COLLETOTRICHUM fioriniae Développement dans l’eau et des extraits floraux axée sur le chloroforme aux bleuets et aux canneberges

Summary

Ici, les essais biologiques conçus pour suivre l’évolution d’un pathogène fongique, Colletotrichum fioriniae, en présence de bleuet ou canneberges extraits floraux sur couvre-objet en verre sont décrites. Eau - chloroforme- et l’eau de pluie de champ - basent florale extraction techniques sont détaillées ainsi que de mieux comprendre comment cette information peut être appliquée.

Abstract

Pour surveiller avec précision la phénologie de la période de floraison et de la dynamique temporelle des signaux chimiques florales sur champignons fruits pourris des agents pathogènes, ont élaboré des méthodes d’extraction floral et lamelle bioessais utilisant Colletotrichum fioriniae. Bleuet et la canneberge, cet agent pathogène est parfaitement contrôlé par application de fongicides au cours de la période de floraison en raison du rôle de fleurs dans les premiers stades de l’infection. Le protocole détaillé ici décrit comment florales extraits (FE) ont été obtenues à l’aide de l’eau - chloroforme- et méthodes de terrain axée sur l’eau de pluie pour un usage ultérieur dans les essais biologiques lamelle de verre correspondant. Chaque FE a servi à fournir un ensemble différent d’informations : réponse de c. fioriniae à mobilisé chimique floral cues dans l’eau (à base d’eau), réponse de pathogène à fleur et fruit surface cires (axée sur le chloroforme) et sur le terrain suivi de recueillies floral eau de pluie, se déplaçant en vitro observations au milieu agricole. Le FE est largement décrite comme soit - ou chloroforme-à base d’eau, avec un bioessai appropriée décrite pour compenser les différences inhérentes entre ces deux matériaux. Eau de pluie qui avait couler de fleurs a été capturé dans les dispositifs uniques pour chaque culture, faisant allusion à la souplesse et l’application de cette approche pour d’autres systèmes de culture. Les tests biologiques sont rapides, peu coûteux et simple et offrent la possibilité de générer des informations spatio-temporelles et in sites sur la présence de stimulateurs florales composés provenant de diverses sources. Cette information en fin de compte mieux éclaireront des stratégies de gestion de la maladie, que FE réduire le temps nécessaire pour l’infection de se produire, donnant ainsi un aperçu en changeant les risques d’infection par des pathogènes pendant la saison de croissance.

Introduction

COLLETOTRICHUM fioriniae provoque une pourriture des fruits de bleuet en corymbe (Vaccinium corymbosum L.) et le grand américain Cranberry (V. macrocarpon Aiton)^1,2. Ce pathogène a été récemment délimité de la c. acutatum espèce complexe^3,4,5,6 et est un agent causal de l’anthracnose du bleuet et membre de la pourriture du fruit de canneberge complexe, en plus de causer de nombreuses autres plantes des maladies dans le monde⁷. C. fioriniae a un hemibiotrophic latente, mode de vie⁸, souffrant d’infections survenant au cours du développement de bloom et symptôme ne pas évident jusqu'à ce que les fruits soient en phase finale de maturation⁹. Dans le bleuet et la canneberge, pourriture des fruits est seulement maîtrisée avec des applications de fongicides réalisées pendant la période de floraison. L’agent pathogène hiverne au bleuet dormants bourgeon floral échelles¹⁰ et sporule pendant la floraison. Les conidies sont déplacés tout au long de la voile par les éclaboussures de pluie dispersion^11,12 et accumulation de l’inoculum a été fortement corrélée à la période de floraison¹³. Réponse de Colletotrichum espèces aux fleurs de l’hôte n’est pas unique à Vaccinium, fleurs sont importants composants des fruits de citrus post floraison drop (PFD)¹⁴ , mais aussi fraise anthracnose¹⁵, dans les deux cas causant l’agent pathogène à sporuler. Tous ces cas soulignent la nécessité de méthodes efficaces pour évaluer la dynamique temporelle des signaux chimiques florales sur c. fioriniae et autres agents pathogènes qui infectent pendant la floraison. Les renseignements fournis par les méthodes décrites ici sont de plus en plus plus précieux.

Ce protocole détaille les méthodes d’approvisionnement extrait floral (FE) et guide de l’évaluation des réponses de c. fioriniae à FE via verre couvre-objet bioessais^15,16. Les techniques d’extraction floral sont divisées en deux types principaux ; extractions à base d’eau (actif-FE, passive (pass -FE) et champ axée sur l’eau de pluie (rw-FE)) et les extractions de¹⁷ axée sur le chloroforme (ch-FE). Les extractions aqueux permettant l’inspection des signaux chimiques floral eau mobilisée. Ces repères mobilisés sont des éléments importants susceptibles de la Cour de l’infection, puisque FE augmente considérablement la vitesse de l’infection à¹⁶, en plus de fournir l’humidité nécessaire pour l’infection de se produire. En outre, ils représentent un état plus naturel comme stimulation florale peut être lavée tout au long de la voile au cours du mouillage-événements comme déjà observée dans les bleuets et autres cultures systèmes^14,16. Les extractions florales axée sur le chloroforme (ch-FE) fournissent également des informations précieuses relatives à la réponse de pathogènes à la surface de l’hôte cires^17,18, élucider les premiers stades de croissance des conidies, une fois déposés sur sensibles organes de l’hôte (ovaires,c'est-à-dire de fleurs et fruits en développement). Réponse de pathogène aux changements saisonniers dans les cires surface hôte peut être également surveillée à l’aide de ce protocole. En conséquence, les essais biologiques sont conçus pour travailler avec FE aqueux ou FE axée sur le chloroforme pour atténuer les différences inhérentes entre ces deux matériaux.

Les données générées par les bio-essais ont révélé que les extractions aqueux stimulent des niveaux plus élevés de conidies secondaires que les extractions axée sur le chloroforme où il y avait une réponse définitive appressorium, donc impliquant plusieurs composés présent dans le FE. Fait intéressant, les deux de ces réactions de croissance ont été observées quand à l’aide d’eau de pluie qui avait couru hors de fleurs de bleuet et la canneberge, indiquant plusieurs composés stimulants peut être lavé à la surface des fleurs. Ainsi, suivi de stimulation florale se donnent un aperçu de la probabilité de succès de pathogène dans un système agricole.

Le but ultime de ce protocole est de fournir une méthodologie de production information biologique de base sur les agents pathogènes fongiques des plantes en réponse à des signaux chimiques florales ainsi que responsable méthodologies qui peuvent utiliser cette information florale pour aider à les maladies propres au site gestion et les processus décisionnels.

Protocol

1. fongiques isolats et Suspensions de spores

1. Isolent Colletotrichum fioriniae un hôte infecté naturellement¹⁹. Ensuite, rangez les cultures propres sur les pentes de gélose (CMA) de semoule de maïs. Placer le bouchon de culture (à partir de la pente de CMA) sur une culture cellulaire en plastique standard plat (9 cm de diamètre) contenant que soit clarifié V8 jus gélose (cV8A) (modifié d’après 1955 Miller), ou non-précisé V8 jus gélose (V8A)²⁰. Quand les colonies commencent à sporuler, strier les conidies (masses conidiennes orange) sur un autre cV8A ou V8A contenant plat culture cellulaire (avec une boucle stérile standard) pour produire une culture à haute densité de sporulation.
   Remarque : Aucune mesure de protocole avec des champignons doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire pour réduire les risques de contamination de cultures fongiques et/ou biologiques.
2. Après que 7 jours de croissance, à l’aide d’une anse stérile standard recueillir une petite quantité de conidies de la culture à haute densité (en appuyant légèrement sur la boucle à la masse de conidies) et incorporer cela dans un tube à centrifuger 15 mL contenant 10 mL d’eau désionisée stérile (SDW). Vortex cet exemple pour 10 s, puis à l’aide d’une pipette standard plonge monter et descendre plusieurs fois au mélange encore l’échantillon.
3. Ensuite, déposez une goutte de l’échantillon de mixés sur le hémocytomètre et estimer les concentrations de spores. Nombre 5-10 champs sur l’hémocytomètre, obtenir la moyenne et multiplier la moyenne par le facteur de dilution appropriée (c.-à-d. 10 000), obtenant ainsi la concentration de conidies / mL SDW.
4. Puis à l’aide d’un volume (V) / équation de la concentration (C) (V₁● [C₁] = V₂● [C₂]) ajuster (avec SDW) à 1,0 X 10 conidies de⁵ millilitres de SDW avec un volume final de 5 mL. Ceci est dénommé la suspension de spores et ne s’effectue qu’immédiatement avant de les utiliser dans un test biologique.

2. actif, à base d’eau florale extraits (active -FE)^15,16

Remarque : Voir la Figure 1, la Figure 2, supplémentaire Figure 3et film supplémentaire 1.

1. Soigneusement main-collect blueberry (avril-mai) et canneberges fleurs (juin-juillet) au cours de leurs fleurs pointe respectives dans le domaine (la Figure 1). Porter et changer de gants en nitrile entre sites d’échantillonnage (emplacements des cultivars et variétés/physiques) pour empêcher la contamination de l’huile de la peau humaine ainsi que la contamination croisée entre variétés florales. Placez les fleurs de bleuet ou canneberge (d’une source unique) dans des sacs en plastique (remplir un sac de 100 x 150 mm) et réfrigérer immédiatement à 4 ° C une fois que les fleurs sont recueillies.
   Remarque : L’extraction active - est modifiée par Leandro et al. (2003) ¹⁶.
2. Avant l’extraction, enlever les fleurs détériorés, endommagés, malades, puis à l’aide de fleurs sains enlever les ovaires, les sépales et les pédoncules avec une pince courbe (45 ° pincettes) et jeter. Utilisez uniquement les organes restants (corolla, stigmatisation, style et étamine) pour active - extractions. Couper la toile de coton (150 x 150 mm) et placer dans un entonnoir de 7 x 7 mm, placer dans un tube à centrifuger propre 50 mL et mis de côté.
3. Mélanger 1 partie transformés fleurs à 9 parties SDW (1 wt : 9 ratio de vol) dans un mortier. Doucement broyer avec un pilon pendant 30 s (attention pas complètement pulvériser les échantillons). Souche résultante pâtes préparées étamine/entonnoir et s’accumuler dans le tube à centrifuger (50 mL). Nettoyer ou utiliser le nouveau mortier/pilon entre chaque extraction avec 95 % EtOH et l’eau courante tiède.
4. Préparer un appareil de filtration sous vide : rassembler l’entonnoir Buchner, fiole d’Erlenmeyer de filtre à vide (jusqu'à 1 000 mL de capacité), papier filtre de 55 mm cercle et tuyau/source de dépression. Ajouter filtre papier à un entonnoir de Buchner taille approprié et placer au sommet de la fiole, puis connecter l’appareil à une eau / d’aspiration source via le tuyau d’aspiration et mis de côté.
5. Clarifier les extraits floraux de bleuets par centrifugation pendant 10 min à 8 055 x g. Décanter le surnageant dans appareil filtre à vide prêt, allumez la source de vide, filtrer le liquide surnageant, puis versez le contenu de la fiole dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL). Nettoyer tous les composants d’appareils entre chaque filtration 95 % EtOH et l’eau courante tiède. Filtre supplémentaire grâce à une seringue adaptée avec un 0,22 µm taille des pores, acétate de stérilisation, filtre dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL).
   1. Pour les extraits de canneberge florales, l’aspirateur seulement filtrer sur papier filtre et versez le contenu de la fiole dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL).
6. Préparation en résultant est dénommée active- extrait floral (active -FE). Conserver tous les extraits floraux aqueux (active-, passif-, collections d’eau de pluie) à-20 ° C en aliquotes de 5 à 50 mL jusqu'à l’utilisation expérimentale. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons (au moins 3 extractions par type d’échantillon) pour donner la réplique.

3. passif , à base d’eau florale extraits ( pass -FE) ¹⁶

Remarque : Voir film supplémentaire 2.

1. La main de fleurs de bleuets entiers frais virés (50 g) comme indiqué ci-dessus et réfrigérer après avoir recueilli. Avant l’extraction, enlever les fleurs détériorés, endommagés, malades et supprimer uniquement les pédoncules de fleur intact. Réfrigérer les échantillons préparés jusqu'à ce que le passif - système d’extraction, décrit ci-dessous, est en place.
2. Rincer tous les éléments avant toute utilisation avec 95 % d’éthanol (EtOH) et l’eau chaude pour éviter la contamination (feuille de maille en plastique, deux paniers de maille en plastique, verre moule à pain et flacon de brume de pompe). Également préparer un tube à centrifuger étamine/entonnoir/50 mL 4 couches pour chaque extraction décrites ci-dessus (à l’étape 2.2) et mettre de côté.
3. Préparer le tamis : Placez une feuille de plastique maille (alias claire bar tapis) dans une maille en plastique, panier (114 x 102 mm). Placez un panier de deuxième, identiques, maille envers (inversées) dans un verre-moule à pain (127 x 229 mm) (pour éviter les fleurs assis dans SDW) et placez le maillage feuille contenant panier au sommet. Ajouter 50 g de fleurs disposés dans la passoire.
   NOTE : Vous pouvez également paniers petit tube à essai [nettoyage] peuvent être utilisés à la place les paniers utilisés à l’origine de la maille en plastique (maille vieux, vert, fraise pinte paniers sont souvent difficiles à la source).
4. Uniformément fleurs de brume avec 250 mL à l’aide d’une pompe à flacon de brume et capturent des eaux de ruissellement dans le moule à pain verre. Puis filtrer le filtrat dans l’étamine/entonnoir préparé dans un tube à centrifuger propre. Préparation en résultant est dénommée passif- extrait floral (pass -FE) ; stocker comme indiqué ci-dessus (étape 2.6).
5. Nettoyer tous les composants entre chaque extraction avec 95 % EtOH et l’eau courante tiède. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons pour fournir la réplique (au moins 3 par type d’échantillon).

4. chloroforme-basé des extraits floraux (ch-FE) ¹⁷

1. Recueillent les fleurs de bleuet et la canneberge comme indiqué ci-dessus (étape 2.1) et préparer les fleurs pour l’extraction (étape 2.2, sans préparation d’étamine/entonnoir). Gardez les fleurs préparés au réfrigérateur jusqu'à ce que, avant utilisation.
   1. Tout travail effectué par le chloroforme doit être effectuée sous une hotte pour des raisons de sécurité. Cela comprend la préparation de matériaux / verrerie, procédés d’extraction et dosage biologique la conductance (étapes à l’aide de ch-FE).
2. Nettoyer tous les composants dont 95 % EtOH deux fois, puis deux fois avec du chloroforme pour prévenir la contamination pour chaque extraction : filetage de tubes de culture de verre, 2 béchers en verre, en acier inoxydable petit écran et un cylindre supérieure [verre]. Mettre de côté à sécher à l’envers. Rincer les casquettes de polytétrafluoroéthylène (PTFE) doublé deux fois avec 95 % EtOH seulement (chloroforme peut endommager les matériaux extérieurs de la PAC) et mettre de côté à sécher.
3. Mélanger 1 partie transformés fleurs à 9 parties chloroforme (1 wt : 9 ratio de vol) dans un bécher (fleurs puis chloroforme), doucement tourbillon pour 30 s et la souche à travers un tamis en acier inoxydable dans le deuxième bol. Versez ch-FE du deuxième bécher dans le tube à culture de verre (10-15 mL) et fixez le bouchon PTFE. Envelopper le bouchon avec du parafilm pour éviter l’évaporation.
4. Cette préparation est l’extrait floral axée sur le chloroforme (ch-FE). Stocker l’échantillon dans l’obscurité (pour réduire la dégradation légère) à 4 ° C jusqu'à l’utilisation expérimentale. Répétez les extractions avec plusieurs échantillons pour fournir la réplique (au moins 3 par type d’échantillon).

5. collecte des eaux pluviales de fleurs de bleuet (BB rw-FE)¹⁶

Remarque : Le dispositif de prélèvement de pluie florale bleuet se compose d’une coupe de pulvérisation air pistolet peinture jetable avec adaptateur de connexion (coupe : filetage femelle, adaptateur : filetage mâle), tubes de centrifugeuse 50 mL (polypropylène), parafilm et fils enrobés en plastique ( fil téléphonique standard, contenu de brin de fil interne).

1. Sélectionnez plusieurs emplacements au sein d’un buisson de myrtilles pour capturer exécuter hors de fleurs avant de créer des dispositifs de prélèvement de l’eau de pluie. Il s’agit directement sous les inflorescences (fleurs) à la base même de la brousse (couronne). Record diamètre des tiges (allant de 1 à 5 cm) à certains endroits, car cela déterminera la taille des trous utilisés pour la fixation de l’appareil, décrite ci-dessous.
2. Pour chaque emplacement sélectionné créer un dispositif de collecte. Tout d’abord percer un trou au fond d’une tasse de pulvérisation (où les courbes de la coupe vers l’ouverture filetée) le diamètre de tige correspondant, avec un étape-peu attaché à une presse de foret. Ensuite, couper une ligne droite du haut de thehole jusqu'à l’embouchure de la coupe de la pulvérisation. Percez 4 trous équidistants (assez grands pour fil le fil enduit en plastique), à l’embouchure de la coupe de pulvérisation et fixer une extrémité des câbles en plastique enduits laissant une extrémité libre.
3. Percer un trou assez grand pour visser l’adaptateur de tasse de pulvérisateur de peinture dans un couvercle de cap de centrifuger de 50 mL. Etouper adaptateur filetage avec parafilm pour éviter des fuites. Fixez-la au cap de la centrifugeuse et la partie filetée de la Coupe du pulvérisateur. Fixer le tube à centrifuger accouplées 50 mL.
4. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 pour créer plusieurs périphériques selon les endroits choisis, un minimum de dispositifs de prélèvement 4 par site d’échantillonnage.
5. Déployer des dispositifs à des endroits choisis par flexion tasses pulvérisateur pour les poser sur les tiges. Orientez la côté coupé de la coupe de pulvérisation vers le haut en utilisant les fils gainés attachés aux autres tiges (pour assurer l’eau passant sur les fleurs est capturé). Apposer parafilm ouvertures qui pourraient couler l’eau de pluie. (Supplemental Figure 3, supplémentaire Figure 4, supplémentaire Figure 5et supplémentaire Figure 6).
6. Tubes de prélèvement d’étiquette avec déploiement date / heure. Après un pluie-événement, enlever et remplacer la partie inférieure (tube) du tube à centrifuger (étiquette de date / heure de collection). Apportez des collections de ruissellement (dénommées extrait floral de bleuet l’eau de pluie (BB rw-FE)) à l’intérieur et aspirateur filtre (filtration décrite dans les étapes 2,4-2,5). Magasin comme ci-dessus (étape 2.6), jusqu'à utilisée dans un bioessai à base d’eau.

6. collecte des eaux pluviales de Cranberry fleurs (CB rw-FE)

1. Le dispositif de collection florale eau de pluie dans la canneberge se compose d’un entonnoir en polypropylène 7 X 7 cm, tubes de centrifugeuse 50 mL (polypropylène), parafilm, et 4 standard, en plastique enduit attaches (par appareil).
2. Tout d’abord, chaleur perforer 8 trous équidistants (diamètre des attaches) autour de la bouche de l’entonnoir à l’aide d’une sonde métallique. Insérer les attaches dans les 4 trous. Fixez l’autre extrémité à endroit opposé des que trous, formant un modèle de croisement soignée. Envelopper l’entonnoir vers le bas-tige avec du parafilm et mettre de côté.
3. Percer un trou assez grand pour insérer la tige vers le bas entonnoir dans un bouchon de centrifuger de 50 mL avec un étape bits. Insérer entonnoir préparé dans le capuchon de la centrifugeuse. Répétez les étapes 6.2-6.3 pour créer plusieurs périphériques, moins collection 4 unités par site d’échantillonnage.
4. Déployer périphériques marqués (date/heure) dans des tourbières canneberges sélectionnés. Soigneusement rentrez deux inflorescences fleur roulement (appelées pousses) sous les attaches en plastique croisées. Ensuite verticalement orienter l’appareil en perçant le tube à centrifuger dans la canopée de canneberge (Supplemental Figures 7 et 8, Supplemental Movie 3).
5. Après la pluie ou les frais généraux d’irrigation, enlever et remplacer la partie inférieure (tube) du tube à centrifuger (étiquette date / temps de collection). Amener les eaux de ruissellement (dénommée extrait floral de canneberge eau de pluie (CB rw-FE)) à l’intérieur et aspirateur filtre (filtration décrite dans les étapes 2,4-2,5). Magasin comme ci-dessus (étape 2.6), jusqu'à utilisée dans un bioessai à base d’eau.

7. essai biologique à l’aide d’extraits d’eau basée Floral^15,16 (active-FE, passer-FE, rw-FE)

Remarque : Voir la Figure 1.

1. Cet essai biologique est préparé dans une hotte à flux laminaire. Préparer du matériel : lamelles de verre triple rinçage avec 95 % EtOH et l’air sec, puis mettre de côté. Couper les disques de serviette de papier du diamètre interne d’un pétri de cellule en plastique standard (9 cm). Mettre 2 couches de disques de papier dans les récipients de culture et tremper avec 2 mL SDW.
2. Préparer au moins 5 mL de 1,0 X 10 conidies⁵ millilitres de SDW suspension de spores (c. fioriniae) comme indiqué ci-dessus (étape 1.2 à 1.4), mis de côté. Ensuite, mélanger des quantités égales de SDW et extrait floral aqueux dans 2 mL tubes de microcentrifuge. Puis, ajouter un volume égal de la suspension de spores sur les tubes de microcentrifuge préparé 2 mL (SDW plus FE) ; la préparation en résultant est dénommée un mélange aqueux de traitement. Pour le contrôle, omettre la partie FE et remplacez par SDW, pour assurer la cohérence des concentrations de conidies.
   Remarque : taille de la portion dépend de nombre de réplicats et points dans le temps. En règle générale, les parties ne dépassent pas 500 µL. Une fois que les conidies et FE sont combinées l’essai biologique a commencé, après l’inoculation de 0 h.
3. Placez les lamelles de verre préalablement nettoyé sur le dessus de l’essuie-tout imbibé dans le plat de culture cellulaire. Placez une goutte de 40 µL du mélange de traitement aqueux sur le centre d’un lamelle couvre-objet. Répéter pour les traitements souhaités, y compris le contrôle, fermez la boîte de Petri de cellule. Répéter dans les récipients de culture de cellule séparée des réplications (au moins 3) et de points de temps (chaque plat est pour 1 point dans le temps). Une fois que tous les traitements et les réplicats ont été distribués, tous les récipients de culture de cellule répliqué dans un récipient hermétique en plastique (30 x 13 x 7 mm) et incuber à 25° C dans l’obscurité.
4. À des moments prédéterminés, ajouter 10 µL de fixatif comme lactophénol coton-bleu (cristaux de 20,0 g de phénol, 20,0 mL 2,5 % l’acide lactique, glycérol 40,0 mL, coton de 0,05 g bleu) dans les gouttelettes, arrêtant la croissance et semi-préserver la monture.
   1. Attendre 2 h pour recueillir le point de temps 0 h comme cela permet l’adhésion conidiale à la surface du verre, mais n’est pas assez long pour la germination des conidies. Pour tous les autres points dans le temps, ajouter le fixateur au moment correspondant.
5. Après avoir ajouté un fixateur, soigneusement inverser les lamelles, plaçant côté goutte vers le bas sur une lame de microscope de verre pour faciliter l’examen microscopique (1 lamelle par lame). Lorsque toutes les lamelles sont sur les lames de verre, les laisser s’installer et partiellement secs sous la hotte à flux pendant 20 min.
6. Compter que toutes les conidies (totales conidies) présentent sur la lamelle couvre-objet (conidies primaires, germination des conidies et nouvellement formé de conidies secondaires) ainsi que de l’appressorium soit 400 X grossissement (compter 16 champs) ou 200 X (en comptant 4 champs), totalisant une superficie de 3,808 mm ². reproduire tout essai biologique pour l’analyse statistique. Pour les tests à l’aide de FE à base d’eau, analyser les données comme décrit dans Waller et al. 2017¹⁶, généralement affiche aussi dire comte/mm² (totales conidies ou appressoria).

8. bioassay aide axée sur le chloroforme Floral extraits (ch-FE)¹⁷

Remarque : Voir la Figure 2.

1. Préparer les matériaux et cellules pétri comme indiqué ci-dessus (étapes 7.1). En outre, rincer un nombre égal de Van Tieghem (VanT. cellules) (8 mm OD, 6 mm ID) à lamelles couvre-objet, mais aussi une pipette de verre (1 mL avec des incréments de 1 µl) au sein d’une hotte aspirante, (deux fois avec 95 % EtOH puis deux fois avec le chloroforme) et mettre de côté.
2. Sous hotte à flux laminaire, à l’aide d’un tube de microcentrifuge de 2 mL ajouter deux volumes égaux (au moins 500 portions de µL) de SDW et 1 volume de suspension de spores, puis mettre de côté. C’est le mélange aqueux de traitement pour les essais biologiques ch-FE.
3. Sous une hotte, placer un VanT. cellule sur une lamelle de verre dans le plat de culture cellulaire en plastique disposés. Distribuer (avec pipette en verre) 33 µL de désiré ch-FE dans le centre de la cellule T. Van (ne pas toucher les parois de la VanT. Cellule ; pour le traitement de la commande, ajouter chloroforme vierge) et laisser pour sécher. Répéter dans les récipients de culture de cellules distinctes pour des réplications (au moins 3).
4. Une fois que les ch-FE a séché, distribuer 99 µL du mélange préparé traitement aqueux avec une pipette standard dans le centre de la VanT. cellule, puis fermer tout pétri de cellules. Une fois le mélange aqueux traitement a entrer en contact avec les traitements secs ch-FE, l’essai biologique a commencé, après l’inoculation de 0 h.
5. Une fois que tous les traitements et les réplicats ont été distribués, tous les récipients de culture cellulaire (fermée) dans un récipient hermétique en plastique (30 x 13 x 7 mm) et incuber à 25° C dans l’obscurité.
6. À des moments prédéterminés, ajouter 15 µL de fixatif (coton lactophénol bleu) à le VanT. cellule et laisser reposer pendant au moins 5 min assurer la coloration fongique adéquate. Passé ce délai, retirer soigneusement le VanT. cellulaire et suivez lamelle inversion et données acquisition étapes ci-dessus (étapes 7,5 à 7,6). Pour l’analyse des données, suivez les méthodes décrites dans Gager 2015¹⁷, généralement affichage des données de formation de l’appressorium, qui est le rapport des conidies totales d’appressoria comptés dans la zone de relevé (3,808 mm²).

9. canneberge Extractions axée sur la phénologie¹⁷

1. Main recueillent les fleurs canneberges (en juin ; 100 g), immatures de fruits (deux fois ; Juillet et août ; 200 g) et d’âge mûr canneberge fruit à la récolte (octobre ; 200 g), les placer dans des sacs en plastique tailles appropriée et garder au froid à 4 ° C immédiatement après le prélèvement. Utilisez les contamination des précautions décrites ci-dessus (étape 2.1).
   Remarque : Il y aura des végétaux supplémentaires prélevé à chaque fois, mais ces montants prémunir contre l’extraction des ovaires infectés évidemment fongiques et fruits (présentant les symptômes et les signes de la maladie).
2. Avant l’extraction, enlever les fleurs détériorés, endommagés, malades, puis à l’aide de fleurs seulement sains, enlever les sépales, pédoncules, corolles, stigmates, styles et des étamines avec une pince courbée (pincettes de 45 °) et jeter tous, mais les ovaires. Une fois que les ovaires sont collectées, effectuer l’extraction axée sur le chloroforme à une 1 wt : 9 ratio de vol (détaillée en étapes 4.2-4.4, en utilisant seulement les ovaires). Conserver les échantillons jusqu'à ce que tous les autres extractions sont complètes, c'est-à-dire jusqu'à la conductance bioassay.
3. Une fois que les fruits sont recueillis, réaliser une extraction axée sur le chloroforme (étapes 4.2-4.4, à l’aide de fruits récoltés au lieu de fleurs), mais ajoutent 10 g de fruit à 90 mL de chloroforme et une fois extrait, laissez agir la solution s’évapore dans 9 mL (conduisant à un poids de 9 mL 10 g : : solution de vol).
4. Faire les extractions de fruits immédiatement après le rassemblement en juillet, août et octobre. Stocker comme indiqué ci-dessus (étape 4.4) jusqu'à ce que toutes les extractions sont collectées. Après la dernière extraction de fruit axée sur le chloroforme, sous réserve de tous les extraits de chloroforme axée sur la pénologie recueillies pour ce dosage à l’essai biologique d’axée sur le chloroforme et analyser en conséquence (étapes 8.1-8,6).

Representative Results

Les résultats présentés ici sont quelques exemples des nombreux essais qui peuvent être effectuées à l’aide de cette méthodologie. La figure 1 est un guide illustré de l’essai biologique de FE à base d’eau et est complétée par la Figure 2 , qui fait suite à l’essai biologique du FE axée sur le chloroforme. La figure 3 fournit un guide visuel de ce qui peut être attendu lors de l’évaluation microscopique de c. fioriniae à 24 h, dans les deux essais biologiques sur aqueux et à base de chloroforme (comparativement SDW contrôles). Figure 4 détaille une étude temporelle de 24h avec c. fioriniae en présence de la variété canneberge « Stevens » ch-FE et donne des repères visuels à un résultat de l’importation de cette recherche : FE a réduit le temps nécessaire pour former des structures de l’infection par rapport à SDW. Figure 5 donne un exemple de données recueillies auprès d’un bioessai lamelle couvre-objet à l’aide de ruissellement de pluie floral cranberry (CB « Fleur » rw-FE). La figure 6 représente un autre résultat important : ovaire floral ch-FE est beaucoup plus stimulant que les fruits FE-ch, ce qui indique l’importance de la floraison du cycle de vie de c. fioriniae. Les photos supplémentaires et les films fournissent visuels importants des fleurs utilisées dans les extractions et les eaux pluviales floral collection appareils/déploiement, en plus des films que de visualiser la (extraction active et passive- procédés à base d’eau).

Figure 1 : Aperçu général de la base d’eau florale extrait biologique (FE). Ce test a été utilisé pour les extraits floraux aqueux avec des fleurs de bleuet et de canneberge : active -floral extraits (active-FE), passive -floral extraits (pass-FE) et le ruissellement de l’eau de pluie floral (rw-FE). Le - FE partie constitue généralement le facteur expérimental/variable. A l’inverse la - FE partie peut rester constant et temps points/heures après l’inoculation peut être évaluée. Préférence a été déposée vers 4 analyse de champ à un grossissement de 200 X. Abréviations : Eau désionisée stérile, SDW ; Surface / champ de vision, A. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Aperçu général des axée sur le chloroforme floral extrait biologique (ch-FE). Ce test a été utilisé pour les bleuets et les canneberges (fleurs, fruits et ovaires). Qu’un seul type de mélange aqueux de traitement a été utilisé dans cet essai, la suspension de spores partie 1 à 2 parties SDW (pour garder la concentration conidienne cohérente en raison de l’évaporation de ch-FE). Ce test permet de comparer plusieurs ch-FE (cires de diverses surfaces végétales), ou plusieurs temps points/heures après l’inoculation à l’aide d’un seul ch-FE. Abréviations : Eau désionisée stérile, SDW ; Cellules Van Tieghem [verre] VanT. cellule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Comparaison visuelle des Colletotrichum fioriniae en présence de FE à base d’eau et ch-FE. Dans ce bleuet dosage « Bluecrop » (active-FE, à base d’eau) (isolat fongique : BB #10) et canneberge « Stevens » axée sur le chloroforme (ch-FE) (isolat fongique : CB-PMAP182) extraits floraux ont été comparés aux contrôles SDW. Une augmentation spectaculaire de la conidiation secondaire (anneaux) et formation de l’appressorium (pointes de flèche) ont été observés lors de la comparaison des conidies en présence de SDW (control) (A) d’actif-FE (B) à l’inoculation après 24h. Toutefois, la conidiation secondaire n’était pas aussi apparente lorsque l'on compare le chloroforme bioessai SDW contrôle (C) ch-FE (D); au contraire, c. fioriniae de croissance s’est déplacée vers la formation de l’appressorium. Montré est une réponse commune à chaque type d’extraction, à base d’eau et base chloroforme, peu importe l’espèce hôte/floral décrit. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Étude de l’évolution temporelle (24h) avec Colletotrichum fioriniae en présence de FE-ch. Dans ce test, un contrôle de SDW (A-D) et de la canneberge « Stevens » ch-FE (E-F) ont été inspectés visuellement à 0, 6, 12 et 24 heures après l’inoculation (un exemple de points dans le temps variable au lieu de comparer plusieurs FE). Formation de l’appressorium (pointes de flèches) a commencé à 6 h dans la ch-FE et régulièrement augmenté au cours de périodes ultérieures. Ce résultats échappe à un facteur important de la biologie de l’agent pathogène pendant la période de floraison : fleurs réduisent le temps nécessaire pour former des structures de l’infection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Affichage graphique des données recueillies à l’aide de rw-FE dans un essai biologique. L’eau de pluie exécuter hors de canneberges fleurs (CB « Fleur » rw-FE) et des eaux de pluie vierge qui n’avait pas touché tout les tissus végétaux canneberge (« Ground » rw-FE) un événement unique en mouillant plus un standard active, canneberge floral extrait aqueux (CB active -FE) (contrôle positif) et SDW (témoin négatif) ont été soumis à un essai biologique à base d’eau lamelle et évaluées pour la croissance de c. fioriniae . CB « Fleur » rw-FE avait le même niveau de formation conidiation et appressorium secondaire comme le standard CB actif-FE à post-inoculation 24h, ce qui indique que les dispositifs de collecte ont été efficaces dans la capture des stimulants florales libérées pendant une mouillage-événement. Conidies totales est composé de primaire (dépôt), les conidies et les conidies secondaires nouvellement formés. Lettres indiquent des différences significatives à p < 0,05 selon différence significative moins de Fischer d’essai (LSD) ; conidies en majuscules, totales ; minuscule, appressoria. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Canneberge phénologie basée ch-FE bioessai, inspection visuelle à. Gestion de la maladie pour les fruits pourris des champignons souvent agit de floraison temps fongicide demandes. Ici, canneberges extraits axée sur le chloroforme (ch-FE) de plusieurs stades de croissance de la canneberge (« Stevens ») ont été visuellement évalués pour l’effet de surfaces cires sur c. fioriniae à l’inoculation après 24h. Ovaires prélevés en juin (A), les fruits non mûrs récoltés en juillet et août (B, C), récoltes de fruits récoltés en octobre (D)et un contrôle SDW (E) ont été inspectés pour la formation de l’appressorium (pointes de flèche). Ovaire ch-FE avait la plus grande magnitude de formation de l’appressorium, indiquant que la phénologie de cette plante (fleur) est essentiel pour le cycle de vie de c. fioriniae. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : inflorescence : Blueberry. Fleurs de bleuet ont été recueillies pour les extractions en pleine floraison (avril-mai dans le New Jersey, USA) (montrées « Bluecrop »). Notez le chevauchement des corolles/ovaires de fleurs adjacents et l’architecture globale de l’inflorescence, par rapport à la Figure 2 (canneberge verticale). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 2 : canneberge dressées. Canneberges fleurs ont été recueillies pour les extractions en pleine floraison (juin-juillet dans le New Jersey, USA) (montrées « Stevens »). Remarque les étapes de fleurs variées sur une seule inflorescence canneberge (verticale) et le crochet, goutte d’eau conservant la forme de la corolle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 3 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (fleur). Terminé-bleuet pluie floral collection dispositif, placé directement sous un cluster des inflorescences. Notez le fil plastifié à orienter verticalement l’appareil. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 4 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (tige). Dispositif de prélèvement de l’eau de pluie floral bleuet remplie, placé à mi-chemin vers le bas de la tige entre une inflorescence et la couronne de la brousse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 5 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (couronne). Complété le dispositif de collecte des eaux florales bleuet, placé à la base de la brousse (couronne). Remarque les fils enrobés en plastique peuvent être retirés si pas nécessaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 6 : déploiement de l’eau de pluie de bleuets (sol). Complété le dispositif de collecte des eaux pluviales vierge, placée à côté de bleuetiers. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 7 : déploiement de l’eau de pluie aux canneberges (close-up). Terminé-dispositif de canneberge pluie floral de collection, avec deux échelles repliées sous les attaches croisées soigneusement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 8 : déploiement de l’eau de pluie canneberge. Multiple complété appareils canneberge pluie floral déployés dans une tourbière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire 1 film : actifs, à base d’eau florales extracts (active -FE). Prise en charge vidéo supplémentaire suivant étapes 2.3-2.5.1. Myrtille « Bluecrop » fleurs étaient utilisées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

2 film supplémentaire : Passive, extraits floraux aqueux (pass-FE). Support complémentaire de la vidéo qui suit les étapes 3.3-3.4. Myrtille « Bluecrop » fleurs étaient utilisées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Supplémentaire Movie 3 : déploiement des dispositifs de prélèvement de canneberge floral eau de pluie. Support complémentaire de la vidéo qui suit étape 6.4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

Les essais biologiques sur la détection de la réponse de c. fioriniae aux extraits floraux (FEs) ont été développées pour le bleuet et la canneberge fruit rot pathosystems mais peut être facilement adaptée à d’autres cultures horticoles. Le protocole décrit ci-dessus a été précieux dans l’acquisition de plusieurs ensembles de données importants y compris, mais sans s’y limiter : des effets sur plusieurs isolats de nombreux pathogènes, temps d’informations se rapportant à des stades de croissance fongique en présence de FEs divers, FE comparaison des techniques d’extraction, inspection des produits chimiques individuels sur fioriniae c. croissance et la différenciation, évaluation des organes individuels fleur extraits, effets de la température sur le c. fioriniae , tandis qu’en présence de FE, effets de phénologie cire dépendant extractions et les effets de l’eau de pluie floral. Grâce à l’utilisation de ces techniques, les données générées ont fourni une compréhension beaucoup plus claire de la vie de c. fioriniae met en scène et élucide partiellement pourquoi la période de floraison est cruciale pour le contrôle de nombreux fruits pourris des agents pathogènes.

Au départ, toutes les fleurs ont été traités identiquement à l’active-FE, mais le procédé d’extraction a déménagé vers l’utilisation des fleurs entières. Dissection florale était beaucoup de temps et avait très peu d’effet sur la bioactivité de la FEs qui en résulte. Cependant, certains organes floraux peuvent et ont été évalués à l’aide de ce protocole, mais beaucoup de soin doit être pris à ne macérer pas complètement les tissus floraux (Supplemental Movie 1avec précautions détaillées dans étape 2.3), car cela peut entraîner libéré composés de champignons toxiques/statique dans le FE qui risquent de fausser l’évaluation microscopique. Moins les extractions envahissantes comme le pass -FE (2 film supplémentaire) et FE-rw sont plus favorables en raison de leur facilité d’acquisition. En outre, ces techniques d’extraction nécessitent seulement une filtration sous vide afin d’acquérir des signaux chimiques biologiquement actifs florales.

Les fleurs utilisées dans toutes les extractions ont été généralement réfrigérés pour les 0-3 jours avant la préparation de l’extrait. Une contestation de ce protocole est la gestion du temps du chiffre d’affaires de FE (collection de champs grâce au stockage des extraits). Cela a été exacerbée par les nombreux échantillons provenant de plusieurs sources et les dates. Gelée de fleurs n’ont pas été évalués de façon réelle, comme décongelé noud détériorées et décoloré. Cependant, une fois que la FEs à base d’eau ont été préparés, répétés de gel et de dégel n’a montré aucun effet sur la bioactivité de la FE, donc aussi longtemps que le FE sont recongelés rapidement après la préparation de l’essai biologique (FE 3 an viable).

Chloroforme d’extraction permet l’étude des réponses de pathogène à cires surface tridimensionnelle floral/fruits dans un plan à deux dimensions par évaporation de ch-FE sur couvre-objet en verre. Toutefois, il est peu probable que les structures cristallines réelles des cires déposés de la ch-FE sont identiques à la surface, d'où ils ont été recueillis. Intentionné, complémentaires des techniques devraient être appliquées si réponse fongique à cire spécifiques structures in vivo est le principal objectif de l’enquête. Axée sur le chloroforme extraits ont besoin d’entretien stockage plus que les extractions à base d’eau. En plus de conserver le ch-FE extraits dans l’obscurité, la culture de cellules PTFE bordée tube casquettes et parafilm étanchéité wrap besoin d’être régulièrement vérifiée pour des fuites par évaporation et remplacé si nécessaire.

Le concept de contrôle de floral de l’écoulement des eaux est enraciné dans l’idée de faire progresser les outils de surveillance spécifique de la maladie. Les dispositifs de collecte d’eau de pluie peuvent être adaptés à beaucoup d’autres architectures végétales, tant que le dispositif de prélèvement capte l’eau de pluie qui a couru hors de fleurs. Cette approche fournit des informations sur si oui ou non stimulation florale est présente sur le terrain à un moment donné et peut être surveillée tout au long de la saison. Alternativement, des dispositifs de collecte peuvent être déployés sur plusieurs sites de la canopée pour déterminer dans quelle mesure florales repères ont été lavés pendant tout mouillage-événement. À l’avenir des expériences, rw-FE dictera quand les applications de fongicides devraient commencer et quand ils se terminent en toute sécurité. De plus, en surveillant les extractions de cire dépendant de phénologie (protocole, article 9), l’importance de la période de floraison à la biologie de l’agent pathogène est devenu encore plus évident. Cet article a été également inclus pour démontrer la flexibilité de ces tests biologiques, fournit également des méthodes qui permettent la comparaison by-side de cires de surface hôte qui sont séparés dans le temps. Les données générées en utilisant les techniques d’extraction floral et dosages biologiques représentent des indicateurs tangibles de stimulation de l’agent pathogène, les classes chimiques spécifiques importants de biologie de l’agent pathogène et de cibles pour les stratégies futures de lutte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter	VWR	101102-280	Blueberry floral extract (FE) clarification
200-1000 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter	Harbor Freight	97098	Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave	Amsco	3011	Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet)	Winco	BL-240	Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer	Fisher Scientific	06-662-47	Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose	VWR	62994-795	Vacuum filter component
Buchner funnel	Coors USA	60240	Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner	-	-	Equipment
Calcium carbonate	Fisher Scientific	C64-500	Media component
Centrifuge	Sorvall	RC 5B Plus	Equipment
Centrifuge tubes (15 ml)	Fisher Scientific	05-527-90	Equipment
Centrifuge tubes (50 ml)	VWR	10025-694	Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50)	Fisher Scientific	AS240	Equipment, FE preparation
Chloroform	VWR	JT9175-3	Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA)	Fisher Scientific	B11132	Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain	Sigma-Aldrich	61335	Lactophenol cotton-blue stain
Difco Agar	VWR	90004-032	Media component
Drill-press	Delta	-	Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water	Barnstead	D738	Equipment, deionized water source
Ethanol (95%)	-	-	Chemical
Filter flask (500 ml)	Pyrex	No. 5340	Vacuum filter component
Fume hood	Hamilton	-	Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)	VWR	60820-110	Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide	Fisher Scientific	22-038-101	Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle	VWR	16126-454	pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes	-	-	Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B	Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)	-	-	Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl)	Hamilton Co. Inc.	#710	ch-FE bioassay
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer	Bright-Line	5971R10	Equipment
Lactic acid	Sigma-Aldrich	W261106	Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood	Labconco	3730400	Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)	-	-	Equipment
Microcentrifuge tubes (2 ml)	Fisher Scientific	05-408-138	Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB	Leica	020-519.010	Equipment
Mortar (ceramic)	Coors USA	60313	Vacuum filter component
Nitrile gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D	Flower collection
Paper disks (cut paper towels)	Office Basics	KCC01510	humidity control in bioassay
Parafilm	Bemis	PM-996	Plastic paraffin film
Pestle (ceramic)	Coors USA	60314	Vacuum filter component
Phenol crystals	Fisher Scientific	A92-100	Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm)	Uline	S1294	Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)	Fisher Scientific	FB0875712	(Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps	VWR	60927-228	Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml)	Pyrex	No. 1000	Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan	-	-	pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder	-	-	Equipment, FE preparation
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)	-	-	Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors	Fisher Scientific	8940	Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer	VWR	470149-756	Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit)	Dewalt	-	Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop)	Fisher Scientific	22-363-602	Culture preparation
Telephone wire (internal wires)	-	-	Blueberry rw-FE collection
Test tube basket	VWR	470137-792	Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket
V8 Juice	Campbell's Soup Company	-	Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets	Donation	-	pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex)	Fisher Scientific	12-812	Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles	Whatman	1001-055	Vacuum filter component
White plastic twist ties (100 mm)	Uline	S-566W	Cranberry rw-FE collection