Her beskrives bioassay utviklet for å overvåke utviklingen av en fungal patogen, Colletotrichum fioriniae, i nærvær av blåbær eller tranebær floral ekstrakter på glass coverslips. Vann, kloroform og feltet regnvann – basert floral utvinning teknikker er detaljert og innsikt i hvordan denne informasjonen kan bli brukt.
For å nøyaktig skjermen phenology blomst perioden og tidsmessige dynamikken i floral kjemiske signaler på sopp frukt råtnende patogener, ble floral utvinning metoder og dekkglassvæske bioassay utviklet utnytte Colletotrichum fioriniae. I blåbær og tranebær kontrolleres optimalt denne patogen ved å bruke soppmidler i bloom perioden på grunn av blomster rollespill i den innledende stadiet av infeksjon. Protokollen detaljert her beskriver hvordan floral ekstrakter (FE) ble hentet ved hjelp av vann-, kloroform og feltet regnvann-baserte metoder for senere bruk i tilsvarende glass dekkglassvæske bioassay. Hver FE var å gi et annet sett med informasjon: svar av C. fioriniae mobilisert floral kjemiske pekepinner i vann (vannbasert), patogen svar blomst og frukt overflaten voks (kloroform-basert) og feltet-basert overvåking av samlet floral regnvann, flytte i vitro observasjoner til landbruket setting. FE er generelt beskrevet som enten eller kloroform-vannbasert, med en passende bioassay beskrevet for å kompensere for den iboende forskjellen mellom disse to materialene. Regnvann som hadde kjørt av blomster var samlet i unike enheter for hver avling, samband med fleksibiliteten og anvendelsen av denne tilnærmingen for andre beskjære systemer. Bioassay er rask, enkel og billig, og gir muligheten til å generere spatiotemporal og områdespesifikke informasjon om tilstedeværelse av stimulerende floral forbindelser fra ulike kilder. Denne informasjonen vil til slutt bedre informere sykdom ledelse strategier, som FE redusere tiden det tar for infeksjon oppstår, gir innsikt i skiftende risiko for patogen smitte over vekstsesongen.
Colletotrichum fioriniae forårsaker en frukt råte både Highbush blåbær (Vaccinium corymbosum L.) og den store amerikanske tranebær (V. macrocarpon Aiton)1,2. Denne patogen var nylig avgrenset fra C. acutatum arter kompleks3,4,5,6 og er en årsakssammenheng agent for blueberry anthracnose og medlem av tranebær frukt rot kompleks, i tillegg til forårsaker mange andre plante sykdommer verdensomspennende7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infeksjoner forekommer under bloom og symptom utvikling ikke bli tydelig til frukt er i sluttfasen av modning9. I blåbær og tranebær, er frukt råte tilstrekkelig kontrollert med soppdreper programmer i bloom perioden. Patogen overvintrer i sovende blåbær floral bud skalaer10 og sporulates under blomst. Conidia flyttes hele kalesjen via regn-splash spredning11,12 og inoculum buildup har vært sterkt korrelert til blomst perioden13. Response av Colletotrichum til verten blomster er ikke unikt for Vaccinium, som blomster er viktige komponenter av sitrus innlegget blomst frukt miste (PFD)14 samt jordbær anthracnose15, i begge tilfeller forårsaker den patogen sporulate. Alle disse tilfellene fremheve behovet for effektive metoder for å evaluere timelige dynamikken i floral kjemiske signaler på C. fioriniae og andre patogener som infisere under blomst. Innsikt levert av metodene som er beskrevet her blir stadig mer verdifull.
Denne protokollen detaljer metoder av planteekstrakter (FE) anskaffelser og guider evalueringen av C. fioriniae svar til FE via glass dekkglassvæske bioassay15,16. Floral utvinning teknikker er delt i to hovedtyper; vannbasert utdrag (aktiv-FE, passiv (pass –FE) og feltet regnvann-basert (rw-FE)), og kloroform-basert (lm-FE)17 utdrag. Vannbasert utdrag tillate inspeksjon av vann mobilisert floral kjemiske signaler. Disse mobilisert signaler er sannsynligvis viktige komponenter av infeksjon court, siden FE sterkt øker hastigheten på infeksjon16, i tillegg til å gi fuktighet kreves for infeksjon oppstår. I tillegg representerer en mer naturlig tilstand som floral stimulering kan vaskes gjennom kalesjen under wetting-hendelser som tidligere observert i blåbær og andre beskjære systemer14,16. Kloroform-baserte floral utdrag (lm-FE) også gi verdifull informasjon om patogen svar til verten overflaten voks17,18, Klargjørende tidlige vekst stadier av conidia en gang satt på utsatt vert organer (i.e. blomster, eggstokkene og utvikle frukt). Patogen response til sesongmessige endringer i vert overflaten voks kan også monitoreres bruker denne protokollen. Følgelig, bioassay er tilpasset arbeider med vannbasert FE eller kloroform-baserte FE å redusere den iboende forskjellen mellom disse to materialene.
Dataene fra bioassay avslørt at vannbasert utdrag stimulere høyere nivåer av sekundære conidiation enn kloroform-baserte utdrag hvor det var en definitiv appressorial respons, derfor implicating flere forbindelser i FE. Interessant, var begge disse vekst svar observert når bruke regnvann som hadde kjørt ut av blåbær og tranebær blomster, som angir flere stimulerende stoffer kan vaskes fra overflaten av blomster. Dermed vil overvåking for floral stimulering gi innsikt i sannsynligheten for patogen suksess i en landbruket systemet.
Det endelige målet med denne protokollen er å gi en metodikk for genererer planlagte biologiske informasjon om sopp plante-patogener svar på floral kjemiske signaler, samt initiering metoder som kan utnytte denne blomster informasjon til hjelp i områdespesifikke sykdom ledelse og beslutningsprosesser prosesser.
Bioassay oppdage C. fioriniae svaret floral ekstrakter (FEs) ble utviklet for blåbær og tranebær frukt rot pathosystems men kan lett tilpasses andre hagebruk avlinger. Protokollen beskrevet ovenfor er verdifull i å skaffe mange viktige datasett inkludert, men ikke begrenset til: FE effekter på flere isolater av mange patogener, tid-retters informasjon om soppvekst stadier i nærvær av ulike FEs, sammenligning av utvinning teknikker, inspeksjon av personlige kjemikalier på C. fioriniae vekst og differensiering, evaluering av personlige blomst orgel ekstrakter, effekten av temperatur på C. fioriniae mens i nærvær av FE, effekter phenology avhengige voks utdrag og floral regnvann effekter. Ved hjelp av disse teknikkene har data generert også gitt en mye klarere forståelse av C. fioriniae livet scener og delvis kaster hvorfor blomst er så avgjørende for kontroll av mange frukt råtnende patogener.
I utgangspunktet alle blomstene ble behandlet identisk til det aktivt-FE, men utpakkingen har flyttet mot hjelp hele blomster. Floral disseksjon var tidkrevende og hadde liten betydning for bioactivity av den resulterende FEs. Imidlertid floral organer kan og har vært vurdert bruker denne protokollen, men stor forsiktighet må tas til ikke helt macerate floral vev (ekstra film 1, med forholdsregler i trinn 2.3), da dette kan resultere i utgitt sopp-giftig/statisk forbindelser i FE som kan forvrenge mikroskopiske evalueringene. Mindre invasiv utdrag som pass –er FE (supplerende Movie 2) og rw-FE nå mer gunstig på grunn av sin enkle anskaffelser. I tillegg krever følgende utvinning bare vakuum filtrering å erverve biologisk aktive floral kjemiske signaler.
Blomstene benyttes i alle utdrag var vanligvis kjøleskap i 0-3 dager før ekstrakt forberedelse. En utfordring i denne protokollen er tid ledelse av FE omsetning (feltet samlingen gjennom lagring av ekstrakter). Denne ble forverret etter mange prøvene fra flere kilder og datoer. Frosne blomster har ikke blitt evaluert til noen reell grad tinte blomster vises forverret og misfarget. Men når den vannbasert FEs er utarbeidet, gjentatt frysing og tining har vist ingen effekt på bioactivity Fe, så så lenge FE er raskt refrozen etter bioassay forberedelser (levedyktig 3 år gamle FE).
Kloroform-baserte utvinning kan etterforskningen av patogen Svar å tredimensjonale floral/frukt overflaten voks i en todimensjonal flyet via lm-FE fordampning på glass coverslips. Men er det usannsynlig at den faktiske krystallinske strukturer av voks avsatt fra lm-FE er identiske på overflaten som de ble samlet. Betydning, supplerende teknikker bør gjennomføres hvis fungal svar på bestemte voks strukturer i vivo er hovedfokus for undersøkelse. Kloroform-baserte ekstrakter trenger mer lagringsplass vedlikehold enn vannbasert utdrag. Holde lm-FE ekstrakter i mørket, PTFE foret cellekultur rør caps og parafilm tetting wrap må kontrolleres regelmessig fordamping lekkasjer og erstattet etter behov.
Begrepet overvåking floral regnvann avrenning er forankret i ideen om å fremme områdespesifikke sykdom overvåkingsverktøy. Regnvann samling enhetene kan tilpasses mange andre plante arkitekturer, så lenge samlingen enheten fanger regnvann som har kjørt ut av blomster. Denne tilnærmingen gir informasjon om hvorvidt floral stimulering finnes i feltet til enhver tid og kan overvåkes gjennom hele sesongen. Alternativt kan samling enheter distribueres på flere baldakin steder å finne ut hvor langt floral signaler har blitt vasket under enhver wetting-hendelse. I fremtiden eksperimenter, rw-FE vil diktere når soppdreper programmer skal begynne, og når de trygt kan ende. I tillegg ved å overvåke phenology avhengige voks utdrag (protocol delen 9), har betydningen av bloom perioden til patogen biologi blitt enda tydeligere. Denne delen ble også inkludert for å demonstrere fleksibilitet til disse bioassay, å tilby metoder som tillater side ved side sammenligning av verten overflaten voks som er timelig atskilt. Dataene som genereres ved hjelp av floral utvinning teknikker og bioassay representerer konkrete indikatorer på patogen stimulering, bestemte kjemiske klasser viktig å patogen biologi og mål for fremtidige kontroll strategier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker William S. Haines, SR utstyrt tranebær Research Fund og New Jersey blåbær og tranebær Research Council, Inc. for støtte. Vi takker også Jennifer Vaiciunas (veiledning og floral forberedelser), Christine Constantelos (fungal kultur og floral forberedelser), David Jones (floral forberedelser og utdrag), Langley Oudemans (floral forberedelser, filming/foto), Jesse Lynch (floral forberedelser), Roxanne Tumnalis (generell støtte) og mange student/summer internship.
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
200-1000 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
40-200 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
5-40 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
Bunsen burner | – | – | Equipment |
Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
Curved forceps (45˚) | Fisher Scientific | 10-270 | Equipment, flower processing and coverslip inversion |
Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
Drill-press | Delta | – | Equipment, rw-FE collection |
EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
Ethanol (95%) | – | – | Chemical |
Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
Freezer (set to -20˚ C) | – | – | Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE |
Fume hood | Hamilton | – | Equipment, chloroform usage |
Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
Glass cell culture tubes | – | – | Storage of ch-FE |
Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | – | – | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
Incubator (set to 25˚ C, dark) | Percival | 50036 | Equipment, bioassay conductance |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
Metal probe (generic) | – | – | Equipment |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
Pyrex bread-pan | – | – | pass-FE collection |
Pyrex graduated cylinder | – | – | Equipment, FE preparation |
Refrigerator (set to 4˚ C) | – | – | Equipment, storage of ch-FE |
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | – | – | Bioassay conductance |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
Step drill bit (step-bit) | Dewalt | – | Equipment, rw-FE collection |
Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
Telephone wire (internal wires) | – | – | Blueberry rw-FE collection |
Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
V8 Juice | Campbell's Soup Company | – | Fungal media component |
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | – | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |