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Neuroscience

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

doi: 10.3791/58870 Published: March 23, 2019

Summary

Este protocolo visualmente se comunica a preparação de tronco cerebral-medular e clarifica a preparação de fatias transversais de tronco cerebral de uma forma abrangente e passo a passo. Ele foi projetado para aumentar a reprodutibilidade e aumentar a probabilidade de se obter fatias ritmicamente ativo, viáveis e duradouras, para gravar saída neural das regiões respiratórias do tronco cerebral.

Abstract

Mamíferos ritmo inspiratório é gerado a partir de uma rede neuronal em uma região da medula chamada o preBötzinger complex (pBC), que produz um sinal que está dirigindo a contração rítmica dos músculos inspiratórios. Atividade neural rítmica gerado no pBC e transportadas para outros pools neuronais para a musculatura da respiração pode ser estudada usando várias abordagens, incluindo em bloco, gravações de nervo e gravações de fatia transversal de carro. No entanto, os métodos publicados anteriormente não extensivamente descrita o processo de dissecção de tronco cerebral-medular de forma transparente e reprodutível para estudos futuros. Aqui, apresentamos uma visão abrangente de um método usado para reproducibly cortar fatias de tronco cerebral ritmicamente ativo contendo os circuitos neuronais necessários e suficientes para geração e transmissão de movimentação inspiratória. Este trabalho se baseia nos protocolos de eletrofisiologia anterior da medula espinhal-tronco cerebral para aumentar a probabilidade de obtenção confiável fatias viáveis e ritmicamente ativo para gravar saída neuronal do pBC, neurônios cortéx hipoglosso (XII pMN), e neurônios hipoglosso (XII MN). O trabalho apresentado expande-se sobre métodos publicados anteriores, fornecendo ilustrações detalhadas, passo a passo da dissecação, de filhote de rato inteiro, a fatia in vitro que contém as raízes do XII.

Introduction

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A rede neural respiratória do tronco cerebral fornece um domínio fértil para compreender as características gerais das redes neurais rítmicas. Em particular, o interesse está no desenvolvimento de roedores neonatal respirando e compreender como se desenvolve o ritmo da respiração. Isto pode ser feito usando uma abordagem multi-nível, incluindo na pletismografia de todo animal vivo, in vitro, em bloco, gravações de nervo e in vitro fatia gravações que contenham o gerador de ritmo de respiração. Reducionista em vitro en bloc e fatia gravações são um método vantajoso usar quando interrogando os mecanismos subjacentes rhythmogenesis respiratória e circuitos neurais na região da medula espinhal-tronco cerebral do desenvolvimento de roedores. O sistema respiratório em desenvolvimento inclui aproximadamente 40 tipos de células, caracterizados por padrão, incluindo as do centro respiratório1,2a disparar. A rede respiratória central inclui um grupo de neurônios ritmicamente ativos localizado na medula ventrolateral rostral1,3. Rhythmogenesis respiratório dos mamíferos é gerado de um autorhythmic interneurônio rede apelidado o complexo de preBötzinger (pBC), que foi localizado experimentalmente através de tanto fatia e en bloc preparações à base de mamíferos neonatal tronco cerebral-espinhal cabos de3,4,5,6,7,8. Esta região tem uma função semelhante ao nó sinoatrial (SA) no coração e gera um sistema de tempo inspiratório a respiração de unidade. Partir do pBC, o ritmo inspiratório é transportado para outras regiões do tronco cerebral (incluindo o núcleo motor hipoglosso) e piscinas de motor da coluna vertebral (tais como os neurônios motores frênico que impulsionam o diafragma)9.

Atividade rítmica pode ser obtida usando o tronco encefálico medula espinhal pt bloco preparações ou fatias de uma variedade de populações de células, incluindo as raízes nervosas de C3-C5, raízes do nervo XII, núcleo motor hipoglosso (XII MN), neurônios cortéx hipoglosso (XII pMN), e o pBC3,10,11,12. Enquanto esses métodos de coleta de dados foram bem sucedidos em um punhado de laboratórios, muitos dos protocolos não são apresentados de uma forma que é totalmente reproduzível para novos pesquisadores entrando em campo. Obter viável e ritmicamente ativo en bloc e fatia preparações requer uma atenção aguda ao detalhe por todos os passos da dissecação e protocolo de corte fatia. Protocolos anteriores extensivamente descrever os vários procedimentos de gravação e eletrofisiologia, ainda falta o detalhe na parte mais crítica de obter uma preparação do tecido viável: executar o procedimento de dissecção e fatia de tronco cerebral-medular.

Eficientemente obter preparação ritmicamente ativo e viável en bloc ou fatia gravações de eletrofisiologia do tronco cerebral-medular requer que todas as etapas ser executada corretamente, com atenção e rapidamente (normalmente, todo o procedimento relacionado aqui pode ser realizada em cerca de 30 min). Pontos críticos do protocolo de eletrofisiologia de tronco cerebral-medular que não foram previamente bem descritos incluem a dissecação das raízes nervosas e do procedimento de corte sobre o vibratome. Este protocolo é o primeiro a gradual comunicar visualmente a dissecação de tronco cerebral-medular para novos pesquisadores e especialistas na área. Este protocolo também completamente explica técnicas cirúrgicas, Marcos e outros procedimentos para ajudar futuros pesquisadores em padronizar as fatias e em bloco de preparações que contêm os circuitos exato desejado em cada experimento. Os procedimentos apresentados aqui podem ser usados em filhotes neonatais tanto o rato e o rato.

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Protocol

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O seguinte protocolo foi aceito e aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Loma Linda e institucional Cuidado Animal. Diretrizes do NIH para o tratamento ético dos animais são seguidas em todos os experimentos animais realizados em laboratório. Todos os padrões éticos foram sustentados por indivíduos realizar este protocolo.

1. soluções

  1. Prepare-se fluido espinal cerebral artificial (aCSF).
    1. Preparar aCSF fresco à noite antes de um experimento em lotes de 1 L, usando a seguinte receita: 7,250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO3 (25 mM), 0,069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0,247 g MgSO4 • 7 H2 Ó (1,0 mM) e g 5,410 D-glicose (30 mM), 0,221 g CaCl2 • 2 H2O (1,5 mM). Sempre adicione o CaCl2 • 2 H2O último.
    2. Dissolva os componentes em 1 L de água desionizada. Mexa por 20-30 min.
    3. Medir o pH da aCSF e ajustar a 7,40 ± 0,02 usando volumes pequenos (tipicamente < 0,5 mL) de NaOH, KOH ou HCl diluído.
      Nota: ACSF preparado pode ser armazenado no frigorífico (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) de três dias antes de crescimento bacteriano afeta a viabilidade do tecido durante um experimento. Use 0,2 µm filtros para reduzir a contaminação por fungos ou bactérias presentes no laboratório desde experimentos podem durar até 36 h. Para eficiência, a receita aCSF descrita pode ser ampliada para lotes de 4L, seguindo o mesmo protocolo e este volume vai durar por até três dias de experimentos.

2. preparação de dissecção e equipamento de Vibratome

  1. Configure a lâmina.
    1. Use um fresco lâminas de dois gumes para o tecido do corte em um vibratome. Lave a lâmina com 100% de etanol e enxagúe com água desionizada antes de corte ou encaixe a lâmina ao meio e inserindo a montagem da lâmina grampo sobre o vibratome.
    2. Mude a lâmina toda vez que uma nova preparação do tecido é montada sobre o vibratome para cortar ou se corta para a laje de parafina ao corte. Qualquer resíduo de parafina tornará quase impossível para cortar tecido neural neonatal de forma limpa.
  2. Configure a placa de cera de parafina.
    1. Use qualquer estilo de incorporação da cera de parafina. Coloque 10 g de incorporação de mídia em um copo de vidro calor tolerante e use fogo baixo para derreter os cera de parafina grânulos para o líquido.
    2. Adicionar cerca de 0,5 g de pó de grafite e misturar a solução cuidadosamente e uniformemente para a parafina líquida.
    3. Use uma pequena laje de plástico como substrato para a parafina. Corte um pedaço pequeno (0,5 - 1 cm de espessura e aproximadamente 2 x 2 cm2 largura) de plástico (policarbonato ou alumínio também pode ser usado). Use arquivo de um mecânico para sulcos zero no plástico blug irá assegurar que a parafina adere ao plástico.
      Nota: Como alternativa, use uma agulha de 18 G aquecida para colocar furos em ângulo para a folha para garantir que a mistura de parafina-grafite adere ao plástico.
    4. Use as costas de um aplicador de ponta de algodão para gotejar a mistura de parafina-grafite sobre o plástico repetidamente mergulhando o aplicador a mistura de parafina derretida e grafite, pingando o chorume para o bloco de plástico, e construindo a parafina-grafite para aproximadamente 1,5 cm de espessura sobre o plástico.
    5. Depois suficientemente espessa camada de mistura parafina-grafite é depositada em cima do bloco, defina o bloco de lado para esfriar e então forma para acomodar o tronco cerebral-medular.

3. dissecção e o isolamento da Neuraxis

  1. Execute anesthetization e dissecação inicial.
    Nota:
    animais utilizados neste estudo podem variar em tamanho de embrionário dia 18 (E18) para pós-Natal dia 10-20 em camundongos ou ratos variando de E18 a pós-Natal dia 5/6. Ratos ou camundongos de qualquer estirpe, tratamento ou sexo podem ser utilizados, dependendo do projeto experimental. Realize anestesia e dissecação preliminar sob uma coifa desde isoflurano é usado (0,25 mL em uma câmara de 25 mL).
    1. Pesar o filhote e, em seguida, coloque-o em uma câmara de anestesia contendo 0,25 mL de isoflurano, colocado em um 2 x 2 polegadas2 pedaço de gaze. Depois que o animal atinge um plano cirúrgico da anestesia (verificado pela pitada de dedo do pé com nenhum reflexo de retirada), pin o animal em uma placa de Petri preenchida com parafina ou silicone elastômero.
      Nota: Neonatais roedores também podem ser anestesiados através de cryoanesthesia13,14, isoflurano vaporização15, ou injeção16 equilibrado com oxigênio.
    2. Coloque o lado ventral animal para baixo e fazer uma incisão de apenas atrás dos olhos à região lombar médio da coluna vertebral com uma lâmina de bisturi número 10 ou 11 ou tesoura cirúrgica. Refletir a pele e descerebrada o animal a nível da sutura parietal/occipital (ver Figura 1) e retire a pele que cruza o animal abaixo do diafragma. Em seguida, remova os braços cortando na articulação do ombro com uma tesoura ou um bisturi.
    3. Uma vez que a pele é removida, transferi o animal para uma câmara de perfusão com silicone elastomerin parte inferior para mais de dissecação e preparação da medula espinhal-tronco cerebral.
    4. Bolha de um reservatório de aCSF (garrafa de 500 mL com side-port) continuamente com refrigerados (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) aCSF e oxigenar com uma mistura de 95% O2 e 5% de CO2 (também chamado de "carbogen"). Durante a dissecção, use aCSF refrigerado para lavar periodicamente a câmara, fornecendo fresco aCSF oxigenado ao longo de isolamento da medula espinhal-tronco cerebral.
      Nota: Células vermelhas do sangue pode ser vistas nas artérias e veias restantes e, quando suficientemente oxigenado, estas são vermelho brilhante.
    5. Use o fluxo de gravidade da perfusão através de tubos e uma torneira de passagem, para intermitentemente ou continuamente perfundir o tecido com aCSF oxigenado (bólus volume ou via lento gotejamento usando uma torneira de passagem, aproximadamente 0,5 - 1,0 mL/min). Isso Oxigena o tecido e mantém um campo cirúrgico limpo.
    6. Remova o excesso de líquidos conforme necessário pelo sistema de filtragem aspiração vácuo.
    7. Faz a dissecação usando um microscópio de dissecação. Um modelo de zoom contínuo é preferido para permitir o ajuste fino da ampliação e permitir a visualização ideal da região de interesse durante cada etapa da dissecação.
      Nota: Ferramentas de microcirurgia recomendadas incluem uma gama de tecido dentada fórceps fórceps rombudo, fórceps #5, fórceps do tecido em ângulo, uma gama de microdissecando tesoura (tesoura de mola) e inseto regular e microdissecando os pinos.
    8. Expor a seção do cérebro através de linha média do crânio ao longo da sutura sagital e depois rebaixar os flaps refletidos com pinos microdissecando e pino da coluna vertebral na extremidade caudal para o fundo coberto de silicone da dissecação câmara usando um 27 G agulha.
      Nota: O resto da dissecação requer um microscópio de dissecação para fornecer a visão mais clara do tecido e pontos de referência utilizados para garantir a máxima probabilidade de obter saída fictícia rítmica sobre os rootlets cranianas do tronco encefálico e raízes da coluna vertebral. Execute estas etapas da dissecação usando tesouras de primavera médio ou tesoura de íris e pinça fina.
  2. Prontamente, transferi o tronco isolado do animal para uma câmara de dissecação aerado. Coloque o lado dorsal de tecido com extremidade rostral (cérebro), virado para a frente da câmara. Alfinete o tecido no ombros e no final mais caudal da medula espinhal.
    1. Faça uma incisão médio-sagital do crânio, seguindo a sutura parietal para não danificar o córtex e tronco cerebral subjacente o crânio.
      Nota: Tecido ósseo neonatal não está totalmente calcificado e é muito frágil. O tecido ósseo/será flexível para um grau, mas mais resistente do que o conjuntivo circundante e tecido muscular.
    2. Use tesoura de mola ou íris média para cortar as suturas occipitais do crânio, começando na sutura sagital e trabalhar lateralmente. Isto irá criar "retalhos" de crânio que pode ser refletida e fixado para ancorar a parte rostral do crânio e fornecer alguma estabilidade ao tecido (ver Figura 2).
    3. Depois refletindo as abas de crânio, cortadas o resto do córtex cerebral, deixando a porção caudal do cerebelo (vermis) relativamente intacta (Figura 2B).
  3. Realize laminectomia dorsal.
    1. Remova a musculatura ao redor do crânio e coluna vertebral usando fórceps e a tesoura de mola micro. Remova o tecido ao longo do lado dorsal da caixa torácica, deixando a caixa torácica intacto, como isso vai ser fixado mais tarde para ancorar o tecido durante a laminectomia ventral, minimizando a possibilidade de danos à medula espinhal.
    2. Cuidadosamente corte fora os processos laterais das lâminas vertebrais usando tesouras de primavera médio ou tesoura de íris bem. Corte qualquer tecido sobrejacente a pons e medula. O vermis, cerebelo, ponte e início da medula espinhal agora será claramente visível (Figura 2C).
  4. Realize laminectomia ventral.
    1. Abaixe o lado dorsal de tecido e pin no tórax e no final mais caudal da coluna vertebral. Segure o lado rostral do tecido usando as abas do crânio(Figura 3).
    2. Remova a metade ventral da caixa torácica, incluindo o esterno e todos os órgãos abdominais, usando a mesma tesoura e pinça. Disse os tecidos moles fora anexado a caixa torácica, expondo as costelas e a medula espinhal (Figura 3B).
    3. Retire a língua, esôfago, traqueia, laringe e todos os outros tecidos moles e musculatura sobrejacente da base do crânio e da coluna vertebral (como visto na Figura 3C).
    4. Disse o tecido sobrejacente a pálete difícil. Identifica o palato duro localizando uma placa retangular de osso na base do crânio com um recuo de V-forma nele (Figura 3C). Corte ao longo da linha mediana do palato, cuidadosamente levantá-la para cima e realizar um corte para removê-la (Figura 4A) transverso.
    5. Começa uma laminectomia ventral removendo lâminas expondo a superfície ventral do tronco cerebral e medula espinhal desde a primeira vértebra cervical para aproximadamente vértebras torácicas 7 (T7), como mostrado na Figura 4B.
    6. Nesta fase, as raízes ventrais será visíveis. Usando pequena micro-dissecção ou tesoura de mola, tome cuidado para fazer cortes mais próximo as lâminas e mais longe da origem das raízes na medula espinhal quanto possível; Evite o alongamento das raízes.
    7. 5-10 mm ao longo de ambos os lados da coluna vertebral nas lâminas de corte. Não corte muito perto da medula espinhal ou para as vértebras. Esta etapa permite a remoção das vértebras cervicais para expor a medula espinhal. Evite cortar as raízes.
    8. Corte raízes aproximadamente 20-25 mm (bilateralmente) ao longo da coluna vertebral (aproximadamente T7). Em todo este procedimento evitar cortar a medula espinhal e manipular as bordas das vértebras como visto na Figura 4. C.
    9. Remova o C1, C2 e C3 cuidadosamente levantando a borda rostral de cada uma das vértebras e recorte estreitamente debaixo do osso. Mais perto do osso que o corte é feito, quanto mais as radicelas. Uso viciado ou dobrado fórceps para ajudar a alcançar um aperto firme em cada vértebra cervical ao fazer cortes (Figura 4C).
    10. Uma vez que o comprimento desejado da medula espinhal é isolado e dissecado da coluna vertebral, fazer um corte transversal para remover a medula espinhal (Figura 5A e Figura 5B).
  5. Remova a dura-máter.
    Nota:
    isolada do tronco encefálico-medular pode ser usado para gravação em bloco em vitro como foi descrito anteriormente3,7. Com a tronco cerebral-medula removida da coluna vertebral, a dura-máter deve ser removida para fornecer acesso ideal para eletrodos de sucção realizar gravações do corte craniana e espinhal rootles. Além disso, remoção da dura-máter torna possível limpa fatia do tronco cerebral e obter fatias finas ritmicamente ativas para gravação in vitro.
    1. Cuidadosamente o pino do tronco cerebral-espinhal isolado cabo lado dorsal do tecido acima para permitir o acesso para a dura-máter em torno do crânio rootles (Figura 5B). Os pinos devem ser aplicados através da margem lateral do tronco cerebral, os rootlets XII rostral.
    2. Remover a dura-máter da superfície dorsal do tronco encefálico, levantando a dura-máter com pinça fina (#5) na margem dorsal da dura-máter e o corte do lateral-para-medial em todo o comprimento do tronco cerebral, com uma tesoura de primavera. Tenha cuidado para evitar o corte no tronco cerebral em si. Delicadamente levante os vasos sanguíneos da superfície do tronco encefálico e cortar para evitar o impedimento da lâmina vibratome ao corte do tronco cerebral.
    3. Disse cuidadosamente dura de aspectos medial e laterais do tronco cerebral, como as raízes de nervos cranianos atravessam a dura-máter e facilmente rasgadas afastado quando a dura-máter é levantada. Minimize a probabilidade dos rootlets sendo puxado cortando suavemente em torno deles com uma tesoura pequena mola.
    4. Vire a tronco cerebral-medula para que a superfície ventral virado para e os rootlets cranianas são claramente visíveis. Disse a dura-máter do lado dorsal do tronco encefálico, suavemente, levantando a dura-máter diretamente sobre a área postrema, cortando de rostral ao caudal. A área postrema aparecerá ligeiramente rosa devido ao grande número de microcapilares perfusing nesta região.
    5. Use um alfinete inseto para provocar afastado qualquer restante dura e remover o restante dos vasos sanguíneos na proximidade de raízes cranianas e cervicais.

4. fatia protocolo

  1. Depois de retirar a dura-máter, coloque o tronco cerebral no centro da plataforma de parafina no bloco plástico (doravante referida como "o bloco de corte"). Coloque a extremidade caudal do tronco cerebral através da medula espinhal distal, usando pinos de inseto bem que têm sido aparados para não mais de 1 cm de comprimento, como mostrado na Figura 5C.
  2. Alinhe o bloco de corte cobertos de parafina com o tronco cerebral fixado no suporte do bloco de vibratome para que a lâmina corte perpendicular à face rostral do tronco cerebral.
  3. Fazer uma fatia inicial para remover o tecido na extremidade rostral mais desigual, estranho. Este corte inicial pode ser de 200-300 µm tipicamente mas cuidadosamente evitar a remoção dos rootlets cranianos IX, X e XII. Essa etapa normalmente irá revelar a extensão caudal do núcleo facial (VII) e os rootlets glossofaríngeo e torna possível alinhar o tronco cerebral para que seu rosto é par-planar da lâmina do vibratome. Fazer pequenos ajustes, se necessário, para garantir a paridade-planaridade e fazer pequenos cortes para remover o tecido que é desigual.
    Nota: Raízes do glossofaríngeo (IX) será visíveis na borda lateral do tronco cerebral, como um corta cada fatia sucessiva, e estes fornecem um marco para a distância rostro-caudal para os circuitos neurais de tronco cerebral necessário para geração de ritmo. No lado ventral do tronco cerebral, os rootlets hipoglosso (XII) também devem ser visíveis ligeiramente caudal no rosto cortado mostrando os rootlets IX. Um marco final será a obex (o ponto no cérebro humano em que o quarto ventrículo se estreita para tornar-se o canal central da medula espinhal) na face dorsal do tronco cerebral. Com estes três pontos de referência visíveis, que o plano de corte correto é estabeleceram (ver Figura 6A) e uma fatia de ritmicamente ativo será obtida confiavelmente.
  4. Continue o corte rostral e caudal até os rootlets IX estão perto da superfície da face de corte do tronco cerebral.
  5. Consulte a Figura 6 para Marcos e orientação correta. Ajuste a parafina-laje na prensa vibratome, de modo que o ângulo próximo de transecção criará uma forma muito ligeira "cunha" para a corte fatia e corte fatias de aproximadamente 100-200 µm até os monumentos descritos podem ser vistos claramente (Figura 6A).
    Nota: Esta ligeira cunha de corte aumenta o número de neurônios motores XII, capturado em fatia e maximiza a probabilidade de obter atividade rítmica durante a gravação. Usar os marcos descrito (rostrais rootlets do pacote de nervo glossofaríngeo, raízes do feixe do nervo hipoglosso, o obex) irá garantir que a fatia reproducibly contém pelo menos uma grande parte do pBC (Figura 6B).
  6. Corte uma fatia de µm de 300-500 de tronco cerebral estes marcadores neuroanatômica rostrais para capturar o pBC e associado a circuitos de transmissão.
    Nota: Uma fatia "ideal" irá conter as radicelas mais rostral do bundle radicelas hipoglosso confiantemente obter atividade inspiratória sem recorrer a gravações de superfície usando um eletrodo de sucção sobre o ritmo-geração/transmissão de loci dentro o tronco cerebral.

5. gravação procedimentos

  1. Coloque a fatia em uma câmara de gravação, perfundir continuamente com aCSF (0,5 - 1,0 mL/min) e use eletrodos de sucção ou extracelulares para atividade de registro população partir os rootlets XII ou o pBC, XII PMN ou motoneurônios XII. Para procedimentos de gravação detalhada, ver publicações anteriores no tronco cerebral-medular eletrofisiologia e patch de aperto10,11.

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Representative Results

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O método apresentado aqui permite que um pesquisador interessado em obter fatias ritmicamente ativas de tronco cerebral reproducibly e confiantemente cortar uma fatia robusta, viável que permitirá a gravação de saída motor fictícia por muitas horas. Todos os elementos de circuito neural minimamente necessário para geração e transmissão de ritmo inspiratório podem ser capturados em uma fatia fina usando esse método. Esses elementos incluem: o complexo preBötzinger, cortéx neurônios projetando para os neurônios motores hipoglosso (pXII MNs) e os neurônios motor hipoglosso (XII MNs) e raízes do nervo hipoglosso. O pBC, XIIn e C4 raízes nervosas são comumente usados para gravações de ritmo inspiratório, conforme ilustrado na Figura 7.

Utilização bem sucedida deste procedimento produzirá uma preparação de bloco viável e ritmicamente ativo en em 10-15 min, ou uma fatia de ritmicamente ativo em < 30 min. Após o isolamento de tronco cerebral em bloco-espinal medula ou uma fatia fina, 15 min de equilíbrio na câmara de gravação é suficiente para a produção de saída motor fictícia. No caso da fatia, aumentar o extracelular [K +] a cerca de 8-9 mM produzirá unidade neural robusta que pode durar 24 a 36 h na experiência do laboratório. A preparação deve ser continuamente superfused com carbogenated (95% O25% CO2) e aCSF aquecida (~ 27 ° C). Dissecações bem sucedidas são executadas rapidamente e evite beliscar, estiramento ou danificar as raízes nervosas, usados para gravações. Para obter melhores resultados, todas as etapas do procedimento são executadas rapidamente e o tecido deve ser banhado ou continuamente perfundido com carbogenated aCSF, ao realizar a dissecção e o isolamento do tecido (como descrito acima). Para extensos detalhes relativos à neuroanatomia e Atlas precisas do tronco cerebral, por favor consulte o trabalho de Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 e colegas. O protocolo aqui apresentado é um método que tem se mostrado confiável no laboratório do autor sênior e este relatório fornece um método gráfico, passo a passo para gerar essas fatias confiando apenas Marcos superfície visíveis no tronco cerebral ou dentro do tronco cerebral como detalhada aqui.

Figure 1
Figura 1 : Inicial dissecação para a extração do tronco cerebral-medular. (A) filhote Anesthetized fixado para dissecação. Linhas tracejadas indicam as diretrizes de incisão para a incisão sagital na pele e transversal corta caudal aos olhos e abaixo do diafragma. (B) guia para remover a pele e patas dianteiras do animal. (C) dorso de roedores sem pele. Linhas tracejadas indicam diretrizes de incisão para a exposição de "garra"-crânio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Fases da laminectomia dorsal. (A) as linhas tracejadas indicam diretrizes de incisão para retirar o cérebro. (B) resultado após a remoção do tecido. Linhas tracejadas indicam diretrizes de incisão para a laminectomia dorsal. (C) Exposed tronco cerebral-espinhal cabo após a laminectomia dorsal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Fases de dissecação inicial ventral. (A) lado Ventral de um roedor esfolado com prosencéfalo decepado e abdômen. Linhas tracejadas indicam as diretrizes de incisão para remover o processo xyphoid e abrindo a caixa torácica para posteriormente remover órgãos da cavidade torácica e abdominal. (B) cavidade torácica e Abdominal os órgãos removidos. (C) estruturas da orofaringe removidas. Linhas tracejadas indicam as diretrizes de incisão para a remoção do palato duro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Estágios da laminectomia ventral. Palato duro de (A) e restantes partes do crânio removidas. Diretrizes de incisão indicam como remover o tecido remanescente ao redor da medula espinhal-tronco cerebral. (B) primeira vértebra cervical (C1) exposta. (C) demonstração sobre o levantamento C1 e fazendo um corte transversal para o corpo vertebral para removê-lo. Nervos são cuidadosamente cortados rente ao lado dorsal do corpo vertebral antes de removê-lo. Este é o passo mais crítico na dissecação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 5
Figura 5 : Preparação de tronco cerebral-medular para fatiar. (A) C1-C3 removido da medula espinhal. Diretrizes de incisão indicam onde cortar a medula do tronco cerebral-espinhal da caudal da medula espinhal. (B) lado Ventral do tronco cerebral-medular com raízes nervosas rotulada. Diretrizes de incisão indicam transecção recomendada ou restantes estruturas rostrais no ponto medular antes da gravação da região de tronco cerebral-medular. (C) parafina laje instalação para cortar sobre o vibratome. A região de corte inclui o tecido entre os nervos cranianos IX e XII. Não coloque micropinos para a região de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Pontos de referência utilizados para obtenção de fatias com um núcleo motor hipoglosso intacto e complexo de PreBötzinger. (A) vista transversal da medula do tronco cerebral-espinhal após corte inicial ter sido feita rostral os rootlets glossofaríngeo (IX). Diretriz de incisão indica nível de transecção só caudal para os hipoglosso rootlets (XII). (B) orientação do bloco de parafina a lâmina antes de cortar uma fatia contendo o pBC e o núcleo motor hipoglosso. Criar um corte de forma trapezoidal "cunha" maximiza a probabilidade de captura suficiente neurônios inspiratórios na fatia para obter atividade rítmica durante a gravação. A cunha incluirá o pBC, os neurônios cortéx hipoglosso e os hipoglosso neurônios motores, que fornecem coletivamente os circuitos necessários para transmitir unidade rítmica, que é um índice de rhythmogenesis respiratória. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Gravações representativas de preparações de bloco ou fatia do pt. (A) rastreamento integrado de radicelas XII. (B) rastreamento integrado desde o pBC. Gravação do pBC usar uma preparação do bloco pt exigirá uma braçadeira do remendo cego. (C) rastreamento integrado de radicelas de nervo o C4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Adaptação do protocolo aqui apresentado em um bloco de pt ou fatia fluxo de trabalho é vantajoso para os laboratórios e estudos que gostam de utilizar também em bloco tronco cerebral-medular e/ou fina fatia preparações para as gravações de eletrofisiologia. O método de dissecação e fatia apresentado, combinado com métodos anteriormente relatados por outros17,18,19, permitirá a preparação pode ser reproduzida de tecido viável e robusto que é amplamente adaptável a uma variedade de experimentos utilizando o rombencéfalo roedor ou da medula espinhal. A dissecação apresentada é altamente detalhada e inclui a laminectomia dorsal e ventral, bem como detalhes abrangentes sobre a orientação da medula espinhal-tronco cerebral quando se preparando para cortar fatias. O protocolo detalhado de dissecção e fatia apresentado permite que o pesquisador incluir todos os circuitos necessários à geração e transmissão de ritmo inspiratório. As populações/estruturas neurais principais que pode ser capturadas usando este método incluem: os neurônios cortéx hipoglosso, o núcleo motor hipoglosso e o complexo de preBötzinger. Nota que as regiões do tronco cerebral que contêm central CO2 sensores ou circuitos de geração de ritmo expiratório (RTN/pFRG) não estão incluídas na preparação detalhada aqui20,21. Uma vez que se obteve a fatia ou preparação do bloco pt, atividade rítmica pode ser obtida usando eletrodos de sucção, eletrodos de superfície ou métodos de gravação única célula como unidade extracelular ou remendo-aperto métodos3,10 ,11.

O objetivo do presente protocolo é fornecer um método claro e fácil de seguir para a geração de uma preparação de tronco cerebral-medula ou uma fatia fina, ritmicamente ativo. Este protocolo deve ser valioso para experientes e novos pesquisadores interessados na incorporação de preparações de tronco cerebral/fatia rítmica em seu arsenal, como há várias etapas críticas detalhadas dentro dos procedimentos que facilitam a captura de robustas, reprodutíveis e duradouro fatias ritmicamente ativas.

Uma vez que o pesquisador tornou-se confortável com a identificação dos pontos anatômicos e as habilidades necessárias para dissecação, aumentará a velocidade da dissecação, e os procedimentos podem ser otimizados para cada investigador individual. O protocolo detalhado aqui foi ensinado ao autor sênior (CGW) durante seu trabalho de pós-doutoramento com Jeffrey Smith, o originador do tronco encefálico rítmica fatia preparação3. Para garantir a atividade rítmica e viabilidade em ambas as fatias e pt preparações de bloco, todos os procedimentos para gerar uma fatia devem ser terminados dentro de aproximadamente 30 min do início do procedimento de uma fatia na câmara de gravação. Com perfusão contínua, há muito pouco impacto na viabilidade do tecido mas, minimizar o tempo para dissecação permite a gravação de mais tempo e aquisição de dados. Para estudos respiratórios, uma fatia que é tão fina quanto aproximadamente 280 µm de espessura3 terá atividade inspiratória rítmica, robusta, mas fatias podem variar até 550 µm17,18,19,22. Prática de cuidado é necessário para desenvolver as habilidades necessárias para executar este procedimento e minimizar a variabilidade na espessura e posição rostral-caudal de cada fatia. Incluindo ou excluindo determinadas populações de célula irá influenciar a qualidade e a robustez da atividade rítmica obtida na gravação mais tarde como excitatórios e inibitórios núcleos no tronco cerebral podem afetar a "qualidade" do ritmo gravada da fatia 3.

Finalmente, é também crítico que aCSF é preparado de acordo com o protocolo e está em um nível de pH padronizado20, temperatura e oxigenação. Anóxica preparações não será ritmicamente ativas e afetarão dados coleção21.

Há várias etapas no procedimento que facilitam uma captura de investigador de preparações viáveis e ritmicamente ativas. Durante a laminectomia ventral, mantendo intacta a caixa torácica dorsal permite alavancagem extra e fornece mais tecido para garantir a preparação ao executar o isolamento relativamente delicado de tronco cerebral-medular da coluna vertebral. A dissecação etapas detalhadas aqui permitem que o investigador facilmente produzir en bloc preparações ou fatias finas para que, por necessidade, etapas adicionais são detalhados que pode ser omitida para obter apenas uma fatia fina. Outras dicas úteis incluem, ao executar a laminectomia ventral, é importante obter um aperto firme sobre o corpo vertebral para levantá-la para cima, enquanto cortando as raízes do nervo. Uma vez que a medula espinhal-tronco cerebral foi dissecada e extraída, a dura-máter e a vasculatura remanescente devem ser dissecados fora da superfície do tecido neural. Os vasos sanguíneos e dura-máter são difíceis e podem impedir que a lâmina de vibratome cortar uma fatia limpa. Dissecação da dura-máter não é vital para a preparação de bloco do pt, mas é recomendada para otimizar o acoplamento de eletrodo de nervo-sucção. Finalmente, cuidadosa e metódica prática no uso do vibratome é necessária para cortar um pedaço limpo e reprodutível. Este protocolo fornece uma lista muito abrangente de etapas detalhadas para a dissecção e procedimentos de corte. A ênfase aqui é fornecer uma lista detalhada passo a passo para um investigador usar como uma base confiável e a ferramenta de treinamento do qual eles podem modificar os procedimentos do seu laboratório, conforme necessário.

Como um todo, esta metodologia representa uma evolução de trinta anos de métodos de eletrofisiologia in vitro. O escopo deste trabalho centra-se na padronização de em bloco e corte gravações de tronco cerebral-medular que normalmente são usadas para estudar a atividade inspiratória no22, de ratos e camundongos P0-P5. No entanto, este processo de dissecção pode ser utilizado em uma variedade de animais de tamanhos, idades e espécies para uma ampla variedade de estudos, incluindo E18 ratos/camundongos neonatais ratos e camundongos (pós-natal dias 0 a 6) e ratos adultos. Estudos futuros podem usar os métodos apresentados para simplificar protocolos de toda espécie e idade, permitindo estudos interrogar os mecanismos em ritmo geração ou outro processo fisiológico nas espécies e idades. Em última análise, mudando a orientação, espessura ou localização da fatia ou em bloco preparação influenciará atividade rítmica23. Extensa literatura foi publicada no passado sobre as populações neurais capturado pelos procedimentos de fatia e existem estereotáxica rato e rato Atlas disponíveis para fornecer mais detalhes sobre os circuitos neurais discutiram aqui24, 25,26. Os procedimentos aqui apresentados fornecem detalhes abrangentes com ilustrações claras que permitem um novo investigador aprender a cortar fatias rítmicas de Marcos prontamente visível em um laboratório dissecando o escopo.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

S.B.P é um destinatário de uma bolsa de pesquisa graduação do Loma Linda University verão.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

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References

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Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina
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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).More

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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