Summary
在这里, 生物鉴定旨在监测真菌病原体, 在玻璃覆盖物上存在的蓝莓或红莓花提取物的发展。详细介绍了水、氯仿和田间雨水基花卉提取技术, 以及如何应用这些信息。
Abstract
为了准确地监测花期的物候和花化学线索对真菌果实腐烂病原体的时间动态, 利用金银花的提取方法和覆盖物进行了研究。在蓝莓和红莓中, 由于花在感染初期的作用, 在开花期间应用杀菌剂对这种病原体进行了最佳控制。这里详细介绍的协议描述了如何获得花卉提取物 (FE) 使用水, 氯仿, 和现场雨水为基础的方法, 供以后在相应的玻璃覆盖物生物检测中使用。每个 FE 提供了一组不同的信息: 在水中动员花化学线索 (水基) 的反应, 病原体对花和水果表面蜡 (氯仿) 的反应, 以及实地监测收集花卉雨水,将体外观测转移到农业环境中。FE 被广泛地描述为水或氯仿为基础, 与适当的生物测定描述, 以弥补这两种材料之间的固有差异。在每一种作物的独特装置中收集了开花的雨水, 这暗指这种方法的灵活性和在其他作物系统中的应用。生物检测是快速, 廉价, 简单, 并提供了产生时空和特定地点的信息, 从各种来源的刺激花卉化合物的存在的能力。这些信息最终将更好地为疾病管理策略提供信息, 因为 FE 减少了感染所需的时间, 从而为了解生长季节病原体感染风险的变化提供了洞察。
Introduction
导致大黄蓝莓 (金银花) 和美国大越橘 (大杨梅)1,2的果实腐烂。这种病原体是最近从3 、4、5、6种的刺五加中分离出来的, 是蓝莓炭疽的因果药, 也是红莓果实腐烂的成员复杂, 此外, 造成世界各地许多其他植物疾病7。在果实成熟的最后阶段之前, 在开花和症状发育过程中发生感染的情况并不明显.在蓝莓和红莓中, 水果腐烂只有在开花期间的杀菌剂应用才能得到充分控制。在休眠的蓝莓花蕾中, 病原菌过冬,在开花过程中形成10种孢子。Conidia 通过雨水飞溅扩散11、12 在整个树冠中移动, 接种积累与绽放期13密切相关。木兰科对寄主花的反应并不是疫苗所独有的, 因为花是柑橘开花后的重要成分, 果实滴 (pfd)14以及草莓炭疽15, 在这两种情况下都会导致孢子的病原体。所有这些案例都突出表明, 需要有效的方法来评估花化学线索的时间动态, 在开花过程中感染。这里描述的方法所提供的见解越来越有价值。
该协议详细介绍了花卉提取物 (fe) 采购的方法, 并通过玻璃覆盖物生物检测 15,16指导了对fe 反应的评价。花拔技术主要分为两种类型;水性萃取物 (主动-fe、无源萃取 (通fe) 和现场雨基萃取物 (rw-fe)) 和氯仿萃取物 (ch-fe)17 。水基萃取允许检查水中调动的花卉化学线索。这些动员的线索很可能是感染法院的重要组成部分, 因为 FE 除了提供感染发生所需的水分外, 还大大提高了感染的速度16。此外, 它们代表了一种更自然的条件, 因为在潮湿事件期间, 花的刺激可以在整个树冠中进行清洗, 如以前在蓝莓和其他作物系统14,16中观察到的那样。氯基花提取 (ch-fe) 还提供了有关病原体对宿主表面蜡的反应的宝贵信息17,18, 阐明了圆锥花序一旦沉积到易感物质上的早期生长阶段宿主器官 (即鲜花、卵巢和发育中的果实)。病原体对宿主表面蜡季节性变化的反应也可以使用此协议进行监测。因此, 生物检测是专门为与水性 FE 或氯仿基 fe 的工作, 以减轻这两种材料之间的固有差异。
生物检测产生的数据显示, 水基萃取物比氯基萃取物刺激更高水平的次生凝固, 因为氯仿萃取物有明确的抑制反应, 因此涉及多种化合物存在于 FE 中。有趣的是, 当使用蓝莓和红莓花流失的雨水时, 这两种生长反应都被观察到, 这表明可以从花的表面清洗多种刺激化合物。因此, 对花卉刺激的监测将提供洞察病原体在农业系统中成功的概率。
该议定书的最终目标是提供一种方法, 以生成关于真菌植物病原体的基线生物信息, 以响应花卉化学线索, 以及启动的方法, 可以利用这些花卉信息, 以帮助特定地点的疾病管理和决策过程。
Protocol
1. 真菌分离物和孢子悬浮液
- 从自然感染的寄主中分离出 19 .然后, 将清洁培养物储存在玉米粉琼脂 (CMA) 的斜面上。将培养物 (从 CMA 倾斜) 插入标准的塑料细胞培养盘 (直径9厘米), 其中包含澄清的 V8 果汁琼脂 (cV8A) (从 Miller 1955 修改) 或未澄清的 V8 果汁琼脂 (V8A)20。当菌落开始孢子时, 条纹圆锥花序 (橙色圆锥形肿块) 到另一个 cV8A 或 V8A 含有细胞培养盘 (具有标准的无菌循环), 以产生高密度的孢子培养。
注: 任何与真菌的协议步骤应在层流罩中执行, 以减少污染真菌培养和/或生物检测的可能性。 - 经过7天的生长, 使用标准的无菌循环从高密度培养中收集少量的圆锥花序 (轻轻接触到锥形质量的环路), 并将其搅拌成一个15毫升的离心管, 其中含有10毫升的无菌去离子水 (SDW)。涡旋这个样品 10秒, 然后使用标准的移液器向上和向下暴跌多次, 以进一步混合样品。
- 然后, 将涡流样本的一滴放入血细胞计, 并估计孢子浓度。在血细胞计上计数5-10 个字段, 得到平均值, 并乘以适当的稀释系数 (即10, 000), 从而获得每毫升 SDW 的锥形浓度。
- 然后使用卷 (v)/浓度 (c) 方程 (v 1[c1] = v2[c2]) 调整 (带 sdw) 到 1.0 x 10 5 conidia 每毫升的 sdw 与5毫升最终体积. 这被称为孢子悬浮液, 只有在使用之前立即在任何一种生物测定中进行。
2.活性水基提取物 (活性-fe )15,16
注: 参见补充图 1、补充图 2、补充图 3和补充电影 1。
- 在田间盛开的果实中, 精心手工采集蓝莓 (4-5月) 和红莓 (6月至7月) 花 (补充图 1)。在取样地点 (品种/物理位置) 之间佩戴和更换丁腈手套, 以抑制人体皮肤油污染以及花卉品种之间的交叉污染。将蓝莓或红莓花 (单一来源) 放入塑料袋 (填充 100 x 150 毫米袋), 并在收集花后立即在4°c 冷藏。
注: 从 Leandro等人的活动提取被修改。(2003年)16岁 - 在提取之前, 取出任何变质, 损坏, 患病的花朵, 然后使用健康的花朵删除卵巢, 间隔和花梗弯曲的钳子 (45°推子) 和丢弃。仅使用剩余的器官 (花冠, 柱头, 花柱和星形) 进行活动提取。切割芝士布 (150 x 150 毫米), 放在 7 x 7 毫米的漏斗内, 放入干净的50毫升离心管中, 放在一边。
- 将1份加工花卉与9个部分 SDW (1 wt:9 vol 比) 结合在砂浆中。用牙套轻轻磨 3 0 秒 (注意不要完全粉碎样品)。通过制备的奶酪糖/漏斗应变产生的纸浆, 并在离心管 (50 毫升) 中收集。用 95% EtOH 和温水在每次提取之间清洗或使用新的砂浆。
- 准备真空过滤装置: 收集布奇纳漏斗、真空过滤器 Erlenmeyer 烧瓶 (最大 1, 000 毫升容量)、55毫米圆形滤纸和真空软管源。将滤纸添加到合适大小的 Buchner 漏斗中, 放在烧瓶上方, 然后通过真空软管将设备连接到水/吸源, 并放在一边。
- 进一步阐明蓝莓花提取物离心10分钟在 8 055 x g。将上清液倒进制备的真空过滤器装置中, 打开真空源, 过滤上清液, 然后将烧瓶中的物项倒入新的离心管 (50 毫升) 中。用 95% EtOH 和温水清洗每个过滤之间的所有设备部件。通过一个适合0.22μm 孔径的注射器, 进一步过滤, 醋酸消毒, 过滤成一个新的离心管 (50 毫升)。
- 对于红莓花提取物, 只有真空过滤器通过滤纸和倒瓶内的东西到一个新的离心管 (50 毫升)。
- 结果制备被称为活性花提取物 (活性-fe)。将所有水性花卉提取物 (主动-,被动-,雨水收集) 储存在-20°C 的5-50 毫升的等价物, 直到实验使用。重复提取多个样品 (每个样本类型至少3个提取), 以提供复制。
3.被动、水基花卉提取物 (通过-fe) 16
注意: 请参阅补充电影 2。
- 手收集整个蓝莓花 (50 克) 如上, 收集后冷藏。提取前, 去除任何变质, 损坏, 患病的花朵, 并删除只有花梗完整的花。冷藏准备好的样品, 直到下文所述的被动萃取系统到位。
- 使用95% 乙醇 (EtOH) 和温水 (塑料网片、两个塑料网篮、玻璃面包盘和泵雾瓶) 之前, 请先冲洗所有组件, 以防止污染。此外, 请按照上述方法 (步骤2.2 中), 为每次提取准备一层奶酪糖/漏斗50毫升离心管, 并放在一边。
- 准备筛子: 将塑料网片 (又名透明棒垫) 放入一个塑料网篮 (114 x 102 毫米)。将第二个相同的网状篮子倒置 (倒置) 到一个玻璃面包盘 (127 x 229 毫米) (以避免鲜花坐在 SDW), 并放置网片包含篮子的顶部。在筛子里加入50克准备好的花。
注: 或者, 小试管 [清洁] 篮子可以用来代替原来使用的塑料网篮 (旧的, 绿色的, 草莓网的品脱篮子往往很难来源)。 - 使用泵雾瓶, 在玻璃面包盘中捕捉径流, 使花朵具有250毫升的均匀薄雾。然后通过制备的奶酪池/漏斗将滤池滤入干净的离心管中。结果制剂被称为被动-花卉提取物 (通fe);按上述步骤存储 (步骤 2.6)。
- 用 95% EtOH 和温水清洗每次提取之间的所有成分。重复提取多个样品, 以提供复制 (每个样本类型至少 3个)。
4. 氯形式的氟提取物 (ch-FE) 17
- 按照上面的步骤2.1 收集蓝莓和红莓花, 并准备提取花 (步骤 2.2, 不准备奶酪花/漏斗)。将准备好的花冷藏至使用前。
- 为了安全起见, 任何使用氯仿进行的工作都必须在通风罩中进行。这包括材料/玻璃器皿的制备、萃取程序和生物测定电导 (使用 ch-FE 的步骤)。
- 用 95% EtOH 清洁所有组件两次, 然后用氯仿清洗两次, 以防止每次提取的污染: 螺纹玻璃培养管、2个玻璃烧杯、小不锈钢筛和一个 [玻璃] 毕业圆筒。放在一边, 要倒置干燥。将聚四氟乙烯 (PTFE) 内衬瓶盖两次, 仅使用 95% EtOH (氯仿会损坏瓶盖的外部材料), 并留在一边晾干。
- 将1份加工花与9个部分氯仿 (1 wt:9 vol 的比例) 结合在烧杯 (花, 然后氯仿) 中, 轻轻旋涡 30秒, 并通过不锈钢筛向第二烧杯应变。将第二烧杯的 ch-FE 浸入玻璃培养管 (10-15 mL), 并贴上聚四氟乙烯盖。用副膜包裹瓶盖, 以防止蒸发。
- 本制剂为氯仿提取物 (ch-FE)。将样品存放在4°C 的黑暗中 (以减少光线退化), 直至实验使用。重复提取多个样品, 以提供复制 (每个样本类型至少 3个)。
5. 从蓝莓花 (BB rw-FE)中收集雨水16
注: 蓝莓花雨水收集装置包括带连接适配器 (杯: 女线、适配器: 男性至男性螺纹) 的空气喷枪一次性喷漆杯、50毫升离心管 (聚丙烯)、副管和塑料涂层电线 (标准电话线, 单独的内部线绞线内容)。
- 在创建收集设备之前, 在蓝莓灌木中选择多个位置, 以捕获从鲜花中流出的雨水。这些包括直接下花序 (花) 到灌木 (冠) 的底部。记录选定位置的茎直径 (范围为1-5 厘米), 因为这将决定用于设备附件的孔的大小, 如下所述。
- 对于每个选定位置, 创建一个收集设备。首先在喷雾杯底部钻一个孔 (杯向螺纹开口弯曲) 到相应的阀杆直径, 并在钻床上连接一个步位。然后, 从孔顶切割一条直线到喷杯的口。钻4等距孔 (足够大, 可以螺纹塑料涂层线), 在喷杯的口, 并连接一端的塑料涂层线, 使一端无自由。
- 钻一个足够大的孔, 将喷漆杯适配器固定在50毫升的离心机盖上。密封适配器螺纹与副体, 以防止泄漏。将其连接到喷雾器杯的离心机盖和螺纹部分。连接配合50毫升的离心管。
- 重复步骤 5.3-5.4, 根据选定位置创建多个设备, 每个采样位置至少有4个收集设备。
- 通过弯曲喷雾器杯将设备部署到选定的位置, 以适应阀杆。使用连接到其他茎上的塑料涂层电线向上定向喷杯的切口一侧 (以确保通过鲜花的水被捕获)。将任何可能泄漏雨水的开口都贴在一起。(补充图 3、补充图 4、补充图 5和补充图 6)。
- 标签收集管, 并提供部署日期/时间。雨事件发生后, 取出并更换离心管的底部 (管) 部分 (标签日期/收集时间)。将径流收集 (称为蓝莓雨水花卉提取物 (BB rw-FE)) 放入内部和真空过滤器 (步骤 2.4-2.5 中描述的过滤)。如上图 (步骤 2.6) 存储, 直至用于水性生物测定。
6. 从越橘花中收集雨水 (CB rw-FE)
- 红莓中的花雨水收集装置由 7 X 7 厘米聚丙烯漏斗、50毫升离心管 (聚丙烯)、准体和4个标准的塑料涂层扭曲带 (每个设备) 组成。
- 首先, 热穿刺8等距孔 (直径的扭曲领带) 周围的漏斗口使用金属探头。将扭曲带插入4个孔。将另一端连接到该孔的相对位置, 形成一个整齐的交叉图案。用护栏包漏斗下的阀杆, 放在一边。
- 钻一个足够大的孔, 将漏斗下杆插入一个50毫升的离心机盖, 带有一个阶梯式。将准备好的漏斗插入离心机盖。重复步骤 6.2-6.3 创建多个设备, 每个采样位置至少4个收集设备。
- 将标记 (datetime) 设备部署到选定的红莓沼泽中。在交叉的塑料扭曲领带下, 整齐地塞住了两座带花的花序 (被称为立柱)。然后垂直定向设备通过刺穿离心管进入越橘天篷 (补充图 7-8,补充电影 3)。
- 降雨或架空灌溉后, 取出并更换离心管的底部 (管) 部分 (标签日期/收集时间)。将径流 (称为越橘雨水花卉提取物 (CB rw-FE)) 放入真空过滤器 (步骤 2.4-2.5 中描述的过滤) 内。如上图 (步骤 2.6) 存储, 直至用于水性生物测定。
7. 使用水基花卉提取物15,16 (活性-fe,通过-fe, rw-fe) 进行生物测定
注意: 请参见图 1。
- 该生物测定是在层流罩中制备的。准备材料: 用 95% EtOH 和空气干燥, 然后放在一边, 用95% 的 EtOH 冲洗玻璃盖板。将纸巾盘切割成标准塑料细胞培养盘 (9 厘米) 的内径。将2层纸盘放入培养皿中, 浸泡2毫升 SDW。
- 根据上述 (步骤 1.2-1.4), 准备至少5毫升的 1.0 X10 5 conidia/毫升的 sdw 孢子悬浮液 (c. fioriniae)。接下来, 将等量的 SDW 和水性花卉提取物混合在2毫升的微离心管中。然后, 在制备的2毫升微离心管 (SDW + FE) 中加入等量的孢子悬浮液;由此产生的制剂被称为水处理混合物。对于控制, 省略 FE 部分并替换为 SDW, 以保持共适应浓度的一致性。
注: 部分大小取决于复制数和时间点。通常情况下, 部分不超过500μl。一旦圆锥和 FE 结合, 生物测定已经开始, 0小时接种后。 - 将预先清洁的玻璃盖板放在细胞培养盘中浸泡过的纸巾上。将40μl 水处理混合物液滴放在覆盖液的中心。重复所需的治疗, 包括控制, 关闭细胞培养盘。在单独的细胞培养皿中重复复制 (至少 3个) 和时间点 (每个培养皿为1个时间点)。一旦所有的治疗和复制被分发, 把所有复制的细胞培养盘放入一个密封的塑料容器 (30 x 13 x 7 毫米), 并在25°c 在黑暗中孵育。
- 在预定的时间点上, 在液滴中加入10μl 的固定剂, 如乳突棉蓝 (20.0 g 苯酚晶体, 20.0 ml 2.5% 乳酸, 40.0 毫升甘油, 0.05 克棉蓝), 停止生长, 半保持安装。
- 等待2小时来收集0小时的时间点, 因为这允许锥形粘附到玻璃表面, 但不够长, 无法进行圆锥形萌发。对于所有其他时间点, 在相应的时间添加固定点。
- 添加固定装置后, 小心地倒置盖板, 将其放置在玻璃显微镜幻灯片上, 以便进行显微镜检查 (每张幻灯片1张被单)。当所有的盖板都在玻璃显微镜幻灯片上时, 让它们在流动罩中沉淀和部分干燥20分钟。
- 在盖板上 (初级圆锥花序、萌发的圆锥花序和新形成的次生圆锥花序) 以及400X 放大倍率 (计数16个字段) 或 200X (计算4个字段) 上的所有圆锥花序 (总圆锥花序) 进行计数, 总面积为3.08 毫米2. 复制整个生物测定进行统计分析。对于使用水性 FE 进行检测, 请按照 Waller 等人的描述分析数据.2017年16日, 通常显示为平均计数 2 (总圆锥花序或闭应菌)。
8. 使用氯形式的花卉提取物 (ch-FE) 进行生物测定17
注意: 请参见图 2。
- 按上述步骤 (步骤 7.1) 准备材料和细胞培养皿。此外, 将同等数量的 Van Tighem 细胞 (VanT. 细胞) (8 毫米 OD, 6 毫米 ID) 冲洗到盖板上, 并在通风罩内冲洗一个玻璃移液器 (1 mL, 1/l 增量), (用 95% EtOH 两次, 然后用氯仿两次), 放在一边。
- 在层流罩中, 使用2毫升微离心管添加两个相等体积的 SDW 和1个体积的孢子悬浮液, 然后放在一边。这是 ch-FE 生物检测的水处理混合物。
- 在通风柜里放一个 VanT细胞在准备好的塑料细胞培养盘内的玻璃覆盖物上。将所需的 ch-FE 分配 (带玻璃移液器) 33μl 到 Van T. 细胞的中心 (不要接触 VanT 的墙壁)。细胞;用于控制处理, 添加原生氯仿), 并允许干燥。在单独的细胞培养皿中重复复制 (至少 3)。
- 一旦 ch-FE干燥, 将准备好的水处理混合物99μl 与标准移液器放入 vant 的中心。细胞, 然后关闭所有细胞培养菜肴。一旦水处理混合物接触到干燥的 ch-FE 处理, 生物测定就开始了, 在接种后的0小时。
- 一旦所有的处理和复制被分发, 将所有 (封闭的) 细胞培养盘放入一个密封的塑料容器 (30 x 13 x 7 毫米), 并在25°c 时在黑暗中孵育。
- 在预定的时间点上, 在 VanT 中加入15Μl 的固定剂 (乳清棉蓝)。细胞, 让坐至少 5分钟, 以确保足够的真菌染色。之后, 小心地删除 VanT。并遵循上面的覆盖反演和数据采集步骤 (步骤 7.5-7.6)。对于数据分析, 请遵循 Gager2015 17中描述的方法, 通常将数据显示为appresyium 形成, 即总圆锥花序与在观察到的区域 (3.808 mm2) 中计数的上的闭皮血症的比率。
9. 基于红莓的苯提取物17
- 手收集红莓花 (6月; 100 克), 未成熟的果实 (两次;7月和 8月;200克), 和成熟的红莓水果在收获时 (10月; 200 克), 放入适当大小的塑料袋, 并在收集后立即在4°c 冷藏。使用上面概述的污染预防措施 (步骤 2.1)。
注意: 每次都会收集额外的植物材料, 但这些量可以防止提取明显受真菌感染的卵巢和水果 (出现疾病症状和体征)。 - 在提取之前, 取出任何恶化, 损坏, 患病的花朵, 然后只使用健康的花朵, 删除间隔, 花梗, 花冠, 柱头, 花柱和雄蕊弯曲钳 (45°推子), 并丢弃所有, 但卵巢。收集卵巢后, 以 1 wt:9 vol 的比率进行氯仿提取 (详见步骤 4.2-4.4, 仅使用卵巢)。储存样品, 直到所有其他提取物完成,即直到生物测定电导。
- 一旦收集到水果, 进行氯仿提取 (步骤 4.2-4.4, 使用收集的水果而不是花), 但在90毫升氯仿中加入10克水果, 一旦提取, 使溶液蒸发到9毫升 (结果为10克: 9 毫升 Wt): vol 解决方案)。
- 在7月、8月和10月采集后立即进行提果。按上述步骤 (步骤 4.4) 存储, 直到收集到所有提取。在最后一次以氯仿为基础的果实提取物后, 对本试验收集的所有基于酚基的氯仿提取物进行氯仿生物测定并进行相应的分析 (步骤 8.1-8.6)。
Representative Results
这里给出的结果是使用这种方法可以进行的许多检测的几个例子。图 1是水基 fe 生物测定的图解指南, 并由图2作为补充 , 该图2与基于氯仿的 fe 生物测定一起进行。图 3提供了一个视觉指南, 说明在24小时对纤维进行微观评价时, 在水和氯仿生物检测 (比较 sdw 控制) 中可以预期的结果。图 4详细介绍了在红莓品种 "史蒂文斯" ch-FE 存在的情况下, 与c. fioriniae进行的24小时时间过程研究, 并对这项研究的一个重要结果给出了视觉上的参考: fe 减少了形成感染结构所需的时间与 SDW 相比。图 5提供了一个使用红莓花卉雨水径流 (Cb "花" rw-FE) 从覆盖物生物测定中收集的数据示例。图 6代表了另一个重要的结果: 花卵巢 ch-fe 比水果 ch-FE 更具有刺激性, 表明了开花在金银花生命周期中的重要性.补充照片和电影提供了在提取和花卉雨水收集装置的部署中使用的花的重要视觉效果, 以及电影, 可视化的活动和被动提取( 水基) 过程。
图 1: 水性花卉提取物 (fe) 生物测定的概述.本方法用于蓝莓和红莓花的水基花卉提取物:活性花提取物 (活性-fe)、被动花提取物 (通-fe) 和花卉雨水径流 (rw-fe)。-Fe 部分通常构成实验/变量因子。相反-fe 部分可以保持不变, 接种后的时间点可以评估。在200X 放大倍率下, 人们倾向于进行4个场分析。缩写: 无菌去离子水, SDW;每个视图字段的面积, A. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 基于氯仿的花卉提取物 (ch-fe) 生物测定的概述.该方法用于蓝莓和红莓 (花、卵巢和水果)。本试验只使用了一种水处理混合物, 1份孢子悬浮液为 2份 SDW (以保持由于 ch-FE 蒸发而使锥形浓度一致)。该检测方法可用于比较多个 ch-FE (来自不同工厂表面的蜡), 或使用单个 ch-FE 在接种后的多个时间点。缩写: 无菌去离子水, SDW;范·铁格姆 [玻璃] 细胞, VanT。细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 在水性 fe 和 ch-FE 存在的情况下, 对纤维的视觉比较。本试验中, 蓝莓 ' bluecrop '(活性-fe, 水基) (真菌分离物: BB#10) 和红莓 ' Stevens ' 氯仿的氯仿 (ch-FE) (真菌分离物: CB-PMAP182) 花提取物与 sdw 对照进行了比较。在接种后24小时内, 在 SDW (对照) (a) 与活性-fe (b) 存在的情况下比较圆锥花序时, 观察到二次凝固 (环)和基尖形成 (箭头) 急剧增加。然而, 在比较氯仿生物测定 SDW 控制(c)与 ch-FE (d)时, 二次凝固并不明显;相反,金银花的生长向足前形成转变。显示的是对每种提取类型的常见反应, 水基和氯仿为基础, 无论描述的女主人/花卉品种。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 在 ch-FE 的存在下, 与Colletotrichum fioriniae进行时间过程研究 (24小时).在本试验中, SDW 控制(a-d)和红莓 "Stevens" ch-FE ( e-f)在接种后的0、6、12和24小时进行了目视检查 (这是一个可变时间点的示例, 而不是比较多个 fe)。在 ch-FE 中, 在6小时开始的吸收物 (箭头), 并在随后的时间点中稳步增加。这导致在开花期间无法找到病原体生物学的一个重要因素: 鲜花减少了形成感染结构所需的时间。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 在生物测定中以图形方式显示使用 rw-FE 收集的数据.雨水从红莓花 (CB "花" rw-FE) 和未触及任何红莓植物组织 ("地面" rw-FE) 的原生雨水流出, 再加上标准的活性、红莓水基花提取物 (cb活性-结果控制) 和 SDW (负对照) 进行了水基盖板生物测定, 并对其生长进行了评价。CB "花" rw-FE 在接种24小时后具有与标准 CB 活性-fe相同的次生结合和附着物形成水平, 表明收集装置能有效捕捉接种后释放的花卉兴奋剂。湿事件。总圆锥花序由原生 (沉积)、圆锥花序和新形成的次生圆锥花序组成。根据 Fischer 的最小显著差异试验 (LSD), 字母表明在p < 0.05 时存在显著差异;大写, 总圆锥花序;小写, 中风。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 基于越橘物候的 ch-FE 生物测定, 目视检查.水果腐烂真菌的病害管理往往涉及开花时间杀菌剂的应用。在这里, 红莓氯仿基提取物 (Ch-fe) 从多个生长阶段的红莓 ("史蒂文斯") 的视觉评估表面蜡的影响, 在24小时后的菲奥里奈。6月采集的卵巢(a)、7月和 8月采集的未成熟水果 (b、c)、10月采集的水果 (d )以及 sdw 控制( e) 是否有顶层形成 (箭头)。卵巢 ch-FE 具有最大的表位形成, 表明这种植物物候 (开花) 对银杏叶的生命周期至关重要。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 蓝莓花序.蓝莓花被收集提取在盛开期间 (4-5月在新泽西州, 美国) (显示 "蓝莓")。注意与补充图 2 (红莓直立) 相比, 相邻花朵的花冠卵巢重叠, 花序的整体结构也有重叠。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 2: 越橘直立.在盛开的时候 (美国新泽西州 6月至7月) 收集了红莓花进行提取 (显示为 "史蒂文斯")。注意在单个红莓花序 (直立) 上的不同花阶段, 和钩, 水滴保持花冠的形状。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 3: 蓝莓雨水调配 (花).完成蓝莓花雨水收集装置, 直接放置在一簇花序下。请注意用于垂直定位设备的塑料涂层线。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 4: 蓝莓雨水调配 (茎).完成蓝莓花雨水收集装置, 放置在茎的一半之间的花序和树冠的灌木。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 5: 蓝莓雨水调配 (冠).完成蓝莓花雨水收集装置, 放置在灌木丛的底部 (冠)。请注意, 如无必要, 可拆除塑料涂层电线。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 6: 蓝莓雨水调配 (地面).完成了原始雨水收集装置, 放置在蓝莓灌木附近。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 7: 越橘雨水调配 (特写).完成了红莓花卉雨水收集装置, 两个立柱夹在整齐交叉的电线下。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 8: 越橘雨水的调配.多个完成的红莓花雨水装置部署在一个沼泽。请点击这里查看此图的较大版本.
补充电影 1: 有源, 水基花卉提取物 (活性-fe).步骤 2.3-2.5.1 的补充视频支持。使用了蓝莓 "蓝莓" 花。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
补充电影 2:被动, 水基花卉提取物 (通过-fe).步骤 3.3-3.4 之后的补充视频支持。使用了蓝莓 "蓝莓" 花。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
补充电影 3: 部署红莓花卉雨水收集装置。步骤6.4 后的补充视频支持。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
Discussion
检测金银花对花卉提取物 (fe) 反应的生物检测是为蓝莓和红莓果实腐烂的病理系统开发的, 但可以很容易地适应其他园艺作物。上面详细介绍的协议在获取许多重要数据集方面很有价值, 包括但不限于: 有限元效应对多种病原体的多种分离物的影响, 与各种 Fe 存在的真菌生长阶段有关的时间过程信息,提取工艺的比较, 对不同化学物质生长和分化的检测, 单个花器官提取物的评价, 在 fe 存在过程中温度对金银花的影响, 影响物候依赖性蜡提取, 和花卉雨水的影响。通过使用这些技术, 所产生的数据也提供了一个更清晰的理解 , 以及部分阐明为什么开花期是如此关键的控制许多水果腐烂病原体。
最初, 所有的花都是与活性-fe 相同的加工方式, 但提取过程已经转向使用整朵花。花解剖很耗时, 对由此产生的 Fe 的生物活性影响很小。然而, 个别花卉器官可以并已评估使用此协议, 但必须非常小心, 以不完全浸渍花卉组织 (补充电影 1, 在步骤2.3 中详细说明的预防措施), 因为这可能会导致释放真菌-毒/静态化合物进入 FE, 可能扭曲的微观评价。侵入性较低的提取, 如通过-Fe (补充电影 2) 和 rw-fe 现在更有利, 因为它们易于获取。此外, 这些萃取技术只需要真空过滤, 即可获得生物活性的花卉化学线索。
所有提取过程中使用的花通常在提取制备前冷藏0-3。该协议面临的挑战是 FE 周转的时间管理 (通过存储提取物进行现场收集)。来自多个来源和日期的大量样本加剧了这种情况。由于解冻的花朵似乎变质和变色, 冷冻的花朵没有得到任何真实程度的评估。然而, 一旦水基 Fe 制备出来, 反复的冷冻和解冻对 FE 的生物活性没有影响, 因此只要生物制剂 (活3年的 FE) 后 fe 迅速再冷冻即可。
以氯仿为基础的萃取通过 ch-FE 蒸发玻璃覆盖物, 可以研究二维平面上的病原体对三维花果表面蜡的反应。然而, 从 ch-FE 沉积的蜡的实际结晶结构不可能与收集它们的表面相同。这意味着, 补充技术应实施, 如果真菌反应特定的蜡结构在体内是主要的研究重点。与水性提取物相比, 氯基提取物需要更多的存储维护。除了将 ch-FE 提取物保持在黑暗中之外, 还需要定期检查 PTFE 内衬细胞培养管盖和副室密封包装是否有蒸发泄漏, 并在必要时更换。
监测雨水径流的概念植根于推进特定地点疾病监测工具的理念。雨水收集装置可以适应许多其他工厂建筑, 只要收集装置收集的雨水已经用完的鲜花。这种方法提供了关于任何特定时间是否存在于现场的花卉刺激的信息, 可以在整个季节进行监测。或者, 收集设备可以部署在多个树冠位置, 以确定在任何特定的润湿事件中, 花的线索被清洗了多远。在未来的实验中, rw-FE 将规定杀菌剂的应用何时开始, 何时可以安全地结束。此外, 通过监测物候依赖性蜡萃取 (协议第9节), 绽放期对病原体生物学的重要性变得更加明显。这一节还包括在其中, 以显示这些生物鉴定的灵活性, 提供的方法, 允许并排比较东道国表面的蜡, 暂时分离。使用花萃取技术和生物鉴定生成的数据是病原体刺激的有形指标、对病原体生物学很重要的特定化学类别以及未来控制策略的目标。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢威廉·海因斯、老红莓研究基金和新泽西蓝莓和越橘研究委员会的支持。我们还感谢詹妮弗·瓦希乌纳斯 (指导和花卉准备)、克里斯汀·康斯坦特洛斯 (真菌文化和花卉制剂)、大卫·琼斯 (花卉制剂和提取)、兰利·乌德曼斯 (花卉制剂、电影摄影)、杰西林奇 (花卉准备), 罗克珊·图姆纳利斯 (一般支持), 和众多的学生/暑期实习生。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
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