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Neuroscience

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

doi: 10.3791/58870 Published: March 23, 2019

Summary

이 프로토콜 모두 시각적으로 통신 brainstem 척수 준비 하 고 포괄적인 단계별 방식 brainstem 가로 조각의 준비를 명확히. 그것은 재현성을 증가 하 고 brainstem의 호흡 영역에서 신경 출력 기록 가능한, 오래 지속, 컬 활성 분할 영역 취득의 가능성을 강화 하도록 설계 되었습니다.

Abstract

포유류 inspiratory 리듬의 모 수는 preBötzinger를 복잡 한 전화 (pBC), 운전 inspiratory 근육의 리듬 수축 신호를 생성 하는 영역에 신경 네트워크에서 생성 됩니다. 리듬 신경 활동 pBC에서 생성 하 고 호흡의 근육 신경 녹음 및 가로 분할 녹음 일괄적 포함 하 여 다양 한 방법을 사용 하 여 공부 될 수 드라이브에 다른 신경 풀에. 그러나, 이전에 게시 방법을 설명 되지 않은 광범위 하 게 brainstem 척수 해 부 과정 미래 연구에 대 한 투명 하 고 재현 가능한 방식. 여기, 우리 사용 reproducibly 리듬-액티브 brainstem 조각을 생성 하 고 전송 inspiratory 드라이브에 대 한 필요 하 고 충분 한 신경 회로 포함 하는 방법의 포괄적인 개요를 제시. 이 작품은 pBC, hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 신경의 출력을 기록에 대 한 실용적이 고 컬 활성 분할 영역을 안정적으로 얻기의 가능성을 향상 시키기 위해 이전 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜 구축 및 hypoglossal 모터 신경 (XII 미네소타)입니다. 제시 하는 작품 XII rootlets를 포함 하는 생체 외에서 슬라이스를 전체 쥐 강아지에서 해 부의 상세한, 단계별로 그림을 제공 하 여 이전 게시 된 방법에 따라 확장 합니다.

Introduction

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Brainstem의 호흡 신경망 리듬 신경 네트워크의 일반적인 특성을 이해 하기 위한 비옥한 도메인을 제공 합니다. 특히, 관심 신생아 설치류 호흡 및 호흡 리듬을 개발 하는 방법을 이해의 개발 이다. 이 비보 전체 동물 plethysmography, 체 외에서 일괄적 신경 녹음, 포함 한 다단계 접근 방식을 사용 하 고 생체 외에서 수 있습니다 호흡 리듬 생성기를 포함 하는 녹음을 슬라이스. 시험관 en 블록 및 슬라이스 녹음에서 reductionist 호흡기 rhythmogenesis 및 설치류 개발의 brainstem 척수 영역에서 신경 회로 뒤에 메커니즘을 심문 할 때 사용 하는 유리한 방법입니다. 개발 호흡기 약 40 세포 유형을, 패턴, 중앙 호흡기1,2의 포함을 발사 하 여 특징을 포함 한다. 중앙 호흡기 네트워크 rostral ventrolateral 모1,3에 위치한 컬 활성 뉴런의 그룹을 포함 합니다. 포유류의 호흡기 rhythmogenesis 생성 되는 autorhythmic에서 interneuron 네트워크 불리는 복잡 한 preBötzinger (pBC), 되었습니다 통해 실험적으로 지역화 신생아 포유류의 조각 및 en 블록 준비 brainstem 척추 코드3,,45,6,,78. 이 지역에에서 동방 마디 (SA)에 비슷한 기능을 제공 하 고 드라이브 호흡을 inspiratory 타이밍 시스템을 생성 합니다. PBC에서 inspiratory 리듬 brainstem (hypoglossal 모터 핵 포함) 및 척추 모터 풀 (예: 격 막 드라이브 인할지 모터 뉴런)9의 다른 지역에 수행 됩니다.

리듬 활동 brainstem 척수 en 블록 준비 또는 다양 한 c 3-c 5 신경 rootlets, XII 신경 rootlets를 포함 하는 세포 인구에서에서 분할 영역을 사용 하 여 얻을 수 있습니다 hypoglossal 모터 핵 (만 12 세), hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 그리고 pBC3,10,,1112. 데이터 수집의 이러한 방법은 실험실의 소수에 걸쳐 성공 했습니다, 여러 프로토콜 하지 새로운 연구 분야를 입력에 대 한 완벽 하 게 재현할 수 있는 방식으로 표시 됩니다. 취득 가능한 컬 활성 en 블록 슬라이스 준비는 해 부와 슬라이스 절단 프로토콜의 모든 단계를 통해 세부 사항에 급성 주의가 필요 합니다. 이전 프로토콜 광범위 하 게 설명 하는 다양 한 기록 절차와 전기 생리학, 아직 실행 가능한 조직 준비의 가장 중요 한 부분에 세부 부족: brainstem 척수 해 부 및 조각 절차를 수행.

제대로, 신중 하 게, 그리고 신속 하 게 모든 단계를 수행 수 해야 효율적으로 얻기 컬 활성 및 가능한 en 블록 또는 슬라이스 준비 brainstem 척수 전기 생리학 기록 (일반적으로, 전체 절차 관련 여기 있을 수 있습니다 약 30 분에서 수행). 있다 하지 이전 잘 설명 하는 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜의 중요 한 포인트 포함 신경 rootlets 및 조각화 절차는 vibratome에의 해 부. 이 프로토콜 stepwise 첫 번째는 새로운 연구와 분야에서 전문가 위한 brainstem 척수 해 부에 시각적으로 의사 소통입니다. 이 프로토콜도 철저 하 게 외과 기술, 랜드마크, 및 조각 및 각 실험에서 원하는 정확한 회로 포함 하는 준비 일괄적 표준화에 미래 연구자를 지원 하기 위해 다른 절차를 설명 합니다. 쥐와 쥐 신생아 강아지에 여기에 제시 된 절차를 사용할 수 있습니다.

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Protocol

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다음 프로토콜 허용 되어 있으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) Loma Linda 대학에 의해 승인. 동물의 윤리적인 처리를 위한 NIH 가이드라인은 실험실에서 수행 하는 모든 동물 실험에서 따 랐 다. 모든 윤리는이 프로토콜을 수행 하는 개인에 의해 확정 했다.

1입니다. 솔루션

  1. 인공 뇌 척추 액체 (실제)을 준비 합니다.
    1. 신선한 실제 1 L 일괄 처리는 다음을 사용 하 여 실험 하기 전에 저녁 준비 제조 법: 7.250 g NaCl (124 m m), 0.224 g KCl (3mm) 2.100 g NaHCO3 (25 m m), 0.069 g NaH24 • H2O (0.5 m m), 0.247 g MgSO4 • 7 H2 O (1.0 m m), 그리고 5.410 g D-포도 당 (30mm) 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1.5 m m). 항상 마지막 CaCl2 • 2 H2O를 추가 합니다.
    2. 이온을 제거 된 물 1 L에 구성 요소를 분해. 20-30 분 저 어.
    3. 실제의 pH를 측정 하 고 7.40 ± 0.02로 조정 작은 볼륨을 사용 하 여 (일반적으로 < 0.5 mL) 희석 NaOH, KOH, 또는 HCl의.
      참고: 준비 된 실제 냉장고 (4 ° C, pH 7.40 ± 0.02)에 3 일 전에 세균 성장에 영향을 미치는 실험 동안 조직의 생존을 저장할 수 있습니다. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 이후 실험 36 h까지 지속 될 수 있다 균 류 또는 박테리아는 실험실에 의해 오염 줄이기 위해. 효율성을 위해 설명 실제 제조 법 4 L 배치 다음과 같은 프로토콜 조절 수 있습니다 그리고이 볼륨의 실험까지 3 일 동안 지속 됩니다.

2입니다. 해 부 및 Vibratome 장비 준비

  1. 블레이드를 설정 합니다.
    1. vibratome에 절단 조직에 대 한 신선한 양 날 면도날을 사용 합니다. 100% 에탄올과 블레이드를 세척 하 고 절단 또는 반 블레이드 스냅 및 장착 블레이드 삽입 클램프는 vibratome에 전에 이온된 물으로 린스.
    2. 때마다 새로운 조직 준비 부 러 뜨 리 vibratome에 장착 하거나 자르는 동안 파라핀 석판으로 인하 하는 경우 블레이드를 변경 합니다. 파라핀 잔여물은 신생아 신경 조직을 통해 깔끔하게 잘라 거의 불가능 하 게 됩니다.
  2. 파라핀 왁 스 슬 래 브를 설정 합니다.
    1. 어떤 포함 스타일 파라핀 왁 스를 사용 합니다. 열에 강한 유리 비 커에 미디어를 포함의 10 g을 배치 하 고 낮은 열을 사용 하 여 녹아 액체 파라핀 왁 스 구슬.
    2. 흑연 분말의 약 0.5 g을 추가 하 고 액체 파라핀으로 솔루션을 철저 하 게 하 고 균일 하 게 혼합.
    3. 기판으로는 파라핀에 대 한 작은 플라스틱 슬 래 브를 사용 합니다. 플라스틱의 작은 (0.5-1 ㎝ 두께 약 2 cm2 넓은 x 2) 조각을 삭감 (폴 리카 보 네이트 또는 알루미늄도 사용할 수 있습니다). 기계공의 파일 스크래치 홈을를 사용 하 여 플라스틱 asthis에서 파라핀 플라스틱에 준수 보장에.
      참고: 또는 온수 18 G 피하 주사 바늘을 사용 하 여 파라핀 흑연 혼합물은 플라스틱에 부합 되도록 시트에 각된 구멍을 배치.
    4. 목화 제보 주걱의 뒷면을 사용 하 여 반복적으로 녹은 파라핀-흑연 혼합물으로 주걱을 찍기, 떨어지는 플라스틱 블록에 슬러리 및 건물에 파라핀 흑연 플라스틱에 파라핀 흑연 혼합물을 똑 플라스틱 위에 두께 약 1.5 c m.
    5. 파라핀-흑연 혼합의 충분히 두꺼운 층 블록에 입금 됩니다, 일단 냉각 하 고 다음 brainstem 척수에 맞게 모양 블록 옆으로 설정 합니다.

3. 해 부의 및 절연은 Neuraxis

  1. 초기 해 부 및 anesthetization을 수행 합니다.
    참고:
    이 연구에 사용 된 동물 데 생 후 10-20, 쥐 또는 쥐 E18에서 출생 후 일에 이르기까지 배아 하루 18 (E18)에서 크기에서 범위 수 있습니다 5/6. 쥐 또는 쥐 긴장, 치료, 또는 성별 사용할 수 있습니다, 실험적인 디자인에 따라. Isoflurane (25 mL 챔버에 0.25 mL) 사용은 마 취와 증기 두건 아래 예비 해 부를 수행 합니다.
    1. 강아지의 무게를 다음 isoflurane에 거 즈의 2 인치2 조각 x 2의 0.25 mL를 포함 하는 마 취 약 실에 넣습니다. 동물 (아니 철수 반사와 발가락 핀치에 의해 확인) 마 취의 수술 평면에 도달 하면, 핀 페 트리 접시에 동물 파라핀 또는 실리콘 탄성으로 가득 합니다.
      참고: Cryoanesthesia13,14, isoflurane 증발15를 통해 또한 신생아 설치류를 취 수 또는 주입16 평형 산소.
    2. 동물 복 부 측을 아래로 두십시오 고 중간 절 개를에서 바로 눈 뒤에 중간 요 추 지역에 척추의 숫자 10 또는 11 메스 블레이드 또는 수술가 위. 피부를 반영 하 고 정수 리/후 두 봉합의 수준에서 동물 decerebrate ( 그림 1참조) 하 고 횡 경 막 아래 동물 transecting 피부를 제거. 그런 다음가 위 또는 메스 어깨 관절에서 절단 하 여 무기를 제거 합니다.
    3. 일단 피부 제거, 동물 실리콘 elastomerin 추가 해 부 및 brainstem 척수의 준비에 대 한 아래쪽으로 관류 챔버에 전송.
    4. 냉장 (4 ° c, pH 7.40 ± 0.02) 실제 저수지 (500 mL 사이드 포트 병)을 지속적으로 거품 실제 95% O2 , 5% CO2 ("carbogen" 라고도 함)의 혼합물으로 산화 하는 고. 해 부, 동안 냉장된 실제 사용 하 여 주기적으로 플러시 brainstem 척수의 격리를 통해 신선한 산소 실제를 제공 하는 챔버.
      참고: 적혈구는 나머지 동맥과 정 맥에서 볼 수 있습니다 그리고 때 충분히 산소, 이들은 밝은 빨강.
    5. 하 중력 흐름 관류를 통해 튜브와는 자 지를 일시적으로 사용 하거나 지속적으로 산소 실제 (bolus 볼륨 또는 통해 느린 똑은 자 지, 약 0.5-1.0 mL/min를 사용 하 여)와 조직 perfuse. 이 조직 산화 제 고 분명 수술 필드를 유지 합니다.
    6. 진공 흡입 여과 시스템에서 필요에 따라 과잉 체액을 제거 합니다.
    7. 절 개 해 현미경을 사용 하 여 수행 합니다. 지속적인 확대 모델 확대의 정밀한 조정을 허용 하는 해 부의 각 단계 동안 관심 영역의 최적의 시각화 선호 된다.
      참고: 미세 도구 권장 이빨된 조직 집게, 무뚝뚝한 겸 자, #5 집게, 각된 티슈 포 셉, 범위를 포함 한 다양 한 마이크로 해 부가 위 (봄이 위), 그리고 일반 곤충과 마이크로 해 부 핀.
    8. 따라 화살 봉합 두개골의 중간 라인 섹션을 통해 뇌를 노출 그리고 마이크로 해 부 핀 반사 플랩 아래 핀 27 G를 사용 하 여 해 부 챔버의 실리콘 커버 하단에 꼬리 끝에 척추를 고정 바늘입니다.
      참고: 해 부의 나머지는 해 부 현미경을 조직 및 brainstem의 두개골 rootlets 및 척추 rootlets 리듬 움직이다 출력을 얻기의 최대 가능성을 보장 하는 데 사용 하는 건축물의 깨끗 한 보기를 제공 하기 위해 필요 합니다. 매체 봄이 위 또는 아이리스가 위 및 미세 집게를 사용 하 여 해 부의 다음이 단계를 수행 합니다.
  2. 동물의 고립 된 트렁크 화난된 해 부 챔버를 신속 하 게 전송. 상공 회의소의 전면에 직면 하 고 rostral 끝 (뇌)와 조직 등 사이드를 놓습니다. 핀 어깨와 척수의 대부분 꼬리 끝에 조직.
    1. 외피와 brainstem 밑에 두개골의 손상을 방지 하려면 정수 리 봉합 다음 두개골을 통해 절 개를 중간에 화살을 확인 합니다.
      참고: 신생아 뼈 조직 이다 하지 완전히 석 회화 이며 매우 취 성. 뼈/조직 정도, 유연 하지만 주변 결합 조직과 근육 보다 강하다는 것입니다.
    2. 매체 봄 또는 홍 채가 위를 사용 하 여 화살 봉합에서 시작 하 고 노력 하 고 옆으로 두개골의 후 두 봉합을 싹 둑. 이 두개골을 반영 하 고 두개골의 rostral 부분을 고정 하 고 조직에 몇 가지 안정성을 제공 하는 고정 된 수의 "날개"를 만들 것입니다 ( 그림 2A참조).
    3. 대뇌 피 질의 나머지를 잘라 두개골 플랩 반영 후 소 뇌 (vermis) 상대적으로 그대로의 꼬리 부분 (그림 2B) 떠난다.
  3. 등 쪽 laminectomy를 수행 합니다.
    1. 두개골 및 척추 열 마이크로 봄이 위와 집게를 사용 하 여 근육을 제거 합니다. 그대로 흉 곽, 복 부 laminectomy, 척수 손상의 기회를 최소화 하는 동안 조직 앵커 나중 고정 됩니다이 흉 곽의 등 쪽 측에 따라서 조직을 제거 합니다.
    2. 신중 하 게 중간 봄이 위 또는 정밀한 아이리스가 위를 사용 하 여 척추 하기의 측면 프로세스를 떨어져 싹 둑. 멀리 어떤 조직 overlying 폰 스 및 모 수 컷. Vermis, 소 뇌, 폰 스, 및 척수의 시작은 지금 명확 하 게 보이는 (그림 2C) 됩니다 합니다.
  4. 복 부 laminectomy를 수행 합니다.
    1. 조직 등 쪽을 거절 하 고 흉 곽과 척추의 가장 꼬리 끝에 핀. 두개골 플랩 (그림 3A)를 사용 하 여 조직의 rostral 측을 고정 합니다.
    2. 흉 곽, 흉 골 및 동일한가 위와 집게를 사용 하 여 모든 복 부 장기 등의 복 부 절반을 제거 합니다. 흉 곽 갈비와 척수 (그림 3B) 노출에 연결 된 멀리 부드러운 조직 해 부.
    3. 혀, 식도, 기관지, 후 두, 그리고 모든 다른 부드러운 조직 및 근육 (로 그림 3C에서 본) 두개골 및 척추의 기지를 overlying 제거 합니다.
    4. 하드 팔레트 overlying 조직 해 부. (그림 3C)에 V 모양의 들여쓰기와 두개골의 기지에 뼈의 사각형 접시를 찾아서 하드 미각을 확인 합니다. 미각의 중간 선 따라, 조심 스럽게 위쪽으로 리프트 잘라내어 제거 합니다(그림 4)를잘라 가로 수행.
    5. 그림 4B에서 보듯이 약 흉부 척추 7 (T7)을 첫 번째 자 궁 경부 척추에서 brainstem 그리고 척수의 복 부 표면 노출 하기를 제거 하 여 복 부 laminectomy를 시작 합니다.
    6. 이 단계에서 복 부 rootlets 표시 됩니다. 만들고 상처를 하기에 가까운 뿌리의 근원에서 멀리 가능한; 척수에 주의 using 작은 마이크로 해 부 또는 봄이 위, 뿌리를 스트레칭 하지 마십시오.
    7. 캡처를 하기에서 척추의 양쪽을 따라 5-10 mm. 자르지 않는다 너무 가까이 척수 또는 척추. 이 단계에는 척수를 폭로 자 궁 경부 척추의 제거 수 있습니다. rootlets 절단 하지 마십시오.
    8. (양측) 척추 (약 T7) 따라 rootlets 약 20-25 m m를 캡처. 이 절차를 통해 척수에 절단을 방지 하 고 그림 4C에서 보듯이 척추의 가장자리를 조작 합니다.
    9. 신중 하 게 운동 각 척추의 rostral 가장자리와 밀접 하 게 뼈 아래 캡처 C1, C2, c 3를 제거 합니다. 뼈를 잘라 만든 것입니다, 더 이상는 rootlet에 가까운. 사용 하 여 연결 또는 겸 인하 (그림 4C)를 만드는 동안 각 자 궁 경부 척추에 확고 한 그립을 달성을 돕기 위해 구 부 러.
    10. 척수의 원하는 길이로 절연 척추 칼럼에서 해 부 일단 가로 상처 (그림 5A그림 5B) 척수를 제거를 확인 합니다.
  5. Dura mater를 제거 합니다.
    참고:
    앞에서 설명한3,7되었습니다 일괄적 생체 외 녹음에 격리 brainstem 척수를 사용할 수 있습니다. Brainstem-척수 척추 칼럼에서 제거와 함께 경질 흡입 전극 두개골과 척추 컷에서 녹음을 수행을 위한 최적의 액세스 rootles 제공 하기 위해 제거 되어야 합니다. 또한, 경질의 제거 깔끔하게 brainstem를 슬라이스 하 고 생체 외 녹음 컬 활성 얇은 슬라이스를 얻을 수 있습니다.
    1. 신중 하 게 격리 brainstem 척추는 두개골을 둘러싼 경질에 대 한 액세스를 허용 하도록 최대 조직 등 쪽 코드 핀 (그림 5B) rootles. 핀의 brainstem, XII rootlets rostral 측면 여백 통해 적용 되어야 한다.
    2. 경질의 등 쪽 여백에 좋은 집게 (#5)와 두 라를 들어올려 brainstem의 등 쪽 표면에서 경질을 제거 하 고 잘 봄이 위 brainstem의 길이 걸쳐 측면 중간에서 잘라. 자체 brainstem에 절단을 피하기 위해 주의 해야 합니다. 부드럽게 brainstem 표면에서 혈관 들어올린 때 brainstem 단면 vibratome 블레이드의 장애를 피하기 위해 잘라.
    3. 신중 하 게 두개골 신경 rootlets 경질을 통과 하 고는 쉽게 찢 어 떨어져 경질 들어올리면 brainstem의 중간과 측면 측면에서 경질 해 부. 부드럽게 그들 주위 작은 봄이 위 절단에 의해 뽑아 되 고 rootlets의 가능성을 최소화 합니다.
    4. 복 부 표면 위를 향하도록 하 고 두개골 rootlets는 명확 하 게 볼 수 있도록 brainstem 척수를 플립. Rostral에서 꼬리를 절단 지역 postrema 바로 위에 두 라를 부드럽게 들어올려 brainstem의 등 쪽 측에서 경질 해 부. 지역 postrema microcapillaries이이 지역 perfusing의 큰 숫자 때문에 약간 분홍색 표시 됩니다.
    5. 좋은 곤충 핀을 사용 하 여 모든 나머지 dura 멀리 애타게 하 고 두개골 및 자 궁 경부 rootlets에 가까운 근접에서 남아 있는 혈관을 제거.

4. 슬라이스 프로토콜

  1. 제거한 후에 경질, brainstem 플라스틱 블록 ("절단 블록" 라 함)에 파라핀 플랫폼의 중앙에 놓습니다. 그림 5C와 같이 길이 1 cm 이상의 손질 되었습니다가 좋은 곤충 핀을 사용 하 여 원심 척수를 통해 brainstem의 꼬리 끝을 고정 합니다.
  2. 블레이드 brainstem의 rostral 얼굴에 수직을 상처에 vibratome 블록 홀더 고정된 brainstem와 파라핀 덮여 절단 블록을 맞춥니다.
  3. 초기 슬라이스 rostral 대부분 끝에 고르지 못한, 외부 조직을 제거를 확인 합니다. 이 초기 컷 200-300 µ m 일반적으로 그러나 신중 하 게 피하기 위해 IX, X와 XII 두개골 rootlets의 제거 될 수 있습니다. 이 단계는 얼굴 핵 (7 세)와 glossopharyngeal rootlets의 꼬리 정도 밝힐 것입니다 일반적으로 하 고 그것의 얼굴은 파 vibratome 블레이드 평면 brainstem 정렬 가능 하 게. 작은 조정을 필요한 파 하면 보장 하는 조직을 제거 하는 작은 상처 합니다.
    참고: 한 인하 각 연속 조각 그리고 brainstem 신경 회로 리듬 생성에 필요한 rostro 꼬리 거리에 대 한 랜드마크를 제공 하는이 Glossopharyngeal (IX) rootlets brainstem의 측면 가장자리에 표시 됩니다. Brainstem의 복 부 측에 hypoglossal rootlets (XII)도 볼 수 있어야 IX rootlets 보여주는 컷된 얼굴에 약간 꼬리. 최종 랜드마크 brainstem의 지 얼굴에 obex를 4 심 되는 척수의 중앙 채널 좁은 인간의 두뇌에 (포인트)를 될 것입니다. 참조의 이러한 세 가지 포인트 표시, 올바른 가공 면은 설립 (참조 그림 6A)와 컬 활성 슬라이스를 안정적으로 얻어질 것입니다.
  4. IX rootlets brainstem의 컷된 얼굴의 표면 근처까지 절단 rostral-꼬리를 계속 합니다.
  5. 랜드마크와 올바른 방향 그림 6 을 참조 하십시오. Vibratome 클램프에 파라핀-슬 래 브 transection의 다음 각도 컷 슬라이스 매우 약간의 "쐐기" 모양을 만들 하 고 랜드마크 설명 될 때까지 약 100-200 µ m의 조각을 삭감 조정 (그림 6A)를 명확 하 게 본.
    참고: 이 약간의 쐐기 절단 조각에서 XII 모터 신경의 수를 증가 하 고 녹음 중 리듬 활동을 얻기의 가능성을 극대화. 랜드마크를 사용 하 여 설명 (rostral rootlets glossopharyngeal 신경 번들, hypoglossal 신경 번들는 obex에서에서 rootlets에서에서) 슬라이스 reproducibly pBC (그림 6B)의 적어도 큰 부분을 포함 하는 것을 보장 한다.
  6. PBC를 잡으려고이 rostral 신경 해부학 표식에서 brainstem의 300-500 µ m 슬라이스를 자르고 전송 회로 관련.
    참고: "이상적인" 슬라이스를 안정적으로 표면 녹음 내 리듬 생성/전송 loci 흡입 전극 사용에 지 하지 않고 inspiratory 활동 hypoglossal rootlet 번들의 가장 rostral rootlet 포함는 brainstem입니다.

5. 기록 절차

  1. 분할 녹음 실에서 실제 (0.5-1.0 mL/min)와 지속적으로 perfuse 놓고 XII rootlets 또는 pBC, XII PMNs 또는 XII motoneurons에서 흡입 또는 세포 외 전극 기록 인구 활동을 사용 합니다. 자세한 기록 절차에 대 한 brainstem 척수 전기 생리학에 이전 간행물을 참조 하 고 클램핑10,11패치.

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Representative Results

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여기에 제시 된 방법 연구원을 reproducibly 하 고 확실 하 게 많은 시간 움직이다 모터 출력의 녹음을 허용 하는 실행 가능한, 강력한 조각을 잘라 brainstem의 리듬 활성 슬라이스를 취득에 관심이 있습니다. 모든 생성 하 고 전송 inspiratory 리듬에 대 한 최소한 필요한 신경 회로 요소는이 메서드를 사용 하 여 얇은 조각에서 캡처할 수 있습니다. 이러한 요소를 포함: 복잡 한 preBötzinger, hypoglossal 모터 신경 (pXII MNs)에 투영 premotor 신경 hypoglossal 모터 신경 (XII MNs), 및 hypoglossal 신경 rootlets. PBC, XIIn, 및 C4 신경 rootlets 일반적으로 사용 됩니다 inspiratory 리듬 녹음, 그림 7에서 볼 수 있듯이.

이 절차의 성공적인 사용은 10-15 분, 실용적이 고 컬 활성 en 블록 준비 또는 컬 활성 조각에 생산할 예정 이다 < 30 분. 일괄적 brainstem-척수 또는 얇은 슬라이스의 격리, 후 녹음 실에서 재래식의 15 분은 거짓 모터 출력의 생산에 대 한 충분 합니다. 슬라이스, 경우 증가 세포 외 [K +] 약 8-9 mm이 연구소의이 경험에서 24 ~ 36 h에 대 한 마지막 수 있는 강력한 신경 드라이브를 생산할 예정 이다. 준비는 지속적으로 superfused carbogenated (95% O2/5% CO2)와 온수 실제 이어야 한다 (~ 27 ° C). 성공 해 신속 하 게 수행 되 고 곤란, 스트레칭, 또는 손상 신경 rootlets 녹음에 사용을 피하십시오. 최적의 결과 대 한 절차의 모든 단계는 신속 하 게 수행 하 고 조직 목욕 하거나 해 부 및 조직 격리 (위에서 설명한) 대로 수행할 때 carbogenated 실제와 함께 끼얹는다 지속적으로 해야 합니다. 광범위 한 세부 neuroanatomy 및 brainstem의 정확한 지도 관한, Ruangkittisakul 외13,14, Ballanyi15 , 동료의 작업을 참조 하십시오. 여기에 제시 된 프로토콜 입증 된 신뢰할 수 있는 고위 작가 실험실에서 한 방법 이며이 보고서 표면 랜드마크 brainstem에 또는 내에서 볼 수에 의존이 분할 영역을 생성 하기 위한 그래픽, 단계별 방법을 제공 합니다 brainstem으로 여기 자세한.

Figure 1
그림 1 : 초기 brainstem 척수 추출에 대 한 해 부. (A) Anesthetized 강아지 해 부에 대 한 고정. 파선 피부에 화살 절 개에 대 한 절 개 지침 나타내고 가로 눈 하 고 횡 경 막 아래 꼬리 인하 합니다. (B) 동물에서 피부와 앞 발을 제거 하기 위한 가이드. (C) 피부 설치류의 등 쪽 양상. 점선된 라인 절 개 해골-플랩 "조가 비" 노출에 대 한 지침을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 지 laminectomy의 단계. (A) 파선 뇌를 제거 하기 위한 절 개 지침을 나타냅니다. 조직을 제거 후 (B) 결과. 파선 등 laminectomy에 대 한 절 개 지침을 나타냅니다. (C) 노출 brainstem 척추 등 laminectomy 다음 코드로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 초기 복 부 해 부의 단계. (A) 잘린된 개와 복 부 피부 쥐의 복 부 측. 파선은 xyphoid 프로세스를 제거 하 고 흉 곽 이후에 복 부와 흉 강 장기를 제거 하 여에 대 한 절 개 지침을 나타냅니다. (B) 복 부 및 흉부 구멍 기관 제거. (C) Oropharyngeal 구조 제거입니다. 파선 하드 미각 제거에 대 한 절 개 지침을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 복 부 laminectomy의 단계. (A) 하드 구개 그리고 남은 해골 부품 제거. 절 개 지침 brainstem 척수를 둘러싼 남아 있는 조직을 제거 하는 방법을 나타냅니다. (B) 첫 번째 자 궁 경관 척추 (C1) 노출. (C) 시범 C1 해제 고 가로 컷 척추 몸 만들기에 그것을 제거. 신경은 신중 하 게 잘라 플러시 척추 몸의 등 쪽 측에 그것을 제거 하기 전에. 이것은 해 부의 가장 중요 한 단계 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 5
그림 5 : 부 러 뜨 리 brainstem 척수의 준비. (A) C1-C3 척수에서 제거. 절 개 지침 위치 꼬리 척수에서 척수 brainstem 서버를 나타냅니다. (B) 레이블이 신경 rootlets와 brainstem 척수의 복 부 쪽. 절 개 지침 권장된 transection 또는 남은 斗 brainstem 척수 영역에서 녹음 하기 전에 골 수에서 rostral 구조를 나타냅니다. (C) 파라핀 슬라브는 vibratome에 조각화에 대 한 설정. 조각화 지역 포함 두개골 신경 IX와 12 세 사이 조직이 되어 있습니다. 조각화 지역으로 마이크로 핀을 배치 하지 마십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 6
그림 6 : 그대로 hypoglossal 모터 핵 및 PreBötzinger 복잡 한 조각을 얻기 위해 사용 하는 건축물. (A)의 brainstem 척수 후 초기 컷 glossopharyngeal (IX) rootlets rostral 가로 보기. 절 개 지침 transection 레벨 hypoglossal (XII) rootlets에 그냥 꼬리를 나타냅니다. (B) pBC와 hypoglossal 모터 핵 포함 하는 슬라이스를 절단 하기 전에 블레이드 파라핀 블록의 방향. 사다리꼴 "쐐기" 모양 컷을 생성할 녹음 중 리듬 활동을 얻기 위해 조각에 충분 한 inspiratory 뉴런의 가능성을 최대화 합니다. 쐐기는 pBC, hypoglossal premotor 신경 및 hypoglossal 모터 신경, 호흡기 rhythmogenesis의 색인은 리듬 드라이브를 전송 하기 위해 필요한 회로 공동으로 제공 하는 포함 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : En 블록 또는 슬라이스 준비에서 대표적인 녹음. (A) 12 세 rootlet에서 통합된 추적. (B) pBC에서 통합된 추적. PBC에서 녹음 장 님 패치 클램프 필요 en 블록 준비를 사용 하 여. C4 신경 rootlet에서 (C) 통합된 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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En 블록으로 여기에 제시 된 프로토콜 적응 또는 슬라이스 워크플로 실험실 용 유리 이며 얇은 중 일괄적 brainstem-척수를 활용 하 고 싶은 연구 슬라이스 전기 생리학 기록에 대 한 준비. 해 부와 슬라이스 방법 제시, 방법과 다른 사람에 의해 이전에 보고 된17,,1819결합, 널리의 범위에 적응할 수 있는 강력 하 고 가능한 조직의 재현할 준비 하면 실험 설치류 hindbrain 또는 척수를 사용 하 여입니다. 제시 해 부 매우 상세 하 고 분할 영역을 준비할 때 brainstem 척수의 방향에 관한 광범위 한 정보 뿐 아니라 등 쪽과 복 부 laminectomy를 포함 합니다. 상세한 해 부와 슬라이스 프로토콜 제시 생성 및 inspiratory 리듬의 전송에 필요한 모든 회로 포함 하는 연구원을 수 있습니다. 주요 신경 인구/구조를이 방법을 사용 하 여 캡처할 수 포함: hypoglossal premotor 신경, hypoglossal 모터 핵, 그리고 복잡 한 preBötzinger. 참고 중앙 공동2 센서 또는 내쉬는 숨 리듬 생성 회로 (RTN/pFRG)를 포함 하는 brainstem의 지역 준비에 포함 되지 않은 자세한 여기20,21. 일단 en 블록 준비 또는 슬라이스 얻은 되었습니다, 리듬 활동 얻을 수 있습니다 흡입 전극, 표면 전극, 또는 extracellular 단위 또는 패치 클램핑 방법3,10 같은 단일 세포 기록 방법을 사용 하 여 ,11.

이 프로토콜의 목표 brainstem 척수 준비 또는 얇은, 컬 활성 슬라이스를 생성 하기 위한 명확 하 고, 따라 하기 쉬운 방법을 제공 하는 것입니다. 이 프로토콜 해야 그들의 armamentarium에 리듬 brainstem/슬라이스 준비 통합에 관심이 모두 경험과 새로운 연구에 귀중 한 몇 가지 중요 한 단계의 캡처를 용이 하 게 하는 프로시저 내에서 선발 강력 하 고, 재현성, 고 긴-지속적인 리듬 활성 조각

연구원은 해부학 적 랜드마크와 해 부에 대 한 필요한 기술을 식별과 편안 하 게 되었다, 일단 해 부의 속도, 증가 하 고 각 개별 조사 절차를 최적화할 수 있습니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 제프리 스미스, 리듬 brainstem 슬라이스 준비3의 원조로 그의 박사 후 작업 동안 수석 저자 (CGW)에 진행 되었다. 되도록 리듬 활동 및 슬라이스 및 en에 생존 블록 준비, 약 30 분 이내 처음부터 절차의 녹음 실에서 한 조각에 슬라이스를 생성 하는 모든 절차를 완료 합니다. 지속적인 관류, 조직 생존 능력에 거의 영향을 있다 하지만 더 이상 녹화 및 데이터 수집에 대 한 허용 해 부에 대 한 시간을 최소화. 호흡 연구, 대 한 약 280 μ m 두께3 얇은 조각 리듬, 강력한 inspiratory 활동 하지만 조각 최대 550 µ m17,18,,1922범위 수 있습니다. 이 절차를 수행 하 고 두께 각 조각의 rostral 꼬리 위치에 있는 가변성을 최소화 하는 데 필요한 기술을 개발 하 주의 연습 필요 합니다. 품질 및 견고성 나중 brainstem에 흥분 성의 억제 핵 조각 에서에서 기록 된 리듬의 "품질"에 영향을 수 있는 녹음에 리듬 활동의 포함 또는 제외 하는 특정 세포 인구 영향 3.

마지막으로, 그것은 또한 그 실제 정확 하 게 프로토콜에 따르면, 준비 되 고 표준화 된 pH20, 온도 및 산소 수준에 중요 한. 무산 소 준비 리듬 활성화 되지 않습니다 하 고 데이터 컬렉션21에 영향을 미칠 것입니다.

실용적이 고 리듬 활성화 준비의 탐정 캡처를 용이 하 게 하는 절차에서 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 복 부 laminectomy 동안 등 흉 곽을 그대로 유지 여분 차입 자본 이용을 허용 하 고 척추 칼럼에서 brainstem 척수의 상대적으로 섬세 한 격리를 수행 하는 동안 준비를 보호 하기 위한 더 많은 티슈를 제공 합니다. 여기서 설명 하는 단계 허용 쉽게 생산 en 블록 준비 또는 얇게 되므로, 필요성에 의해 추가 단계 조사는 상세한 해 부는 그냥 얇은 슬라이스를 생략할 수 있습니다. 다른 유용한 팁 포함, 복 부 laminectomy 수행 하는 동안 신경 rootlets severing 하는 동안 그것을 위쪽으로 해제 척추 신체에 확고 한 그립을 얻을 하는 것이 중요 하다. Brainstem 척수 해 부 되 고 추출 후 dura mater 및 나머지 맥 관 구조 해야 합니다 수 해 부 신경 조직의 표면에서. 혈관 고 경질 힘든 깨끗 한 슬라이스 절단에서 vibratome 블레이드를 방지할 수 있습니다. 경질의 해 부 엉 블록 준비에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 신경 흡입 전극 커플링을 최적화 하는 것이 좋습니다. 마지막으로,는 vibratome의 사용에 신중 하 고 질서 있는 실천은 깨끗 하 고 재현할 수 조각 절단 필요 합니다. 이 프로토콜 절 개 및 절단 절차에 대 한 자세한 내용은의 매우 포괄적인 목록을 제공합니다. 여기에 강조 신뢰할 수 있는 기초 및 훈련 도구는 수정 그들의 실험실의 절차 필요에 따라 사용 하는 수 사관에 대 한 단계별 자세한 목록을 제공 하는.

전반적으로,이 방법론 생체 전기 생리학의 방법의 30 년 진화를 나타냅니다. 이 종이의 범위는 일괄적의 표준화에 초점을 맞추고 및 brainstem 척수 녹음 P0 P5 쥐 및 쥐22inspiratory 활동 공부에 일반적으로 사용 되는 슬라이스. 그러나,이 해 부 과정 동물 크기, 연령, 및 연구, E18 쥐/생쥐, 신생아 쥐 및 쥐 (출생 후 0 ~ 6), 일 성인 쥐 등의 다양 한 종족의 범위에 걸쳐 활용 될 수 있습니다. 미래 연구는 종 및 연령대, 프로토콜을 합리화 하 종 및 연령대에 걸쳐 리듬 생성 또는 다른 생리 적 과정에 메커니즘을 심문 하는 연구를 수 있도록 제시 하는 방법을 사용할 수 있습니다. 궁극적으로, 방향, 간격, 또는 위치는 슬라이스 또는 일괄적 변경 준비 리듬 활동23좌우할 것 이다. 광범위 한 문학 과거에 출판 된 슬라이스 절차에 의해 캡처하고 stereotaxic 쥐 및 마우스 atlases 신경 회로 관하여 더 자세히 논의 여기24, 제공할 수 있다 신경 인구에 관하여 25,26. 여기에 제시 된 절차 범위 해 부 실험실에서 랜드마크에서 리듬 조각을 쉽게 볼 수를 삭감 하는 법을 배워야 새로운 탐정을 허용 하는 명확한 삽화와 함께 광범위 한 정보를 제공 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

S.B.P은 Loma Linda 대학 여름 학부 연구 화목의 받는 사람입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

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References

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리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스
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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).More

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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