Her, er bioassays designet til at overvåge udviklingen af en svampe patogen, Colletotrichum fioriniae, i overværelse af blåbær eller tranebær blomsterarter udskrifter på glas coverslips beskrevet. Vand-, chloroform, og feltet regnvand – baseret floral udvinding teknikker er detaljerede samt indsigt i hvordan oplysningerne kan anvendes.
Nøjagtigt overvåge Fænologi udløb bloom og tidsmæssige dynamikken i floral kemiske signaler på svampe frugt rådner patogener, blev floral udvindingsmetoder og coverslip bioassays udviklet, udnytte Colletotrichum fioriniae. I blåbær og tranebær styres dette patogen optimalt ved at anvende fungicider periode flor på grund af blomster rollespil i de indledende stadier af infektion. Protokollen detaljeret her beskriver hvordan floral ekstrakter (FE) er fremstillet ved hjælp af vand-, chloroform- og felt regnvand-baserede metoder til senere brug i tilsvarende glas coverslip bioassays. Hver FE tjente til at angive forskellige sæt af oplysninger: svar af C. fioriniae mobiliserede floral kemiske stikord i vand (vandbaseret), patogen svar til blomst og frugt overflade voks (chloroform-baseret) og felt-baseret overvågning indsamlet floral regnvand, flytte in vitro- bemærkninger til en landbrugs indstilling. FE er generelt betegnes som enten vand – eller chloroform-baseret, med en passende bioassay beskrevet for at kompensere for de iboende forskelle mellem disse to materialer. Regnvand, der havde kørt off blomster blev indsamlet i unikke enheder for hver afgrøde, hentyder til den fleksibilitet og anvendelsen af denne tilgang til andre afgrøder systemer. Bioassays er hurtig, billig, enkel og giver mulighed for at generere spatiotemporelle og områdespecifikke oplysninger om tilstedeværelsen af stimulerende floral forbindelser fra forskellige kilder. Denne information vil i sidste ende bedre informere sygdom strategier, som FE falde af fristerne for infektion at forekomme, hvilket giver indblik i skiftende risici for patogen infektion over vækstsæsonen.
Colletotrichum fioriniae forårsager en frugt rådner af både Highbush blåbær (Vaccinium corymbosum L.) og de store amerikanske tranebær (V. macrocarpon Aiton)1,2. Dette patogen blev for nylig afgrænset fra C. acutatum arter komplekse3,4,5,6 og er en kausal agent af blueberry anthracnose og medlem af tranebær frugt rot komplekse, ud over forårsager talrige andre plante sygdomme på verdensplan7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infektioner opstår under flor og symptom udvikling ikke bliver synlige, indtil frugten er i sidste fase af modning9. I blåbær og tranebær kontrolleret frugt rådner kun tilstrækkeligt med fungicid ansøgninger periode flor. Patogenet Overvintrer i hvilende blueberry blomster bud skalaer10 og sporulates under flor. Konidierne flyttes hele baldakinen via regn-splash spredning11,12 og inokulum oprustning er blevet stærkt korreleret til flor periode13. Svar af Colletotrichum arter til vært blomster er ikke enestående for Vaccinium, som blomster er vigtige komponenter af citrus post bloom frugt drop (PFD)14 samt jordbær anthracnose15, i begge tilfælde forårsager patogenet til sporulate. Alle disse tilfælde understrege behovet for effektive metoder til at evaluere de tidsmæssige dynamikken i floral kemiske signaler på C. fioriniae og andre patogener, der inficerer under flor. Den indsigt, som de metoder, der beskrives her bliver stadig mere værdifuldt.
Denne protokol beskriver metoder til blomster ekstrakt (FE) indkøb og guider evaluering af C. fioriniae svar til FE via glas coverslip bioassays15,16. Floral udvinding teknikker er opdelt i to hovedtyper; vandbaseret ekstraktion (aktiv-FE, passiv (pass –FE) og feltet regnvand-baseret (rw-FE)), og chloroform-baseret (ch-FE)17 ekstraktioner. Vand-baserede ekstraktioner mulighed for inspektion af vand mobiliseret floral kemiske signaler. Disse mobiliserede stikord er sandsynligvis vigtige komponenter Domstolens infektion da FE øger hastigheden af infektion16, ud over at give fugt kræves for infektion at forekomme. Derudover udgør de en mere naturlig tilstand som floral stimulation kan blive vasket hele baldakinen under befugtning-begivenheder som tidligere observerede i blåbær og andre afgrøde systemerne14,16. Chloroform-baserede floral ekstraktioner (ch-FE) også give værdifuld information vedrørende patogen svar til værten overflade voks17,18, belyse de tidlige vækst stadier af konidier engang deponeret på modtagelige værten organer (dvs. blomster, æggestokkene og udvikle frugt). Patogenet svar til sæsonbestemte ændringer i vært overflade voks kan også overvåges ved hjælp af denne protokol. Derfor, bioassays er skræddersyet til at arbejde med enten vandbaseret FE eller chloroform-baserede FE at afbøde de iboende forskelle mellem disse to materialer.
De data, der genereres fra bioassays afslørede at vandbaseret ekstraktion stimulere højere niveauer af sekundære conidiation end chloroform-baserede ekstraktioner hvor der var en definitiv appressorial svar, derfor implicere flere forbindelser stede i FE. Interessant nok, blev begge disse vækst svar observeret når ved hjælp af regnvand, der var løbet ud af blåbær og tranebær blomster, der angiver flere stimulerende forbindelser kan vaskes fra overfladen af blomster. Således vil overvågning for blomstermotiver stimulation give indsigt i sandsynligheden for, at patogenet succes i et landbrugssystem.
Det ultimative mål for denne protokol er at give en metode til generere baseline biologiske oplysninger om svampe plante patogener som svar på floral kemiske signaler, som igangsættende metoder, der kan udnytte denne floral oplysninger til støtte i lokationsspecifikke sygdom forvaltnings- og beslutningsprocedurerne processer.
Bioassays påvisning af C. fioriniae svar på floral ekstrakter (FEs) blev udviklet til blåbær og tranebær frugt rot pathosystems, men let kan tilpasses andre gartneriafgrøder. Protokollen beskrevet ovenfor har været værdifulde i at erhverve mange vigtige datasæt, herunder, men ikke begrænset til: FE effekter på flere isolater af mange patogener, tidsforløb oplysninger vedrørende svampevækst stadier i overværelse af forskellige FEs, sammenligning af udvinding teknikker, inspektion af individuelle kemikalier på C. fioriniae vækst og differentiering, evaluering af individuelle blomst orgel ekstrakter, effekter af temperatur på C. fioriniae mens i FE, effekter af Fænologi afhængige voks ekstraktioner og floral regnvand effekter. Ved hjælp af disse teknikker har data genereret også givet en meget klarere forståelse C. fioriniae livets stadier og delvist belyser hvorfor perioden bloom er så kritisk, at kontrol med mange frugt rådner patogener.
I første omgang alle blomster blev behandlet identisk til aktivt-FE, men udpakningen er flyttet mod at bruge hele blomster. Floral dissektion var tidskrævende og havde meget lille effekt på bioactivity af den resulterende FEs. Dog enkelte blomstermotiver organer kan og har været evalueret ved hjælp af denne protokol, men stor omhu skal tages til ikke helt udblødte floral væv (supplerende film 1, med forholdsregler detaljerede taktfast 2.3), da dette kan resultere i frigivet svampe-toxic/statisk forbindelser ind i en FE, der kunne fordreje de mikroskopiske evalueringer. Mindre invasive ekstraktioner som pass –er FE (supplerende film 2) og rw-FE nu mere gunstig på grund af deres lethed af erhvervelse. Derudover kræver disse udvinding teknikker kun vakuum filtrering til at erhverve biologisk aktive floral kemiske signaler.
Blomsterne anvendes i alle ekstraktioner blev typisk afkølet til 0-3 dage før ekstrakt forberedelse. En udfordring i denne protokol er tidsstyring af FE omsætning (feltsamlingen gennem opbevaring af uddrag). Dette var forstærket af talrige prøver fra flere kilder og datoer. Frosne blomster er ikke blevet evalueret virkelige omfang, som optøede blomster vises forringet og misfarvet. Når den vandbaserede FEs er blevet forberedt, gentagen nedfrysning og optøning har vist nogen effekt på genindfrosset bioactivity af FE, så så længe som FE dog hurtigt efter bioassay forberedelse (levedygtige 3 år gammel FE).
Chloroform-baseret udvinding giver mulighed for undersøgelse af patogenet svar til tre-dimensionelle blomster/frugt overflade voks i et todimensionalt fly via ch-FE fordampning på glas coverslips. Men det er usandsynligt, at de faktiske krystallinske strukturer af voks deponeret fra ch-FE er identisk med den overflade, hvorfra de blev indsamlet. Betydning, supplerende teknikker skal gennemføres, hvis svampe svar på specifikke voks strukturer i vivo er det vigtigste fokus i undersøgelsen. Chloroform-baserede ekstrakter har brug for mere lagerplads vedligeholdelse end de vandbaseret ekstraktion. Ud over at holde ch-FE ekstrakter i mørke, PTFE foret cellekultur tube caps og parafilm forsegling wrap skal jævnligt kontrolleres for fordampning lækager og udskiftes efter behov.
Begrebet overvågning floral regnvandsafstroemning er forankret i tanken om at fremme lokationsspecifikke sygdom overvågningsværktøjer. Regnvand samling enheder kan tilpasses til mange andre plante arkitekturer, så længe enheden indsamling indfanger regnvand, der har kørt ud af blomster. Denne fremgangsmåde indeholder oplysninger om hvorvidt floral stimulation er til stede i feltet på ethvert givet tidspunkt og kan overvåges hele sæsonen. Alternativt, strømaftagere kan implementeres på flere baldakin steder til at bestemme hvor langt floral stikord er blevet vasket i nogen givet befugtning-event. I fremtidige eksperimenter, rw-FE vil diktere Hvornår fungicid programmer skal begynde og hvornår de kan sikkert ende. Derudover ved at overvåge Fænologi afhængige voks ekstraktioner (protokollen afsnit 9), er betydningen af perioden bloom patogen biologi blevet endnu tydeligere. Dette afsnit blev også medtaget for at udvise fleksibilitet for disse bioassays, giver metoder, der giver mulighed for side-by-side sammenligning af vært overflade voks, der er timeligt adskilt. De data, der genereres ved hjælp af blomsterarter udvinding teknikker og bioassays repræsenterer konkrete indikatorer for patogenet stimulation, specifikke kemiske klasser vigtige patogen biologi og mål for fremtidige kontrolstrategier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takke William S. Haines, Sr. begavet Cranberry Research Fund og New Jersey blåbær og tranebær forskning Rådet, Inc. for støtte. Vi takker også Jennifer Vaiciunas (vejledning og floral præparater), Christine Constantelos (svampe kultur og floral præparater), David Jones (floral præparater og udtræk), Langley Oudemans (floral præparater, filme/fotografering), Jesse Lynch (floral præparater), Roxanne Tumnalis (generel support), og mange studerende/sommer praktikanter.
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
200-1000 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
40-200 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
5-40 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
Bunsen burner | – | – | Equipment |
Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
Curved forceps (45˚) | Fisher Scientific | 10-270 | Equipment, flower processing and coverslip inversion |
Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
Drill-press | Delta | – | Equipment, rw-FE collection |
EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
Ethanol (95%) | – | – | Chemical |
Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
Freezer (set to -20˚ C) | – | – | Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE |
Fume hood | Hamilton | – | Equipment, chloroform usage |
Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
Glass cell culture tubes | – | – | Storage of ch-FE |
Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | – | – | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
Incubator (set to 25˚ C, dark) | Percival | 50036 | Equipment, bioassay conductance |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
Metal probe (generic) | – | – | Equipment |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
Pyrex bread-pan | – | – | pass-FE collection |
Pyrex graduated cylinder | – | – | Equipment, FE preparation |
Refrigerator (set to 4˚ C) | – | – | Equipment, storage of ch-FE |
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | – | – | Bioassay conductance |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
Step drill bit (step-bit) | Dewalt | – | Equipment, rw-FE collection |
Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
Telephone wire (internal wires) | – | – | Blueberry rw-FE collection |
Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
V8 Juice | Campbell's Soup Company | – | Fungal media component |
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | – | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |