Summary

Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

Published: March 23, 2019
doi:

Summary

Ce protocole tant visuellement communique la préparation du tronc cérébral-moelle épinière et clarifie la préparation des tranches transversale du tronc cérébral d’une façon complète étape par étape. Il a été conçu pour accroître la reproductibilité et la probabilité d’obtenir des tranches viables, durables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de sortie neuronale des régions respiratoires du tronc cérébral.

Abstract

Mammifères rythme inspiratoire est généré à partir un réseau de neurones dans une région du bulbe rachidien appelé la preBötzinger complexe (pBC), produisant un signal conduisant à la contraction rythmique des muscles inspiratoires. Activité neuronale rythmique générée en pBC et transportés aux autres piscines neuronales au lecteur que la musculature de la respiration peut être étudiée en utilisant diverses approches, y compris en bloc nerf enregistrements et tranche transversale. Cependant, méthodes publiées antérieurement n’ont pas largement décrit le processus de dissection du tronc cérébral-moelle épinière de manière transparente et reproductible pour de futures études. Nous présentons ici une vue d’ensemble d’une méthode permettant de façon reproductible couper en tranches de tronc cérébral rythmiquement actifs contenant le circuit neuronal nécessaire et suffisant pour la production et de transmission entraînement inspiratoire. Ce travail s’appuie sur les précédents protocoles d’électrophysiologie de tronc cérébral-moelle épinière pour accroître la probabilité d’obtention fiable des tranches viables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de la sortie neuronale de la pBC, neurones prémoteur hypoglosse (XII pMN), et motoneurones hypoglosse (XII MN). Le travail présenté élargit les précédentes méthodes publiées en fournissant des illustrations détaillées, étape par étapes de la dissection, de chiot tout rat, à in vitro de tranches contenant les radicelles XII.

Introduction

Le réseau de neurones respiratoire du tronc cérébral fournit un domaine fertile pour comprendre les caractéristiques générales des réseaux de neurones rythmiques. En particulier, l’intérêt est dans le développement de rongeurs nouveau-nés respirer et comprendre comment le rythme de la respiration se développe. Cela peut être fait en utilisant une approche à plusieurs niveaux, y compris en pléthysmographie animaux vivo, in vitro en bloc les enregistrements de nerf et in vitro couper les enregistrements qui contiennent le générateur de rythme de respiration. Réductionniste in vitro en bloc et tranche enregistrements constituent une méthode avantageuse à utiliser pour interroger les mécanismes derrière rythmogenèse respiratoire et des circuits neuronaux dans la région du tronc cérébral-moelle épinière, de développer des rongeurs. Le développement du système respiratoire comprend environ 40 types de cellules, caractérisés par le modèle, y compris ceux du centre respiratoire1,2de tir. Le réseau respiratoire central comprend un groupe de neurones rythmiquement actives située dans la medulla ventrolatérale rostrale1,3. Rythmogenèse respiratoire chez les mammifères est généré depuis une autorhythmic interneurone réseau baptisé le preBötzinger complexe (pBC), qui a été localisée expérimentalement par tranche tant en préparations de bloc de mammifères néonatale tronc cérébral-moelle cordons3,4,5,6,7,8. Cette région joue un rôle semblable au nœud sino-auriculaire (SA) dans le coeur et génère un système de chronométrage inspiratoire à la respiration en voiture. De la pBC, le rythme inspiratoire se fait dans d’autres régions du tronc cérébral (y compris le noyau moteur Hypoglosse) et spinal bassins de moteur (tels que les motoneurones phréniques qui animent le diaphragme)9.

L’activité rythmique peut-être être obtenue à l’aide de préparations de tronc cérébral la moelle épinière en bloc ou tranches de différentes populations de cellules, y compris les radicelles nerveuses de C3-C5, radicelles de nerf XII, noyau moteur hypoglosse (XII MN), les neurones prémoteur hypoglosse (XII pMN), et le pBC3,10,11,12. Bien que ces méthodes de collecte de données ont réussi, à travers une poignée de laboratoires, bon nombre des protocoles ne sont pas présentés d’une manière qui est parfaitement reproductible pour les nouveaux chercheurs entrant dans le champ. Obtention viable et rythmiquement actif en bloc et tranche préparations nécessite une attention aiguë aux détails à travers toutes les étapes de la dissection et la tranche coupe protocole. Précédents protocoles largement décrivent les diverses procédures d’enregistrement et électrophysiologie, mais manque de détail dans la partie la plus critique de l’obtention d’une préparation de tissu viable : effectuez la procédure de dissection et de la tranche du tronc cérébral-moelle épinière.

Efficacement obtention d’une préparation de bloc ou tranche rythmiquement active et viable en enregistrements d’électrophysiologie du tronc cérébral-moelle épinière exige que toutes les étapes correctement, soigneusement et rapidement (en général, l’ensemble de la procédure liée ici peut être effectué en environ 30 min). Des points critiques du protocole électrophysiologie du tronc cérébral-moelle épinière qui n’ont pas été préalablement bien décrites comprennent la dissection des radicelles nerveuses et la procédure de découpage en tranches sur le vibratome. Ce protocole est le premier à stepwise communiquer visuellement la dissection du tronc cérébral-moelle épinière pour les nouveaux chercheurs et experts en la matière. Ce protocole explique aussi bien les techniques chirurgicales, monuments et autres procédures afin d’aider les futurs chercheurs en normalisant les tranches et en bloc les préparations pour contenir les circuits exact désiré dans chaque expérience. Les procédures présentées ici peuvent être utilisés chez les chiots nouveau-nés rat et souris.

Protocol

Le protocole suivant a été accepté et approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Loma Linda. Lignes directrices des NIH pour le traitement éthique des animaux sont respectées dans toutes les expériences animales réalisées au laboratoire. Toutes les normes éthiques ont été accueillis par des individus effectuant ce protocole. 1. les solutions Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF). <ol…

Representative Results

La méthode présentée ici permet un chercheur intéressé à obtenir des tranches rythmiquement actives du tronc cérébral de façon reproductible et fiable couper une tranche viable et solide qui permettra d’enregistrer la production automobile fictive pendant plusieurs heures. Tous les éléments de circuits neuronaux au minimum nécessaire pour la production et de transmission rythme inspiratoire peuvent être capturées dans une fine tranche à l’aide de cette méthode. Ces él…

Discussion

Adapter le protocole présenté ici dans un bloc fr ou tranche workflow est avantageuse pour les laboratoires et études qui tient à utiliser soit en bloc du tronc cérébral-moelle épinière et/ou mince tranche de préparations pour des enregistrements de l’électrophysiologie. La méthode de dissection et tranche présenté, combinée à méthodes précédemment signalées par d’autres17,18,19, permettra la préparation …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.B.P est récipiendaire d’une bourse de recherche de Loma Linda University Summer Undergraduate.

Materials

NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

References

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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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