5) op de dorsale marge van de dura en snijd van laterale-naar-mediale over de lengte van de hersenstam met fijne lente schaar. Wees voorzichtig om te voorkomen dat snijden in de hersenstam zelf. Zachtjes heffen van bloedvaten van het oppervlak van de hersenstam en snijd Voorkom belemmering van het blad van de vibratome bij het segmenteren van de hersenstam.
    3. Zorgvuldig ontleden dura van de mediale en laterale aspecten van de hersenstam, zoals de craniale zenuw worteltjes de dura passeren en zijn gemakkelijk weg gescheurd wanneer de dura wordt opgeheven. Het minimaliseren van de kans op de worteltjes wordt trok door zachtjes met kleine voorjaar schaar om hen heen te snijden.
    4. Flip de hersenstam-ruggenmerg zodat de ventrale omhoog zijde en de craniale worteltjes duidelijk zichtbaar zijn. Ontleden de dura van de dorsale zijde van de hersenstam door zachtjes het opheffen van de dura direct boven het gebied postrema, snijden van rostraal naar caudal. Het gebied postrema verschijnt iets roze vanwege het grote aantal microcapillaries zoogdierlevercellen van deze regio.
    5. Gebruik een fijne insect pin tease weg elke resterende dura en verwijderen van resterende bloedvaten dicht bij craniale en cervicale worteltjes.

4. slice Protocol

  1. Na het verwijderen van de dura, plaatst u de hersenstam in het midden van het platform van de paraffine op het plastic blok (hierna te noemen het "snijden blok"). PIN het caudal einde van de hersenstam via het distale ruggenmerg met behulp van fijn insect pins die ingekort tot niet meer dan 1 cm in lengte, heb zoals weergegeven in Figuur 5C.
  2. Hiermee lijnt u het blok paraffine bedekte snijden met de vastgezette hersenstam in de vibratome blok houder zodat het mes loodrecht op de rostraal gezicht van de hersenstam snijdt.
  3. Maak een eerste segment te verwijderen van de ongelijke, vreemde weefsel op het uiteinde van de rostraal meest. Deze eerste snede kan worden 200-300 µm meestal maar zorgvuldig vermijden verwijdering van IX, X en XII craniale worteltjes. Deze stap zal meestal onthullen de caudal omvang van de facial kern (VII) en de glossopharyngeus worteltjes en maakt het mogelijk om de hersenstam uitlijnen zodat haar gezicht par-vlakke naar de blade vibratome is. Kleine aanpassingen maken als nodig is om te zorgen voor par-planariteit en maken kleine bezuinigingen op het verwijderen van weefsel dat is ongelijk.
    Opmerking: Glossopharyngeus (IX) worteltjes zal worden zichtbaar op de laterale rand van de hersenstam als een elke opeenvolgende segment snijdt, en deze een mijlpaal voor de rostro-caudal afstand tot de hersenstam neurale circuits nodig voor ritme-generatie bieden. Aan de ventrale zijde van de hersenstam, de hypoglossal worteltjes (XII) ook zichtbaar moeten zijn iets caudal aan het gesneden gezicht tonen de worteltjes IX. Een laatste mijlpaal zullen de obex (het punt in het menselijk brein waartegen de vierde ventrikel versmalt tot het centrale kanaal van het ruggenmerg) op het dorsale oppervlak van de hersenstam. Met deze drie referentiepunten zichtbaar, dat de juiste knipvlak is gevestigd (Zie Figuur 6A) en een ritmisch-actieve segment betrouwbaar zal worden verkregen.
  4. Blijven snijden rostraal-naar-caudal totdat de IX worteltjes in de buurt van het oppervlak van het gesneden gezicht van de hersenstam zijn.
  5. Zie Figuur 6 voor monumenten en correcte oriëntatie. De paraffine-plaat in de vibratome klem zodanig aanpassen dat de volgende hoek van transect zal leiden tot een zeer lichte "wig"-vorm aan de gesneden segment en plakjes van ongeveer 100-200 µm gesneden tot de bezienswaardigheden beschreven kunnen worden duidelijk gezien (Figuur 6A).
    Opmerking: Deze lichte wig snijden verhoogt het aantal XII motorische neuronen gevangen in het segment en maximaliseert de kans voor het verkrijgen van ritmische activiteit tijdens het opnemen. Met behulp van de bezienswaardigheden beschreven (rostraal worteltjes uit de nervus glossopharyngeus bundel, worteltjes uit de hypoglossal zenuw-bundel, de obex) zal ervoor zorgen dat het segment reproducibly in ieder geval een groot deel van de pBC (Figuur 6B bevat).
  6. Een 300-500 µm segment van hersenstam gesneden uit deze rostraal neuroanatomische markers te vangen de pBC en bijbehorende transmissie circuits.
    Opmerking: Een "ideale" segment bevat de meest rostraal worteltje van de bundel hypoglossal worteltje om betrouwbaar inspiratory activiteit te verkijgen zonder toevlucht te nemen tot oppervlakte opnamen met behulp van een zuignap elektrode via het ritme-genereren/verzenden loci binnen de hersenstam.

5. opname Procedures

  1. Plaatst u het segment in een opname kamer, voortdurend perfuse met aCSF (0,5 - 1,0 mL/min) en met zuignap of extracellulaire elektroden record bevolking activiteit vanuit de XII worteltjes of vanuit de pBC, XII PMNs of XII motoneurons. Voor gedetailleerde opname procedures, zie de publicaties van de vorige op de hersenstam-ruggenmerg elektrofysiologie en patch klemmen10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De methode die hier gepresenteerd kan een onderzoeker belangstellende ritmisch actieve segmenten van de hersenstam te reproducibly en betrouwbaar snijden een levensvatbare, robuuste segment zodat opname van fictieve motor output voor vele uren. Alle de minimaal noodzakelijke neurale elementen voor het genereren en verzenden inspiratory ritme kan worden vastgelegd in een dun plakje met behulp van deze methode. Tot deze elementen behoren: de preBötzinger Complex, premotor neuronen projecteren naar de hypoglossal motorische neuronen (pXII MNs) hypoglossal motorische neuronen (XII MNs) en de hypoglossal zenuw worteltjes. De pBC, XIIn en C4 zenuw worteltjes worden vaak gebruikt voor inspiratory ritme opnamen, zoals geïllustreerd in Figuur 7.

Succesvol gebruik van deze procedure zal produceren een levensvatbare en ritmisch actieve nl blok preparaat in 10-15 min, of een ritmisch-actieve segment in < 30 min. Na isolatie van de en bloc hersenstam-ruggenmerg of een dun plakje is 15 min van evenwichtsinstelling in de zaal van de opname voldoende voor de productie van fictieve motor output. In het geval van het segment, zal verhogen de extracellulaire [K +] tot ongeveer 8-9 mM produceren robuuste neurale station dat voor 24 tot 36 h in dit laboratorium van ervaring duren kan. De voorbereiding moet voortdurend superfused met carbogenated (95% O2/5% CO2) en verwarmde aCSF (~ 27 ° C). Succesvolle dissecties snel worden uitgevoerd en Vermijd knijpen, uitrekken of beschadiging van de zenuw worteltjes gebruikt voor opnamen. Voor een optimaal resultaat alle stappen in de procedure snel worden uitgevoerd en het weefsel moet worden gebaad of voortdurend geperfundeerd met carbogenated aCSF bij het uitvoeren van de dissectie en weefsel isolatie (zoals hierboven beschreven). Zie voor uitgebreide informatie over de neuroanatomie en precieze atlassen van de hersenstam, het werk van Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 en collega's. Het protocol hier gepresenteerd is een methode die heeft bewezen betrouwbaar in de senior auteur laboratorium en dit verslag biedt een grafische, stapsgewijze methode voor het genereren van deze segmenten te vertrouwen alleen op oppervlakte bezienswaardigheden zichtbaar op de hersenstam of binnen de hersenstam als gedetailleerde hier.

Figure 1
Figuur 1 : Eerste dissectie voor de extractie van de hersenstam-ruggenmerg. (A) Anesthetized pup gespeld voor dissectie. Stippellijnen incisie richtsnoeren voor Sagittaal incisie in de huid en dwarse snijdt caudal voor de ogen en onder het middenrif. (B) gids voor het verwijderen van de huid en voorpoten van dier. (C) dorsale aspect gevilde knaagdier. Stippellijnen incisie richtlijnen voor schedel-flap "clamshell" blootstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Stadia van de dorsale laminectomie. (A) als stippellijnen incisie richtsnoeren voor het verwijderen van de hersenen. (B) resultaat na het verwijderen van weefsel. Stippellijnen incisie richtsnoeren voor dorsale laminectomie. (C) Exposed hersenstam-spinal cord na dorsale laminectomie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Stadia van eerste ventrale dissectie. (A) ventrale zijde van een gevild knaagdier met afgehakte reukkolf en buik. Stippellijnen incisie richtsnoeren voor het verwijderen van de xyphoid proces en de ribbenkast vervolgens Schakel abdominale en thoracale holte organen te openen. (B) abdominale en thoracale holte organen verwijderd. (C) orofaryngeale structuren verwijderd. Stippellijnen incisie richtsnoeren voor het verwijderen van het harde verhemelte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Stadia van de ventrale laminectomie. (A) harde verhemelte en de resterende delen van de schedel verwijderd. Insnijding richtsnoeren aangeven hoe te verwijderen van de resterende weefsel rondom de hersenstam-ruggenmerg. (B) eerste cervicale wervel (C1) blootgesteld. (C) demonstratie op opheffing van de C1 en het maken van een dwarse snede aan de Vertebrale lichaam te verwijderen. Zenuwen zijn zorgvuldig gesneden flush aan de dorsale zijde van het Vertebrale lichaam voordat u deze verwijdert. Dit is de meest kritische stap in de dissectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 5
Figuur 5 : Voorbereiding van hersenstam-ruggenmerg snijden. (A) C1-C3 verwijderd uit het ruggenmerg. Insnijding richtsnoeren geven aan waar te verbreken van de hersenstam-ruggenmerg van het caudal ruggenmerg. (B) ventrale zijde van de hersenstam-ruggenmerg met gelabelde zenuw worteltjes. Insnijding richtsnoeren aangeven aanbevolen transect of resterende rostraal structuren op de ponto-Wallenberg voordat u gaat opnemen uit de hersenstam-ruggenmerg regio. (C) paraffine slab setup voor het snijden op de vibratome. De segmenteringshulplijnen regio omvat weefsel tussen hersenzenuwen IX en XII. Zet geen micro-pins in de segmenteringshulplijnen regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 6
Figuur 6 : Bezienswaardigheden gebruikt voor het verkrijgen van segmenten met een intact hypoglossal motor nucleus en PreBötzinger Complex. (A) dwarse weergave van de hersenstam-ruggenmerg na eerste snede rostraal van de worteltjes glossopharyngeus (IX) is geboekt. Insnijding richtsnoer geeft transect niveau net caudal aan de hypoglossal (XII) worteltjes. (B) oriëntatie van paraffine blok naar blade voordat een plak met pBC en de hypoglossal motor kern af te snijden. Maakt een trapeziumvormig "wig" vorm knippen maximaliseert de waarschijnlijkheid van het vastleggen van genoeg inspiratory neuronen in het segment voor ritmische activiteit tijdens het opnemen. De wig omvatten pBC, de hypoglossal premotor neuronen, en de hypoglossal motorische neuronen, die gezamenlijk de nodige circuits bieden voor het verzenden van ritmische drive, die een index van de respiratoire rhythmogenesis is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Representatief opnames uit nl blok of segment preparaten. (A) geïntegreerde trace van XII worteltje. (B) geïntegreerde trace van de pBC. Opnemen vanaf de pBC vergt met behulp van een nl blok voorbereiding een blinde patch klem. (C) geïntegreerde trace van de C4 zenuw worteltje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aanpassing van het protocol hier gepresenteerd in een blok nl of segment werkstroom is gunstig voor laboratoria en studies die wil gebruik maken van beide en bloc hersenstam-ruggenmerg en/of dun schijfje preparaten voor electrofysiologie opnamen. De dissectie en segment methode gepresenteerd, gecombineerd met de methoden die eerder door anderen gemeld17,18,19, reproduceerbare voorbereiding van robuust en levensvatbare weefsel dat is wijd aan te passen aan een reeks zal toestaan experimenten met de knaagdier hindbrain of ruggenmerg. De dissectie gepresenteerd is zeer gedetailleerd en omvat dorsale en ventrale laminectomie, evenals uitgebreide informatie met betrekking tot de oriëntatie van de hersenstam-ruggenmerg bij de voorbereiding van te snijden segmenten. De gedetailleerde dissectie en segment protocol gepresenteerd kunnen de onderzoeker te nemen van alle circuits die nodig zijn voor de opwekking en de transmissie van inspiratory ritme. De belangrijkste neurale populaties/structuren die kunnen worden vastgelegd met behulp van deze methode zijn: de hypoglossal premotor neuronen, de hypoglossal motor kern en de complexe preBötzinger. Opmerking dat de gebieden van de hersenstam die bevatten van centrale CO2 sensoren of expiratoire ritme genererende schakelingen (RTN/pFRG) niet in de voorbereiding opgenomen worden gedetailleerde hier20,21. Zodra de nl blok bereiding of segment heeft verkregen, kan ritmische activiteit worden verkregen met behulp van zuiging elektroden, oppervlakte elektrodes of eencellige opname methoden zoals extracellulaire eenheid of patch-klemmen methoden3,10 ,11.

Het doel van dit protocol is bedoeld als een duidelijke, gemakkelijk-aan-volg methode voor het genereren van een hersenstam-ruggenmerg preparaat of een dunne, ritmisch-actieve segment. Dit protocol moet waardevol voor zowel nieuwe als ervaren onderzoekers ook geïnteresseerd in de integratie van de ritmische hersenstam/slice preparaten in hun arsenaal, aangezien er verschillende kritische stappen gedetailleerde procedures die vangst van vergemakkelijken robuuste, reproduceerbare en langdurige ritmisch actieve segmenten.

Zodra de onderzoeker is geworden comfortabel met identificatie van de anatomische bezienswaardigheden en de vaardigheden die nodig zijn voor de dissectie, de snelheid van de dissectie zal toenemen, en de procedures kunnen worden geoptimaliseerd voor elke individuele onderzoeker. Het protocol hier gedetailleerde werd onderwezen aan de senior auteur (CGW) tijdens zijn postdoc-werk met Jeffrey Smith, de opdrachtgever van de ritmische hersenstam segment voorbereiding3. Om ervoor te zorgen ritmische activiteit en levensvatbaarheid in zowel de segmenten en nl blok preparaten, moeten alle procedures voor het genereren van een segment worden afgewerkt binnen ongeveer 30 min vanaf begin van de procedure aan een segment in de zaal van de opname. Met continue perfusie, er is zeer weinig invloed op de levensvatbaarheid van het weefsel, maar het minimaliseren van de tijd voor dissectie zorgt voor een langere opname en data-acquisitie. Voor respiratoire studies, een segment dat is zo dun als ongeveer 280 µm dik3 ritmische, robuuste inspiratory activiteit zal hebben, maar segmenten kunnen variëren tot 550 µm17,18,19,22. Zorgvuldige praktijk is nodig voor het ontwikkelen van de nodige vaardigheden om het uitvoeren van deze procedure en minimaliseren van de variabiliteit in de dikte en de rostraal-caudal positie van elk segment. Inclusief of exclusief bepaalde cel bevolking zal invloed hebben op de kwaliteit en de degelijkheid van ritmische activiteit verkregen in later opnemen als zowel excitatory als remmende kernen in de hersenstam invloed op de "kwaliteit" van het ritme van het segment opgenomen hebben kunnen 3.

Tot slot is het ook cruciaal dat aCSF precies volgens protocol is bereid, en is op een gestandaardiseerde pH20, temperatuur en oxygenatie niveau. Zuurstofvrije preparaten niet zal ritmisch actieve en data collectie21zal beïnvloeden.

Er zijn verscheidene belangrijke stappen in de procedure die de opname van een onderzoeker van levensvatbare en ritmisch actieve preparaten te vergemakkelijken. Tijdens de ventrale laminectomie, intact houden van de dorsale ribbenkast kunt extra hefboomeffect en biedt meer weefsel voor de beveiliging van de voorbereiding tijdens het uitvoeren van de relatief fijne isolatie van de hersenstam-ruggenmerg van de wervelkolom. De stappen hier gedetailleerde toestaan de detective om gemakkelijk producten nl blok preparaten of dunne plakjes zodat, door noodzaak, zijn extra stappen die gedetailleerde dissectie kan worden weggelaten om gewoon een dun plakje. Andere nuttige tips opnemen, terwijl het uitvoeren van de ventrale laminectomie, is het belangrijk om te krijgen een stevige grip op de Vertebrale lichaam op te heffen het omhoog terwijl het versnijden van de zenuw worteltjes. Zodra de hersenstam-ruggenmerg is ontleed en geëxtraheerd, moeten de dura mater en overige therapieën worden ontleed off van het oppervlak van het zenuwweefsel. Bloedvaten en dura zijn stoer en kunnen voorkomen dat het mes vibratome snijden een schone segment. Dissectie van de dura is niet essentieel voor de voorbereiding van de blok nl, maar wordt aanbevolen voor het optimaliseren van zenuw-zuig elektrode koppeling. Ten slotte, zorgvuldige en systematische praktijk in het gebruik van de vibratome is noodzakelijk voor een schone, reproduceerbare plak af te snijden. Dit protocol biedt een zeer uitgebreide lijst met gedetailleerde stappen voor de dissectie en snijden procedures. De nadruk ligt hier is bedoeld als een stapsgewijze gedetailleerde lijst voor een onderzoeker te gebruiken als een betrouwbare Stichting en trainingsinstrument waaruit ze kunnen hun laboratory's procedures naar wens aanpassen.

Als een geheel vertegenwoordigt deze methodologie een dertig jaar evolutie van methoden van in vitro electrofysiologie. Het toepassingsgebied van dit document focust op de standaardisatie van en bloc en snijd hersenstam-ruggenmerg opnames die doorgaans gebruikt worden voor het bestuderen van inspiratory activiteit in P0-P5 ratten en muizen22. Echter kan dit dissectie-proces worden gebruikt in een heel scala van dierlijke maten, leeftijden en soorten voor een breed scala van studies, met inbegrip van de E18 ratten/muizen, neonatale ratten en muizen (postnatale dagen 0 tot en met 6) en volwassen muizen. Toekomstige studies kunnen het gebruik van de methoden die voorgesteld om te stroomlijnen van protocollen over de soorten en leeftijden, waardoor studies te ondervragen mechanismen in ritme generatie of andere fysiologisch proces over zowel soorten en leeftijden. Uiteindelijk, wijzigen van de afdrukstand, de dikte of de locatie van het segment of en bloc voorbereiding beïnvloedt ritmische activiteit23. Uitgebreide literatuur is gepubliceerd in het verleden door segment procedures betreffende de neurale populaties gevangen en er zijn stereotaxic rat en muis atlassen beschikbaar om meer detail over de neurale circuits besproken hier24, 25,26. De hier gepresenteerde procedures bieden uitgebreide informatie met duidelijke illustraties, waarmee een nieuwe detective te leren knippen ritmische segmenten van bezienswaardigheden gemakkelijk zichtbaar onder een laboratorium ontrafeling van de werkingssfeer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

S.B.P is een ontvanger van een Loma Linda University zomer Undergraduate Research Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
  2. Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
  3. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
  4. Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
  5. Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
  6. Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
  7. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
  8. Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
  9. Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
  10. Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. e53071 (2015).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  12. Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
  13. Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
  14. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
  15. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
  16. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
  17. Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
  18. Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
  19. Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
  20. Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
  21. Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
  22. Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
  23. Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
  24. Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
  25. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, Inc. (1997).
  26. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, Inc. (2008).
Voorbereiding van ritmisch-actief In Vitro neonatale knaagdier hersenstam-ruggenmerg en dun plakje
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).More

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter