Summary

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

Published: March 23, 2019
doi:

Summary

이 프로토콜 모두 시각적으로 통신 brainstem 척수 준비 하 고 포괄적인 단계별 방식 brainstem 가로 조각의 준비를 명확히. 그것은 재현성을 증가 하 고 brainstem의 호흡 영역에서 신경 출력 기록 가능한, 오래 지속, 컬 활성 분할 영역 취득의 가능성을 강화 하도록 설계 되었습니다.

Abstract

포유류 inspiratory 리듬의 모 수는 preBötzinger를 복잡 한 전화 (pBC), 운전 inspiratory 근육의 리듬 수축 신호를 생성 하는 영역에 신경 네트워크에서 생성 됩니다. 리듬 신경 활동 pBC에서 생성 하 고 호흡의 근육 신경 녹음 및 가로 분할 녹음 일괄적 포함 하 여 다양 한 방법을 사용 하 여 공부 될 수 드라이브에 다른 신경 풀에. 그러나, 이전에 게시 방법을 설명 되지 않은 광범위 하 게 brainstem 척수 해 부 과정 미래 연구에 대 한 투명 하 고 재현 가능한 방식. 여기, 우리 사용 reproducibly 리듬-액티브 brainstem 조각을 생성 하 고 전송 inspiratory 드라이브에 대 한 필요 하 고 충분 한 신경 회로 포함 하는 방법의 포괄적인 개요를 제시. 이 작품은 pBC, hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 신경의 출력을 기록에 대 한 실용적이 고 컬 활성 분할 영역을 안정적으로 얻기의 가능성을 향상 시키기 위해 이전 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜 구축 및 hypoglossal 모터 신경 (XII 미네소타)입니다. 제시 하는 작품 XII rootlets를 포함 하는 생체 외에서 슬라이스를 전체 쥐 강아지에서 해 부의 상세한, 단계별로 그림을 제공 하 여 이전 게시 된 방법에 따라 확장 합니다.

Introduction

Brainstem의 호흡 신경망 리듬 신경 네트워크의 일반적인 특성을 이해 하기 위한 비옥한 도메인을 제공 합니다. 특히, 관심 신생아 설치류 호흡 및 호흡 리듬을 개발 하는 방법을 이해의 개발 이다. 이 비보 전체 동물 plethysmography, 체 외에서 일괄적 신경 녹음, 포함 한 다단계 접근 방식을 사용 하 고 생체 외에서 수 있습니다 호흡 리듬 생성기를 포함 하는 녹음을 슬라이스. 시험관 en 블록 및 슬라이스 녹음에서 reductionist 호흡기 rhythmogenesis 및 설치류 개발의 brainstem 척수 영역에서 신경 회로 뒤에 메커니즘을 심문 할 때 사용 하는 유리한 방법입니다. 개발 호흡기 약 40 세포 유형을, 패턴, 중앙 호흡기1,2의 포함을 발사 하 여 특징을 포함 한다. 중앙 호흡기 네트워크 rostral ventrolateral 모1,3에 위치한 컬 활성 뉴런의 그룹을 포함 합니다. 포유류의 호흡기 rhythmogenesis 생성 되는 autorhythmic에서 interneuron 네트워크 불리는 복잡 한 preBötzinger (pBC), 되었습니다 통해 실험적으로 지역화 신생아 포유류의 조각 및 en 블록 준비 brainstem 척추 코드3,,45,6,,78. 이 지역에에서 동방 마디 (SA)에 비슷한 기능을 제공 하 고 드라이브 호흡을 inspiratory 타이밍 시스템을 생성 합니다. PBC에서 inspiratory 리듬 brainstem (hypoglossal 모터 핵 포함) 및 척추 모터 풀 (예: 격 막 드라이브 인할지 모터 뉴런)9의 다른 지역에 수행 됩니다.

리듬 활동 brainstem 척수 en 블록 준비 또는 다양 한 c 3-c 5 신경 rootlets, XII 신경 rootlets를 포함 하는 세포 인구에서에서 분할 영역을 사용 하 여 얻을 수 있습니다 hypoglossal 모터 핵 (만 12 세), hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 그리고 pBC3,10,,1112. 데이터 수집의 이러한 방법은 실험실의 소수에 걸쳐 성공 했습니다, 여러 프로토콜 하지 새로운 연구 분야를 입력에 대 한 완벽 하 게 재현할 수 있는 방식으로 표시 됩니다. 취득 가능한 컬 활성 en 블록 슬라이스 준비는 해 부와 슬라이스 절단 프로토콜의 모든 단계를 통해 세부 사항에 급성 주의가 필요 합니다. 이전 프로토콜 광범위 하 게 설명 하는 다양 한 기록 절차와 전기 생리학, 아직 실행 가능한 조직 준비의 가장 중요 한 부분에 세부 부족: brainstem 척수 해 부 및 조각 절차를 수행.

제대로, 신중 하 게, 그리고 신속 하 게 모든 단계를 수행 수 해야 효율적으로 얻기 컬 활성 및 가능한 en 블록 또는 슬라이스 준비 brainstem 척수 전기 생리학 기록 (일반적으로, 전체 절차 관련 여기 있을 수 있습니다 약 30 분에서 수행). 있다 하지 이전 잘 설명 하는 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜의 중요 한 포인트 포함 신경 rootlets 및 조각화 절차는 vibratome에의 해 부. 이 프로토콜 stepwise 첫 번째는 새로운 연구와 분야에서 전문가 위한 brainstem 척수 해 부에 시각적으로 의사 소통입니다. 이 프로토콜도 철저 하 게 외과 기술, 랜드마크, 및 조각 및 각 실험에서 원하는 정확한 회로 포함 하는 준비 일괄적 표준화에 미래 연구자를 지원 하기 위해 다른 절차를 설명 합니다. 쥐와 쥐 신생아 강아지에 여기에 제시 된 절차를 사용할 수 있습니다.

Protocol

다음 프로토콜 허용 되어 있으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) Loma Linda 대학에 의해 승인. 동물의 윤리적인 처리를 위한 NIH 가이드라인은 실험실에서 수행 하는 모든 동물 실험에서 따 랐 다. 모든 윤리는이 프로토콜을 수행 하는 개인에 의해 확정 했다. 1입니다. 솔루션 인공 뇌 척추 액체 (실제)을 준비 합니다. 신선한 실제 1 L 일괄 처리는 …

Representative Results

여기에 제시 된 방법 연구원을 reproducibly 하 고 확실 하 게 많은 시간 움직이다 모터 출력의 녹음을 허용 하는 실행 가능한, 강력한 조각을 잘라 brainstem의 리듬 활성 슬라이스를 취득에 관심이 있습니다. 모든 생성 하 고 전송 inspiratory 리듬에 대 한 최소한 필요한 신경 회로 요소는이 메서드를 사용 하 여 얇은 조각에서 캡처할 수 있습니다. 이러한 요소를 포함: 복잡 한 preB?…

Discussion

En 블록으로 여기에 제시 된 프로토콜 적응 또는 슬라이스 워크플로 실험실 용 유리 이며 얇은 중 일괄적 brainstem-척수를 활용 하 고 싶은 연구 슬라이스 전기 생리학 기록에 대 한 준비. 해 부와 슬라이스 방법 제시, 방법과 다른 사람에 의해 이전에 보고 된17,,1819결합, 널리의 범위에 적응할 수 있는 강력 하 고 가능한 조직의 재…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.B.P은 Loma Linda 대학 여름 학부 연구 화목의 받는 사람입니다.

Materials

NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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