Här beskrivs bioassays syftar till att övervaka utvecklingen av svamp patogener, Colletotrichum fioriniae, i närvaro av blåbär eller tranbär blommig extrakt på glas coverslips. Vatten-, kloroform och fältet regnvatten – baserat blommig utvinning tekniker är detaljerade samt fördjupad insikt i hur denna information kan tillämpas.
För att noggrant övervaka fenologi för perioden bloom och tidsmässiga dynamiken i blommig kemiska ledtrådar om svamp frukt ruttna patogener, utvecklades blommig extraktionsmetoder och täckglas bioassays utnyttja Colletotrichum fioriniae. I blåbär och tranbär styrs denna patogen optimalt genom att tillämpa fungicider under perioden bloom på grund av den roll blommor spelar i de inledande skedena av infektion. Protokollet beskrivs här beskriver hur blommig extrakt (FE) erhölls med vatten – kloroform- och fältet regnvatten-baserade metoder för senare användning i motsvarande glas täckglas bioassays. Varje FE bidragit till en annan uppsättning information: svar av C. fioriniae mobiliserade blommig kemiska signaler i vatten (vattenbaserad), patogen reaktion på blomma och frukt ytan vaxer (kloroform-baserat), och fältbaserade övervakning av samlat blommig regnvatten, flytta in vitro- observationer till ett jordbrukslandskap. FE i huvudsak beskrivs som antingen vatten – eller kloroform-baserade, med en lämplig bioassay som beskrivs för att kompensera för de inneboende skillnaderna mellan dessa två material. Regnvatten som hade springa iväg blommor samlades i unika enheter för varje gröda, anspelar på den flexibilitet och tillämpningen av denna metod för andra grödor system. Bioassays är snabb, billig, enkel och ger förmågan att generera spatiotemporal och platsspecifika information om förekomst av stimulerande blommig föreningar från olika källor. Denna information kommer i slutändan bättre informera sjukdom förvaltningsstrategier, FE minska den tid som behövs för infektion förekommer, vilket ger inblick i föränderliga risker för patogen infektion under växtsäsongen.
Colletotrichum fioriniae orsakar en frukt ruttna både allåkerbär blåbär (Vaccinium corymbosum L.) och den stora amerikanska tranbär (V. macrocarpon Aiton)1,2. Denna patogen var nyligen avgränsas från C. acutatum arter komplexa3,4,5,6 och är en kausal agent för blåbär anthracnos och medlem av tranbär frukt röta komplexa, förutom att orsaka många andra växt sjukdomar världen över7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infektioner som inträffar under blom och symptom utveckling inte blir uppenbara tills frukten är i slutfasen av mognad9. I blåbär och tranbär kontrolleras frukt ruttna endast med fungicid ansökningar under perioden bloom. Patogenen övervintrar i vilande blåbär blommig knopp skalor10 och sporulates under bloom. Conidia flyttas hela trädkronorna via regn-splash spridning11,12 och inokulum uppbyggd har varit starkt korrelerad till bloom perioden13. Svar av Colletotrichum arter till värd blommor är inte unik för Vaccinium, eftersom blommor är viktiga komponenter av citrus post bloom frukt drop (PFD)14 samt jordgubb anthracnos15, i båda fallen som orsakar patogenen till sporulate. Alla dessa fall belysa behovet av effektiva metoder för att utvärdera tidsmässiga dynamiken i blommig kemiska ledtrådar om C. fioriniae och andra patogener som infekterar under bloom. De insikter som tillhandahålls av metoderna som beskrivs här blir allt mer värdefull.
Detta protokoll metoder blommig extrakt (FE) upphandling och guider utvärderingen av C. fioriniae Svaren till FE via glas täckglas bioassays15,16. De blommiga utvinning teknikerna är indelade i två huvudtyper; vatten-baserade extraktioner (aktiv-FE, passiv (pass –FE) och fältet regnvatten-baserade (rw-FE)), och kloroform-baserade (ch-FE)17 extraktioner. De vattenbaserade extraktioner möjliggör inspektion av vatten mobiliserade blommig kemiska signaler. Dessa mobiliserade ledtrådar är sannolikt viktiga komponenter domstolens infektion eftersom FE kraftigt ökar hastigheten på infektion16, förutom att ge fukt krävs för infektionen att inträffa. Dessutom utgör de ett mer naturligt tillstånd som blommig stimulering kan tvättas i hela kapellet under vätning-händelser som tidigare observerats i blåbär och andra gröda system14,16. Kloroform-baserade blommig extraktioner (ch-FE) ger också värdefull information som hänför sig till patogen svar värd yta vaxer17,18, belysa tillväxten tidigt i conidia en gång deponeras på mottagliga mottagande organ (dvs. blommor, äggstockarna och utveckla frukt). Patogen svar på säsongsmässiga förändringar i värd yta vaxer kan också övervakas med hjälp av detta protokoll. Följaktligen skräddarsys bioassays arbetar med antingen vatten-baserade FE eller kloroform-baserade FE för att mildra de inneboende skillnaderna mellan dessa två material.
De data som genereras från bioassays avslöjade att vattenbaserade extraktioner stimulera högre nivåer av sekundära conidiation än kloroform-baserade extraktioner där det fanns en definitiv appressorial svar, därför ifrågasätta flera föreningar närvarande i FE. Intressant, observerades båda dessa tillväxt-svar när använder regnvatten som hade sprungit bort av blåbär och tranbär blommor, som anger flera stimulerande föreningar kan tvättas från ytan av blommor. Således, övervakning för blommig stimulering ger inblick i sannolikheten för patogen framgång i ett jordbrukssystem.
Det slutliga målet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att generera biologiska originalplansinformation på svamp växt patogener som svar på blommiga kemiska signaler, samt initierande metoder som kan utnyttja denna blommiga information till stöd i platsspecifika sjukdom förvaltning och beslutsfattande processer.
De bioassays att upptäcka C. fioriniae svar blommig extrakt (FEs) utvecklades för blåbär och tranbär frukt ruttna pathosystems men kan lätt anpassas till andra trädgårdsgrödor. Det protokoll som anges ovan har varit värdefullt att förvärva många viktiga data set inklusive, men inte begränsat till: FE effekter på flera isolat av många patogener, tidsförlopp information som rör svamptillväxt stadier i närvaro av olika FEs, jämförelse av utvinning tekniker, inspektion av enskilda kemikalier på C. fioriniae tillväxt och differentiering, utvärdering av enskilda blomma orgel extrakter, effekter av temperatur på C. fioriniae medan i närvaro av FE, effekter fenologi beroende vax extraktioner och blommig regnvatten effekter. Med hjälp av dessa tekniker har data som genereras också lämnat en mycket tydligare förståelse av C. fioriniae liv arrangerar och delvis förtydligar varför perioden bloom är så kritiskt att kontroll av många frukter ruttna patogener.
Inledningsvis alla blommor bearbetades identiskt till det aktivt-FE, men extraheringen har rört sig mot med hjälp av hela blommor. Blommig dissektion var tidskrävande och hade mycket liten inverkan på bioaktiviteten av den resulterande FEs. Dock blommig individorgan kan och har varit utvärderade använder detta protokoll, men stor omsorg måste tas att inte helt lös upp blommig vävnader (kompletterande film 1, med försiktighetsåtgärder som beskrivs i steg 2,3), eftersom detta kan leda till frisläppt svampar-giftigt/statiska föreningar i FE som kan snedvrida de mikroskopiska utvärderingarna. Mindre invasiva extraktioner som pass –är FE (kompletterande Movie 2) och rw-FE nu mer gynnsam på grund av sin användarvänlighet förvärv. Dessutom kräver dessa utvinning tekniker endast dammsugarfilter att förvärva biologiskt aktiva blommig kemiska signaler.
Blommorna används i alla extraktioner var vanligen kyld för 0-3 dagar före extrahera förberedelse. En utmaning i detta protokoll är tid förvaltning av FE omsättning (fältuppsättningen genom lagring av extrakt). Detta förvärrades av många prover från flera källor och datum. Frusna blommor har inte utvärderats i någon verklig omfattning, som tinade blommorna försämrats och missfärgat. Dock när den vattenbaserade FEs har upprättats, upprepad frysning och upptining har inte visat någon effekt på bioaktiviteten i FE, så så länge som FE är snabbt omfrysning efter bioassay förberedelse (livskraftiga 3-årig FE).
Kloroform-baserat extraktion kan utredningen av patogen Svaren till tredimensionella blommig/frukt ytan vaxer i ett tvådimensionellt plan via ch-FE avdunstning på glas coverslips. Det är dock osannolikt att de faktiska kristallina strukturerna av vaxer deponeras från ch-FE är identiska till ytan där de samlades. Menande, kompletterande tekniker bör genomföras om svamp svar på specifika vax strukturer i vivo är i fokus för undersökningen. Kloroform-baserade extrakt behöver mer lagring underhåll än de vattenbaserade extraktioner. Förutom att hålla i ch-FE extrakt i mörkret, PTFE fodrad cellkulturen röret caps och parafilm tätning wrap behöver kontrolleras regelbundet för avdunstning läckor och ersättas vid behov.
Begreppet övervakning blommig regnvatten är rotad i idén om advancing platsspecifika sjukdom övervakningsverktyg. De regnvatten strömavtagare kan anpassas till många andra växt-arkitekturer, så länge samling enheten fångar regnvatten som har körts bort av blommor. Detta tillvägagångssätt ger information om huruvida blommig stimulering är närvarande på fältet vid varje given tidpunkt och kan övervakas under hela säsongen. Alternativt, samling enheter kan distribueras på flera kapell platser att avgöra hur långt blommig cues har tvättats under varje given vätning-event. I framtiden experiment, rw-FE kommer att diktera när fungicid program ska börja och när de kan säkert slut. Dessutom, genom att övervaka fenologi beroende vax extraktioner (protokoll avsnitt 9), har vikten av bloom perioden till patogen biologi blivit ännu tydligare. Det avsnittet ingick också för att Visa flexibiliteten i dessa bioassays, tillhandahålla metoder som möjliggör en sida-vid-sida jämförelse av värd yta vaxer som är tidsmässigt avgränsade. De data som genereras med hjälp av blommig utvinning tekniker och bioassays utgör konkreta indikatorer av patogen stimulering, specifika kemiska klasser viktigt att patogenen biologi och mål för framtida kontrollstrategier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar den William S. Haines, Sr. begåvad tranbär forskningsfond och New Jersey blåbär och tranbär Research Council, Inc. för stöd. Vi vill också tacka Christine Constantelos (svamp kultur och blommig preparat), Langley Oudemans (blommig preparat, Filmning/fotografering), David Jones (blommig preparat och extraktioner), Jennifer Vaiciunas (vägledning och blommig preparat), Jesse Lynch (blommig preparat), Roxanne Tumnalis (allmänt stöd) och ett flertal student/Sommarpraktikanter.
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
200-1000 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
40-200 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
5-40 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
Bunsen burner | – | – | Equipment |
Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
Curved forceps (45˚) | Fisher Scientific | 10-270 | Equipment, flower processing and coverslip inversion |
Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
Drill-press | Delta | – | Equipment, rw-FE collection |
EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
Ethanol (95%) | – | – | Chemical |
Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
Freezer (set to -20˚ C) | – | – | Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE |
Fume hood | Hamilton | – | Equipment, chloroform usage |
Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
Glass cell culture tubes | – | – | Storage of ch-FE |
Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | – | – | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
Incubator (set to 25˚ C, dark) | Percival | 50036 | Equipment, bioassay conductance |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
Metal probe (generic) | – | – | Equipment |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
Pyrex bread-pan | – | – | pass-FE collection |
Pyrex graduated cylinder | – | – | Equipment, FE preparation |
Refrigerator (set to 4˚ C) | – | – | Equipment, storage of ch-FE |
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | – | – | Bioassay conductance |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
Step drill bit (step-bit) | Dewalt | – | Equipment, rw-FE collection |
Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
Telephone wire (internal wires) | – | – | Blueberry rw-FE collection |
Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
V8 Juice | Campbell's Soup Company | – | Fungal media component |
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | – | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |